CZ292199B6 - O-Fosfonomethylcholin a jeho alkylestery, způsob jejich přípravy a použití - Google Patents

Abstract

O-Fosfonomethylcholin vzorce I a jeho alkylestery vzorce II, kde R je alkylskupina odvozen od prim rn ho alkoholu s po tem 8 - 16 atom uhl ku a zp sob jejich p° pravy. Je pops no jejich pou it pro potla en vzniku nebo r stu n dor u zv °at a u lov ka.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nové látky O-fosfonomethylcholinu a jeho alkylesterů, způsobu jejich přípravy a použití jako léčiva zejména jako nová cytostatika.

Dosavadní stav techniky

Zhoubné nádory a různé druhy leukemie patří mezi nejnebezpečnější příčiny vážných lidských onemocnění a úmrtí. Podle údajů WHO v roce 1996 tyto neoplazie tvořily >12 % všech příčin smrti v globálním měřítku a v civilizovaných zemích je tento podíl podstatně větší. Mezi nej vážnější patří nádory plicní, nádory žaludku a střev, jatemí nádory a nádory prsu. V České republice tvoří nádory přibližně 20 % všech příčin úmrtí.

Pro léčení zhoubných forem bujení je neodmyslitelná farmakoterapie, sloužící nejen jako doplněk chirurgických zákroků a jako součást paliativní terapie, ale také jako léčebná metoda v raných fázích léčení některých nádorů. Zvláště citlivé na farmakoterapii jsou např. Hodgkinův lymfom, testikulámí a ovariální karcinom, kožní karcinom, nádory prostaty, nádory prsu a malobuněčný nádor plicní, mezi citlivé na chemoterapii se uvádějí i nádory děložního čípku. Zvláštní význam má farmakoterapie u akutní lymfoblastické leukemie dětí a akutní myelooblastické leukemie dospělých.

Strategie chemoterapeutických postupů užívaných v terapii nádorových onemocnění a leukémií využívá molekulárně biologické podstaty buněčné transformace a dějů probíhajících v transformované buňce, doplněné dalšími faktory. Chemoterapie neoplastických onemocnění je věnováno velké množství monografií (z moderních např. O. Foye, Cancer Chemotherapeutic Agents; ACS, Washington, D.C. 1995; P. Klener, Protinádorová chemoterapie, Galén, Praha 1996) a specializovaných časopisů.

Významnými skupinami klinicky používaných chemoterapeutick jsou antimitotické preparáty (např. vincristin, podofylotoxin, paclitaxel a jeho polosyntetické deriváty, např. Taxotere), alkylační činidla, např. dusíkaté yperity (např. chlorambucil, melfalan, manomustin, cyklofosfamid, ifosfamid, mafosfamid), aziridiny (např. tretamin, thiotepa, mitomyciny), sulfonáty (např. busulfan), deriváty platiny (např. cis-platina, karboplatina) a deriváty močoviny (např. semustin, lomustin, karmustin, streptozotocin), inhibitory topoizomeráz (např. tenipozid, etopozic, irinotekan, merbaron), dále látky štěpící řetězce DNA (např. bleomyciny, streptonigrin, neokarcinostetin) a interkalátory, např. antracyklinová antibiotika (daunorubicin, doxorubicin, aklarubicin, zorubicin, idarubicin a d.), chromymyciny, deriváty antracenu (např. mitoxantron, ametantron) a další. Důležitou skupinou protinádorových chemoterapeutik jsou tzv. antimetabolity, napodobující chemickou strukturu přirozených součástí látkové výměny a ovlivňují enzymové reakce přirozených metabolitů. Mezi antimetabolity používané v léčení nádorových onemocnění a leukémií patří např. deriváty kyseliny listové (metotrexát, trimetrexát, paltitrexát, edatrexát), inhibitory ribonukleotidreduktázy (hydroxyurea, guanazol, keracemid), analogy aminokyselin (DFMO, PALA) a hlavně četné látky zasahující metabolismus nukleových kyselin (biosyntézu a funkci jejich prekurzorů, polymerační reakce). Úspěšná kancerostatika a antileukemika mají strukturu pyrimidinových i purinových sloučenin. Jsou to hlavně analogy uracilu (např. 5-fluoruracil a jeho profarmaka, např. togafur, floxuridin), látky řady cytosinu (např. cytosinarabinosid, cyklocytidin, gemcitabin); mezi purinovými cytostatiky mají hlavní význam

6-merkaptopurin a jeho deriváty (např. 6-thioguanin) a analogy acenosinu (např. kladribin a fludarabin).

-1 CZ 292199 B6 l

Jinou skupinou farmak, užívaných v terapii některých nádorů, jsou látky odvozené od membránových fosfolipidů, jako jsou lyzofosfolipidy nebo éterfosfolipidy. Předpokládá se, že se inkorporují do lipidové dvojvrstvy buněčné membrány a ovlivňují přenos intracelulámích signálů (H.H. grunicke, K. Mály. F. Uberall, C. Schubert, E. Kindler, J. Staker and H. Brachwitz, 5 Cellular signalling as a target in cancer chemotherapy. Phospholipid analugues as inhibitors ofmitogenic signál transduction. And. Enzyme Regul. 36, 385-407 (1996); P. Hilgard, T. Klenner, J. Stekar and C. Unger, Alkylphosphocholines; a new class of membrane-active anticancer agents. Cancer Chemother. Pharmacol 32, 90-95 (1993). D. Berkovic, Cytotoxid etherphospholipid analogues. gen Pharmacol 31, 511-517 (1998).). Takovými látkami jsou např. ío eldefosin (3-O-oktadexyl-2-O-methylglycerylester fosfocholinu), jeho 3-oktadecylsulfanyl analog ilmofosin, a hlavně hexadexylester fosfocholinu miltefosin, používaný v lokální aplikaci při léčení kožních nádorů, maligního melanomu, kožních forem B- a T-lymfomů, či metastáz solidních tumorů do kůže (Miltex^ [T. Beckers, R. Voegeli and P. Hilgard, molecular and cellular effects of hexadecylphosphocholine (Miltefosine) in human myeloid leukaemic cell lineš. 15 Eur. J Cance 30A, 2143-2150 (1994); M. R. Berger, B. Betsch, B. Betsch, M. gebelein,

E. Amtmann,, P. Heyl and H. R. Scherf, Hexadecylphosphocholine differs from conventional cytostatic agents. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 119, 541-548 (1993); D. Berkovic, E. A. Fleer, H. Eibl and C. Unger, Effects of hexadecylphosphocholine on cellular function. Prog. Exp. Tumor Res. 34, 59-68 (1992); R. Dummer, J. Rogen, T. Vogt, J. Becker, H. Hefher, 20 H. Sindermann and g. Burg, Topical application of hexadecylphostphocholine in patients with cutaneous lymphomas. Prog Exp Tumor Res 34, 160-169 (1992); H. Eibl and C. Unger, Hexadecylphosphocholine: a new and selective antitumor drug. Cancer Treat. Rev. 17, 233-242 (1990); E. A. Fleer, C. Unger, D. J. Kim and H. Eibl, Metabolism of ether phospholipids and analogs in neoplastic cells. Lipids 22, 856-861 (1987); C. C. geilen, R. Haase, K. Buchner, T.

Wieder, F. Hucho and W. Reutter, The phospholipid analogue, hexadecylphosphocholine, inhibits protein kinase C in vitro and antagonises phorbol ester-stimulated cell proliferation. Eur J. Cancer 27,1650-1653 (1991); N. grosman, Effect of the cmti-neoplastic agents edelrfosine (ET-18-OCH3), ilmofosine (BM 41.440) and the hexadecylphosphocholine analogues D-20133 and D-21266 and histamine release from isolated rat mast cells, Immunopharmacology 44, 30 211-221 (1999).]

Dosavadní úspěšné klinické postupy při chemoterapii nádorových onemocnění a leukémií se neomezují na monoterapii, ale vždy používají kombinaci mnoha léčebných složek. Hlavní potíží této terapie je toxicita používaných léků a četné vedlejší reakce, vyplývající z toho, že většina 35 principů, na nichž jsou uvedené léky založeny, působí stejně tak na buňky transformované, jako na buňky normální. Proto lze počítat jedině s relativními rozdíly (např. zvýšenou mitotickou aktivitou některých transformovaných buněk, hypoxickým charakterem nádorové tkáně apod.) nebo zvláštními vlastnostmi patologického stavu (metastatická aktivita, potřeba angiogeneze). Úspěšnost terapie je dále omezována tzv. mnohočetnou lékovou rezistencí (MDR), přirozeným 40 procesem, který snižuje účinnost léčby zvýšeným transportem účinné látky z buňky. Obě tyto nevýhody je možné řešit jedině zaváděním stále nových biologicky aktivních látek, založených nejlépe na nových principech biologického působení proti metabolismu transformovaných buněk, metastázi, tvorbě tumorů apod.

Podmínkou úspěšného působení farmaka jsou jednak jeho farmakologické parametry, jednak jeho biologická stálost, bezprostředně svázaná s toxicitou možných produktů rozkladu a případně nutným vyšším či častějším dávkováním účinného léku. Tento jev je zvláště významný u látek, které jsou založeny na podobnosti chemické struktury k přirozeným substrátům buněčných enzymů, nebo obsahují strukturní prvky snadno podléhající obvyklým rozkladným reakcím (např.

hydrolýze či fosforolýze esterových vazeb karboxylových kyselin nebo kyseliny fosforečné). Tuto nevýhodu lze odstranit současným podáním inhibitorů zmíněných enzymů, pokud jsou známy a terapeuticky přípustné, nebo vývojem takových léčiv, které svou strukturou příslušné rozkladné reakce znemožňují. Jednou z takových možností je náhrada esterových vazeb kyseliny fosforečné typu C-O-P(O)-enzymově neštěpitelnými izostemími fosfonomethyletherovými 55 vazbami typu O-C-P(O)-, s výhodu použití při vývoji analogů nukleosidů s protivirovým

-2CZ 292199 B6 ůČinkěm (viz např. CS OA 233 665 a 264 222, CZ patent 285 420, US 5 141 051, 5 142 051, 3 641 763, Japan 2 937 532 a další; pro přehled viz např. A. Holý, E. De Clercq and I. Votruba, Phosphonylmethyl ethers of nukleasides and their acyclic analogues. In Nucleotide Analogues as Antiviral agents. (Ed. Martin J. C.) pp. 51-71, Američan Chemical Society, ACS Symposium Series 1989. A. Holý, H. Dvořáková and J. Jindřich, Antiviral Acyclic Nucleotide Analogues. In Antibiotics and Antiviral Compounds. (Eds. Kroh K., Kirst H. A. and Maag, H.) pp. 455-462, Weinheim/New York, Verlag Chemie 1993. A. Holý, Isopolar Phosphorus-ModifiedNucleotide Analogues. In Advances in Antiviral Drug Design. (Ed. E. De Clercq) pp. 179-232, greenwich, CT (USA), JAI press, lne. 1994).

Hexadecylester fosfocholinu (milftefosin) může jako fosfodiester snadno podléhat štěpení esterových vazeb fosforečné kyseliny jedna na fosfocholin, jednak na hexadecylfosfát, při čemž oba rozkladné produkty nemají žádoucí biologický účinek. Tuto nevýhodu odstraňuje předmětný vynález, který popisuje nové analogy alkylesterů fosfocholinu, alkylesteiy O-fosfonomethylcholinu s mastným alifatickým řetězcem, způsobem jejich přípravy a použití.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je O-fosfonomethylcholin vzorce I

(i) a jeho alkylestery obecného vzorce Π

(11), kde R je alkylová skupina odvozená od primárního alkoholu s počtem 8 až 16 atomů uhlíku.

Význakem předloženého vynálezu je také způsob přípravy látek podle vynálezu.

Klíčovou látkou celé toto skupiny je O-fosfonomethylcholin vzorce I

(l), kterou lze způsobem podle vynálezu snadno připravit z dialkylesteru 2-chlorethoxymethylfosfonové kyseliny obecného vzorce ΙΠ

CICH₂CH₂OCH₂P(O)(OR')₂ (ΠΙ), kde R' je alkylový zbytek s 2 nebo 3 atomy uhlíku,

-3CZ 292199 B6 tím, že se uvede do reakce s roztokem dimethylaminu ve vodě nebo organickém rozpouštědle, s výhodou v ethanolu, při teplotě 100 až 120 °C, získaný produkt obecného vzorce IV (CH₃)2N-CH₂CH₂OCH₂P(O)(OR')₂ (IV ), kde R' má stejný význam jako ve vzorci ΙΠ, se zbaví současně vzniklého hydrochloridu dimethylaminu vytřepáním vodou v roztoku směsi v organickém rozpouštědle (s výhodou v benzenu nebo toluenu), a po odpaření rozpouštědla ve vakuu se získaný olejovitý produkt uvede buď přímo nebo v roztoku v inertním organickém rozpouštědle (s výhodou v benzenu nebo chlorovaných rozpouštědel), do reakce s methyljodidem, při teplotách 0 až 100 °C. Kvartemizační reakce je silně exotermická, při vyšší koncentraci reaktantů není reakční směs třeba zahřívat. Kvartémí sůl obecného vzorce V [(CH₃)₃N-CH₂CH₂OCH₂P(O)(OR')₂]T ( V ), kde R' má stejný význam jako ve vzorci ΙΠ, která se vyloučí ze směsi, se za vyloučení vlhkosti odsaje, promyje vysušeným etherem a zbaví etheru ve vakuu. Poté se uvede do reakce s bromtrimethylsilanem v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou v acetonitrilu, chlorovaných rozpouštědlech či v dimethylformamidu, obvykle po dobu 10 až 16 hodin při teplotě místnosti. Reakční doba lze zkrátit zahříváním, až na teplotu 100 °C. Po odstranění rozpouštědel ve vakuu se reakční směs rozloží vodou, slabě alkalizuje vodným amoniakem a směs se po odpaření těkavých podílů zbaví anorganických solí. K tomu účelu lze s výhodou použít silně bazického anexu (např. Dowexu 1 v acetátovém cyklu), z něhož se látka eluuje vodou nebo zředěnými roztoky těkavé kyseliny (např. kyseliny octové). Po odpaření se látka vzorce I izoluje jako dobře krystalický zwitter-ion krystalizací.

Výchozí dialkylestery 2-chlorethoxymethylfosfonové kyseliny obecného vzorce ΙΠ jsou dobře dostupné např. reakcí 2-chlorethyl chlormethyletheru s odpovídajícím trialkylfosfitem. Zvláště s ohledem na stabilitu esterové vazby při reakci s dimethylaminem lze s výhodou použít diizopropylesteru, jehož příprava je popsána např. v práci A. Holý, J. gůnter, H. Dvořáková, M. Masojídková, g. Andrei, R. Snoeck, J. Balzarini and E. De Clarcq, Structure-antiviral activity relationship in the series of pyrimidine andpurine N-[2-(2-phosphonomethoxy)ethyl]nucleotide analogues. 1. Derivatives substituted and the carbon atoms of the base. J. Med. Chem, 42, 2064-2086 (1999).

Jinou alternativou přípravy O-fosfonomethylcholinu je přímá reakce chlorderivátu vzorce Π s trimethylaminem za vzniku látky typu V. Nevýhodou je však v tomto případě kromě nepříjemných vlastností trimethylaminu jeho silná bazicita, která může působit rozpad esterových vazeb a snížení výtěžku. Dvoustupňová metoda založená na přípravě dimethylaminoderivátu a jeho následné kvartemizaci probíhá téměř kvantitativně v obou stupních, je málo náročná na technické provedení a nevyžaduje složité čištění meziproduktu. Metoda má obecnou platnost, takže ji lze použít i pro jiné reaktivní halogenidy, mesyláty, trifluormethansulfonáty a podobná alkylační činidla, schopná kvartemizovat látky vzorce Π a připravit tak analogy látky vzorce I, odvozené od analogů cholinu s nesymetrickým terciárním aminovým zbytkem.

Přímá esterifikace např. působením obvyklých činidel typu A.ňT-dicyklohexylkarbodiimidu, aktivujících fosfomonoesteiy, není pro zwitteriontové sloučeniny použitelná. Ani reakce dvojsodné soli látky I s alkylhalogenidy nedává uspokojivé výtěžky žádaných produktů. Pro přípravu esterů O-fosfonomethylcholinu obecného vzorce Π lze s výhodou použít postup obdobný přípravě alkylesterů fosfocholinu: látka vzorce I se nejprve ve vodném roztoku převede neutralizací jedním ekvivalentem vodného roztoku tetraalkylamoniumhydridu na monotetraalkylamoniovou sůl. S výhodu se k tomu účelu použije sůl tetrabutylamonná [P. Knopik, K. S. Bruzik, W. J. Stec. OPI Briefs 23, 214-216 (1991)]. Po odpaření a vysušení se tato sůl uvede do reakce s alkylhalogenidem v organickém inertním rozpouštědle. S výhodou se reakce provede

-4CZ 292199 B6 š alkylbromidem, a to v acetonitrilú při teplotě varu. Potřebné alkylbromidy jsou obvykle snadno komerčně dostupné. Reakci lze nadbytkem alkylhalogenidu dovést do konce vzhledem k výchozí látce I. Jediným vedlejším produktem reakce je tetrabutylamoniumbromid. uvedená metoda má obecnou použitelnost nejen pro přípravu primárních alkylesterů O-fosfonomethylcholinu, ale lze ji stejně dobře použít i pro syntézu esterů O-fosfonomethylcholinu s alkoholy sekundárními. Alkylestery O-fosfonomethylcholinu se v závislosti na charakteru alkylesterové skupiny v některých případech vyloučí přímo ze směsi v dostatečně čistém stavu nebo je lze dodatečně čistit krystalizací. Obecně lze pro oddělení tetrabutylamoniumbromidu použít chromatografii surové směsi na sloupci silikagelu. Kvartémí sůl se eluuje směsí chloroformu a methanolu (4:1), kdežto alkylestery O-fosfonomethylcholinu obecného vzorce Π lze ze silikagelu eluovat až methanolem.

Jinou možností přípravy esterů O-fosfonomethylcholinu podle vynálezu je aktivace matečné zwitteriontové sloučeniny vzorce I působením vilsmeier-Haack-Amoldova činidla (dimethylchlormethylenamoniumchloridu), buď připraveného předem (např. reakcí dimethylformamidu s fosgenem, thionylchloridem nebo oxalylchloridem) nebo činidlem vznikajícím in šitu, např. reakcí trifosgenu (trichlormethylchlorkarbonátu) s dimethylformamidem, a následujícím působením přebytku alifatického alkoholu (P. Alexander, A. Holý and M. Masojídková, Preparation of 9-(2-Phosphonomethoxyethyl)adenine Esters as Potential Prodrugs. Collect. Czech. Chem. Commun. 59, 1853-1869 (1994)). Výhodou této varianty je nižší cena alifatického alkoholu ve srovnání s alkylbromidem a možnost pracovat přímo s látkou i bez nutnosti jejího převádění na kvartémí amoniovou sůl, nevýhodou je nutnost práce v bezvodém prostředí, vysoká cena aktivačního činidla a obtížně kontrolovatelný průběh exotermní aktivační reakce.

Hlavní oblastí použití alkylesterů O-fosfonomethycholinu je jejich možný protinádorový účinek. Ten byl prokázán u hexadecylesteru a tetradecylesteru na modelu in vivo, vyhodnocujícím progresi transplantovaného SD lymfomu u inbredních potkanů. Sledování hmotnosti lymfomu bylo zjištění, že po lOtidenní terapii při aplikaci látky lx denně v dávce 10 mg/kg do místa rostoucího lymfomu se u hexadecylesteru O-fosfonomethylcholinu dosáhne 30 - 40% snížení hmotnosti lymfomu oproti kontrolní skupině neléčených pokusných zvířat.

Analogy esterů fosfocholinu s mastnými alkoholy mohou mít i další významné použití v chemoterapii. Je známo, že miltefosin (hexadecylfosfocholin) má význačný terapeutický účinek na střevní formu leishmaniázy, onemocnění vyvolaného parazitem Leishmania donovani přenášeným mouchou Phlebotomus (horečka kala-azar v indii postihuje 3 miliony pacientů ročně, neléčená má až 98% mortalitu, ale i při existujícím léčení umírá ročně více než 1000 lidí) [R. Schmidt-Ott, T. Klenner, P. Overath and T. Aebischer, Topical treatment with hexadecylphosphocholine (Miltex) efficiently reduces parasite burden in experimental cutaneous leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 93, 85-90 (1999); S.S undar, F. Rosenkaimer, M. K. Makharia, A. K. goyal, A. K. Mandal, A. Voss, P. Hilgard and H. W. Murray, Trial of oral miltefosine for visceral leishmaniasis with miltefosine. Ann, Trop, med Parasitol 93, 589-597 (1999); B.L. Herwaldt, Miltefosine - The long-awaited therapy for visceral leishmaniasis- New Engl. J. Med. 341,1840-1842 (1999).

Struktura předmětných látek, charakterizovaná jejich zwitteriontovým charakterem na jedné straně a přítomností lipofilního esterově vázaného zbytku na straně druhé, také jednoznačně předurčuje jejich význam jako potenciálních tenzidů.

V dalším je příprava látek podle vynálezu a jejich biologický účinek doložen na příkladech, aniž se tím jakkoli omezuje.

-5CZ 292199 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Příprava O-fosfonomethylcholinu

Směs diizopropylesteru 2-chlorethoxymethylfosfonové kyseliny (50 g, 0,193 mol) a 30% roztoku dimethylaminu v ethanolu (140 ml) se zahřívá v autoklávu na 120 °C 24 hodin a odpaří se ve vakuu. Kolejovitému odparku se v 500-ml baňce s magnetickým míchadlem a zpětným chladičem za míchání rychle přidá 30 ml methyljodidu a směs se míchá do odeznění prudké reakce a potom ponechá stát 16 hodin při teplotě místnosti. Přidá se 200 ml absolutního etheru, směs se 20 min míchá, krystalický produkt se odsaje, promyje suchým etherem a vysuší ve vakuu. Získá se 46 g kvartémí soli V (R=izopropyl), t.t. 72 °C. Analýza: pro C12H29INO4P (409,24) vypočteno 35,22 % C, 7,14 % H, 31,04 % I, 3,42 % N, 7,57 % P; nalezeno 35,45 % C, 7,20% H, 31,56 % I, 3,58% N, 7,46 % P. 'H-NMR spektrum (CDC1₃): 4,72 dh, 2H, J(P,H)=7,7; J(H,H)=6,2 (2 x CH(CH₃)₂); 4,15 m; 2H (bT-CHj); 4,05 m; 2H (N-CH7-CH7-O); 3,82 d; 2H, J = 7,6 (P-CH2-O); 3,53 s; 9H [N^CH^]; 1,34 d; 12H [(CH^CH],

Tato látka se rozpustí v 250 ml acetonitrilu, přidá se 40 ml bromrimethylsilanu a ponechá se stát přes noc při teplotě místnosti. Poté se těkavé podíly odpaří ve vakuu, zbytek se kodestiluje toluenem (3 x 100 ml), přidá se 200 ml vody a znovu odpaří ve vakuu. Zbytek se v 200 ml vody neutralizuje přidáním Dowexu 1 x 2 v OřT-formě a výsledná suspenze se vlije na sloupec 200 ml téhož ionexu. Sloupec se promyje vodou (500 ml), spojené eluáty se odpaří, zbytek kodestiluje ethanolem (2 x 100 ml) a krystaluje z ethanolu. Získá se 23 g monohydrátu O-fosfonomethylcholinu, t.t. 265 °C. Analýza: pro C6H16NO4P.H2O (215,18) vypočteno 33,49% C, 8,43 % H, 6,51 % n, 14,39 % P; nalezeno 33,35 % C, 8,40 % H, 6,70 % N, 14,61 % P. 'H-NMR spektrum (D₂O + NaOD): 3,99 br s; 2H (N’-CH₂); 3,64 d; 2H, J = 8,9 (P-CH₂-O); 3,58 m; 2H (N-CH2-CH2-O); 3,17 s; 9H [řT(CH₃)₃].

Příklad 2 Příprava O-fosfonomethylcholinu

Směs diethylesteru 2-chlorethoxymethylfosfonové kyseliny (50 g) a 30% vodného roztoku dimethylaminu (100 ml) se zahřívá v autoklávu na 120 °C 8 hodin a odpaří se ve vakuu, zbytek se kodestiluje se 100 ml vody, přidá se 100 ml 20% KOH, extrahuje se benzenem (2 x 100 ml) a extrakt se pó vysušení uhličitanem draselným odpaří ve vakuu. K olejovitému odparu surové látky vzorce ΙΠ (R = ethyl) se v 500-ml baňce s magnetickým míchadlem a zpětným chladičem za míchání rychle přidá 30 ml methyljodidu a směs se míchá do odeznění prudké reakce a potom ponechá stát 16 hod při teplotě místnosti. Přidá se 200 ml absolutního etheru, směs se 20 min míchá, krystalický produkt se odsaje, promyje suchým etherem a vysuší ve vakuu. Získaná kvartémí sůl V (R-ethyl) se dále zpracuje stejně jako je uvedeno v příkladu 1. Získá se 18 g CMosfonomethylcholinu, t.t. 265 °C.

Příklad 3. Decylester O-fosfonomethylcholinu.

Roztok 4,3 g (20 mmol) hydrátu CMosfonomethylcholinu v 50 ml vody se neutralizuje 20% roztokem tetrabutylamoniumhydroxidu na pH 7,5, roztok se odpaří ve vakuu, zbytek se kodestiluje ethanolem (3 x 50 ml) a toluenem (2 x 50 ml) a suší přes noc při 13 Pa nad oxidem fosforečným. K odparku se přidá acetonitril (80 ml) a decylbromid (4,2 ml, 20 mmol). Směs se míchá magnetickým míchadlem 2 hodiny v uzavřené baňce a potom se zahřívá kvaru pod zpětným chladičem s chlorkalciovým uzávěrem za míchání další 3 hodiny. Směs se odpaří ve vakuu, zbytek se dekantuje opakovaně etherem (3 x 100 ml) a adsorbuje zmethanolu na 50 g silikagelu. Tento materiál se vnese na sloupec 400 ml silikagelu v chloroformu a elucí směsí chloroform - methanol (4:1) se vymyje tetrabutylamoniumbromid (TLC silikagel, chloroform - methanol 4:1, Rf 0,4). Poté se methanolem eluuje produkt, který se po odpaření míchá

-6CZ 292199 B6 s petróletherem a odsaje. Výtěžek 5,2 g, t.t. 131 °C. Analýza: pro 0ιβΗ₃₆Ν04Ρ (337,4) vypočteno 56,95 % C, 10,75 % H, 4,15 % N, 9,18 % P; nalezeno 56,85 % C, 11,00 % H, 3,98 % N, 9,02 % P. ‘H-NMR spektrum (CDC1₃): 4,19 m; 2H (JT-CHí); 3,80 q; 2H, J = 6,78 (P-O-CH₂);

3,74 m; 2H (N-CH,-€H,-O); 3,62 d; 2H, J = 6,1 (P-CH₂-O); 3,48 s; 9H [N*(CH₃)₃]; 1,55 m, 2H [-CH2-(CH₂)g-]; 1,24-1,31 m, 14 H HCH₂)H; 0,88 t, 3H, J = 7,0 HCHQr-CH,].

Příklad 4. Dodecylester O-fosfonomethylcholinu

4,3 g (20 mmol) O-fosfonomethylcholinu se převede na tetrabutylamononnou sůl způsobem popsaným v příkladu 3. K jejímu vysušenému odparku se přidá acetonitril (100 ml) a dodecylbromid (5,0 ml, 20,8 mmol). Směs se dále zpracuje způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 5,2 g dodecylesteru O-fosfonomethylcholinu, t.t. 243 °C. Analýza: pro C18H40NO4P (365,5) vypočteno 59,15 % C, 11,03 % H, 3,83 % N, 8,47 % P; nalezeno 58,95 % C, 11,20 % H, 3,95 % N, 8,32 % P. ’Η-NMR spektrum (CDC1₃): 4,18 m; 2H (N*-CH₂); 3,80 q; 2H, J = 7,1 (P-O-CH₂);

3,74 m, 2H (N-CHz-CHj-O); 3,62 d, 2H, J=6,l (P-CH₂-O); 3,49 s, 9H [N*(CH₃>3]; 1,55 m, 2H r-CH7-(CH₇)_in-l; 1,24-1,31 m, 18 H HCH₂)_1<r-]; 0,881, 3H, J=7,0 l-(CH>)in-CH₃l.

Příklad 5. Tetradecylester O-fosfonomethylcholinu

4,3 g (20 mmol) O-fosfonomethylcholinu se přivede na tetrabutylamonnou sůl způsobem popsaným v příkladu 3. K jejímu vysušenému odparku se přidá acetonitril (80 ml) a tetradecylbromid (6,0 ml, 20 mmol). Směs se dále zpracuje způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 5,6 g tetradecylesteru O-fosfonomethylcholinu, t.t. 244 °C. Analýza: pro C20H44NO4P (393,54) vypočteno 61,04 % C, 11,27 % H, 3,56 % N, 7,87 % P; nalezeno 60,95 % C, 11,34 % H, 3,81 % N, 7,81 % P. 'H-NMR spektrum (CDC1₃): 4,18 m, 2H (řT-CHz); 3,80 q, 2H, J = 6,7 (P-O-CH₂);

3,75 m, 2H (N-CII₂-CH₂-O); 3,62 d, 2H, J = 6,0 (PCH₂-O); 3,49 s, 9H [řT(CH₃)₃]; 1,55 m, 2H [-QMCH₂)₁₂-]; 1,25-1,30 m, 20 H [-(CH₂)₁₂-]; 0,88 ζ 3H, J = 7,0 [-(CHOia-CHj].

Příklad 6. Pentadecylester O-fosfonomethylcholinu

4,3 g (20 mmol) O-fosfonomethylcholinu se převede na tetrabutylamonnou sůl způsobem popsaným v příkladu 3. K jejímu vysušenému odparku se přidá acetonitril (80 ml) pentadecylbromidu (6,0 ml, 20,5 mmol). Směs se dále zpracuje způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 5,8 g tetradecylesteru O-fosfonomethylcholinu, t.t. 143 °C. Analýza: pro C21H46NO4P (407,57 ) vypočteno 61,89 % C, 11,38 % H, 3,44 % N, 7,60 % P; nalezeno 61,98 % C, 11,48 % H, 3,21 % N, 7,87 % P. 'H-NMR spektrum (CDC1₃): 4,19 m, 2H (N⁺-CH₂); 3,80 q, 2H, >7,1 (P-O-CH₂);

3,75 m, 2H (N-C^-CHz-O); 3,63 d, 2H, J = 6,2 (P-CHr-O); 3,49 s, 9H [N^CH^]; 1,56 m, 2H [-CHr-(CH₂)₁₃-]; 1,25-1,30 m, 24 H [_(CH₂)₁₃-]; 0,881, 3H, J = 7,0 HCH₂)₁₃-CH₁₃].

Příklad 7. Hexadecylester O-fosfonomethylcholinu

4,3 g (20 mmol) O-fosfonomethylcholinu se převede na tetrabutylamonnou sůl způsobem popsaným v příkladu 3. K jejímu vysušenému odparku se přidá acetonitril (100 ml) a hexadecylbromid (20,0 ml). Směs se dále zpracuje způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 5,9 g hexadecylesteru O-fosfonomethylcholinu, t.t. 144 °C. Analýza: pro C₂₂H4₈NO₄P (421,6) vypočteno 62,68 % C, 11,48 % H, 3,32 % N, 7,35 % P; nalezeno 62,80 % C, 11,64 % H, 3,25 % N, 7,47 % P. ’Η-NMR spektrum (CDC1₃): 4,20 m, 2H (N-CH₂); 3,81 q, 2H, J=6,7 (P-O-CH₂); 3,72 m, 2H (N-CH₂—CHj-O); 3,63 d, 2H, J = 6,0 (P-CHr-O); 3,49 (s, 9H [FT(CH₃)₃]; 1,56 m, 2H [-QMCHjju-]; 1,25-1,30 m, 26 H HCH₂)i₄-]; 0,881, 3H, J = 6,8 [-(CH^u-CH)].

Příklad 8. Tetradecylester CMosfonomethylcholinu.

K suspenzi jemně rozetřeného O-fosfonomethylcholinu (2,1 g, 0,01 mol) ve 100 ml dimethylformamidu v kulaté 500-ml baňce opatřené magnetickým míchadlem a uzávěrem proti přístupu vzdušné vlhkosti se po malých částech za míchání a chlazení ledovou lázní přidá 11,9 (0,04 mol) trichlormethylchlorkarbonátu („trifosgen“). Po ukončení prudké reakce se směs míchá do úplného rozpuštění (ca. 30 min), přidá se tetradekanol (21,5 g, 0,1 mol), směs se míchá do rozpuštění a ponechá stát při teplotě místnosti 2 dny. Potom se přidá za míchání 20 ml vody, těkavé podíly se odpaří ve vakuu při 50 °C a ke zbytku se přidá 200 ml vody. Zalkalizuje se přidáním konc. vodného amoniaku na pH 9, vytřepe se etherem (3 x 100 ml) a vodná fáze se zahustí ve vakuu za ca. 70 ml Tento roztok se nanese na sloupec (150 ml) Dowexu 1x2 (OH' forma), promytý vodou a sloupec se eluuje vodou (300 ml). Eluát se odpaří ve vakuu, zbytek se kodestiluje ethanolem (3 x 100 ml) a suší ve vakuu nad oxidem fosforečným. Odparek se míchá s petroletherem (100 ml), vykrystalovaný produkt se odsaje, promyje petroletherem (100 ml) a vysuší ve vakuu. Získá se 1,4 g tetradecylesteru CMosfonomethylcholinu, t.t. 244 °C. Analýza: pro C20H44NO4P (393,54) vypočteno 61,04% C, 11,27 % H, 3,56 % N, 7,87 % P; nalezeno 61,15 % C, 11,40 % H, 3,78 % N, 8,01 % P. 'H-NMR spektrum (D₂O + NaOD): 3,87 br s, 2H (N*-CH₂); 3,68 q, 2H, J = 6,5 P-O-CH₂); 3,49 d, 2H, J = 8,2 (P-CHr-O); 3,46 m, 2H (N-CHz-CHz-O); 3,06 s, 9H [bf (CH₃)₃]; 1,43 m, 2H í-CHMCHBh-I; 1,13 b, 22 H HCHOn-CH,].

Příklad 9. Stanovení cytostatického účinku alkylesterů CMosfonomethylcholinu.

Ke stanovení byly použity tři skupiny po čtyřech dvouměsíčních samcích SD/cub potkanů zvláštního chovu ve zvěřinci Biologického ústavu 1. lékařské fakulty UK v Praze. Průměrná hmotnost zvířete byl 300 g. Zvířatům bylo subkutánně injikováno 10⁶ buněk SD lymfomu do pravého boku. 10 dnů po injekci buněk lymfomu byla zahájena terapie, která spočívala v injekční aplikaci sterilního roztoku zkoumané látky (3 ml, 1 mg/ml, 1 x denně do místa rostoucího lymfomu), rozpuštěné v PBS pufrovaném na pH 7,2. Jedna z uvedených tří skupin zvířat sloužila jako kontrolní. Terapie byla ukončena po 10 dnech. 24 hodin po jejím ukončení byla zvířata usmrcena, lymfomy vyjmuty a zváženy. Hodnocení biologického účinku spočívá ve vyhodnocení poklesu průměrné hmotnosti lymfomu u zvířat, léčených zkoumanými látkami, ve srovnání s průměrnou hmotností lymfomu u kontrolní skupiny zvířat. Průměrné hodnoty hmotností, spolu se standardními odchylkami, statistickou průkazností vyjádřenou t-testem, a poklesem hmotnosti lymfomu vyjádřeným v procentech kontroly, jsou uvedeny v následující tabulce:

	O-Fosfonomethylcholin (Π)
	Kontrola	Tetradecylester	Hexadecylester
Hmotnost lymfomu (g)	13,45	9,375	7,95
Standardní odchylka	2,6177	3,5717	1,2894
t-test	—	0,08326	0,01357
Pokles hmotnosti (%)	0	30	41

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. O-Fosfonomethylcholin vzorce I

   H3C© H₃C-N - CH_Z CH_Z O- CH_r P- OH

   H₃CO©
2. 2. Alkylestery O-fosfonomethylcholinu obecného vzorce Π ©O

   H₃C-N-CH_zCH_rO-CH2- P-OR h₃c6© (D (lib kde R je alkylskupina odvozená od primárního alkoholu s počtem 8 až 16 atomů uhlíku.
3. 3. Způsob přípravy O-fosfonomethylcholinu vzorce I podle nároku 1,vyznačený tím, že se dialkylester 2-chlorethoxymethylfosfonové kyseliny obecného vzorce ΙΠ

   CICH₂CH2OCH₂P(O)(OR')2 (ΠΙ), kde R' je alkylový zbytek s 2 nebo 3 atomy uhlíku uvede do reakce s roztokem dimethylaminu ve vodě nebo v organickém rozpouštědle, s výhodou v ethanolu, při teplotě 100 až 120 °Č, získaný produkt obecného vzorce IV (CH₃)₂N-CH₂CH₂OCH₂P(O)(OR')₂ (IV ), kde R' má stejný význam jako ve vzorci ΙΠ se uvede buď přímo nebo v roztoku v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou v benzenu nebo chlorovaných rozpouštědlech, do reakce s methyljodidem, při teplotách 0 až 100 °C, získaný meziprodukt obecného vzorce V [(CH₃)₃N-CH₂CH₂OCH₂P(O)(OR')₂]T ( V ), kde R' má stejný význam jako ve vzorci ΙΠ se uvede do reakce s bromtrimethylsilanem v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou v acetonitrilu nebo chlorovaných rozpouštědlech, při teplotách 0 až 100 °C, po odstranění rozpouštědel se směs rozloží vodou a látka vzorce I se získá ionexovou chromatografií na krystalizací.
4. 4. Způsob přípravy alkylesterů obecného vzorce Π podle nároku 2, vyznačený tím, že se CMosfonomethylcholin vzorce I převede neutralizací jedním ekvivalentem hydroxidu tetraalkylaminiového, s výhodou tetrabutylamoniového, na mono-tetraalkylamoniovou sůl, která se po vysušení uvede do reakce s alkylhalogenidem obecného vzorce VI

   -9CZ 292199 B6

   R-X (VI), kde R má stejný význam jako ve vzorci Π a X je brom nebo jod, v organickém inertním 5 rozpouštědle, s výhodou v acetonitrilu, a látky obecného vzorce Π se izolují, s výhodou krystalizací nebo chromatografíí na silikagelu.
5. 5. Způsob přípravy alkylesterů obecného vzorce Π podle nároku 2, vyznačený tím, že se (λ-fosfonomethylcholin vzorce I uvede do reakce nejprve s dimethylchlormethyíenamonium-

   10 chloridem v dimethylformamidu a poté s alifatickým alkoholem, při teplotě místnosti, a látky obecného vzorce Π se izolují ionexovou chromatografíí.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že se O-fosfonomethylcholin vzorce I v dimethylformamidu uvede do reakce při teplotě místnosti s dimethylchlormethylenamonium-

   15 chloridem připraveným in šitu přidáním trichlormethylchlorkarbonátu.
7. 7. Alkylestery O-fosfonomethylcholinu obecného vzorce Π podle nároku 2 pro potlačení vzniku nebo růstu nádorů u zvířat a u člověka.