CZ289902B6 - Způsob zjią»ování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku a testovací zařízení pro provádění tohoto způsobu - Google Patents

Abstract

Zp sob zji ov n p° tomnosti enzymaticky aktivn hydrol zy ve vzorku zahrnuje um st n vzorku na prvn a druh² pevn² nosi , p°i em prvn pevn² nosi m hl sic enzym kovalentn k sob p°ipojen² tak, e tento hl sic enzym se uvol uje p soben m uveden hydrol zy, a druh² pevn² nosi , kter² nen ve styku s t mto prvn m nosi em, a m imobilizovan² na sob indik tor, p°i em uveden² indik tor je citliv² na zjistitelnou zm nu p soben m hl sic ho enzymu, kde uveden² vzorek je um st n takov²m zp sobem, e vzorek uv d do styku prvn a druh² pevn² nosi , tak e libovoln² hl sic enzym uvol ovan² libovolnou aktivitou hydrol zy p° tomnou v uveden m vzorku dovoluje difundovat t mto vzorkem do uveden ho druh ho pevn ho nosi e, pozorov n , zda dojde ke zjistiteln zm n indik toru, kter je indikac p° tomnosti enzymaticky aktivn hydrol zy ve vzorku. Je tak pops no za° zen k prov d n tohoto zp sobu.\

Description

Způsob zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku a testovací zařízení pro provádění tohoto způsobu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku a zařízení pro provádění tohoto způsobu.

Dosavadní stav techniky

Candida albicans a jiné Candida species způsobují známé lékařsky významné infekce. Orální kandidióza (dále též candidiasis) je na příklad velmi známá u pacientů s nedostatečnou imunitou. Vulvovaginální kandidióza je nadto nejčastějším onemocněním v porodnictví a gynekologii. Odhaduje se, že přibližně tři čtvrtiny všech dospělých žen trpí alespoň jednou výskytem této nemoci (De Bemardis a kol., J. Kliň. Microbiol. 29(11). 2598 až 2603 (1989)). Vzhledem k tomuto široce rozšířenému výskytu byl věnován rozsáhlý výzkum zaměřený k pochopení etiologie kandidiózy.

Výzkum ukázal, že Candida albicans a ostatní Candida species mají etiologickou účast v lidské kandidióze a nyní se má všeobecně za to, že kandidióza je způsobena především přítomností Candida albicans. Dále je nyní do značné míry zřejmá úloha aspartové proteázy (dále též proteázy kyseliny aspartové) nebo (zaměnitelně) kyselé proteinázy jako virulenčního faktoru Candida albicans. Je známo, že čisté kultury Candida albicans vylučují aspartovou proteázu, jsou-li pěstovány za přesně definovaných podmínek. Podobně je známo, že čisté kmeny Candida albicans, izolované od žen s příznaky vulvovaginitidy, uvolňují tento enzym, nechají-li se následně růst v prostředí specificky definované kultury.

Antigen kyselé proteinázy Candida albicans, to je antigen proteázy kyseliny asparagové, byl detekován imunologicky ve vaginální tekutině všech žen, od nichž byl vulvovaginální Candida albicans izolován (de Bemardis a kol., Abstrakt č. F-91 vAbstracts of the Annual Meeting of the Američan Society for Microbiology (Anaheim, CA 1990)). Avšak koncentrace antigenu kyselé proteinázy Candida albicans byla významně vyšší u pacientek se symptomatickou vulvovaginální kandidiózou než u asymptomatických nosičů. Koncentrace tohoto antigenu ve vaginální tekutině žen s kandidiózou je přibližně 176± 15,2ng/ml, zatímco koncentrace tohoto antigenu ve vaginální tekutině žen bez izolace Candida albicans, to je bez klinické kandidiózy, je menší než 2 ng/ml. Asymptomatické nosiče Candida albicans mají střední hladiny antigenu 94 ± 18,5 ng/ml. Tyto poznatky silně naznačují, že kyselá proteináza (to je proteáza kyseliny asparagové) se podílí na pathogenesi vulvovaginální kandidióze. O asparagové proteáze Candida albicans je však známo, že je za tělní teploty nestabilní. Kromě toho detekce antigenu proteázy kyseliny asparagové imunologicky neindikuje, zda je enzym přítomen v enzymaticky aktivní formě.

Kyselá proteináza Candida albicans je mimobuněčnou proteázou kyseliny asparagové. Proteázy kyseliny asparagové jsou hlavní třídou proteáz. Obsahují jeden nebo několik klíčových zbytků kyseliny asparagové, jež jsou potřeba k aktivitě. Asparagová proteáza Candida albicans má širokou specifičnost proteinového substrátu, která zahrnuje například albumin, hemoglobin, kasein, immunoglobin A a mnoho jiných proteinů. Tento enzym funguje optimálně v kyselých podmínkách (to je při hodnotě pH 2,5 až 5,5) a je rychle inaktivován při vysokých hodnotách pH (to je při hodnotě pH 7,5). Asparagová proteáza Candida albicans je silně inhibována pepstatinem, není však inhibována thiolovými reagenciemi, chelatačními činidly nebo inhibitory serinové proteázy.

Mnoho farmaceutických společností a čelných akademiků studuje inhibitory proteázy kyseliny asparagové k potenciálnímu terapeutickému použití. Jejich úsilí je však ztěžováno chybějícím vhodným enzymovým testem proteáz kyseliny asparagové. Zatímco pro některé serinové, thiolové, metallové, kyselé a zásadité proteázy a peptidázy jsou k dispozici jednoduché kolorimetrické testy, nejsou k dispozici pro proteázy kyseliny asparagové. Substrátová specifičnost této zvláštní třídy enzymů vyžaduje přítomnost několika hydrofobních aminokyselin. Tato vlastnost silně bránila hledání jednoduchých syntetických chromogenických substrátů, jelikož hydrofobní aminokyseliny, jež slouží jako substrát pro asparagovou proteázu, se jak je známo obtížně rozpouštějí ve vodě. Výsledkem je, že chromogenické substráty pro asparagovou proteázu nejsou obchodně dostupné, obtížně se syntetizují a charakterizují a ve vodě se špatně rozpouštějí. Konečným důsledkem těchto nedostatků je, že enzymová aktivita, definovaná těmito chromogenickými substráty, je extrémně nízká a kolorimetrické testy na asparagovou proteázu jsou tudíž spíše necitlivé. Podobně byly pro asparagové^- proteázy popsány fluorogenické látky, které však také mají omezenou užitečnost. Předně, jak bylo shora uvedeno, vyžaduje substrátová specifičnost této zvláštní třídy enzymů přítomnost několika hydrofobních aminokyselin, pro které jsou tyto substráty relativně nerozpustné. Za druhé, při nízkých dosažitelných koncentracích těchto substrátů se fluorogenické látky hydrolyzují velmi pomalu a fluorogenické testy jsou tudíž časově náročné. Kromě toho obsahují mnohé biologické vzorky fluorescentní materiály, které mohou interferovat s fluorogenickými testy na asparagové proteázy.

Vzhledem k nedostatku vhodných kolorimetrických a fluorogenických testů k zjištění asparagových proteáz, používá se obvykle spektrofotometrických zkoušek v ultrafialové (UV) oblasti k testování přítomnosti této zvláštní třídy enzymů. Při typických spektrofotometrických zkouškách v ultrafialové oblasti se přidává asparagová proteáza do roztoku proteinu (jako například hemoglobinu nebo albuminu) a směs se inkubuje při teplotě 30 až 37 °C po dobu 0,5 až 4 hodiny. Po inkubaci se přidá do zmrazené inkubační směsi studená koncentrovaná kyselina trichloroctová (TCA) k vysrážení nespotřebovaného proteinu, čímž zůstanou v roztoku peptidy absorbující ultrafialové světlo. Nakonec se vysrážený nespotřebovaný protein peletuje odstředěním po dobu přibližně jedné hodiny za teplot zmrazení, supematant se odsaje a zjistí se jeho optická hustota při 280 nm naznačující rozsah hydrolýzy proteinu. Ačkoli je možno této zkoušky použít ke zjištění aspartové proteázy, je tento test jak časově náročný, tak pracný.

Je znám EP 244 932, zaměřující se výlučně na stanovení enzymaticky aktivní endoglykosidázy a značného substrátu, který nachází použití při stanovení zhoubného bujení při rakovině. V tomto dokumentu však nikde není popsán nebo alespoň navržen vícestupňový způsob umístění vzorku do testovacího zařízení a jednoduché zjišťování výsledku. Také se v tomto dokumentu neuvažuje s detekcí kandidiózy a Trichomonas vaginalis, ani s detekcí inhibitoru hydrolázy.

Dosud tedy nebyl vyvinut pohodlný, jednoduchý a na místě proveditelný test ke zjištění přítomnosti enzymaticky aktivní aspartové proteázy. Proto je úkolem vynálezu nalézt způsob testování přítomnosti enzymaticky aktivní aspartové proteázy, který by čelil problémům a nedostatkům dosavadního stavu techniky. Způsob podle tohoto vynálezu se dále také hodí k testování přítomnosti ostatních známých hydrolytických enzymů, to je hydroláz.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydroláza ve vzorku, který spočívá v

a) umístění tohoto vzorku na první a druhý pevný nosič, přičemž první pevný nosič má hlásiči enzym kovalentně k sobě připojený tak, že tento hlásiči enzym se uvolňuje působením uvedené hydrolázy, a druhý pevný nosič, který není ve styku s tímto prvním nosičem, a má imobilizovaný na sobě indikátor, přičemž uvedený indikátor je citlivý na zjistitelnou změnu působením hlásícího enzymu, kde uvedený vzorek je umístěn takovým způsobem, že vzorek uvádí do styku

-2CZ 289902 B6 první a druhý pevný nosič, takže libovolný hlásiči enzym uvolňovaný libovolnou aktivitou hydrolázy přítomnou v uvedeném vzorku dovoluje difundovat tímto vzorkem do uvedeného druhého pevného nosiče, a

b) pozorování, zda dojde ke zjistitelné změně indikátoru, která je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy v uvedeném vzorku.

Podle výhodného provedení způsobu hydrolázou je proteáza vybraná ze souboru zahrnujícího aspartovou proteázu, serinovou proteázu, thiolovou proteázu, metaloproteázu, kyselé proteázy a alkalické proteázy.

Výhodný je způsob podle vynálezu, ve kterém uvedeným hlásícím enzymem je peroxidáza a detekce kandidiózy se provádí zjišťováním přítomnosti enzymaticky aktivní aspartové proteázy ve vzorku, jehož podstata spočívá v

a) uvedení uvedeného vzorku do styku s pevným nosičem, který obsahuje hlásící enzym na sobě imobilizovaný tak, že hlásiči enzym se uvolňuje působením aspartové proteázy,

b) kombinování uvedeného vzorku, poté co se uvedl do styku s uvedeným pevným nosičem, s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu po působení uvedeného hlásícího enzymu, a

c) pozorování zda dojde ke zjistitelné změně indikátoru, přičemž tato zjistitelná změna je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní aspartové proteázy v tomto vzorku a tím kandidiózy.

Podle jiného výhodného provedení způsob zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vorku, k detekci Trichomonas vaginalis zjišťováním přítomnosti enzymaticky aktivní thiolové proteázy ve vzorku, spočívá v

a) uvedení tohoto vzorku do styku s pevným nosičem, který obsahuje hlásiči enzym imobilizovaný na něm tak, že hlásící enzym se uvolňuje po působení thiolové proteázy,

b) kombinování uvedeného vzorku, poté co se uvedl do styku s uvedeným pevným nosičem, s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu po působení uvedeného hlásícího enzymu, a

c) pozorování zda dojde ke zjistitelné změně indikátoru, přičemž tato zjistitelná změna je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní thiolové proteázy ve vzorku a tím Trichomonas vaginalis.

Způsob popsaný výše je vždy výhodný, pokud hlásiči enzym sestává z peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy nebo glukuronidázy, zejména pak pokud hlásiči enzym sestává z peroxidázy křenu selského.

Podle výhodného provedení způsobu podle tohoto vynálezu pevným nosičem je nerozpustná základní hmota, gel nebo pryskyřice, přičemž pevný nosič zahrnuje celulózu, agarózu, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, oxiran akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z kůže hovězího dobytka, peptidoglykan ze stěn bakteriálních buněk nebo jeho fragmenty, nylon, polyethylentereftalát, polykarbonát nebo sklo s řízenou velikostí pórů.

Při způsobu podle tohoto vynálezu je výhodné, pokud hlásiči enzym je imobilizován na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro enzymaticky aktivní hydrolázu nebo proteázu, jakož i pokud spojovníkovou molekulou je protein nebo peptid. Proteinem je s výhodou azokasein, kasein, kappa-kasein, imunoglobulin, hemoglobulin, myoglobin, albumin, elastin, keratin nebo kolagen.

-3CZ 289902 B6

Je výhodné, pokud při způsobu podle tohoto vynálezu zjistitelnou změnou je změna barvy po působení hlásícího enzymu, který se uvolňuje z pevného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou nebo proteázou.

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu také spočívá v tom, že hlásiči enzym je schopen katalyzovat tvorbu fluorescenčního signálu, fosforescenčního signálu, bioluminiscenčního signálu, chemoluminiscenčního signálu nebo elektrochemického signálu, po svém uvolnění zpěvného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou nebo proteázou. Zvláště výhodně hlásiči enzym je schopen vytvářet zónu sraženiny, aglutinace, precipitace nebo vyčeření, zejména hlásícím enzym je peroxidáza a indikátorem je vizuální chromogenní indikátor.

Při výhodném provedení způsobu chromogenní indikátor obsahuje peroxid vodíku a guajakol, kyselinu 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou), tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin nebo kyselinu 4,5-dihydronaftalen-2,7-disulfonovou.

Předmětný vynález bude dále podrobněji osvětlen v širších souvislostech.

S překvapením bylo zjištěno, že enzymaticky aktivní aspartová proteáza Candida albicans je přítomna ve vaginální tekutině žen trpících vulvovaginální kandidiózou. Dále se zjistilo, že přítomnost enzymaticky aktivní aspartové proteázy ve vzorku může sloužit jak indikátor k detekci a diagnóze kandidiózy. Na základě těchto poznatků byl tudíž nyní vyvinout již zmíněný způsob k detekci kandidiózy testováním na přítomnost enzymaticky aktivní aspartové proteázy ve vzorku.

Při tomto způsobu se vzorek, například vaginální tekutina, uvádí do styku s pevným nosičem. Pevný nosič, se kterým přijde vzorek do styku, má hlásiči enzym (to je enzym vyvolávající signál), jenž je na něm imobilizován (znehybněn). Hlásiči enzym je na pevném nosiči imobilizován tak, že se z něho uvolní působením enzymaticky aktivní asparagové proteázy, pokud je enzymaticky aktivní asparagové proteáza skutečně ve vzorku obsažena. Poté, když přijde vzorek do styku s pevným nosičem, kombinuje se s indikátorem. Indikátorem je jakákoli chemická látka, jež je schopna viditelné nebo zjistitelné změny (jako je například změna barvy) vlivem působení hlásícího enzymu. Jestliže po kontaktu se vzorkem prodělá indikátor zjistitelnou změnu, je enzymaticky aktivní asparagová proteáza přítomna ve vzorku a lze tudíž říci, že je přítomna kandidióza.

Před tímto vynálezem neexistoval rychlý a přímý prostředek k testování přítomnosti enzymaticky aktivních asparagových proteáz nebo, což je významnější, přítomnosti kandidiózy. Spektrofotometrické, fluorogenické a imunologické zkoušky byly použity k testování přítomnosti aktivity asparagové proteázy, avšak tyto zkoušky jsou časově náročné, pracné a nevhodné k použití pro neškolený personál kliniky. Podobně může být Candida albicans zjišťována pěstováním vzorku v definovaném prostředí nebo mikroskopií na mokré cestě. Proces pěstování kultur je časově velice náročný (to je trvá přibližně 48 hodin) a oba postupy vyžadují nákladné zařízení a rozsáhlé školení. Na rozdíl od jmenovaných testů je způsob testování přítomnosti enzymaticky aktivní asparagové proteázy podle vynálezu a vzápětí kandidiózy rychlý, přesný, levný a snadno použitelný.

Technologie uvolňování hlásícího (reporterového) enzymu, na níž je test asparagové proteázy založen, může být také použito k testování přítomnosti jakéhokoli aktivního hydrolytického enzymu včetně - bez záměru na jakémkoliv omezení: proteáz (nebo zaměnitelně) proteináz, peptidáz, lipáz, nukleáz, homo-oligosacharidáz, hetero-oligosacharidáz, homo-polysacharidáz, hetero-polysacharidáz, fosfatáz, sulfatáz, neuraminidáz a esteráz. Byly tudíž nyní vyvinuty způsoby testování přítomnosti enzymaticky aktivních hydroláz ve vzorku.

-4CZ 289902 B6

Při těchto způsobech se uvádí do styku vzorek s pevným nosičem. Pevný nosič, se kterým přijde vzorek do styku, má hlásící enzym (to je enzym vyvolávající signál), jenž je na něm znehybněn. Hlásící enzym je na pevném nosiči znehybněn tak, že se z něho uvolní působením hydrolázy, pokud je enzymaticky aktivní hydroláza skutečně ve vzorku přítomna. Poté, když přišel vzorek do styku s pevným nosičem, kombinuje se s indikátorem. Indikátorem je jakákoli chemická látka, jež je schopna viditelné nebo zjistitelné změny, obvykle změny barvy, vlivem působení hlásícího enzymu. Zjistitelná změna v indikátoru je znamením, že enzymaticky aktivní hydrolýza je ve vzorku přítomna. Naopak chybějící zjistitelná změna v indikátoru je znamením, že enzymaticky aktivní hydroláza ve vzorku chybí. Podobně jako u testu enzymaticky aktivní asparagové proteázy a kandidiózy jsou způsoby podle vynálezu testování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku rychlé, přesné, levné a snadno použitelné.

Kromě toho technologie uvolňování hlásícího enzymu, na níž jsou uvedené způsoby podle vynálezu založeny, může být také použito k testování přítomnosti inhibitoru jakéhokoli známého hydrolytického enzymu včetně - bez záměru na jakémkoliv omezení: inhibitorů proteáz (nebo zaměnitelně) proteináz, peptidáz, lipáz, nukleáz, homo-oligosacharidáz, hetero-oligosacharidáz, homo-polysacharidáz, hetero-polysacharidáz, fosfatáz, sulfatáz, neuraminidáz a esteráz. Byl tudíž nyní vyvinut způsob testování přítomnosti inhibitoru hydroláz ve vzorku.

Při těchto způsobech se uvádí do styku vzorek s cílovou hydrolázou a s pevným nosičem. Pevný nosič, se kterým přijde vzorek do styku, má hlásiči enzym (to je enzym vyvolávající signál), jenž je na něm znehybněn. Hlásiči enzym je na pevném nosiči znehybněn tak, že se z něho uvolní působením cílové hydrolázy, pokud není cílová hydroláza inaktivována vlivem přítomnosti inhibitoru hydrolázy. Poté, když přišel vzorek do styku s cílovou hydrolázou a s hlásícím enzymem, kombinuje se s indikátorem. Indikátorem je jakákoli chemická látka, jež je schopna viditelné nebo zjistitelné změny, obvykle změny barvy, vlivem působení hlásícího enzymu, jestliže se hlásiči enzym uvolní z pevného nosiče cílovou hydrolázou. Pokud ve vzorku není inhibitor cílové hydrolázy, uvolní cílová hydroláza hlásiči enzym z nosiče, čímž způsobí zjistitelnou změnu indikátoru. Jestliže naopak je ve vzorku přítomen inhibitor hydrolázy, je cílová hydroláza inhibována, hlásiči enzym se z pevného nosiče neuvolní a v indikátoru se nevytvoří zjistitelná změna nebo odezva. Podobně jako u shora popsaných způsobů, jsou způsoby testování přítomnosti inhibitoru hydrolázy ve vzorku rychlé, přesné, levné a snadno použitelné.

Vedle způsobů testování přítomnosti enzymaticky aktivní asparagové proteázy a aktivit jiných hydrolytických enzymů, je nyní vyvinuto suché, uzavřené zkušební zařízení k testování vzorku na přítomnost kandidiózy testováním na přítomnost enzymaticky aktivní asparagové proteázy. Kromě toho je také vyvinuto suché uzavřené zkušební zařízení k testování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku. Tato zkušební zařízení jsou kombinací hlásícího enzymu, znehybněného na pevném nosiči, indikátoru a jednoho nebo několika reakčních činidel v suchém tvaru v laminované destičce s vnitřní komůrkou, přičemž komůrka je prázdným prostorem pro vložení vzorku. Pro vhodnost jsou části destičky a umístění funkčních chemikálií popsány od referenční sestavy, kdy destička je ve vodorovné poloze, což je poloha, kterou bude destička nej pravděpodobněji zaujímat za použití. Jestliže je destička v této poloze, zejména výhodné destičky podle vynálezu, což jsou tenké ploché struktury, vkládá se vzorek do komůrky otvorem v horní části destičky. Pokud jde o lamináty tvořící destičku, je nevrchnější laminát v této poloze, kterým se vkládá vzorek, nazýván vrchní laminát destičky, přičemž spodní povrch tohoto laminátu tvoří horní povrch komůrky. Podobně je nejspodnější laminát destičky nazýván spodní laminát destičky, přičemž spodní laminát tvoří dolní povrch komůrky. Tenké okraje po obvodě tohoto vrchního a spodního laminátu se nazývají boční okraje destičky a tenké boční konce komůrky podél okrajů jejího horního a dolního povrchu jsou nazývány boční stěny komůrky. Oblasti kteréhokoli daného povrchu ksobě vzájemně přivrácené v téže vodorovné rovině se nazývají horizontálně sousedící, zatímco laminát umístěný přímo nad druhými lamináty vytvářející rovnoběžné vodorovné roviny se označuje jako vertikálně sousedící.

-5CZ 289902 B6

Jak vrchní, tak spodní, čili oba lamináty destičky jsou vyrobeny z materiálu propouštějícího světlo, s výhodou průhledného. Hlásiči enzym znehybněný na pevném nosiči, indikátor a ostatní složky a reakční činidla, potřebná ke zkoušce, jsou uspořádány v jednom nebo v několika laminátech uvnitř komůrky, buď jako povlaky na horním povrchu komůrky, jako povlaky na dolním povrchu komůrky, nebo na obou povrchách komůrky. Indikátorem je jakákoli chemická látka, jež je schopna viditelné nebo zjistitelné změny, obvykle změny barvy, vlivem působení hlásícího enzymu, když je uvolněn z pevného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou, jejíž přítomnost se zjišťuje. Laminát, obsahující indikátor, může být na horním nebo dolním povrchu komůrky. V tomtéž laminátu, jako je indikátor, může být jedno nebo několik reakčních činidel potřebných ke zkoušce, nebo může být v separátních laminátech na témže povrchu nebo na protilehlém povrchu. Podle některých výhodných provedení vynálezu je indikátor obsažen v laminátu, umístěném přímo pod stěnou propouštějící světlo a hlásiči enzym, znehybněný na pevném nosiči, je obsažen v laminátu umístěném na protější stěně.

Reakční činidla, zaujímající polohu na laminátech, mohou být volena tak, že k provedení zkoušky stačí vložit vzorek a minimální počet přídavných reakčních činidel, například vývojky, podle obzvlášť výhodných provedení obsahují lamináty všechna potřebná reakční činidla kromě vzorku, takže provedení zkoušky nevyžaduje nic jiného než vložení vzorku.

Všechny lamináty jsou před stykem se vzorkem pevnými vrstvami a laminát obsahující indikátor má s výhodou složení, jež je nerozpustné v tekutém vzorku, pro který je zkouška určena, takže indikátor zůstává v laminátu po celou dobu trvání zkoušky. Pro vzorky ve vodném nebo vodou rozpustném prostředí je proto výhodným indikátorovým laminátem buď vodou nerozpustný indikátor, nebo indikátor obsažený v matrici, která je nerozpustná ve vodě. Jestliže je indikátor tudíž obsažen v tenkém koncentrovaném laminátu přímo pod průsvitnou stěnou, dojde ke změně indikátoru, která je detekovatelná přes průsvitnou stěnu v krátkém časovém úseku, což vede jak k vysoké citlivosti, tak k rychlému výsledku.

Způsob podle vynálezu může být upraven a používán ke zkouškám velmi rozmanitých hydroláz ve zkušebních vzorcích z rozmanitých zdrojů. Kromě toho může být způsob podle vynálezu upraven a používán ke zkouškám velmi rozmanitých inhibitorů hydroláz. Zkouška může zahrnovat buď jednotlivou reakci, nebo sled reakcí vrcholících ve zjistitelné změně v indikátoru a počet a typy reakčních činidel a reakcí se budou měnit od jedné zkoušky ke druhé v závislosti na tom, která hydroláza se zjišťuje. V některých případech se nejlepších výsledků dosáhne, jsouli reagující látky před aplikací rozděleny mezi horní a dolní povrch komůrky tak, že jsou od sebe odděleny mezerou, dokud se mezera nevyplní zkoušeným vzorkem. V jiných případech mohou být reagující látky umístěny ve společné vrstvě nebo ve dvou nebo více oddělených, avšak svisle sousedících vrstvách na horním nebo dolním povrchu komůrky, beze ztráty spolehlivosti zkoušky. Ve všech případech jsou však vrstvy vytvářeny a uspořádány tak, že reakce vrcholící ve zjistitelné změně indikátoru nastane pouze, když je komůrka naplněna zkušebním vzorkem a tak, že když nastane změna indikátoru, je alespoň soustředěna a s výhodou omezena na vrstvu bezprostředně přilehlou k průsvitné stěně.

Podle výhodného provedení vynálezu zahrnuje zkušební zařízení zabudovanou pozitivní kontrolu a/nebo zabudovanou negativní kontrolu, jež jsou aktivovány přidáním jediného vzorku. Aktivace těchto kontrol nastává současně s prováděním zkoušky a zjistitelné indikace (jako například změna barvy nebo chybějící změna barvy) reprezentující obě kontroly a zkoušku se dosáhne jediným vnesením vzorku do zkušebního zařízení a jsou zjistitelné průsvitnou stěnou. Kontroly jsou ve zkušebním zařízení umístěny v polohách, jež horizontálně sousedí se zkušební oblastí s příslušnými indiciemi na horním a dolním povrchu zařízení, s výhodou na horním povrchu zařízení, k identifikování kontrol a k odlišení jich od zkoušky. Kontroly samy sestávají obecně z dalších vrstev obsahujících reakční činidla nebo jiné vhodné látky, jež buď vyvolají zjistitelnou změnu v indikátoru samy o sobě, nebo zabrání výskytu změny a učiní tak pouze, když je vzorek přítomen a ještě nezávisle na přítomnosti nebo nepřítomnosti podezírané hydrolázy ve vzorku. Opět volba těchto kontrol a chemický mechanismus, jímž fungují, stejně jako volba umístění

-6CZ 289902 B6 těchto vrstev na těmže povrchu komůrky jako indikátor nebo na protějším povrchu, se bude měnit od zkoušky ke zkoušce.

Další výhodná provedení vynálezu jsou založena na přídavných význacích ke zlepšení provádění zkoušky. U vzorků na vodné bázi zabudování povrchově aktivního činidla do vrstev bezprostředně přivrácených k mezeře, jež se plní vzorkem, podpoří smočení vrstev vzorkem a rychlé a stejnoměrné zaplnění komůrky. Povrchově aktivním činidlem může být samotná funkční ingredience ve vrstvě nebo kombinace se zkušebním reakčním činidlem ve vrstvě. S výhodou jsou obě strany mezery povlečeny vrstvami obsahujícími povrchově aktivní činidlo. Ve zkušebním zařízení je vstupní otvor pro zavádění vzorku, aby bylo umožněno přímé zavedení vzorku do komůrky a ve výhodném provedení je v komůrce několik průduchů umístěných vzdáleně od vstupního otvoru, aby se dále usnadnilo vyplnění komůrky.

Ostatní význaky a přednosti vynálezu a jeho výhodného provedení objasňuje následující popis s připojenými obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je perspektivní pohled na ilustrované zkušební zařízení podle vynálezu.

Na obr. 2 je bokorys části zařízení podle obr. 1 v řezu.

Dále se popisují výhodná provedení vynálezu.

Vynález se týká způsobu testování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku, při kterém

a) se uvádí vzorek do styku s pevným nosičem obsahujícím na sobě imobilizovaný hlásící enzym, který se uvolňuje působením hydrolázy,

b) vzorek se po uvedení do styku s pevným nosičem kombinuje s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu působením hlásícího enzymu a

c) pozoruje se případná zjistitelná změna indikátoru, která je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku.

Pojmem „hydroláza“ je zde označován enzym, kteiý katalyzuje hydrolytické reakce. Způsobu podle vynálezu je možno použít k testování přítomnosti kteréhokoli známého hydrolytického enzymu. Takovými hydrolytickými enzymy, to je hydrolázami jsou bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy (nebo zaměnitelně) proteinázy, peptidázy, lipázy, nukleázy, homooligosacharidázy, hetero-oligosacharidázy, homo-polysacharidázy, hetero-polysacharidázy, fosfatázy, sulfatázy, neuramidázy a esterázy. Podle výhodného provedení vynálezu je možno způsobu podle vynálezu použít k testování přítomnosti proteáz zahrnujících - bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy kyseliny asparagové, serinové proteázy, thiolové proteázy, metalloproteázy, kyselé proteázy a alkalické proteázy. Podle jiného výhodného provedení je možno způsobu podle vynálezu použít k testování přítomnosti homo-oligosacharidáz nebo hetero-oligosacharidáz, nebo homo-polysacharidáz nebo hetero-polysacharidáz včetně - bez záměru na jakémkoliv omezení chitináz, amyláz, cellulázy a lysozymu.

Pojmu „hlásiči enzym“ („recepter enzyme“) nebo (zaměnitelně) „signální enzym“ („markér enzyme“) je zde použito k označení enzymu vytvářejícího signál, to je enzymu, jehož aktivita vyvolává zjistitelnou změnu. Mezi takové enzymy patří bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, catalázy, ureázy a glukuronidázy. Při výběru hlásícího enzymu k použití

-7CZ 289902 B6 při způsobu podle vynálezu je rozhodující, aby hlásící enzym nepodléhal inaktivací kterýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivační hydrolýzy žádnou hydrolázovou aktivitou ve vzorku. Výběr vhodného hlásícího nebo signálního enzymu je pracovníkům v oboru znám. Současně jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy, jako například peroxidáza křenu.

Hlásiči enzym je znehybněn na pevném nosiči, to je na nerozpustném polymemím materiálu, anorganické nebo organické matrici, gelu, agregátu, precipitátu nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásiči enzym je uvolňován působením hydrolázy, jejíž přítomnost se testuje. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými nosiči podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sepharoza, oxiran, akrylové kuličky a polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polyethylenterftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Znehybnění hlásícího enzymu na pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Hlásiči enzym může být k pevnému nosiči připevněn přímo. V tomto případě slouží nerozpustný nosič přímo jako substrát pro hydrolázu. Jestliže se testuje jakožto hydroláza například chitináza, může být hlásící nebo značkový enzym (jako například křenový peroxidáza) připevněn přímo k nerozpustnému chitinu. V přítomnosti chitinázy se z pevného nosiče uvolní křenová peroxidáza. Podobně, jestliže se má jakožto hydroláza zjišťovat celuláza, může být hlásící nebo značkový enzym (jako například křenová peroxidáza) připevněn přímo k celulóze a v přítomnosti celulázové hydrolázy se z pevného nosiče uvolní křenová peroxidáza. Konečně, jestliže se má jakožto hydroláza zjišťovat lysozym, může být hlásící nebo značkový enzym, například křenová peridáza připevněn přímo k peptidoglykanu buněčných stěn bakterií a v přítomnosti lysozymové hydrolázy se z pevného nosiče uvolní křenová peroxidáza.

Nebo může být hlásící enzym znehybněn na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát při zjišťování hydrolázy. Mezi takové spojovníkové molekuly patří, bez záměru na jakémkoliv omezení: proteiny, uhlovodíky, lipidy, peptidy, estery anukleové kyseliny. Příslušná spojovníková molekula, použitá k připojení hlásícího enzymu k pevnému nosiči, závisí na tom, jaká hydroláza se zjišťuje a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru znám.

Pojmem „indikátor“ se zde vždy míní jakákoliv chemickou látku, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, když je ve vzorku přítomna enzymaticky aktivní hydroláza. Výsledná zjistitelná změna je indikací, že enzymaticky aktivní hydroláza je obsažena ve vzorku.

Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo signálního enzymu, je-li uvolněn zpěvného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou, jejíž přítomnost se zjišťuje. Nebo může být hlásiči enzym schopen katalyzovat vytváření signálu fluorescenčního, fosforescenčního, bioluminiscenčního, chemiluminiscenčního nebo elektrochemického signálu vlivem svého uvolnění z pevného nosiče působením hydrolázy. Přídavně může být hlásící enzym schopen vytvářet jiné viditelné nebo zjistitelné signály, zónu sraženiny, aglutinace, precipitace nebo vyčeření. V těchto případech by indikátorem byly chemické látky nebo substráty požadované hlásícím nebo signálním enzymem k vytvoření žádané zjistitelné změny.

Jako vizuálních indikátorů může být použito rozmanitých chromogenických indikátorů (to je chromogenů) a jiných druhů majících podobný účinek s křenovou peroxidázou jako hlásícím enzymem. Mezi výhodné chromogenické indikátory podle vynálezu patří peroxid vodíku achromogen, zahrnující - bez záměru na jakémkoliv omezení, jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu, tetramethylbenzidin, feno, 4-aminoantipyrin a 4,5-dihydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný

-8CZ 289902 B6 chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu. Guaiakol může být popřípadě před použitím vyčištěn, například rozpouštědlovou extrakcí. Nejvodnější chromogenický indikátor pro každý daný hlásiči enzym závisí na reakci nebo reakcích, které je hlásící enzym schopen katalyzovat nebo iniciovat a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru znám.

Je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor, je možno použít buď kapalný chromogenový, nebo pevný chromogenový systém. Použij e-li se kapalného chromogenového systému ke zjišťování peroxidáz, bude takový systém sestávat z rozpouštědla, z peroxidů vodíku a chromogenu schopného oxidace peroxidem vodíku v přítomnosti peroxidázy, jakou je například křenová peroxidáza. Použij e-li se alternativně pevného chromogenového systému, bude takový systém sestávat z peroxidů vodíku a chromogenu schopného oxidace peroxidem vodíku v přítomnosti peroxidázy a z pevného nosiče, kterým je chromogen napuštěn nebo znehybněn a vysušen. V tomto systému může být chromogen impregnován na sací papír nebo na nosič vytvořený pásky Hemoccult®, nebo může být alternativně chromogen uložen na plastu nebo jiném listu ve tvaru tenké vrstvy. Podle tohoto posledního provedení může být chromogen vrstven jako roztok obsahující polymemí materiál (jako například hydroxypropylcelulozu a ethylcelulozu). Je-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být zachycen v matrici materiálu, který je nerozpustný ve vodě. Nebo není-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být navrstven jako roztok v organickém rozpouštědle buď sám, nebo v kombinaci s vodou rozpustným nebo s vodou nerozpustným polymerem.

V pevném chromogenovém systému k detekci peroxidáz může být peroxid vodíku buď v pevném tvaru (jako je například titaniumhydroxyperoxid), nebo může být vytvořen in šitu. In šitu může být peroxid vodíku vytvořen například glukózou, okolním kyslíkem a glukozovou oxidázou. Alternativně může být peroxid vodíku vytvářen in šitu použitím vysušené vrstvy, vytvořené uložením suspense perborátu sodného v alkoholu. Při nízké hodnotě pH uvolňuje perborát sodný peroxid vodíku spontánně. V přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy po jejím uvolnění zpěvného nosiče hydrolázou se chromogen oxiduje a výsledkem je vizuálně zjistitelná změna barvy. Tato výsledná změna zabarvení je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku.

Tohoto způsobu stejně jako jiných způsobů podle vynálezu je možno použít k současnému testování přítomnosti dvou nebo několika aktivních hydroláz ve vzorku. Takový způsob používá směsi dvou nebo několika hlásících enzymů, znehybněných na pevném nosiči (nosičích) substrátovými vazbami, jež jsou citlivé na specifické hydrolázy a dvou nebo několika indikátorů a reakčních systémů k vytváření zjistitelné odezvy na každý z hlásících enzymů. Bylo by například možné použít způsobu podle vynálezu k současné detekci směsi proteáz, lipáz a polysacharidáz, čímž by bylo možno získat hydrolytický profil daného patogenního nebo chorobného procesu.

Nadto je pracovníkům v oboru zřejmé, že reakční podmínky (jako například volba spojovníkové molekuly nebo můstku, pevných nosičů, hodnoty pH, kapacity pufru, identity pufru, solí) způsobu podle vynálezu mohou být modifikovány a regulovány ke zvýšení specifičnosti hydrolázy a k rozlišení různých hydroláz přítomných ve vzorku. Je například známo, že určité hydrolázy fungují při nízké hodnotě pH a jsou inhibovány při vysoké hodnotě pH. Na rozdíl od toho fungují jiné hydrolázy při vysoké hodnotě pH a jsou inhibovány při nízké hodnotě pH. Řízením hodnoty pH je možno selektivně zjišťovat přítomnost příslušné hydrolázy. Kromě toho je pracovníkům v oboru jasné, že lze také použít při způsobu podle vynálezu specifických inhibitorů enzymů ke zvýšení aktivity hydrolázy a specificity a k rozlišení mezi odlišnými hydrolázami.

Vynález se také týká způsobu testování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku, přičemž tento způsob spočívá v umístění vzorku do zkušebního zařízení, které obsahuje první a druhý pevný nosič, přičemž první pevný nosič má na sobě znehybněný hlásiči enzym takovým

-9CZ 289902 B6 způsobem, že hlásiči enzym se uvolňuje působením hydrolázy a druhý pevný nosič, který není ve styku s prvním pevným nosičem, který má na sobě znehybněný indikátor, který je citlivý na zjistitelnou změnu vlivem působení hlásícího enzymu, přičemž vzorek je umístěn ve zkušebním zařízení tak, že se vzorek stýká s prvním a s druhým pevným nosičem tak, že každému hlásícímu enzymu, uvolněnému působením aktivity ve vzorku přítomné hydrolázy, je umožněno difundovat vzorkem k druhému pevnému nosiči; pozoruje se, zda indikátor prodělává zjistitelnou změnu, přičemž zjistitelná změna je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku.

Tohoto způsobu podle vynálezu je možno použít také k testování přítomnosti kteréhokoli známého hydrolytického enzymu. Takovými hydrolytickými enzymy, to je hydrolázami jsou bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy (nebo zaměnitelně) proteinázy, peptidázy, lipázy, nukleázy, homo-oligosacharidázy, hetero-oligosacharidázy, homo-polysacharidázy, heteropolysacharidázy, fosfatázy, sulfatázy, neuraminidázy a esterázy. Podle výhodného provedení vynálezu je možno způsobu podle vynálezu použít k testování přítomnosti proteáz zahrnujících bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy kyseliny asparagové, serinové proteázy, thiolové proteázy, metalloproteázy, kyselé proteázy a alkalické proteázy.

Hlásícím nebo signálním enzymem podle tohoto způsobu může být kterýkoli enzym vytvářející signál nepodléhající inaktivaci kterýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivační hydrolyzy aktivitou hydrolázy přítomné ve vzorku. Mezi takové enzymy patří bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Současně jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy, jako například peroxidáza křenu.

Hlásiči enzym je znehybněn na prvním pevném nosiči, to je na nerozpustném polymemím materiálu, to je anorganické nebo organické matrici, gelu, nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásící enzym se uvolňuje z pevného nosiče působením enzymaticky aktivní hydrolázy, jejíž přítomnost se testuje. Hlásící enzym může být k prvnímu pevnému nosiči připojen přímo, je-li pevným nosičem substrát pro hydrolázu, nebo alternativně může být hlásiči enzym, znehybněn na prvním pevném nosiči pomocí spojovníkové molekuly, kterou je substrát pro enzymaticky aktivní hydrolázu, která se zjišťuje. Mezi takové spojovníkové molekuly patří bez záběru na jakémkoliv omezení: proteiny, uhlovodíky, lipidy, peptidy, estery a nukleové kyseliny. Příslušná spojovníkové molekula, použitá k připojení hlásícího enzymu k pevnému nosiči, závisí na tom, jaká hydroláza se zjišťuje a výběr vdaném případě nečiní pracovníkům v oboru potíže. Znehybnění hlásícího enzymu na prvním pevném nosiči se provádí běžnými způsoby, známými pracovníkům v oboru.

Při tomto způsobu podle vynálezu je indikátor připojen k druhému pevnému nosiči, který není ve styku s prvním pevným nosičem. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodným prvním i druhým nosičem podle vynálezu celulóza, agaróza, dextran, polyakrylát, polyakiylamid nebo jejich deriváty, chitin, sepharoza, oxiran, akrylové kuličky, polymerní dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylentereftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Znehybnění vizuálního indikátoru na druhém pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, když je ve vzorku přítomna enzymaticky aktivní hydroláza. Výsledná zjistitelná změna indikátoru je indikací, že enzymaticky aktivní hydroláza je ve vzorku přítomna. Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo signálního enzymu, je-li uvolněn z pevného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou, jejíž přítomnost se zjišťuje.

-10CZ 289902 B6

Jako vizuálních indikátorů je možno použít chromogenních indikátorů (to je chromogenů) a jiných látek majících podobný účinek. Výhodnými chromogenickými indikátory pro hlásiči systémy podobné peroxidáze podle vynálezu jsou peroxid vodíku a chromogen zahrnující bez záběru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis(3ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5-dihydroxynaftalen-2,7-disulfonová kyselina. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modiý v oxidovaném stavu. Nejvodnější chromogenický indikátor pro každý daný hlásící enzym bude záviset na reakci nebo reakcích, které je hlásící enzym schopen katalyzovat nebo iniciovat a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý.

Je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor pro peroxidové reakce, používá se pevný chromogenový systém a takový systém sestává z peroxidu vodíku a chromogenů schopného oxidace peroxidy vodíku v přítomnosti peroxidázy a z pevného nosiče, na nějž je chromogen impregnován nebo znehybněn a vysušen. V tomto systému může být chromogen impregnován na sací papír nebo na nosič vytvořený pásky Hemoccult®, nebo může být alternativně chromogen uložen na plastu nebo jiném listu ve tvaru tenké vrstvy. Podle tohoto posledního provedení může být chromogen vrstven jako roztok obsahující polymemí materiál (jako například hydroxypropylcelulozu a ethylcelulozu). Je-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být zachycen v matrici materiálu, který je nerozpustný ve vodě. Alternativně není-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být navrstven jako roztok v organickém rozpouštědle buď sám, nebo v kombinaci s vodou rozpustným nebo s vodou nerozpustným polymerem. V pevném chromogenovém systému může být peroxid vodíku buď v pevném stavu (jako je například titaniumhydroperoxid), nebo může být vytvořen in šitu ve zkušebním zařízení. V přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy po jejím uvolnění z pevného nosiče hydrolázou se chromogen oxiduje a výsledkem je vizuálně zjistitelná změna barvy. Tato výsledná změna zabarvení je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je zjišťovanou hydrolázou enzymaticky aktivní proteáza kyseliny asparagové, přičemž způsob je založen na tom, že se umístí vzorek do zkušebního zařízení, jež obsahuje první a druhý pevný nosič, přičemž prvním pevným nosičem je polyakrylát mající na něm znehybněnou křenovou peroxidázu prostřednictvím myoglobinové molekuly, která je substrátem pro proteázu kyseliny asparagové a druhým pevným nosičem, kterým není ve styku s prvním pevným nosičem, je derivát celulózy, na němž je znehybněn peroxid vodíku a guajakol, což je chromatogenický substrát, který podléhá změně barvy působením křenové peroxidázy v přítomnosti peroxidu vodíku, přičemž vzorek se umístí do zkušebního zařízení takovým způsobem, že vzorek se uvede do styku s prvním i s druhým pevným nosičem tak, že veškeré křenové peroxidáze, uvolněné enzymaticky aktivní proteázou kyseliny asparagové přítomné ve vzorku, je umožněno difundovat vzorkem k druhému pevnému nosiči; a v pozorování, zda guaiakol změní barvu, přičemž změna barvy je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní proteázy ve vzorku.

Jak bylo shora uvedeno, pracovníkům v oboru je zřejmé, že ke zvýšení specifičnosti proteázy kyseliny asparagové je možno použít zvláštních reakčních podmínek (jako například volby spojovníkové molekuly, pevného nosiče, hodnoty pH, kapacity pufru, identity pufru, solí) a specifických inhibitorů. Například k testování proteázy kyseliny asparagové při hodnotě pH přibližně 2,5 až 5,0 je možno selektivně zjišťovat proteázy kyseliny asparagové mezi četnými thiolovými, serinovými, metallo- a alkalickými proteázami. Dále přidáním inhibitorů metalloproteáz, thiolových, serinových a kyselých nebo alkalických proteáz je možno selektivně zjišťovat proteázy asparagové kyseliny.

-11 CZ 289902 B6

Vynález se rovněž týká způsobu zjišťování kandidiózy testováním přítomnosti enzymaticky aktivní proteázy kyseliny asparagové ve vzorku, přičemž

a) se uvádí vzorek do styku s pevným nosičem obsahujícím znehybněný hlásiči enzym, který se uvolňuje působením proteázy asparagové kyseliny,

b) vzorek se po uvedení do styku s pevným nosičem kombinuje s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu působením hlásícího enzymu a

c) pozoruje se případná zjistitelná změna indikátoru, která je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní proteázy asparagové kyseliny ve vzorku a tudíž kandidiózy.

Hlásícím enzymem nebo značkovým enzymem použitým při způsobu podle vynálezu může být enzym vyvolávající signál, to je enzym, jehož aktivita vyvolává viditelnou nebo zjistitelnou změnu nepodléhající inaktivaci jakýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivující hydrolyzy kteroukoli proteázou kyseliny asparagové nebo kterékoli jiné hydrolázové aktivity přítomné ve vzorku. Mezi takové enzymy patří bez záběru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Výběr příslušného hlásícího nebo značkovacího enzymu je pracovníkům v oboru zřejmý. Při tomto způsobu podle vynálezu jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy. Zejména je vhodným hlásícím enzymem peroxidáza křenu, jelikož křenová peroxidáza není snadno hydrolyzována proteázou asparagové kyseliny nebo mnoha jinými známými proteázami, jež mohou být ve vzorku přítomny.

Hlásiči enzym je znehybněn na pevném nosiči, to je na nerozpustné matrici, gelu nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásící enzym se uvolňuje působením proteázy kyseliny asparagové. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými pevnými nosiči podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sepharoza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylenterftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Podle vynálezu jsou jako pevné nosiče vhodné: chitin, polyakrylát, celulóza a jejich deriváty a sepharoza. Znehybnění hlásícího enzymu na pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Hlásící enzym může být znehybněn na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro enzymaticky aktivní proteázu kyseliny asparagové. Mezi takové spojovníkové molekuly podle vynálezu patří bez záměru na jakémkoliv omezení: proteiny a peptidy, přičemž vhodnými spojovníkovými molekulami jsou proteiny. Pokud je spojovníkovou molekulou protein, patří mezi výhodné proteiny bez záměru na jakémkoliv omezení: azokasein, kasein, K-kasein, imunoglobuliny, hemoglobin, myoglobin, albumin, elastin, keratin a kolagen. Podle výhodného provedení vynálezu je spojovníkovou molekulou K-kasein, kasein, hemoglobin nebo myoglobin.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, když je ve vzorku přítomna enzymaticky aktivní proteáza asparagové kyseliny. Výsledná zjistitelná změna je indikací, že ve vzorku je přítomna enzymaticky aktivní proteáza asparagové kyseliny a přítomnost enzymaticky aktivní proteázy asparagové kyseliny opět indikuje přítomnost kandidiózy.

Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo signálního enzymu, je-li uvolněn zpěvného nosiče enzymaticky aktivní proteázou kyseliny asparagové. Nebo může být hlásiči enzym schopen katalyzovat vytváření signálu fluorescenčního, fosforescenčního, bioluminiscenčního, chemiluminiscenčního nebo elektrochemického signálu vlivem svého uvolnění zpěvného nosiče působením proteázy

-12CZ 289902 B6 kyseliny asparagové. Přídavně může být hlásiči enzym schopen vytvářet jiné viditelné nebo zjistitelné signály, zónu sraženiny, aglutinace, precipitace nebo vyčeření. V těchto případech by indikátorem byly chemické látky nebo substráty požadované hlásícím nebo signálním enzymem k vytvoření žádané zjistitelné změny.

Jako vizuálních indikátorů může být použito rozmanitých chromogenických indikátorů (to je chromogenů) a jiných druhů majících podobný účinek, je-li jako hlásícího nebo signálního enzymu použito peroxidáz. Mezi výhodné chromogenické indikátory podle vynálezu patří peroxid vodíku a chromogen, zahrnující bez záměru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5-dihydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu. Guaiakol může být popřípadě před použitím vyčištěn, například rozpouštědlovou extrakcí. Nejvodnější chromogenický indikátor pro každý daný hlásiči enzym závisí na reakci nebo reakcích, které je hlásiči enzym schopen katalyzovat nebo iniciovat a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý. Jak bylo shora uvedeno, je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor, je možno aplikovat buď kapalný chromogenový, nebo pevný chromogenový systém.

Vynález se rovněž týká způsobu zjišťování Trichomonas vaginalis testováním přítomnosti enzymaticky aktivní thiolproteázy ve vzorku, přičemž

a) se uvádí vzorek do styku s pevným nosičem obsahujícím znehybněný hlásiči enzym, který se uvolňuje působením enzymaticky aktivní thiolproteázy,

b) vzorek se po uvedení do styku s pevným nosičem kombinuje s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu působením hlásícího enzymu a

c) pozoruje se případná zjistitelná změna indikátoru, která je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní thiolproteázy ve vzorku a tudíž Trichomonas vaginalis.

Podobně jako u shora popsaných způsobů, může být hlásícím enzymem nebo signálním enzymem, použitým při způsobu podle vynálezu, enzym vyvolávající signál, to je enzym, jehož aktivita vyvolává viditelnou nebo zjistitelnou změnu nepodléhající inaktivaci kterýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivující hydrolýzy kteroukoli hydrolázovou aktivitou přítomnou ve vzorku. Mezi takové hlásiči enzymy patří bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Výběr příslušného hlásícího nebo značkovacího enzymu je pracovníkům v oboru zřejmý. Při tomto způsobu podle vynálezu jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy, zejména peroxidáza křenu.

Hlásiči enzym je znehybněn na pevném nosiči, to je na nerozpustné matrici, gelu nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásiči enzym se uvolňuje zpěvného nosiče působením enzymaticky aktivní thiolproteázy. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými pevnými nosiči podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sefaroza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylentereftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Podle vynálezu jsou jako pevné nosiče vhodné: chitin, polyakrylát, celulóza a jejich deriváty a sepharoza. Znehybnění hlásícího enzymu na pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Hlásiči enzym může být znehybněn na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro enzymaticky aktivní thiolproteázu. Mezi takové spojovníkové molekuly podle vynálezu patří bez záměru na jakémkoliv omezení: proteiny a peptidy, přičemž vhodnými spojovníkovými molekulami jsou proteiny. Pokud je spojovníkovou molekulou

-13CZ 289902 B6 protein, patří mezi výhodné proteiny bez záměru na jakémkoliv omezení: azokasein, kasein, K-kasein, imunoglobuliny, hemoglobin, myoglobin, albumin, elastin, keratin a kolagen. Při vhodném provedení podle vynálezu je spojovníkovou molekulou K-kasein, kasein, hemoglobin nebo myoglobin.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, když je ve vzorku přítomna enzymaticky aktivní thiolproteáza. Výsledná zjistitelná změna je indikací, že ve vzorku je přítomna enzymaticky aktivní proteáza asparagové kyseliny a přítomnost enzymaticky aktivní thiolproteázy kyseliny opět indikuje přítomnost Trichomonas vaginalis.

Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo signálního enzymu, je-li uvolněn zpěvného nosiče enzymaticky aktivní proteázou kyseliny asparagové. Nebo může být hlásící enzym schopen katalyzovat vytváření signálu fluorescenčního, fosforescenčního, bioluminiscenčního, chemiluminiscenčního nebo elektrochemického signálu vlivem svého uvolnění zpěvného nosiče působením thiolproteázy. Přídavně může být hlásící enzym schopen vytvářet jiné viditelné nebo zjistitelné signály, zónu sraženiny, aglutinace, precipitace nebo vyčeření. V těchto případech by indikátorem byly chemické látky nebo substráty požadované hlásícím nebo signálním enzymem k vytvoření žádané zjistitelné změny.

Jako vizuálních indikátorů může být použito rozmanitých chromogenických indikátorů (to je chromogenů) a jiných látek majících podobný účinek, je-li jako hlásícího nebo signálního enzymu použito peroxidáz. Mezi výhodné chromogenické indikátory podle vynálezu patří peroxid vodíku a chromogen, zahrnující bez záměru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5-dihydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu. Guaiakol může být popřípadě před použitím vyčištěn, například rozpouštědlovou extrakcí. Nejvodnější chromogenický indikátor pro každý daný hlásící enzym závisí na reakci nebo reakcích, které je hlásící enzym schopen katalyzovat nebo iniciovat a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý. Jak bylo shora uvedeno, je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor, je možno aplikovat buď kapalný chromogenový, nebo pevný chromogenový systém.

Podobně jako u testů s proteázou kyseliny asparagové, je možno použít některých reakčních podmínek a specifických inhibitorů ke zvýšení aktivity a specificky thiolproteázy. Je možno přidat například inhibitory (jako například pepstatin k inhibování proteáz kyseliny asparagové, inhibitor trypsinu sojových bobů k inhibování trypsinu, ethylendiamintetraoctová kyselina nebo jiná chelatační činidla k inhibování metallo-proteáz, nebo kteréhokoli ze známých v přírodě se vyskytujících inhibitorů nethiolových proteinových proteáz) k testování systému tak, aby pouze thiolové proteázy fungovaly a mohly být tudíž zjištěny. Kromě toho testováním při hodnotě pH přibližně 7,4 budou mnohé proteázy aktivní, avšak proteázy kyseliny asparagové budou inaktivovány.

Je důležité poznamenat, že technologie uvolňování hlásícího enzymu podle vynálezu je možno použít také ke zjišťování přítomnosti nebo nepřítomnosti inhibitoru hydrolázy ve vzorku. Četné biologické procesy, včetně například regulace krevního tlaku, srážení krve, bakteriální replikace zahrnují použití velmi specifických, pečlivě modulovaných hydroláz. Kromě toho je známo, že například četné drogy, pesticidy a herbicidy fungují prostřednictvím inhibování specifických hydroláz. Za určitých okolností je velmi žádoucí určit například koncentraci terapeutické drogy inhibující hydrolázu v krvi nebo stanovit přítomnost potenciální kontaminace inhibitoru hydrolázy pesticidy ve výrobě. V těchto případech je proto nutno zjišťovat inhibitor hydrolázy spíše než hydrolázu samotnou.

-14CZ 289902 B6

Vynález se proto rovněž týká způsobu testování přítomnosti inhibitoru cílové hydrolázy ve vzorku, přičemž (a) se uvádí vzorek do styku s cílovou hydrolázou a s pevným nosičem, přičemž na nosiči je nepohyblivě nasazen hlásiči enzym, který se uvolňuje působením cílové hydrolázy, není-li cílová hydroláza inaktivována přítomností inhibitoru, (b) kombinuje se vzorek s indikátorem po svém uvedení do styku s cílovou hydrolázou a s pevným nosičem s indikátorem, přičemž indikátor je citlivý na zjistitelnou změnu působením hlásícího enzymu, (c) pozoruje se, zda indikátor prodělává zjistitelnou změnu, přičemž tato zjistitelná změna je indikací nepřítomnosti inhibitoru cílové hydrolázy ve vzorku.

Ke zjištění přítomnosti inhibitoru hydrolázy ve vzorku se začlení do zkušebního systému definované množství cílové hydrolázy a provedení zkoušky zahrnuje zjišťování schopnosti vzorku inhibovat cílovou hydrolázu. V případě, že se inhibitor cílové hydrolázy ve vzorku nenachází, uvolní cílová hydroláza hlásiči enzym z pevného nosiče, čímž způsobí zjistitelnou změnu v indikátoru. Naopak, je-li inhibitor cílové hydrolázy ve vzorku přítomen, cílová hydroláza je inhibována, hlásiči enzym se z pevného nosiče neuvolní a v indikátoru se nevytvoří zjistitelná změna nebo odezva. Není nutno, aby inhibitor ve vzorku inhiboval do systému přidanou cílovou hydrolázu úplně. Požaduje se pouze, aby se projevila dostatečná míra inhibice cílové hydrolázy, aby to vyvolalo patrný rozdíl v očekávané zjistitelné odezvě.

Tohoto způsobu podle vynálezu je možno použít k testování přítomnosti nebo nepřítomnosti kteréhokoli známého inhibitoru hydrolytického enzymu včetně - bez záměru na jakémkoliv omezení: inhibitorů proteáz (nebo zaměnitelně) proteináz, peptidáz, lipáz, nukleáz, homooligosacharidáz, hetero-oligosacharidáz, homo-polysacharidáz, hetero-polysacharidáz, fosfatáz, sulfatáz, neuraminidáz a esteráz. Podle výhodného provedení vynálezu je možno způsobu podle vynálezu použít k testování přítomnosti inhibitorů proteáz zahrnujících bez záměru na jakémkoliv omezení: inhibitory proteáz kyseliny asparagové, inhibitory serinových proteáz, inhibitory thiolových proteáz, inhibitory metalloproteáz, inhibitory kyselých proteáz a inhibitory alkalických proteáz. Podle dalšího výhodného provedení je možno způsobu podle vynálezu použít k testování přítomnosti inhibitorů proteáz kyseliny asparagové, jako jsou například pepstatin ovomakroglobulin, haloperidol, transitní státní mimetika, U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 a A-7003. U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 a A-7003 jsou experimentální drogy, jež byly nedávno popsány v literatuře. Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se zjišťuje přítomnost pepstatinu jakožto inhibitoru proteázy kyseliny asparagové.

V souladu s tímto způsobem podle vynálezu patří mezi cílové hydrolázy bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy, proteinázy, peptidázy, lipázy, nukleázy, homo-oligosacharidázy, hetero-oligosacharidázy, homo-polysacharidázy, hetero-polysacharidázy, fosfatázy, sulfatázy, neuraminidázy a esterázy. Příslušná cílová hydroláza použitá při uvedeném způsobu závisí na tom, který inhibitor se zjišťuje a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý. Je-li například zjišťovaným inhibitorem pepstatin, pak je cílovou hydrolázou použitou ve shora popsaném zkušebním systému proteáza asparagové kyseliny.

Hlásícím enzymem nebo signálním enzymem, použitým při tomto způsobu podle vynálezu, může být jakákoliv enzym vyvolávající signál, to je enzym, jehož aktivita vyvolává viditelnou nebo zjistitelnou změnu nepodléhající inaktivaci jakýmkoliv činidlem ve vzorku, včetně inaktivující hydrolýzy cílovou hydrolázou, jež je začleněna do zkušebního systému. Mezi takové enzymy patří bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Výběr

-15CZ 289902 B6 příslušného hlásícího nebo signálního enzymu je pracovníkům v oboru zřejmý. Při tomto způsobu podle vynálezu jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy a zejména peroxidáza křenu.

Hlásiči enzym je znehybněn na pevném nosiči, to je na nerozpustné matrici, gelu nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásiči enzym se uvolňuje působením cílové hydrolázy z pevného nosiče, není-li cílová hydroláza inaktivována přítomností inhibitoru. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými pevnými nosiči, podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sefaroza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylenterftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů.

Hlásiči enzym může být znehybněn na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro en2ymaticky aktivní cílovou proteázu. Mezi takové spojovníkové molekuly podle vynálezu patří bez záměru na jakémkoliv omezení: proteiny, uhlohydráty, lipidy, peptidy, estery a nukleové kyseliny. Příslušná spojovníková molekula, použitá k připojení hlásícího enzymu k pevnému nosiči, závisí na tom, která cílová hydroláza byla přidána do zkušebního systému a výběr v každém daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, jestliže enzymaticky aktivní cílová hydroláza není inaktivována přítomností inhibitoru ve vzorku. Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo signálního enzymu, je-li uvolněn z pevného nosiče enzymaticky aktivní cílovou hydrolázou za předpokladu, že enzymaticky aktivní cílová hydroláza není inaktivována přítomností inhibitoru ve vzorku.

Jako vizuálních indikátorů může být použito rozmanitých chromogenických indikátorů (to je chromogenů) a jiných látek, majících podobný účinek. Mezi výhodné chromogenické indikátory podle vynálezu pro peroxidáze podobné hlásiči enzymy, patří peroxid vodíku a chromogen, zahrnující bez záměru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5-dihydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu. Jak bylo shora popsáno, je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor, je možno použít buď kapalného chromogenního systému, nebo pevného chromogenního systému.

Zařízení pro provádění způsobu zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku spočívá podle vynálezu v tom, že sestává z krabičky vymezené alespoň zčásti první a druhou protilehlou stěnou s povrchy, mezi nimiž je mezera směřujícími dovnitř, přičemž první stěna /nebo druhá stěna jsou z průsvitného materiálu; ze hlásícího enzymu znehybněného na pevném nosiči na dovnitř směřujícím povrchu první nebo druhé stěny tak, že hlásiči enzym je uvolňován působením hydrolázy;

z indikátoru obsaženého na dovnitř směřujícím povrchu první a druhé stěny, přičemž indikátorem je látka citlivá na zjišťovanou změnu vyvolanou působením hlásícího systému;

a z otvoru v krabičce k zavádění vzorku.

Podle vynálezu je krabička s výhodou plochá a je tak velká, aby se dala snadno držet rukou. Komůrka v krabičce je s výhodou plochá a současně mělká, její šířka a délka je značně větší než její hloubka, jež je v podstatě stálá. Komůrka je s výhodou dostatečná mělká, aby bylo umožněno

-16CZ 289902 B6 spontánní navlhčení stěn komůrky vzorkem k dosažení maximálního styku mezi vzorkem a suchými reagenčními povlaky na horním a dolním povrchu. To je obzvláště důležité, jsou-li povlaky reakčních činidel na horním i dolním povrchu komůrky. V takových případech také malá konstantní vzdálenost mezi těmito povrchy minimalizuje difuzní vzdálenost, kterou difundují reakční činidla na protilehlém povrchu, na němž je nanesen vizuální indikátor, aby dospěla k indikátoru.

V rámci těchto úvah není hloubka komůrky pro vynález rozhodující a může se měnit. Ve většině případů bude nejlepší výsledky dávat komůrka s hloubkou 0,076 až 1,27 mm, s výhodou 0,127 až 0,371 mm. Pro každou danou hloubku budou stranové rozměry komůrky (to je vzdálenost mezi bočními stěnami) definovat velikost vzorku, který může zkušební zařízení pojmout a nejsou jinak důležité, kromě toho, že definují tvar a velikosti viditelné zkušební plošky na vnějším povrchu zkušebního zařízení. Stranové rozměry mají tudíž zabezpečit zkušební plochu dostatečně velkou, aby byla vidět a přesto dostatečně malou, aby komůrka mohla být úplně zaplněna vzorkem rozumné velikosti. Velikost vzorku se bude měnit podle typu vzorku a jeho zdroje a způsobu odběru vzorku. U typických konstrukcí se uvažuje o stranové ploše komůrky přibližně 0,1 až 10 cm², nebo s výhodou přibližně 0,3 až 3 cm². Vnitřní objem komůrky u typických konstrukcí se bude měnit podobně a u většiny vzorků bude nejvhodnější a nejpohodlnější objem přibližně 3 μΐ až 300 μΐ.

Zkušebního zařízení podle vynálezu je možno použít k testování přítomnosti jakéhokoli známého hydrolytického enzymu, přičemž se bez záměru na jakémkoliv omezení uvádějí: proteázy, proteinázy, peptidázy, lipázy, nukleázy, homo-oligosacharidázy, hetero-oligosacharidázy, homo-polysacharidázy, hetero-polysacharidázy, fosfatázy, sulfatázy, neuraminidázy a esterázy. Podle výhodného provedení vynálezu je možno zkušebního zařízení použít k testování přítomnosti proteáz zahrnujících - bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy kyseliny asparagové, serinové proteázy, thiolové proteázy, metalloproteázy, kyselé proteázy a alkalické proteázy. Podle jiného výhodného provedení je možno zkušebního zařízení použít k testování přítomnosti homo-oligosacharidáz, hetero-oligosacharidáz, homo-polysacharidáz, hetero-polysacharidáz včetně - bez záměru na jakémkoliv omezení chitináz, amyláz, celluláz a lysozymu.

Hlásícím nebo značkovacím enzymem podle tohoto způsobu může být kterýkoli enzym vytvářející signál, to je enzym, jehož aktivita přináší zjistitelnou změnu, nepodléhající inaktivaci kterýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivní hydrolyzy aktivitou hydrolázy přítomné ve vzorku. Mezi takové enzymy patří - bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Současně jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy, jako například peroxidáza křenu.

Hlásící enzym je znehybněn na prvním pevném nosiči, to je na nerozpustném polymemím materiálu, to je anorganické nebo organické matrici, gelu, nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásiči enzym je uvolňován z pevného nosiče působením enzymaticky aktivní hydrolázy, jejíž přítomnost se testuje. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými pevnými nosiči podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sefaroza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylenterflaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Znehybnění vizuálního indikátoru na prvním pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Hlásiči enzym může být k prvnímu pevnému nosiči připojen přímo, nebo alternativně může být hlásiči enzym znehybněn na prvním pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro enzymaticky aktivní cílovou hydrolázu. Mezi takové spojovníkové molekuly podle vynálezu patří bez záměru na jakémkoliv omezení: proteiny, uhlohydráty, lipidy, peptidy, estery a nukleové kyseliny. Příslušná spojovníková molekula, použitá k připojení

-17CZ 289902 B6 hlásícího enzymu k prvnímu pevnému nosiči závisí na tom, která cílová hydroláza se zjišťuje a výběr v každém daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý.

U zkušebního zařízení podle vynálezu je indikátor znehybněn na druhém pevném nosiči, který není v přímém styku s prvním pevným nosičem. Bez záměru na jakémkoliv omezení se jako vhodné pevné nosiče podle vynálezu uvádějí celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakiylamid nebo jejich deriváty, chitin, sefaroza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylenterftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Znehybnění vizuálního indikátoru na prvním pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, když je ve vzorku přítomna enzymaticky aktivní hydroláza. Tato zjistitelná změna je indikací, že enzymaticky aktivní hydroláza je ve vzorku přítomna. Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo značkovacího enzymu, je-li uvolněn zpěvného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou, jejíž přítomnost se zjišťuje. Nebo může být hlásící enzym schopen katalyzovat vytváření signálu fluorescenčního, fosforescenčního, bioluminiscenčního, chemiluminiscenčního nebo elektrochemického signálu vlivem svého uvolnění zpěvného nosiče působením proteázy kyseliny asparagové. Přídavně může být hlásící enzym schopen vytvářet jiné viditelné nebo detekovatelné signály, zónu sraženiny, aglutinace, precipitace nebo vyčeření. V těchto případech by indikátorem byly chemické látky nebo substráty požadované hlásícím nebo značkovacím enzymem k vytvoření žádané zjistitelné změny.

Jako vizuálních indikátorů je možno použít rozmanitých chromogenních indikátorů (to je chromogenů) a jiných látek majících podobný účinek. Výhodnými chromogenickými indikátory pro hlásiči systémy pro peroxidázu podle vynálezu jsou peroxid vodíku a chromogen zahrnující bez záměru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis(3ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5—di— hydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu. Nejvhodnější chromogenický indikátor pro každý daný hlásiči enzym bude záviset na reakci nebo reakcích, které je hlásiči enzym schopen katalyzovat nebo iniciovat a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý.

Je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor pro peroxidové reakce, používá se pevný chromogenový systém a takový systém sestává z peroxidu vodíku a chromogenů schopného oxidace peroxidy vodíku v přítomnosti peroxidázy a z pevného nosiče, na který je chromogen impregnován nebo znehybněn a vysušen. V tomto systému může být chromogen impregnován na sací papír nebo na nosič vytvořený pásky Hemoccult®, nebo může být alternativně chromogen uložen na plastu nebo jiném listu ve tvaru tenké vrstvy. Podle tohoto posledního provedení může být chromogen vrstven jako roztok obsahující polymemí materiál (jako například hydroxypropylcelulózu nebo ethylcelulózu). Je-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být zachycen v matrici materiálu, který je nerozpustný ve vodě. Nebo není-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být navrstven jako roztok v organickém rozpouštědle buď sám, nebo v kombinaci s vodou rozpustným nebo s vodou nerozpustným polymerem.

V tomto zvláštním chromogenovém systému může být peroxid vodíku buď v pevném stavu (jako je například titaniumhydroperoxid), nebo může být vytvořen in šitu ve zkušebním zařízení. Nebo může být peroxid vodíku generován in šitu navrstvením suspense perborátu sodného v alkoholu na vnitřní čelní povrchy zkušebního zařízení. Při nízkých hodnotách pH uvolňuje perborát sodný peroxid vodíku spontánně. V přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy (například křenové

-18CZ 289902 B6 peroxidázy), při uvolňování z prvního pevného nosiče hydrolázou, je chromogen oxidován a výsledkem je vizuálně zjistitelná změna barvy. Jak bylo už shora uvedeno, je tato výsledná změna zabarvení je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že reakční podmínky (jako například volba spojovníkové molekuly nebo můstku, pevných nosičů, hodnoty pH, kapacity pufru, identity pufru, solí) zkušebního zařízení podle vynálezu mohou být modifikovány a regulovány ke zvýšení specifičnosti hydrolázy a k rozlišení různých hydroláz, jež mohou být přítomny ve vzorku. Kromě toho je odborníkům jasné, že lze také do nárokovaných zkušebních zařízení přidat specifické inhibitory enzymů ke zvýšení aktivity hydrolázy a specificity a k rozlišení mezi odlišnými hydrolázami ve vzorku.

Zkušební zařízení je opatřeno vstupem pro zavádění vzorku, jímž se vzorek do komůrky vkládá. S výhodou je vstup v téže stěně, kterou se pozorují změny vizuálního indikátoru, to je ve průsvitné stěně. Vstup má tvar přizpůsobený převodnímu zařízení, kterého se používá k přepravě vzorku z jeho zdroje a vstup se tudíž může měnit, aby vyhovoval různým typům převodních zařízení, kterých se může použít. Příklady převodních zařízení jsou stříkačky, pipety, tampony a vyšetřovací zrcátka. Pracovníkům v oboru jsou známa i jiná zařízení. Zpravidla je přiměřený kruhový vstup, ačkoli u převodních zařízení, jako jsou výtěrové tampony, může vstupní otvor mít ostrou hranu, o kterou se převodní zařízení otírá k snadnějšímu seškrábnutí vzorku.

*

Výhodná provedení zkušebního zařízení obsahují dodatečná opatření, která dále podporují proniknutí kapaliny k vyplnění komůrky a tím uvedení všech reakčních činidel do styku se vzorkem. Jedním takovým opatřením jsou průduchy v komůrce k umožnění úniku vzduchu. Průduchy jsou umístěny v přiměřených vzdálenostech od vstupního otvoru k dosažení maximální plochy povrchu zvlhčeného vzorkem. U zkušebních zařízení, do nichž jsou začleněny pozitivní a negativní kontroly uvnitř komůrky v polohách vodorovně přivrácených ke zkušební oblasti, je uspořádání průduchů takové, aby bylo zaručeno, že vzorek dospěje k oběma kontrolám a vyplní je k zabránění jakýchkoli falešných nebo pochybných odečtů. Jak bude o tom pojednáno dále, je jedním výhodným uspořádáním umístění zkušební oblasti mezi kontrolní prostory tak, že pozitivní a negativní kontrolní prostory se nestýkají na společném rozhraní, ačkoli mají společné rozhraní se zkušebním prostorem. Při tomto uspořádání je vstupní otvor nejvýhodněji umístěn ve stěně přímo nad zkušebním prostorem a jeden průduch je nad každým zobou kontrolních prostorů nebo v blízkosti jejich vnějšího obvodu, čímž je zaručeno, že se napřed vyplní zkušební prostor a pak oba kontrolní prostory.

Jiným opatřením podporujícím migraci kapaliny ve výhodných provedeních podle vynálezu je umístění povrchově aktivních činidel podél vnitřního povrchu komůrky. Činidlo může být na horním a/nebo na dolním povrchu komůrky a může být začleněno v podobě vysušeného roztoku v matrici nosiče tvořící většinou laminát nebo povlak na povrchu. V některých případech obsahuje laminát také jedno nebo několik činidel, jež se podílejí na reakcích. V jiných případech je povrchově aktivní činidlo pouze funkční součástí laminátu.

Povrchově aktivní činidla jsou užitečná u vzorků na vodné bázi, jakými biologické vzorky většinou bývají. Vhodnými povrchově aktivními činidly jsou činidla, jež lze získat v pevném tvaru a může být použito velmi rozmanitých látek, jež mají povrchově aktivní účinek. Těmi látkami bývají obecně detergenty, smáčedla nebo emulgátoiy a široce se liší chemickou strukturou a elektronickým charakterem, včetně látek aniontových, kationtových, obojetných a neiontových. Příkladem jsou alkylalkoxysulfáty, alkylaiylsulfonáty, glycerolové estery mastných kyselin, deriváty na bázi lanolinu, polyoxyethylenalkylfenoly, polyoxyethylenaminy, polyoxyethylenové mastné kyseliny a estery, polyoxyethylenové mastné alkoholy a estery, poly(ethylenglykol)mastné kyseliny a estery, polyoxyethylenové mastné estery a oleje, polyoxypropylen/polyoxyethylenové kondenzáty a blokové polymery, sorbitanové estery mastných kyselin, sulfoderiváty a sukcináty, alkylglukosidy a deriváty kyseliny cholové. Obchodní názvy některých z těchto látek jsou například Lubrol, Brij, Tween, Tergitol, Igepal, Triton a Teepol.

-19CZ 289902 B6

Vytvoření pevného laminátu, jak indikátoru, tak reakčních činidel je možné nanášením vrstveného materiálu v kapalné formě s následujícím vysušením nebo jiným převedením do pevného tvaru. Kapalnou formou látky může být například roztok, suspense nebo nevytvrzený stav látky a operace převedení do pevného stavu může být tudíž odpaření rozpouštědla nebo vytvrzení látky. Příslušná látka může být kombinována s přídavnými materiály k jednomu nebo k několika ůčelům, jako například:

(1) usnadnit nanesení kapaliny na povrch modifikováním viskozity kapaliny, (2) napomoci vytvořit souvislou hladkou pevnou vrstvu, která zůstane stejnoměrná a časem se nerozpadne nebo nezgranuluje vlivem aplikace dalších vrstev na ni, (3) modifikovat rozpustnost vrstvy rozpouštědly použitými ve vrstvách, jež mají být na ni naneseny nebo vytvořit vrstvu rozpustnou v rozpouštědlech, jež nerozpouštějí vrstvy nanesené vespod nebo všech těchto cílů současně.

Vhodnými aditivy, jež mají sloužit jednomu nebo všem těmto účelům, jsou rozpustné polymemí materiály. Příklady jsou celulóza a různé deriváty celulózy se substituenty přiměřeně vybranými k dosažení žádané rozpustnosti. U zkušebních zařízení, určených pro vodné vzorky nebo pro vzorky na vodné bázi, obsahuje indikátorový laminát s výhodou indikátor zachycený v matrici pevného materiálu, která je nerozpustná ve vodě. To zabraňuje migraci indikátoru z laminátu a dále od průsvitného povrchu. Nebo je však indikátor sám nerozpustný ve vodě a sám o sobě tvoří souvislý laminát, který zůstane nedotčen.

U provedení podle vynálezu, kde jsou ve zkušebním zařízení jak pozitivní, tak negativní kontrolní indikátor, se do každé kontroly včleňuje jedno nebo několik přídavných reakčních činidel. Tato přídavná činidla jsou buď zabudována do jednoho z existujících laminátů ve vodorovně definované části toho laminátu, nebo se nanáší jako oddělený svisle sousedící laminát nad vodorovně definovanou částí existujícího laminátu. Díky své poloze v komůrce, definují tato přídavná reakční činidla kontrolní oblasti, které jsou navzájem a od zkušební oblasti vodorovně oddělené.

Volba vhodného reakčního činidla pro pozitivní a negativní kontrolu závisí na hydroláze, na kterou je celková zkouška zaměřena, na typu vizuálního indikátoru použitého k detekování hydrolázy a má-li reakční činidlo sloužit jako pozitivní nebo negativní kontrola. Při využití známých chemikálií bude volba vhodného reakčního činidla ve většině případů zřejmá odborníkům. Reakčním činidlem pro zápornou kontrolu může být například sám vzorek hydrolázy, analogu hydrolázy nebo jakéhokoli jiného druhu s paralelním účinkem, jenž iniciuje a indukuje reakci nebo následnost reakcí, jež vrcholí detekovatelnou změnou v indikátoru. Laminát, obsahující toto reakční činidlo bude buď na horním, nebo dolním povrchu komůrky za předpokladu, že reakční činidlo nebude iniciovat nebo indukovat zjistitelnou změnu dokud je vzorek přítomen, avšak bude to dělat nezávisle na přítomnosti nebo nepřítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku. Reakční činidlo pro negativní kontrolu může být podobně inhibitující látkou jako denaturující, inhibující nebo jinak inaktivující činidlo, jež brání nebo blokuje reakci nebo sled reakcí a tím zabraňuje, aby se zjistitelná změna projevila nezávisle na tom, zdaje enzymaticky aktivní hydroláza ve vzorku přítomna či nikoli.

Obě kontroly jsou aktivovány, když se vzorek vnese do zkušebního zařízení. V některých případech se toho dosahuje nejúčinněji umístěním kontrolních reakčních činidel do laminátu na témže povrchu, jako je laminát (lamináty) obsahující druhé reakční činidlo (druhá reakční činidla). Jinak se nejlepších výsledků dosahuje, jsou-li kontrolní reakční činidla umístěna v laminátu na opačné straně komůrky, než která nese druhé reakční činidlo (druhá reakční

-20CZ 289902 B6 činidla), takže kontrolní reakční činidlo a ostatní reakční činidla jsou od sebe oddělena vzduchovou mezerou. U výhodných provedení obsahují kontrolní oblasti zkušebního zařízení všechny složky a reakční činidla, použitá ve zkušební oblasti s přidáním kontrolních reakčních činidel buď začleněných do vodorovně vyrovnaných sekcí jednoho, nebo více zkušebních laminátů, použitých ve zkušební oblasti, nebo nanesených jako oddělené lamináty nad takovými vodorovně vyrovnanými sekcemi. K dosažení ostrých rozhraní pro kontrolní oblasti, a k zabránění aktivaci nebo desaktivaci zkušební oblasti kontrolními reakčními činidly, je často výhodné vytvořit necelistvosti v laminátu na rozhraní k oddělení kontrolních oblastí od zkušební oblasti k minimalizaci nebo k vyloučení možnosti stranové difúze kontrolních reakčních činidel z jejich příslušných kontrolních oblastí. Tyto necelistvosti mohou být v laminátu podél horního a/nebo dolního povrchu.

Jak bylo uvedeno, jsou kontroly aktivovány s výhodou samotným vzorkem. Toho se dá pohodlně dosáhnout uspořádáním kontrolních oblastí v prodloužení zkušební oblasti, jež zaujímají místo v téže komůrce zkušebního zařízení, kde je umožněna komunikace mezi jednotlivými oblastmi bez překážek. Podle výhodného provedení, kdy jsou začleněny oblasti pozitivní i negativní kontroly, jsou kontrolní oblasti od sebe odděleny zkušební oblastí, jež leží mezi nimi. Naplnit všechny oblasti jedinou aplikací je umožněno uspořádáním vstupního otvoru pro zavádění vzorku a průduchů jak shora popsáno. Jelikož jsou zjistitelné změny nebo jejich absence pozorovatelné průsvitnou stěnou zkušebního zařízení, je identifikace pozitivní a negativní oblasti vhodně dosaženo označením na vnější straně zkušebního zařízení.

Průsvitná stěna může být z materiálu, který je inertní a dostatečně tuhý k držení indikátorového laminátu a přesto dostatečně průsvitný, aby jím byla patrna změna indikátoru jakmile k ní dojde. Může být použito průsvitných nebo průhledných, s výhodou neabsorpčních materiálů: výhodnější jsou průhledné materiály. Příklady polymemích materiálů, vhodných k tomuto použití, jsou polyethylentereftaláty (jako například Mylar®) a polykarbonáty (jako například Lexan®). Protilehlá, (to je spodní) stěna zařízení může být podobně zhotovena z průsvitného nebo průhledného materiálu, ačkoli může být také z matného materiálu, jelikož prohlížéní výsledků zkoušky i pozitivní a negativní kontroly je požadováno pouze z jedné strany zkušebního zařízení. Je-li spodní stěna průsvitná, může být detekce změn ve zkušební oblasti i v obou kontrolních oblastech usnadněna potištěním nebo povlečením kterékoli strany spodní stěny barevným nebo odrazovým materiálem ke zvýšení barevného kontrastu.

Zkušební zařízení (krabička) může být zhotoveno mnoha způsoby. Listy polymemího materiálu mohou být laminovány společně s příslušnými vybráními pro vymezení tvaru komůrky a otvoru pro zavedení vzorku a průduchy. Hloubka komůrky i její tvar a stranové rozměry jsou pak definovány tloušťkou středového listu, zatímco umístění otvorů je dáno vrchním listem. Povlaky indikátoru a reakčních činidel mohou být naneseny na vrchní list a/nebo na spodní list podle potřeby před sestavením listů do laminátu. Listy mohou být pak spolu spojeny obvyklými prostředky, jako například tepelným stavením nebo pomocí lepidla.

Obzvlášť výhodným způsobem vytvarování zkušebního zařízení je použití jediného listu průhledného nebo jinak průsvitného polymemího materiálu s vytlačením mechanicky nebo chemicky k vytvoření vlisu nebo zahloubení o konstantní hloubce ve vnitřním povrchu komůrky. Vlis je v jedné polovině listu, zatímco otvory pro zavádění vzorku a smáčení jsou vdmhé polovině. Povlaky indikátoru a reakčních činidel se nanesou v příslušných místech listu a polovina s otvory se pak přehne přes druhou polovinu k vytvoření uzavřené komůrky a k dosažení správného slícování oblastí reprezentujících horní a dolní povrch komůrky. Čelní povrchy listu se spojí jako u laminátu z předchozího odstavce.

Výhodným způsobem spojování obou polovin dohromady je pomocí lepidel na vodné nebo rozpouštědlové bázi, citlivých na teplo a na tlak. Lepidlo může být omezeno na obvodové oblasti komůrky, aby se zabránilo styku se zkušebními reakčními činidly, nebo může pokrývat celý vnitřní povrch komůrky a pak je naneseno před aplikací povlaku indikátoru a reakčních činidel.

-21 CZ 289902 B6

V tomto druhém případě jsou vhodnými lepidly lepidla průsvitná, inertní, smáčivá a jinak snášenlivá s vrstvami na ně nanesenými. Existuje mnoho typů vhodných lepidel pro toto použití a nejvhodnější výběr se mění mezi jednotlivými systémy v závislosti na vrstvách, jež na ně mají být naneseny.

Vynález se rovněž týká zkušebního zařízení ke zkoušení vzorku na přítomnost kandidiózy testováním přítomnosti enzymaticky aktivní proteázy kyseliny asparagové ve vzorku, přičemž zkušební zařízení sestává z krabičky vymezené alespoň zčásti první a druhou protilehlou stěnou s povrchy, mezi nimiž je mezera směřujícími dovnitř, přičemž první stěna a/nebo druhá stěna jsou z průsvitného materiálu; ze hlásícího enzymu znehybnělého na pevném nosiči na dovnitř směřujícím povrchu první nebo druhé stěny tak, že hlásiči enzym je uvolňován působením hydrolázy;

z indikátoru obsaženého na dovnitř směřujícím povrchu první a druhé stěny, přičemž indikátorem je látka citlivá na zjišťovanou změnu vyvolanou působením hlásícího systému;

a z otvoru v krabičce k zavádění vzorku.

Hlásícím nebo signálním enzymem podle tohoto provedení může být kterýkoli enzym vytvářející signál, nepodléhající inaktivaci kterýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivační hydrolyzy aktivitou hydrolázy přítomné ve vzorku. Mezi takové enzymy patří bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Současně jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy, jako například peroxidáza křenu.

Hlásiči enzym je znehybněn na prvním pevném nosiči, to je na nerozpustné matrici, gelu, nebo pryskyřici takovým způsobem, že hlásiči enzym je uvolňován zpěvného nosiče působením proteázy kyseliny asparagové. Hlásiči enzym může být na pevném nosiči znehybněn použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný spoj, kterým je substrát pro proteázu kyseliny asparagové. U tohoto zkušebního zařízení jsou takovými spojovníkovými molekulami proteiny a peptidy, přičemž vhodnými spojovníkovými molekulami jsou proteiny. Pokud je spojovníkovou molekulou protein, patří mezi výhodné proteiny bez záměru na jakémkoliv omezení: azokasein, kasein, K-kasein, imunoglobuliny, hemoglobin, myoglobin, albumin, elastin, elastin, keratin a kolagen. Při výhodném provedení podle vynálezu je spojovníkovou molekulou K-kasein, kasein, hemoglobin nebo myoglobin. U zkušebního zařízení podle vynálezu je indikátor znehybněn na druhém pevném nosiči, kteiý není v přímém styku s prvním pevným nosičem. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými pevnými nosiči podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sefaroza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylenterftaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů. Znehybnění vizuálního indikátoru na prvním pevném nosiči se provádí běžnými, v oboru známými způsoby.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení reakcí probíhajících, když je ve vzorku přítomna enzymaticky aktivní proteázy asparagové kyseliny a přítomnost enzymaticky aktivní proteázy asparagové kyseliny pak indikuje přítomnost kandidiózy. Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo značkovacího enzymu, je-li uvolněn z pevného nosiče enzymaticky aktivní proteázou kyseliny asparagové, jejíž přítomnost se zjišťuje.

Jako vizuálních indikátorů je možno použít rozmanitých chromogenních indikátorů (to je chromogenů) a jiných látek majících podobný účinek. Výhodnými chromogenickými indikátory

-22CZ 289902 B6 podle vynálezu, je-li použitým uvolnitelným hlásícím enzymem peroxidáza, jsou peroxid vodíku a chromogen zahrnující bez záměru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5-di-hydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu.

Je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor pro peroxidázy nebo pseudoperoxidázy, používá se pevný chromogenový systém a takový systém sestává z peroxidu vodíku a chromogenu schopného oxidace peroxidy vodíku v přítomnosti peroxidázy a zpěvného nosiče, na kterém je chromogen impregnován nebo znehybněn a vysušen. V tomto systému může být chromogen impregnován na sací papír nebo na nosič vytvořený pásky Hemoccult®, nebo může být alternativně chromogen uložen na plastu nebo na jiném listu ve tvaru tenké vrstvy. V tomto posledním provedení může být chromogen vrstven jako roztok obsahující polymemí materiál (jako například hydroxypropylcelulozu nebo ethylcelulozu). Je-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být vázán v matrici materiálu, který je nerozpustný ve vodě, nebo není-li chromogen sám ve vodě rozpustný, může být navrstven jako roztok v organickém rozpouštědle buď sám nebo v kombinaci s vodou rozpustným nebo vodou nerozpustným polymerem.

V tomto pevném chromogenovém systému může být peroxid vodíku buď v pevném stavu (jako je například titaniumhydroperoxid), nebo může být vytvořen in šitu ve zkušebním zařízení.

V přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy při svém uvolňování z prvního pevného nosiče enzymaticky aktivní proteázou kyseliny asparágové, je chromogen oxidován a výsledkem je vizuálně zjistitelná změna barvy. Jak bylo již shora uvedeno, tato výsledná změna zabarvení je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní proteázy kyseliny asparagové ve vzorku a přítomnost enzymaticky aktivní proteázy kyseliny asparagové indikuje přítomnost kandidiózy.

Vynález se rovněž týká zkušebního zařízení ke zkoušení vzorku na přítomnost candidiasis testováním přítomnosti inhibitoru cílové hydrolázy ve vzorku, přičemž zkušební zařízení sestává z krabičky vymezené alespoň zčásti první a druhou protilehlou stěnou s povrchy, mezi nimiž je mezera směřujícími dovnitř, přičemž první stěna /nebo druhá stěna jsou z průsvitného materiálu; z cílové hydrolázy citlivé na inaktivaci přítomnosti inhibitoru; z hlásícího enzymu znehybnělého na pevném nosiči na dovnitř směřujícím povrchu první nebo druhé stěny tak, že hlásící enzym je uvolňován působením cílové hydrolázy, není-li cílová hydroláza inhibována přítomností inhibitoru;

z indikátoru obsaženého na dovnitř směřujícím povrchu první a druhé stěny, přičemž indikátorem je látka citlivá na zjišťovanou změnu vyvolanou působením hlásícího systému;

a z otvoru v krabičce k zavádění vzorku.

Ke zjištění přítomnosti inhibitoru hydrolázy ve vzorku, se začlení do zkušebního zařízení definované množství cílové hydrolázy buď bezprostředně před provedením zkoušky, nebo výhodněji při výrobě zkušebního zařízení. Provedení zkoušky zahrnuje zjišťování schopnosti vzorku inhibovat cílovou hydrolázu. V případě, že se inhibitor cílové hydrolázy ve vzorku nenachází, uvolní cílová hydroláza hlásiči enzym zpěvného nosiče, čímž způsobí zjistitelnou změnu v indikátoru. Naopak, je-li inhibitor cílové hydrolázy ve vzorku přítomen, cílová hydroláza je inhibována, hlásící enzym se z pevného nosiče neuvolní a v indikátoru se nevytvoří zjistitelná změna nebo odezva. Není nutno, aby inhibitor ve vzorku inhiboval do systému přidanou cílovou hydrolázu úplně. Požaduje se pouze, aby se projevila dostatečná míra inhibice cílové hydrolázy, aby to vyvolalo patrný rozdíl v očekávané zjistitelné odezvě. Prvky pozitivní a negativní kontroly zkušebního zařízení ilustrují výskyt úplně inhibované cílové hydrolázy a cílové hydrolázy prosté inhibice.

-23CZ 289902 B6

Citlivost této technologie uvolňování enzymu může být podle potřeby nastavena vnesením definovaných množství cílové hydrolázy do zkušebního zařízení. Podobně, jestliže je to třeba, může být expoziční doba cílové hydrolázy vůči inhibitoru ve vzorku regulována fyzikálně nebo chemicky oddělením cílové hydrolázy od znehybněného hlásícího enzymu. Například je možno řídit časový přístup cílové hydrolázy ke znehybnělému hlásícímu enzymu povlečením hlásícího enzymu v časově uvolňované matrici povlakem narušitelným hodnotou pH nebo jiným řízené uvolňovaným materiálem. Alternativně může být cílová hydroláza přítomna v místě chemické formy, jež je bezprostředně přístupná pro jakýkoli inhibitor přítomný ve vzorku. Tudíž dříve než dosáhne přístupu ke znehybnělému hlásícímu enzymu, může být cílová hydroláza vystavena působení inhibitoru po dostatečně dlouhou dobu, aby k inhibici došlo. Jelikož může být přístupnost ke znehybnělému hlásícímu enzymu časově řízena, mohou výsledky zkoušky dokládat přítomnost i pomalu působících inhibitorů.

Tohoto zkušebního zařízení podle vynálezu je možno použít k testování přítomnosti nebo nepřítomnosti kteréhokoli známého inhibitoru hydrolytického enzymu včetně - bez záměru na jakémkoliv omezení: inhibitorů proteáz (nebo zaměnitelně) proteináz, peptidáz, lipáz, nukleáz, homo-oligosacharidáz, hetero-oligosacharidáz, homo-polysacharidáz, hetero-polysacharidáz, fosfatáz, sulfatáz, neuraminidáz a esteráz. Podle výhodného provedení vynálezu se zkušebního zařízení podle vynálezu používá k testování přítomnosti inhibitorů proteáz zahrnujících bez záměru na jakémkoliv omezení: inhibitory proteáz kyseliny asparagové, inhibitory serinových proteáz, inhibitory thiolových proteáz, inhibitory metalloproteáz, inhibitory kyselých proteáz a inhibitory alkalických proteáz. Podle dalšího výhodného provedení se zkušebního zařízení podle vynálezu používá k testování přítomnosti inhibitorů proteáz kyseliny asparagové, jako jsou například pepstatin, ovomakroglobulin, haloperidol, transitní státní mimetika, U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 a A-7003. U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 a A-7003 jsou experimentální drogy, jež byly nedávno popsány v literatuře. Podle ještě dalšího výhodného provedení tohoto zkušebního zařízení podle vynálezu se zjišťuje přítomnost pepstatinu jakožto inhibitoru proteázy kyseliny asparagové.

V souladu s tímto zkušebním zařízením podle vynálezu patří mezi cílové hydrolázy bez záměru na jakémkoliv omezení: proteázy, proteinázy, peptidázy, lipázy, nukleázy, homo-oligosacharidázy, hetero-oligosacharidázy, homo-polysacharidázy, hetero-polysacharidázy, fosfatázy, sulfatázy, neuraminidázy a esterázy. Příslušná cílová hydroláza použitá při uvedeném způsobu bude záviset na tom, který inhibitor se zjišťuje a výběr v daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý. Je-li například zjišťovaným inhibitorem pepstatin, je cílovou hydrolázou, použitou ve shora popsaném zkušebním systému proteáza asparagové kyseliny. Kromě toho jsou pracovníkům v oboru známy příslušné koncentrace cílové hydrolázy, geometrické umístění cílové hydrolázy ve zkušebním zařízení a příslušné technologie časového a řízeného uvolňování a matrice.

Podobně jako u jiných zkušebních zařízení podle vynálezu může být hlásícím enzymem nebo signálním enzymem, použitým v tomto zvláštním zkušením zařízení enzym vyvolávající signál, to je enzym, jehož aktivita vyvolává zjistitelnou změnu nepodléhající inaktivaci jakýmkoli činidlem ve vzorku, včetně inaktivující hydrolyzy cílovou hydrolázou, jež je začleněna do zkušebního systému. Mezi takové enzymy patří bez záměru na jakémkoliv omezení: peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy a glukuronidázy. Výběr příslušného hlásícího nebo signálního enzymu je pracovníkům v oboru zřejmý. V tomto zkušebním zařízení podle vynálezu jsou vhodnými hlásícími enzymy peroxidázy a zejména peroxidáza křenu.

Hlásiči enzym je znehybněn na pevném nosiči, to je na nerozpustné matrici, gelu nebo pryskyřici tak, že hlásící enzym je uvolňován působením cílové hydrolázy, pokud není cílová hydroláza inhibována přítomností inhibitoru ve vzorku. Bez záměru na jakémkoliv omezení jsou vhodnými pevnými nosiči podle vynálezu celulóza, agaroza, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, sepharoza, oxiran, akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen,

-24CZ 289902 B6 keratin, elastin, prášek z hovězí kůže, peptidoglykan bakteriálních buněčných stěn nebo jeho fragmenty, nylon, polethylenterflaláty, polykarbonáty a sklo s řízenou velikostí pórů.

Jak bylo shora objasněno, může být hlásiči enzym znehybněn na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro enzymaticky aktivní cílovou hydrolázu. Mezi takové spojovníkové molekuly podle vynálezu patří bez záměru na jakémkoliv omezení: proteiny uhlohydráty, lipidy, peptidy, esteiy a nukleové kyseliny. Příslušná spojovníkové molekula, použitá k připojení hlásícího enzymu k prvnímu pevnému nosiči, závisí na tom, která cílová hydroláza se zjišťuje a výběr v každém daném případě je pracovníkům v oboru zřejmý.

Indikátorem může být jakákoli chemická látka, jež prodělává zjistitelnou změnu v důsledku reakce nebo jako výsledek vyvrcholení probíhajících reakcí, není-li cílová hydroláza inaktivována přítomností inhibitoru ve vzorku. Výhodnými indikátory jsou vizuální indikátory a zejména chromogenické indikátory, to je takové, u nichž je vizuální změnou změna barvy, včetně vybarvení jinak bezbarvého materiálu působením hlásícího nebo signálního enzymu, je-li uvolněn zpěvného nosiče enzymaticky aktivní cílovou hydrolázou za předpokladu, že není inaktivována přítomností inhibitoru ve vzorku.

Jako vizuálních indikátorů je možno použít rozmanitých chromogenních indikátorů (to je chromogenů) a jiných látek majících podobný účinek. Výhodnými chromogenickými indikátory podle vynálezu, je-li použitým uvolnitelným hlásícím enzymem peroxidáza, jsou peroxid vodíku a chromogen zahrnující bez záměru na jakémkoliv omezení jednu z následujících sloučenin: guaiakol, 2-2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu, tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin a 4,5-di-hydroxynaftalen-2,7-disulfonovou kyselinu. Obzvlášť výhodný chromogenický indikátor sestává z peroxidu vodíku a guaiakolu, což je chromogen bezbarvý v redukovaném stavu a tmavě modrý v oxidovaném stavu. Jak bylo shora popsáno, je-li vizuálním indikátorem chromogenický indikátor, je možno použít buď kapalného, nebo pevného chromogenového systému.

Z uvedeného pojednání o struktuře zkušebního zařízení k testování přítomnosti hydrolázy vyplývá, že jsou jeho konstrukce a jeho výhodné provedení plně použitelné pro zkušební zařízení ke zkoušení vzorku na přítomnosti kandidiózy testováním na přítomnost enzymaticky aktivní proteázy kyseliny asparagové a jako zkušebního zařízení ke zkoušení vzorku na přítomnost inhibitoru cílové proteázy.

Ačkoli není záměrem omezovat vynález na jakoukoli zvláštní konstrukci zkušebního zařízení, ilustrují následující obrázky, jež nejsou kresleny v měřítku, jak může být takové zkušební zařízení konstruováno.

Na obr. 1 je struktura nosiče zkušebního zařízení v perspektivním pohledu, před nanesením indikátoru a reakčních činidel a před uzavřením komůrky. Struktura nosiče sestává z testovacího zařízení 11 z poměrně tuhého, průhledného chemicky inertního plastu s rýhou 12 pro přehnutí, jež definuje záhyb dělicí list, který rozděluje testovací zařízení 11, na dvě poloviny, spodní protilehlou stěnu 13 a vrchní protilehlou stěnu 14, mající stejnou délku i šířku. Spodní protilehlá stěna 13 má prolis kompozitového tvaru mající uprostřed kruh 15 a po stranách čtyřhranná vybrání, první čtyřhranné vybrání 16 a druhé čtyřhranné vybrání 17. Ve vrchní polovině, v druhé protilehlé stěně 14 jsou tři otvory, včetně středového otvoru 18, který slouží jako vstup pro vkládání vzorku a dvou postranních otvorů, prvního průduchu 19 a druhého průduchu 20. První průduch 19 i druhý průduch 20 jsou kruhové a středový otvor 18 je kruhový a s jednou ostrou hranou ke snadnému seškrabování vzorku z tamponu, kterého je použito jako odběrového zařízení. Otvory jsou umístěny tak, že když se plast přehne podle rýhy 12 dělicího záhybu a vrchní, druhá protilehlá stěna 14 se uvede do styku se spodní, první protilehlou stěnou 13, je středový otvor 18 nad středem kruhu 15prolisu a první průduch 19 je nad prvním čtyřhranným vybráním 16 a druhý průduch 20 je nad druhým čtyřhranným vybráním 17 na jejich vnějším

-25CZ 289902 B6 okraji. První čtyřhranné vybrání 16 a druhé čtyřhranné vybrání 17 představují oblasti pozitivní a negativní kontroly zkušebního zařízení.

Může být mnoho variant zkušebního zařízení podle obr. 1. První protilehlá stěna 13 a druhá protilehlá stěna 14 mohou mít z různých důvodů různé délky nebo šířky. Jediným rozhodujícím význakem je, že prolisy v první protilehlé stěně 13 a otvory v druhé protilehlé stěně 14 jsou umístěny vůči rýze 12 pro přehnutí tak, že otvory a prolisy jsou ve správné poloze, jestliže se první protilehlá stěna 13 a druhá protilehlá stěna 14 přehnou podle rýhy 12 pro přehnutí. V jiném příkladě mohou první čtyřhranné vybrání 16 a druhé čtyřhranné vybrání 17 v první protilehlé stěně 13 struktury končit v kruhových (nebo půlkruhových) oblastech lícujících s prvním průduchem 19 a druhým průduchem 20 v druhé protilehlé stěně 14. První průduch 19 a druhý průduch 20 mohou mít jakýkoli tvar. Je skutečností, že pokud mají průduchy jiný tvar než středový otvor 18 pro zavádění vzorku, je to výhodné pro uživatele, aby si nespletl kam zavádět vzorek.

Na obr. 2 je řez zkušebního zařízení z obr. 1, ukazující krabičku 31 v řezu po nanesení povlaků a po přehnutí a slepení obou polovin. Vnitřní povrch první protilehlé stěny 13 z průhledného polymeru je povlečen prvním lepidlem 32 a vnitřní povrch druhé protilehlé stěny 14 z průhledného polymeruje povlečen druhým lepidlem 33. Přímo pod vrstvou druhého lepidla 33 je vrstva obsahující vizuální indikátor 34 a pod ním je vrstva 35 reakčního činidla. Poznamenává se, že vrstva vizuálního indikátoru 34 a vrstva 35 reakčního činidla mohou zaujímat celou délku a šířku krabičky 31 a obklopovat středový otvor 18 pro zavádění vzorku a zasahovat do všech oblastí krabičky 31.

Zkušební oblast a kontrolní oblasti krabičky 31 jsou vymezeny horizontálním umístěním povlaků na první protilehlé stěně 13 krabičky 31. Reakční činidlo pro negativní kontrolu je obsaženo v prvním povlaku 36, který zaujímá dolní povrch prvního čtyřhranného vybrání 16 krabičky 31 (viz obr. 1) a reakční činidlo pro pozitivní kontrolu je obsaženo ve druhém povlaku 37 podobně situovaném ve druhém čtyřhranném vybrání 17. Alternativně mohou být reakční činidla pro kontroly umístěna na horním povrchu krabičky 31 spíše než na dolním povrchu. To je skutečně výhodné pro některé testy. Část dolního povrchu pod středovým otvorem 18 krabičky 31 (viz obr. 1) je povlečena vrstvou 38, která může obsahovat přídavné reakční činidlo použité ve zkušební reakci nebo nemusí reakční činidlo obsahovat vůbec. Při pohledu s vrchu uzavřeného zkušebního zařízení má kruhová zkušební oblast 41 po stranách čtyřhrannou negativní kontrolní oblast 42 a čtyřhrannou pozitivní kontrolní oblast 43. Tři segmenty prvního povlaku 36, druhého povlaku 37 a vrstvy 38 mohou být odděleny mezerami, neboli prvním přerušením 44 a druhým přerušením 45 ke zpomalení nebo k minimalizaci difúze mezi nimi, nebo k zabránění styku mezi těmito segmenty. Podobná přerušení mohou být také mezi vrstvou vizuálního indikátoru 34 a vrstvou 35 reakčního činidla, přímo nad mezerami prvního přerušení 44 a druhého přerušení 45. Přerušení ve vrstvě vizuálního indikátoru 34 a ve vrstvě 35 reakčního činidla dále zabraňují difúzi kontrolních složek nebo jiných reakčních činidel z kontrolních oblastí do zkušební oblasti. Vedle jakýchkoli přítomných reakčních činidel mohou všechny dovnitř směřující povrchy 35 reakčního činidla, prvního povlaku 36, druhého povlaku 37 a vrstvy 38 přídavně obsahovat smáčedlo nebo detergent k podpoře rychlého a úplného rozlití vzorku podél horního a dolního povrchu k naplnění krabičky. V některých případech se stejného účinku dosahuje vrstvou proteinu.

U některých provedení podle vynálezu mají reakční činidla sklon kazit se vlivem dlouhodobého vystavení působení vzduchu nebo vzdušné vlhkosti. U zařízení znázorněného na obr. 2 je tomu zabráněno tenkým listem 46 materiálu, který je neproniknutelný jak pro vlhkost, tak pro vzduch. Tenký list 46 kryje středový otvor 18 pro vkládání vzorku a oba průduchy a utěsňuje vnitřek krabičky proti okolí, dokud je testovací zařízení připraveno 11 k použití, načež se list snadno odloupne. U materiálů zvlášť citlivých na působení vody a vzduchu může být také vhodné umístit nepromokavý a pro vzduch neproniknutelný list na dno testovacího zařízení 11, kde může být tenký list 46 permanentně připevněn nebo může být odloupnut. Další ochrany proti působení

-26CZ 289902 B6 vlhkosti a vzduchu je možno dosáhnout umístěním zařízení do vaku, který zařízení úplně obklopí.

Jak bylo shora uvedeno, mohou se všechny rozměry zařízení podle obr. 1 a 2 měnit, stejně jako jejich uspořádání a tvar. Typickým příkladem však je zařízení, kde nosičem je Mylar o tloušťce 0,127 mm a lepivou vrstvou je polyethylen o nízké hustotě o tloušťce 0,051 mm, šířka 47 mezery je 0,19 mm a zkušební oblast tvoří kruh o průměru 7,938 mm a o ploště 0,494 cm² a čtyřhranné kontrolní oblasti mají plochu 3,175 x 1,588 mm (0,0504 cm²). Průduchy a kruhový otvor pro vkládání vzorku jsou v tomto příkladě kruhové o průměru 3,2 mm. Obsah krabičky je přibližně 12 μΐ.

Využitelnost

Zkušební zařízení podle vynálezu se hodí ke zkoušení vzorků na přítomnost hydrolázy z velkého rozsahu zdrojů, včetně biologických a jiných zdrojů. Příkladem jsou tělní tekutiny, jako jsou krev, sérum, plasma, moč, uretrální výměšky, slzy, vaginální tekutina, cervikální výpotek, míšní tekutina a sliny, stejně jako netělní tekutiny jako poživatiny, voda z rybníků a plováren a tekuté odpady.

Příklady provedení vynálezu

I. Přípravy

A. Příprava pevných nosičů aktivovaných bromkyanem

1. Materiály

a. Pevné, nerozpustné nosiče (Sepharose 4B, chitin a Sigmacell®20) [společnosti

Sigma Chemical CO.]

b. Destilovaná voda a led z destilované vody

c. 4,0 M hydroxid sodný

d. Pevný bromkyan

e. Kopulační pufr (0,1 M kyselý uhličitan sodný obsahující 0,6 M chlorid sodný

f. Motor magnetického míchače a míchací tyčinka; pH-metr; odtahová digestoř

3. Postup

Přidá se 10 ml studené destilované vody do 5 g vlhkého pevného nosiče a směs se ochladí na teplotu 10 až 15 °C. Hodnota pH suspense se nastaví na 10,8 4,0 M hydroxidem sodným a přidá se 100 mg drceného bromkyanu na 1 g vlhkého pevného nosiče. Hodnota pH se udržuje na 10,8 přisazováním 4,0 M hydroxidu sodného podle potřeby a teplota suspense se v průběhu aktivačního procesu zvýší na 18 až 20 °C. Aktivace se považuje za ukončenou, když nejsou nutné další přísady 4,0 M hydroxidu sodného k udržení hodnoty pH 10,8. V té chvíli se přidá rozdrcený led k ochlazení reakční směsi a suspense se zfiltruje na předem vychlazené filtrační nálevce. Filtrát se shromáždí v sací baňce obsahující pevný síran železnatý, který reaktivoval zbylý bromkyan a kyanid zbylý v reakční směsi. Pevný nosič se promyje 1 1 studené destilované vody a 11 kopulačního pufru za odsávání a uloží se jako vlhká pasta při teplotě 4 °C.

-27CZ 289902 B6

B. Příprava konjugátů [kapa-kasein-HRPO] (hydrazidový způsob)

1. Materiály

a. Kapa-kasein a hydrazid křenové peroxidázy (HRPO) [společnosti Sigma Chemical Co.)

b. Destilovaná voda

c. Pufry

i. 50 nM kyseliny 2-[morfolin]ethansulfonové (MES), pH 6,0 ii. 100 mM pufru acetátu sodného, pH 4,0 obsahujícího 0,5 M chloridu sodného iii. 100 mM borátu sodného, hodnota pH 9, obsahujícího 0,5 M chloridu sodného

d. Pevný perjodát sodný

e. 100 mM formaldehydu

Postup

a. Perjodátová aktivace kapa-kaseinu

Rozpustí se 20 mg kapa-kaseinu ve 2 ml pufru MES a do roztoku se přidá 8,6 mg pevného perjodátu sodného. Směs se inkubuje na rotoru po dobu 30 minut ve tmě za teploty místnosti. Reakční směs se pak dialyzuje proti přibližně 300 ml mM MES, hodnota pH 6,0 po dobu přibližně 45 minut při teplotě místnosti, načež se díalyzační tekutina nahradí a pokračuje se pod dalších 45 minut.

b. Kovalentní vazba HRPO ke kapa-kaseinu

Do aktivovaného kapa-kaseinu se přidá 5 mg hydrazidu HRPO (přibližně 175 jednotek na 1 mg proteinu) a směs se inkubuje za míchání 4 hodiny při teplotě místnosti. Do směsi se přidá 200 ml 100 mM formaldehydu a v inkubaci se pokračuje při teplotě místnosti po dobu dalších 30 minut. Přidají se 2 ml 1 M studeného acetátového pufru, pH 4,0 a konjugát se nechá vysrážet po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Pelety se vyjmou odstředěním, znovu se rozpustí ve 2 ml 100 mM borátového pufru, hodnota pH je 9,0 a před použitím se uloží při teplotě 4 °C.

C. Připojení konjugátů [kapa-kasein-HRPO] (hydrazinová metoda) k nosičům aktivovaným bromkyanem

1. Materiály

a. Konjugáty [kapa-kasein HRPO] (příprava B)

b. Destilovaná voda

c. Pufry

i. kopulační pufr (0,lM NaHCO₃ s obsahem 0,5 M NaCl) ii. 1,0 M Tris pufr, pH 8,0 iii. 100 mM pufr acetátu sodného, pH 4,0 obsahující 0,5 M chlorid sodný iv. 100 mM borát sodný, pH 9, obsahující 0,5 M chlorid sodný

d. Bromkyanid aktivovaný Sepharose 4B a Sigmacell® 20 (příprava A)

e. Bromkyanid aktivovaný Sepharose 6MB (od Sigma Chemical Co.)

-28CZ 289902 B6

2. Postup

a. Bromkyanid aktivovaný Sepharose 4B a Sigmacell® 20

Rozředí se 2 ml konjugátu [kapa-kasein-HRPO] připraveného z hydrazidu HRPO, jak je popsáno v případě B, ve 3 ml kopulačního pufru a přidá se k 1 g vlhkého bromkyanu aktivovaného Sepharose 4B a Sigmacell®. Suspense se nepřetržitě míchá při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Pevný nosič se promyje kopulačním pufrem a vodou a přidá se 3 ml 1,0 M Tris pufru s hodnotou pH 8. Suspense se inkubuje po dobu 2 hodin při teplotě místnosti k inaktivaci zbývajících aktivních míst na pevném nosiči. Kodstranění nevázaného materiálu zpěvného nosiče se použije promývacích cyklů sestávajících z kyselého pufru s hodnotou pH 4,0 a následně kopulačního pufru. Konečný oplach je destilovanou vodou a vlhká suspense se až do použití uloží při teplotě 4 °C.

b. Komerčně aktivovaná Sepharosa 6 MB (Sigma Chemical Co.)

Vlhký gel (1 g vlhké hmotnosti) se promyje 200 ml 1 mM kyselinou chlorovodíkovou před použitím jak shora uvedeno.

c. Aktivovaný chitin

Použije se shora uvedeného postupu A s tím, že místo 1 g se použije 500 mg vlhkého aktivovaného chitinu.

D. Příprava aldehydu křenové peroxidázy (HRPO)

1. Materiály

a.

b.

c.

d.

Pevný perjodat sodný

Biogel®P-30 sférický polyakrylamidový gel

HRPO, typ Π, 200 J/mg (od Sigma Chemical Co.) mM pufr kyseliny 2-(N-morfolino)ethansulfonové, pH 5,0 od Bio-Rad

2. Postup

25,7 mg pevného perjodátu sodného (40 mmol) se přidá do 30 mg HRPO ve 3 mg pufru MES. Roztok se inkubuje ve tmě po dobu 30 minut při teplotě místnosti za trvalé rotace. Roztok se nechá projít sloupcem P-30 v pufru MES k odstranění přebytku perjodátu sodného a zabarvený HRPO se shromáždí na celkový objem 3 ml. Aldehyd HRPO se okamžitě zkopuluje na žádaný protein (hemoglobin, myoglobin nebo kasein).

E. Vázání hemoglobinu a myoglobinu k pevným nosičům aktivovaným bromkyanem

1. Materiály

a. Pevné, nerozpustné nosiče

i. Bromkyan aktivovaný Sepharosou 6MB, (od Sigma Chemical Co.) ii. Sigmacell®20 (jak popsáno v přípravě A)

b. Destilovaná voda

c. Pufiy:

i. Kopulační pufr (0,1 M hydrogenuhličitan sodný obsahující 0,5 M chlorid sodný) ii. 1,0 M pufr Tris, pH 7,0

-29CZ 289902 B6 iii. 100 mM pufr acetátu sodného, pH 4,0 obsahujícího 0,5 M chloridu sodného iv. 100 mM borátu sodného, pH 8,0, obsahujícího 0,5 M chloridu sodného

v. objemově 0,1% roztok glutaraldehydu ve vodě

2. Postup

Do 1 g vlhkého pevného nosiče se přidá 100 mg buď hemoglobinu, nebo myoglobinu rozpuštěného v 5 ml kopulačního pufru. Suspense se nepřetržitě míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Pevný nosič se promyje kopulačním pufrem a vodou a přidá se 3 ml 1,0 M Tris pufru s hodnotou pH 8 a suspense se inkubuje po dobu 2 hodin při teplotě místnosti k inaktivací zbývajících aktivních míst na pevném nosiči. Kodstranění nevázaného materiálu zpěvného nosiče se použije tří promývacích cyklů sestávajících z kyselého pufru s hodnotou pH 4,0 následovaných borátovým pufrem, přičemž oba obsahují chlorid sodný. U myoglobinem derivatizovaných nosičů se použije konečného oplachu destilovanou vodou a vlhká suspense se až do použití uloží při teplotě 4 °C. U nosičů derivovaných hemoglobinem se do vlhké suspense ze shora uvedeného postupu přidá 5 ml 1% roztoku glutaraldehydu a suspense se uloží přes noc při teplotě 4 °C. K odstranění navázaného materiálu z nosiče se použije tří promývacích cyklů sestávajících z kyselého pufru s hodnotou pH 4,0 následovaných borátovým pufrem s hodnotou pH 8,0. Konečný oplach se provede destilovanou vodou a vlhká suspense se až do použití uloží při teplotě 4 °C.

F. Vázání aldehydu křenové peroxidázy (HRPO) k nosičům derivatizovaných hemoglobinem nebo myoglobinem

1. Materiály

a. Aldehyd HRPO připravený podle přípravy D

b. Hemoglobinem nebo myoglobinem derivatizované pevné nosiče připravené podle přípravy E

c. 100 mM bromkyan sodný

d. 1,0 M chlorid sodný

e. Destilovaná voda

2. Postup ml aldehydu HRPO (30 mg), získaného ze sloupce P-30 v přípravě D, se přidá do 1 g pevných nosičů derivatizovaných hemoglobinem nebo myoglobinem popsaných v přípravě E. Suspenze se inkubuje po dobu 16 hodin při teplotě 4 °C a následně 4 hodiny při teplotě místnosti. K odstranění nevázaného materiálu z nosiče se použije tří promývacích cyklů sestávajících z destilované vody a 1,0 M chloridu sodného. Pevný nosič se pak inkubuje s 5 ml 100 mM bromkyanu přes noc při teplotě 4 °C. Konečný oplach se provede destilovanou vodou a vlhká suspense se až do použití uloží při teplotě 4 °C.

G. Příprava Sigmacell®20 aktivovaného aldehydem

1. Materiály

a. Sigmacell® 20 (od Sigma Chemical Co.)

b. Destilovaná voda

c. Pevný perjodát sodný

d. 20 mM hydrogenuhličitan sodný s hodnotou pH 9,5

-30CZ 289902 B6

2. Postup

Do 1 g Sigmacell® suspendovaného v 10 ml destilované vody se přidá pevný perjodát sodný (428 mg). Směs se nechá trvale rotovat po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Granulát se odstraní odstředěním, promyje se pětkrát 10 ml destilované vody a jednou 10 ml 20 mM hydrogenuhličitanu sodného s hodnotou pH 9,5. Pryskyřice se použije bezprostředně po připravení.

H. Kovalentní vazba hemoglobinu a myoglobinu k Sigmacell®20 aktivovanému aldehydem

I. Materiály

a. Sigmacell® 20 (od Sigma Chemical Co.)

b. Destilovaná voda

c. 100 mM kyanoborhydrid sodný

d. Lidský hemoglobin a koňský srdeční myoglobin (oba od Sigma Chemical Co.)

e. Pufry

i. 20 mM hydrogenuhličitan sodný, pH 9,5 ii. 50 mM ethanolamin, pH 9,5 iii. 100 mM Tris pufr, pH 8,0 s obsahem 0,5 M NaCl iv. 100 mM pufr acetátu sodného, pH 4,0 s obsahem 0,5 M NaCl

v. 20 mM MES pufr, pH 5,0

2. Postup

Do 1 ml aldehydem aktivovaného Sigmacell® 20 se přidá 50 mg buď myoglobinu, nebo hemoglobinu rozpuštěného v 9 ml hydrogenuhličitanu sodného o hodnotě pH 9,5. (Příprava G). Suspense se nechá rotovat přes noc při teplotě místnosti a granule se oddělí odstředěním. Granulát se promyje 10 ml vody. Přidá se 9 ml 50 mM ethanolaminu s hodnotou pH 9,5 a směs se nechá trvale rotovat 1 hodinu při teplotě místnosti. Granulát se izoluje odstředěním a promyje se postupně vždy 10 ml acetátového pufru, Tris pufru a MES pufru. Přidá se 20 ml vodného roztoku 100 mM kyanoborhydridu sodného a směs se inkubuje po dobu jedné hodiny za stálé rotace při teplotě místnosti, načež se inkubuje přes noc při teplotě 4 °C. Po noční inkubaci s derivatizovaný nosič promyje pětkrát 10 ml alikvoty destilované vody a dvakrát 10 ml alikvoty MES pufru.

I. Kovalentní vazba aldehydu HRPO k hemoglobinu nebo myoglobinu znehybněnému na Sigmacell®20 aktivovaným aldehydem

1. Materiály

a. Hemoglobinem nebo myoglobinem derivatizovaný Sigmacell® 20 (od Sigma Chemical Co.)

b. Destilovaná voda

c. 100 mM kyanoborhydrid sodný

d. Pufry

i. 100 mM Tris pufr, pH 8,0 s obsahem 0,5 M NaCl ii. 100 mM sodnoacetátový pufr, pH 4,0 s obsahem 0,5 M NaCl iii. 20 mM MES pufr, pH 5,0

e. Aldehydem aktivovaný HRPO (Příprava D).

-31 CZ 289902 B6

2. Postup mg odsoleného aldehydu HRPO (Příprava D) rozpuštěného ve 2 ml MES pufru s hodnotou pH 5,0 se přidá do 1 g hemoglobinu nebo myoglobinem derivatizovaného Sigmacell® 20 (Příprava H) a suspense se nechá rotovat 1 hodinu při teplotě místnosti s následnou inkubací přes noc při teplotě 4 °C. Nosič se izoluje odstředěním a promyje se dvakrát 10 ml alikvoty destilované vody. Přidá se 20 ml 100 mM kyanoborhydridu sodného a suspense se inkubuje po dobu 60 hodin při teplotě 4°C. Granulát se promyje postupně dvakrát destilovanou vodou, acetátovým pufrem. Tris pufrem a MES pufrem.

J. Kovalentní vazba hemoglobinu ke komerčním akrylovým kuličkám Eupergit® C

1. Materiály

a. Oxiranakrylové kuličky (Eupergit® C, od Sigma Chemical Co.)

b. Lidský hemoglobin (typ IV od Sigma Chemical Co.)

c. Pufry a roztoky

i. 1,0 M pufr fosforečnanu draselného, pH 7,5 s obsahem 0,1 % azidu sodného (hmotnost k objemu) ii. 1,0 M chlorid sodný iii. 5% (objem/objem) merkaptoethanol, nastavený na hodnotu pH 8,0 s obsahem 5,0 M hydroxidu sodného iv. 100 mM pufr fosforečnanu draselného, pH 7,4

v. 500 mM pufr fosforečnanu draselného, pH 7,4 vi. 3,5 M thiokyanát sodný vii. Fosforečnanem pufrovaná solanka (PBS) (0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,2 s obsahem 0,15 M NaCl)

d. Destilovaná voda

2. Postup

Rozpustí se hemoglobin (125 mg) v 5 ml 1,0 M fosfátového pufru, pH 7,4, obsahujícího azid sodný do 1 g Eupergitu® C. Směs se inkubuje bez míchání po dobu 72 hodin při teplotě místnosti. Nosič se promyje třikrát 1,0 M chloridem sodným a pětkrát destilovanou vodou. Nosič se smísí s 2,5 ml merkaptoethanolu předem nastaveného na hodnotu pH 8,0 a suspense se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Kuličky se promyjí desetkrát destilovanou vodou, vloží se do malé nálevky ze slinutého skla a promyjí se postupně vždy 50 ml 0,5 M pufru fosforečnanu draselného, pH 7,4, 0,1 M pufru fosforečnanu draselného, pH 7,4; 3,5 M thiokyanátem sodným a nakonec velkým množstvím fosforečnanem pufrované solanky (PBS) (0,01 M fosforečnan sodný, pH7,2 s obsahem 0,15 N NaCl). Derivatizované kuličky se zpracují objemově 0,1% glutaraldehydem za rotace po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, přes noc při teplotě 4 °C a pak se promyjí destilovanou vodou.

K. Kovalentní vazba aldehydu HRPO (Příprava D) k hemoglobinem derivatizovanému Eupergitu® C (Příprava J)

1. Materiály:

a. Aldehyd HRPO (Příprava D)

b. Hemoglobinem derivatizovaný Eupergit® C (Příprava J)

c. 100 mM kyanoborhydrid sodný

d. 1,0 M chlorid sodný

e. Destilovaná voda

-32CZ 289902 B6

2. Postup mg aldehydu HRPO (Příprava D) ve 3 ml MES pufru se přidá do 1 g hemoglobinem derivatizovaného Eupergitu®C (Příprava J). Suspense se inkubuje 16 hodin při teplotě 4 °C a následně 4 hodiny při teplotě místnosti. K odstranění nevázaného materiálu z nosiče se použije třech promývacích cyklů sestávajících z destilované vody a 1,0 M chloridu sodného. Pevný nosič se pak inkubuje s 5 ml 100 mM kyanoborhydridu po dobu 60 hodin při teplotě 4 °C. Konečný oplach se provede destilovanou vodou a vlhká suspense se až do použití uloží při teplotě 4 °C.

L. Kovalentní vazba kaseinového HRPO k polymemímu dialdehydu

1. Materiály

a. 25 mg konjugátu kapa-kasein-HRPO připraveného hydrazidovým způsobem (příprava B) rozpuštěného ve 2 ml 100 mM borátového pufru, pH 9,0

b. Polymemí dialdehyd (od Sigma Chemical Co.)

c. Pufry:

i. 100 mM ethanolamin, pH 9,5 ii. 10 mM sodnoborátový pufr, pH 9,0 s obsahem 0,5 M NaCl iii. 100 mM sodnoacetátový pufr, pH 4,0 s obsahem 0,5 M NaCl iv. 50 mM MES pufr, pH 6,0

d. 100 mM formaldehyd

e. 100 mM kyanoborhydrid sodný

2. Postup

Způsobem popsaným v přípravě B se připraví 2 ml konjugátu kapa-kasein-HRPO s jednou modifikací: vypustí se zpracování formaldehydem. Tento roztok se smísí se 3 ml MES pufru a roztok se přidá do 1 g polymemího dialdehydu. Suspense se nechá rotovat 6 hodin při teplotě místnosti a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C. Do suspense se přidá 200 ml 100 mM formaldehydu a směs se inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti. Pryskyřice se odstraní odstředěním, promyje se vodou a znovu se suspenduje ve 3 ml 100 mM ethanolaminu s hodnotou pH 8,5. Po dvouhodinové inkubaci s rotací za teploty místnosti se piyskyřice postupně promyje acetátovým pufrem, borátovým pufrem a vodou. Pevný nosič se pak inkubuje s 5 ml 100 mM kyanoborhydridu přes noc při teplotě 4 °C. Konečné promytí se provede destilovanou vodou a vlhká suspense se uloží do použití při teplotě 4 °C.

M. Vazba úplného kaseinu nebo kapa-kaseinu značeného HRPO (aldehydová metoda) k akrylovým kuličkám Eupergitu® C

1. Materiály

a. Oxiranakrylové kuličky (Eupergit® C od Sigma Chemical Co.)

b. Hovězí úplný kasein nebo kapa-kasein (od Sigma Chemical Co.)

c. Pufiy a roztoky

i. 100 mM hydrogenuhličitan sodný, pH 8,5 s obsahem 0,5 M NaCl ii. 100 mM sodnoacetátový pufr s obsahem 0,5 M NaCl iii. 100 mM Tris pufr s obsahem 0,5 M NaCl iv. 20 mM MES pufr, pH 5,0

v. 5 % (objemově) merkaptoethanolu ve vodě vi. 200 mM borhydrid sodný ve vodě

-33CZ 289902 B6

d. Destilovaná voda

2. Postup

a. Kovalentní vazba kaseinu nebo kapa-kaseinu ke kuličkám Eupergitu C do 1 ml kuliček Eupergitu® C suspendovaných ve vodě se přidají 2 ml roztoku obsahujícího buď úplný kasein, nebo kapa-kasein (10 mg/ml) v 100 mM sodnohydrogenuhličitanovém pufru, pH 8,5 s obsahem 0,5 M NaCl. Směs se inkubuje za rotace po dobu 48 hodin při teplotě místnosti. Granulát se izoluje odstředěním a promyje se postupně 9 ml alikvotu acetátu a Tris pufru a následně dvěma proplachy 9 ml alikvotu a MES pufru. Přidá se 10 ml 5% merkaptoethanolu a směs se inkubuje za rotačního míchání přes noc při teplotě místnosti. Kaseinem derivatizovaný nosič se izoluje odstředěním a promyje se čtyřikrát 9 ml MES pufru.

b. Značení kaseinu znehybnělého na Eupergitu® C pomocí HRPO

Tři ml aldehydem aktivovaného HRPO (Příprava D) se přidá do kaseinem derivatizovaného Eupergitu® C ze shora uvedeného odstavce a) a směs se inkubuje za rotace 1 hodinu při teplotě místnosti a 60 hodin při teplotě 4 °C. Granulát se izoluje odstředěním a promyje se 10 ml podíly vody. Do granulátu se přidá vodný roztok borhydridu sodného (5 ml) a suspense se inkubuje po dobu 6 hodin při teplotě místnosti. Granulát se izoluje odstředěním a promyje se postupně vždy 9 ml podíly pufrů acetátu, Tris, acetátu. Tris a MES.

N. Kovalentní vazba myoglobin-HRPO k polymemímu dialdehydu

1. Materiály

a. 30 mg koňského srdečního myoglobinu rozpuštěného ve 2 ml 20 mM bikarbonátového pufru, pH 9,5

b. Polymemí dialdehyd (celulozový dialdehyd od Sigma Chemical Co.)

c. Pufry:

i. 50 mM ethanolamin, pH 9,5 ii. 100 mM borát sodný, pH 9,0 s obsahem 0,5 M NaCl iii. 100 mM sodnoacetátový pufr s obsahem 0,5 M NaCl iv. 50 mM MES pufr, pH 6,0

v. 100 mM Tris pufr, pH 8,0 s obsahem 0,5 M NaCl

d. 100 mM formaldehyd

e. 100 mM kyanoborhydrid sodný ve vodě

2. Postup

a. Kovalentní vazba myoglobinu k polymemímu dialdehydu

Dva ml roztoku myoglobinu se smísí s 1 ml suspense polymemího dialdehydu a suspense se nechá rotovat při teplotě místnosti přes noc. Pryskyřice se oddělí odstředěním a promyje se dvakrát 10 ml alikvoty vody. Přidá se 9 ml roztoku ethanolaminu a suspense se inkubuje za rotace po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pryskyřice se oddělí odstředěním a promyje se potupně vždy 10 ml podíly pufrů acetátového, Tris a MES. Přidá se 20 ml kyanoborhydridu sodného. Suspense se inkubuje přes noc při teplotě 4 °C. Myoglobinem derivatizovaný polymemí dialdehyd se promyje pětkrát 10 ml alikvotů vody a dvakrát MES pufru.

-34CZ 289902 B6

b. Značení myoglobinem derivovaných kuliček aldehydem HRPO (Příprava D)

Do pryskyřice se přidají 2 ml odsoleného aldehydu HRPO (Příprava D) a suspense se inkubuje 1 hodinu za rotace při teplotě místnosti a přes noc při teplotě 4 °C. Pryskyřice se pak izoluje odstředěním, promyje se dvakrát vždy 10 ml podíly vody, suspenduje se ve 20 ml kyanborhydridu sodného a inkubuje se po dobu 60 hodin při teplotě 4 °C. Pryskyřice se izoluje odstředěním, promyje se dvakrát vždy 10 ml podíly vody, pak postupně dvakrát vždy 10 ml podíly pufrů acetát/NaCl a Tris/NaCl. Nakonec se pryskyřice promyje 10 ml MES pufru a uloží se až do použití při teplotě 4 °C.

O. Příprava HRPO značeného chitinu a jeho použití k chitinázovému testu

1. Materiály

a. Bromkyanem aktivovaný chitin (Příprava A)

b. HRPO (typ II od Sigma Chemical Co., 78 J/mg)

c. Chitináza (EC 3.2.1.14, izolovaná ze Streptomyces grisius, obchodní produkt Sigma Chemical Co.

d. Pufry:

i. 500 mM Tris/MES pufr, pH 5,4 ii. Kopulační pufr 100 mM hydrogenuhličitan sodný s obsahem 0,5 M NaCl iii. 100 mM sodnoacetátový pufr, pH 4,0 s obsahem 0,5 M NaCl iv. 100 mM sodnoborátový pufr, pH 8,0 s obsahem 0,5 M NaCl

v. 1,0 M Tris pufr, pH 8,0

e. Testovací směs ABTS: 40 ml 25 mg/ml ABTS (diamoniová sůl (2,2'-azino-di[3ethylbenzthiazolinsulfonová] kyseliny)

2. Postup

a. Příprava HRPO derivatizovaného chitinu

500 mg bromkyanem aktivovaného chitinu (Příprava A) se suspenduje v 5 ml kopulačního pufru, přidá se 5 mg HRPO a suspense se míchá bez přerušení 2 hodiny při teplotě místnosti. Pevný materiál se promyje destilovanou vodou a kopu lačním pufrem. Do nosiče se přidají 3 ml 1,0 M Tris-pufru, pH 8,0 a suspense se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti, načež se promyje třikrát postupně acetátovým a borátovým pufrem a nakonec vodou.

b. Chitinázový test mg chitinu značeného HRPO se suspenduje ve 200 μΐ pufru MES/Tris. Přidá se 50 μΐ roztoku chitinázy (50 J/ml) a směs se inkubuje 4 hodiny při teplotě 37 °C. Reakční směs se odstředí k sedimentování chitinu a smísí se 10 μΐ podíl supematantu se 100 μΐ testovací směsi ABTS. Uvolnění chitinázou katalyzované na chitin vázané HRPO se zjistí vytvořením zeleného zabarvení v roztoku.

P. Příprava bromkyanem aktivovaného sefarozového kaseinu nebo kapa-HRPO aldehydu

1. Materiály

a. Bromkyanem aktivovaná Sepharosa (Příprava A)

b. 10 mg/ml kaseinu nebo kapa-kaseinu v kopulačním pufru (0,1 M hydrogenuhličitan sodný s obsahem 0,5 M NaCl)

c. Pufry a roztoky:

-35CZ 289902 B6

i. 50 mM ethanolamin, pH 9,5 ii. 100 mM borát sodný, pH 9,0 s obsahem 0,5 M NaCl iii. 10 mM sodnoacetátový pufr, pH 4,0 s obsahem 0,5 M NaCl iv. 20 mM MES pufr, pH 5,0

v. 100 mM Tris pufr, pH 8,5 s obsahem 0,5 M NaCl vi. 100 mM borhydrid sodný ve vodě

d. HRPO aldehyd (Příprava D)

2. Postup ml kaseinového nebo kapa-kaseinového roztoku se přidá do 1 ml bromkyanem aktivované Sepharozy a suspense se inkubuje 2 hodiny za rotace při teplotě místnosti. Přidá se 7 ml roztoku ethanolaminu a směs se inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti. Pryskyřice se izoluje odstředěním a promyje se postupně 9 ml alikvotu acetátového a Tris-pufru s obsahem chloridu sodného a následně se promyje dvakrát 9 MIMES pufrem.

Přidají se 3 ml odsoleného HRPO aldehydu (Příprava D) a směs se nechá rotovat 1 hodinu při teplotě místnosti, s následnou inkubací přes noc při teplotě 4 °C. Pryskyřice se izoluje odstředěním a promyje se dvakrát 10 ml vody. Pryskyřice se suspenduje v 10 ml borhydridu sodného a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě místnosti. Nakonec se pryskyřice izoluje odstředěním a promyje se postupně 9 ml pufirů s obsahem 0,5 M NaCl: acetátového, Tris, acetátového a Tris-pufru. Pryskyřice se nakonec promyje 9 ml MES-pufru a uloží se v MES-pufru při teplotě 4 °C.

Q. Kovalentní vazba myoglobinu a albuminu hovězího séra k jemně práškovitému Eupergit® C akrylovým kuličkám (Eupergit®C) a následné kovalentní značení křenovou peroxidázou (aldehydový způsob).

Operace 1: Kovalentní vazba myoglobinu a albuminu hovězího séra k akrylovým kuličkám Eupergitu® C (Eupergit®C)

1. Materiály

a. Oxiranakrylové kuličky (Eupergit®C, 150 pm kuličky od Sigma Chemical Co.)

b. Koňský srdeční myoglobin (typ IV) nebo albumin hovězího séra (od Sigma Chemical Co.)

c. Pufry a roztoky:

i. 1,0 M draselnofosfátový pufr, pH 7,5 s obsahem 0,1 % azidu sodného (hmotnost k objemu) ii. 1,0 M NaCl iii. 5% (objemově) merkaptoethanol nastavený na hodnotu pH 8,0 0,5 N hydroxidem sodným iv. 100 M draselnofosfátový pufr, pH 7,5

v. 500 M draselnofosfátový pufr, pH 7,5 vi. 3,5 M thiokyanát sodný vii. Solanka fosfátového pufru (PBS) (0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,2 s obsahem

0,15 M NaCl)

d. Destilovaná voda

-36CZ 289902 B6

2. Postup

Jeden gram oxiranakrylových kuliček se roztluče paličkou v hmoždíři ručně na jemný prášek. Rozpustí se albumin hovězího séra (125 mg) v 5 ml 1,0 M fosfátového pufru, pH 7,5 s obsahem azidu sodného a přidá se 1 g jemně rozemletého Eupergitu® C. Směs se nechá inkubovat bez míchání po dobu 72 hodin při teplotě místnosti. Pomocí odstředění se nosič promyje třikrát 1,0 M NaCl a pětkrát 20 ml destilované vody. Nosič se smísí s 2,5 ml merkaptoethanolu předběžně nastaveného na hodnotu pH 8,0 a suspense se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Kuličky se promyjí desetkrát pomocí odstředění destilovanou vodou a postupně 50 ml následujících pufrů: 0,5 M draselnofosfátového pufru, pH 7,5; 0,1 M draselnofosfátového pufru, pH 7,5; 3,5 M thiokyanátu sodného a nakonec velkými objemy solanky pufrované fosfátem (PBS) (0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,2 s obsahem 0,15 M NaCl).

Operace 2: Kovalentní značení křenovou peroxidázou (aldehydová metoda)

Aldehydu křenové peroxidázy (Příprava D) se použije ke značení shora uvedených akrylových kuliček derivatizovaných myoglobinem nebo albuminem z operace 1 pomocí postupu F.

R. Vazba myoglobinu Sigmacell®-20 k HRPO glutaraldehydem

1. Materiály

a. Myoglobin kovalentně vázaný ke bromkyan aktivovanému Sigmacellu®-20 (Příprava E)

b. 0,5 M MES-pufr, pH 5,0

c. 1% (objemově) glutaraldehyd ve vodě

d. Hydrazid HRPO (od Sigma Chemical Co. 200 J/mg)

e. 100 mM formaldehyd

f. 100 mM kyanoborhydrid sodný

g. 0,5 M chlorid sodný

2. Postupy

Do 1 g myoglobinem konjugovaného Signacellu® 20 se přidá 1 ml glutaraldehydového roztoku a suspense se nechá rotovat 30 minut při teplotě místnosti a promyje se vodou. 5 mg hydrazidu HRPO ve 2 ml 100 mM Mes-pufru se přidá do promyté pryskyřice a suspense se nechá rotovat 4 hodiny při teplotě místnosti. Přidá se 200 μΐ roztoku 100 mM formaldehydu a směs se nechá inkubovat 30 minut při teplotě místnosti. Pryskyřice se promyje vodou, suspenduje se v 5 ml 100 mM kyanoborhydridu sodného a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C. Pryskyřice se pak promyje destilovanou vodou a 0,5 M NaCl a uloží se v podobě vlhké pasty až do použití.

S. Příprava guaiakolového roztoku a guaiakolových listů

1. Guaiakol, roztok hydroxypropylcelulozy (to je guaiakolový inkoust)

Rozpustí se 150 g práškovitého guaiakolu v 660 ml teplého míchaného ethanolu. Do výsledného roztoku se přidá 1330 ml destilované vody a výsledná suspense se nechá vychladnout na teplotu místnosti. Po 2 hodinách se supematant dekantuje a zbylá suspense se zachytí.

Smísí se 250 ml 10% (hmotnostně) roztoku hydroxypropylcelulozy v ethanolu s dalšími 250 ml ethanolu a výsledný roztok se přidá do guaiakolové suspense. Směs se míchá dokud se guaiakolový zbytek úplně nerozpustí.

-37CZ 289902 B6

2. Guaiakolové listy

Pipetou se nanese 1 ml shora uvedeného guaiakolového roztoku na polyethylenovou stranu listu 254x254 mm Mylar/polyethylenového laminátu (0,178 mm Mylar/3 ml polyethylen). Guaiakolový roztok se rozetře po povrchu listu standardní zkušební tyčinkou z pleteného drátu a nechá se vyschnout při teplotě místnosti.

T. Příprava suspense perborátu sodného (to je sodnoperborátového inkoustu) g jemně rozemletého pevného perborátu sodného se smísí s dostatečným objemem 10% (hmotnostně) roztoku hydroxypropylcelulozy v bezvodém alkoholu k vytvoření 1 litru suspense.

II. Pokusy

Pokus I

Tento pokus se týká uvolnění HRPO se [Sepharose-kasein HRPO] a [Sepharose-kapa-kasein HRPO] asparagovou proteázou uvolněnou do kultury Candida albicans.

A. Materiály: (Sefarosa aktivovaná kyanogenbromidem) (metoda kopulace aldehydem HRPO)

1. Bromkyanem aktivovaná Sepharosa 4B (Příprava A) napřed derivatizovaná kovalentně vázaným kaseinem nebo kapa-kaseinem (Příprava P) a následně značená aldehydem HRPO (Příprava D)

2. Asparagová proteáza produkující kulturu Candida albicans (ATCC 28366) propagovanou a pěstovanou v kapalné kultuře jak je popsáno v Joumal of Generál Microbiology, 129, str. 431 až 438 (1983).

3. Guiakolem pokryté listy (Příprava S)

4. Pufry a roztoky

a. 20 mM peroxid vodíku

b. 500 mM MES-pufr, pH 6,0

B. Postupy mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sepharose-kasein HRPO] (nebo Kapa-kaseinového derivátu) se suspenduje ve 300 μΐ buď v kultuře Candida albicans obsahující aktivní sekretovanou asparagovou proteázu, nebo 300 μΐ téže kultury Candida albicans vařené 20 minut k inaktivaci asparagové proteázy. Směs se nechá rotovat 15 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a buněk Candida albicans.

μΐ čirého supematantu se smísí s 10 μΐ roztoku peroxidu vodíku a 10 μΐ pufru MES. 20 μΐ každého roztoku se přidá na povrch guaiakolem povlečeného listu a list se zkoumá z hlediska vytvoření modrého zabarvení.

-38CZ 289902 B6

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možná modrá barva
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,50	Zřetelně modrá barva
1,00	Tmavě modrá barva
1,50	Modrá barva o intenzitě 1,0 až 2,0
2,00	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému
C. Výsledky
Tmavě modré zabarvení se utvoří	na guaiakolem povlečeném listu v místě přidání supematantu
Sepharosa-protein-HRPO-zpracovaného Candida albicans. Žádné zabarvení není patrno v místě,
do kterého byl přidán vařenou kulturou zpracovaný supematant Sepharosa-protein-HRPO.
Zdroj enzymu	Zabarvení
Kultura Candida albicans	1,5
Vařená kultura	0

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza sekretovaná do růstového prostředí buňkami Candida albicans hydrolyzuje kasein nebo kapa-kasein vázaný na Sepharosu při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje HRPO vázané na Sepharosu a nechává pouze rozpustnou asparagovou proteázu v roztoku. Rozpustné HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvou. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob jak zjišťovat asparagovou proteázu.

Vaření kultury inaktivuje asparagovou proteázu vylučovanou do růstového prostředí buňkami Candida albicans. Není tudíž hydrolyzován kasein vázaný na Sepharosu nebo kapa-kasein a z nosiče se neuvolní rozpustná aktivní HRPO. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sepharosu nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázu solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení. Uvolňování HRPO z nosiče není jednoduše výsledkem nespecifického uvolňování HRPO solemi nebo jinými sloučeninami přítomnými v růstovém prostředí.

Pokus II

Tento pokus se týká uvolnění HRPO se [Eupergit® C akrylové kuličky-kasein HRPO] konjugátů a [Eupergit® C akrylové kuličky-kapa-kasein HRPO] aspartovou proteázou uvolněnou do kultury Candida albicans.

A. Materiály: (Eupergitem® C aktivované akrylové kuličky) (metoda kopulace aldehydem HRPO)

1. Oxiranakrylové kuličky (Eupergit® C se zpracují kaseinem nebo kapa-kaseinem (Příprava M) a následně značí aldehydem HRPO (Příprava D)

2. Asparagová proteázy produkující kulturu Candida albicans (ATCC 28366) propagovanou a pěstovanou v kapalné kultuře jak je popsáno v Joumal of Generál Microbiology, 129, str. 431 až 438 (1983).

3. Guaiakolem pokryté listy (Příprava S)

-39CZ 289902 B6

4. Pufry a roztoky

a. 20 mM peroxid vodíku

b. 500 mM MES-pufr, pH 6,0

B. Postupy mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Eupergit® C-kasein-HRPO] (nebo kapa-kaseinového ekvivalentu) se suspenduje ve 300 μΐ buď kultury Candida albicans obsahující vyloučenou asparagovou proteázu, nebo 300 μΐ téže kultury Candida albicans, která byla vařena 20 minut k inaktivaci asparagové proteázy. Směs se nechá rotovat 15 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a buněk Candida albicans.

Smísí se 80 μΐ čirého supematantu s 10 μΐ roztoku peroxidu vodíku a 10 μΐ MES-pufru. Umístí se 20 μΐ každého roztoku na povrch guaiakolem povlečeného listu a zkoumá se vytvoření modrého zabarvení na listu.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možná modrá barva
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,50	Zřetelná modrá barva
1,00	Tmavě modrá barva
1,50	Modrá barva o intenzitě 1,0 až 2,0
2,00	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě přidání supematantu Eupergit® C-protein-HRPO zpracovaného Candida albicans. Žádné zabarvení není patrno v místě, do kterého byl přidán vařenou kulturou zpracovaný supematant Eupergit® C-proteinHRPO.

Zdroj enzymu	Zabarvení
Kultura Candida albicans	1,5
Vařená kultura	0

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza sekretovaná do pěstovaného média buňkami Candida albicans hydrolyzuje kapa-kasein nebo kasein vázaný na Eupergit^RC za uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje HRPO vázané na Eupergit®C a nechává pouze rozpustnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob jak zjišťovat asparagovou proteázu.

Vaření kultury inaktivuje asparagovou proteázu vylučovanou do růstového prostředí buňkami Candida albicans. Není tudíž hydrolyzován kasein vázaný na Eupergit^RC nebo kapa-kasein a z nosiče se neuvolní rozpustná aktivní HRPO. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Eupergit®C nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázu solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré

-40CZ 289902 B6 zabarvení. Uvolňování HRPO z nosiče není jednoduše výsledkem nespecifického uvolňování HRPO solemi nebo jinými sloučeninami přítomnými v růstovém prostředí.

PokusΙΠ

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Sepharose-hemoglobin-HRPO] nebo [Sepharosemyoglobin-HRPO] pepsinem a asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi.

A. Materiály: (Sepharose aktivovaná bromkyanem) (způsob aldehydové vazby HRPO)

1. Bromkyanem aktivovaná Sepharosa 4B (Příprava A) napřed derivatizovaná kovalentně vázaným hemoglobinem nebo myoglobinem (Příprava E) a následně značená aldehydem HRPO (Příprava D a F). Konjugát se zpracuje přes noc 100 mM kyanborhydridem sodným při teplotě místnosti a před použitím se promyje 0,5 M NaCl.

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza (typ ΧΠΙ) z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobě obchodně dostupných proužků Hemoccult® (ode SmithKline Diagnostice)

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátovém pufru, pH 7,0

b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0

B. Postupy mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sepharose-hemoglobin-HRPO] nebo (myoglobinového ekvivalentu) se suspenduje v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje po dobu 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k dostranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
025	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelně modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utváří na guaiakolem povlečeném listu v místě kam byly přidány vzorky supematantu obsahující asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi. Pouze velmi jemné zabarvení je patrno v místě, do kterého byly přidány podíly supematantu obsahující pouze samotný BSA (2 mg/ml) nebo pufr.

-41 CZ 289902 B6

Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a pepsin a asparagová proteáza z vepřového žaludku hydrolyzuje Sepharosou vázaný hemoglobin nebo myoglobin, při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje Sepharosou vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob zjišťování aktivní Aspergillus aspartové proteázy nebo vepřového pepsinu.

Ani BSA, ani pufr nemají aktivitu asparagová proteázy. Není tudíž hydrolyzován Sepharosou vázaný hemoglobin nebo myoglobin a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sepharosu nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

Pokus IV

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Sepharose-kasein-HRPO] nebo [Sepharose-kapakasein-HRPO] pepsinem a asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi.

A. Materiály: (Sepharosa aktivovaná bromkyanem) (způsob hydrazidové vazby HRPO)

1. Bromkyanem aktivované Sepharosa 4B (Příprava A) nechaná reagovat s kapa-kaseinHRPO nebo kasein-HRPO (hydrazidový způsob) (Příprava B a C).

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobě obchodně dostupných proužků Hemoccult®

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátovém pufru, pH 7,0

b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0

B. Postupy mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sepharose-kasein-HRPO] nebo (kapa-kaseinového ekvivalentu) se suspenduje v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k odstranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.

-42CZ 289902 B6

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému
C. Výsledky
Tmavě modré zabarvení se utváří	na guaiakolem povlečeném listu v místě přidání vzorků
supematantu obsahujících asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi nebo pepsin. Pouze jemnější
zabarvení je patrno vmiste, do kterého byly přidány podíly supematantu obsahující pouze
samotný BSA (2 mg/ml) nebo pufr.
Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a vepřový pepsin hydrolyzuje Sepharosou vázaný kasein nebo kapa-kasein, při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje Sepharosou vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustné HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolem peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob, jak zjišťovat asparagovou proteázu nebo pepsin.

Ani BSA, ani pufř nemají aktivitu asparagové proteázy. Není tudíž hydrolyzován Sepharosou vázaný kasein nebo kapa-kasein a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sepharosu nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

Pokus V

Tento pokus se týká uvolňování HRPO z [chitin-kapa-kasein-HRPO] pepsinem a asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi.

A. Materiály: (Bromkyanem aktivovaný chitin) (způsob hydrazidové vazby HRPO)

1. Bromkyanem aktivovaný chitin (Příprava A) se nechá reagovat s kapa-kasein-HRPO (hydrazidový způsob) (Příprava B a C).

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobě obchodně dostupných proužků Hemoccult® (od SmithKline Diagnostice)

-43CZ 289902 B6

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátovém pufru, pH 7,0 b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0 B. Postupy Suspenduje se 40 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [chitin-kapa-kasein-HRPO] v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k odstranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.
Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému
C. Výsledky
Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě přidání vzorků supematantu obsahujícího asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi nebo pepsin. Pouze sotva znatelné zabarvení je patrno v místě, do kterého byly přidány podíly supematantu obsahujícího
pouze samotný BSA (2 mg/ml) nebo pufr.
Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a vepřový pepsin hydrolyzuje Sigmacell® 20 vázaný hemoglobin nebo myoglobin, při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje Sigmacell® 20 vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob, jak zjišťovat asparagovou proteázu nebo pepsin.

Ani BSA, ani pufr nemají aktivitu asparagové proteázy. Není tudíž hydrolyzován Sigmacell® 20 vázaný hemoglobin nebo myoglobin a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sigmacell® 20 nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázu solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

-44CZ 289902 B6

Pokus VI

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Sigmacell® 20-hemoglobin-HRPO] nebo [Sigmacell® 20-myoglobin-HRPO] pepsinem a asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi.

A. Materiály: (Bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20) (způsob aldehydové vazby HRPO)

1. Bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20 (Příprava A) napřed derivatizovaný kovalentně vázaným hemoglobinem nebo myoglobinem (Příprava E) a následně značený aldehydem HRPO (Příprava D až F). Konjugát se zpracuje přes noc 100 mM kyanborhydridem sodným při teplotě místnosti a před použitím se promyje 0,5 M NaCl.

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobě obchodně dostupných proužků Hemoccult®

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátovém pufru, pH 7,0

b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0

B. Postupy

Suspenduje se 40 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sigmacell® 20-hemoglobin-HRPO] v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k dostranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu vmiste přidání vzorků supematantu obsahujícího asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi nebo pepsin. Pouze velmi jemné zabarvení je patrno v místě, do kterého byly přidány podíly supematantu BSA (2 mg/ml) nebo pufr.

Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

-45CZ 289902 B6

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a vepřový pepsin hydrolyzuje Sigmacell®20 vázaný hemoglobin nebo myoglobin, při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje Sigmacell® 20 vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob, jak zjišťovat asparagovou proteázu nebo pepsin.

Ani BSA, ani pufr nemají aktivitu asparagové proteázy. Není tudíž hydrolyzován Sigmacell® 20 vázaný hemoglobin nebo myoglobin a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sigmacell® 20 nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

Pokus VII

Tento pokus se týká uvolňování HRPO se [Sigmacell® 20-kapa-kasein-HRPO] pepsinem a asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi.

A. Materiály: (Bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20) (způsob hydrazidové vazby HRPO)

1. Bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20 (Příprava A) nechaný reagovat s kapa-kaseinHRPO (hydrazidový způsob) (Příprava B a C)

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobně obchodně dostupných proužků Hemoccult®

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátovém pufru, pH 7,0

b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0

B. Postupy

Suspenduje se 40 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sigmacell® 20-kapa-kasein-HRPO] v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k dostranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

-46CZ 289902 B6

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném litu v místě přidání vzorků supematantu obsahujících asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi nebo pepsin. Pouze velmi jemné zabarvení je patrno v místě, do kterého byly přidány podíly supematantu BSA (2 mg/ml) nebo pufr.

Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a vepřový pepsin hydrolyzuje Sigmacell® 20 vázaný kapa-kasein při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje Sigmacell®20 vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob jak zjišťovat asparagovou proteázu nebo pepsin.

Ani BSA, ani pufr nemají aktivitu asparagové proteázy. Není tudíž hydrolyzován Sigmacell® 20 vázaný kapa-kasein a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sigmacell® 20 nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

Pokus vm

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Sigmacell®20-kapa-kasein-HRPO] (hydrazidový způsob) nebo [Sigmacell® 20-myoglobin/hemoglobin-HRPO] (aldehydový způsob) asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi nebo pepsinem.

A. Materiály: (Bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20)

1. Bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20 (Příprava A) nechaný reagovat s kapa-kaseinHRPO (hydrazidový způsob) (Příprava B). Alternativně se derivatizuje bromkyanem aktivovaný Sigmacell® 20 (Příprava E) a pak se váže k aldehydu HRPO (Příprava D)

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobě obchodně dostupných proužků Hemoccult®

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátového pufru, pH 7,0

b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0

-47CZ 289902 B6

B. Postupy

Suspenduje se 40 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sigmacell® 20-lkapa-kasein-HRPO] v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k odstranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě přidání vzorků supematantu obsahujícího asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi nebo pepsin. Pouze velmi jemné zabarvení je patrno v místě, do kterého byly přidány podíly supematantu BSA (2 mg/ml) nebo pufr.

Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a vepřový pepsin hydrolyzuje Sigmacell® 20 vázaný kapa-kasein při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuj e Sigmacel*20 vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob, jak zjišťovat asparagovou proteázu nebo pepsin.

Ani BSA, ani pufr nemají aktivitu asparagové proteázy. Není tudíž hydrolyzován Sigmacell® 20 vázaný kapa-kasein a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sigmacell® 20 nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

Pokus IX

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Sigmacell® 20-hemoglobin-HRPO] nebo [Sigmacell® 20-myoglobin-HRPO] asparagovou proteázou uvolněnou do kultury Candida albicans.

A. Materiály: (aldehydem aktivovaný Sigmacell® 20) (způsob aldehydové vazby HRPO)

-48CZ 289902 B6

1. Aldehydem aktivovaný Sigmacell®20 (Příprava G) se napřed derivatizuje skovalentně vázaným hemoglobinem nebo myoglobinem (Příprava H) a následně s aldehydem HRPO (Příprava A a F)

2. Kultura Candida albicans (ATCC 28366) produkující asparagovou proteázu propagovaná a vypěstovaná v kapalné kultuře, jak popsána v Joumal of Generál Microbiology 129, str. 431 až 438(1983)

3. Guaiakolem impregnovaný papír (Příprava S)

4. Pufry a roztoky

a. 20 mM peroxid vodíku

b. 500 mM MES pufr, pH 6,0

B. Postupy

Suspenduje se 10 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sigmacell® 20-protein-HRPO] ve 300 μΐ buď kultury Candida albicans obsahující vyloučenou asparagovou proteázu, nebo 300 μΐ téže kultury Candida albicans, která byla vařena 20 minut k inaktivaci asparagové proteázy. Směs se nechá rotovat 15 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a buněk Candida albicans.

μΐ čirého supematantu se smísí s 10 μΐ roztoku peroxidu vodíku a 10 μΐ MES-pufru. 20 μΐ každého roztoku se umístí na povrch guaiakolem povlečeného listu a list se zkoumá na modré zabarvení.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
1,5	Modrá barva o intenzitě 1,0 až 2,0
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému
C. Výsledky
Tmavě modré zabarvení se utvoří	na guaiakolem povlečeném listu v místě, kam byl přidán
proteinem Sepharose-HRPO zpracovaná Candida albicans. V místě, kam byl vnesen vařenou
kulturou zpracovaný protein Sepharose-HRPO není patrno žádné zabarvení.
Zdroj enzymu	Zabarvení
Kultura Candida albicans	1,5
Vařená kultura	0

D. Interpretace

Asparagová proteáza sekretovaná do pěstovaného média buňkami Candida albicans hydrolyzuje protein vázaný na Sigmacell® 20 a uvolňuje rozpustnou, aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje HRPO vázané na Sepharosu a nechává pouze rozpustnou asparagovou proteázu v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guaiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob jak zjišťovat asparagovou proteázu.

-49CZ 289902 B6

Vaření kultury inaktivuje asparagovou proteázu vylučovanou do pěstovaného média buňkami Candida albicans. Není tudíž hydrolyzován protein vázaný na Sigmacell®20 a z nosiče se neuvolní rozpustná aktivní HRPO. Odstředění sedimentované HRPO vázané na Sigmacell® 20 nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázu solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení. Uvolňování HRPO z nosiče není jednoduše výsledkem nespecifického uvolňování HRPO solemi nebo jinými sloučeninami přítomnými pěstovaném médiu.

Pokus X

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [polymemí dialdehyd-kapa-kasein-HRPO] asparagovou proteázou z Aspergillus saitoi.

A. Materiály: (Polymemí dialdehyd) (HRPO hydrazidový způsob vazby)

1. Obchodně dostupný polymemí dialdehyd od Sigma Chemical Co. se nechá reagovat s kapakasein-HRPO (hydrazidový způsob) (Příprava B a L).

2. Zkušební roztoky: a. Obchodně dostupná asparagová proteáza z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 J/mg); b. pepsin (1 mg/ml, 2900 J/mg) a c. albumin hovězího séra (BSA) (2 mg/ml ve vodě) (vše od Sigma Chemical Co.)

3. Guaiakolem impregnovaný papír v podobě obchodně dostupných proužků Hemoccult®

4. Pufry a roztoky

a. 0,02 % (objemově) peroxid vodíku ve 200 mM fosfátového pufru, pH 7,0

b. 100 mM acetátový pufr, pH 4,0

B. Postupy

Suspenduje se 40 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [polymemí aldehyd-kapa-kasein-HRPO] v 75 μΐ acetátového pufru, pH 4,0 a přidá se 25 μΐ zkoušeného roztoku. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a odstředí se k odstranění konjugátu pevné fáze. Přidá se 5 μΐ supematantu na guaiakolový proužek a následně 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
1,5	Modrá barva o intenzitě 1,0 až 2,0
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě přidání vzorků supematantu obsahujícího asparagovou proteázu z Aspergillus saitoi nebo pepsin. Pouze velmi jemné zabarvení je patrno v místě, do kterého byly přidány podíly supematantu BSA (2 mg/ml) nebo pufr.

-50CZ 289902 B6

Zdroj enzymu	Zabarvení
Asparagová proteáza	2,0
Pepsin	2,0
BSA	±
Pufr	±

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza Aspergillus saitoi a vepřový pepsin hydrolyzuje polymemím dialdehydem vázaný kapa-kasein při uvolňování rozpustné aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje polymemím dialdehydem vázanou HRPO a nechává pouze enzym solubilizovaný HRPO v roztoku. Rozpustná HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modrou barvu. Tvoření modrého zabarvení na guiakolem povlečených listech představuje tudíž pohodlný způsob, jak zjišťovat asparagovou proteázu nebo pepsin.

Ani BSA, ani pufr nemají aktivitu asparagové proteázy. Není tudíž hydrolyzován polymemím dialdehydem vázaný kapa-kasein a rozpustná aktivní HRPO se z nosiče neuvolní. Odstředění sedimentované HRPO vázané na polymemí dialdehyd nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení.

Pokus XI

Tento pokus se týká uvolňování HRPO z [polymemí dialdehyd-myoglobin-HRPO] asparagovou proteázou z Candida albicans.

A. Materiály: (polymemí dialdehyd) (způsob aldehydové vazby HRPO).

1. Obchodně dostupný polymemí dialdehyd od Sigma Chemical Co. se nechá reagovat s myoglobinem (Příprava N) a následně s aldehydem HRPO (Příprava N).

2. Kultura Candida albicans (ATCC 28366) produkující asparagovou proteázu propagovaná a vypěstovaná v kapalné kultuře, jak popsáno vJoumal of Generál Microbiology 129, str. 431 až 438 (1983)

3. Guaiakolem impregnovaný papír (Příprava S)

4. Pufry a roztoky

a. 20 mM peroxid vodíku

b. 500 mM MES pufr, pH 6,0

B. Postupy

Suspenduje se 10 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [polymemí dialdehyd-myoglobin-HRPO] ve 300 μΐ buď kultury Candida albicans obsahující vyloučenou asparagovou proteázu, nebo ve 300 μΐ téže kultury Candida albicans, která byla vařena 20 minut k inaktivaci asparagové proteázy. Směs se nechá rotovat 20 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a buněk Candida albicans.

μΐ čirého supematantu se smísí s 10 μΐ roztoku peroxidu vodíku a 10 μΐ MES-pufru. 20 μΐ každého roztoku se umístí na povrch guaiakolem povlečeného listu a list se zkoumá na modré zabarvení.

-51 CZ 289902 B6

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
1,5	Modrá barva o intenzitě 1,0 až 2,0
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě, kam byl přidán polymemí dialdehydem-myoglobin-HRPO zpracovaný Candida albicans. V místě, kam byl vnesen vařenou kulturou zpracovaný dialdehyd-myoglobin-HRPO, není patrno žádné zabarvení.

Zdroj enzymu	Zabarvení
Kultura Candida albicans	1,5
Vařená kultura	0

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza sekretovaná do růstového prostředí buňkami Candida albicans hydrolyzuje polymemí dialdehyd-myoglobin a uvolňuje rozpustnou, aktivní HRPO. Odstředěním sedimentuje HRPO vázané na polymemí dialdehyd a nechává pouze rozpustnou asparagovou proteázu HRPO v roztoku. Rozpustné HRPO katalyzuje oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku, čímž vytváří modré zabarvení.

Vaření kultury inaktivuje asparagovou proteázu vylučovanou do pěstovaného média buňkami. Candida albicans. Není tudíž hydrolyzován protein vázaný na polymemí dialdehyd a z nosiče se neuvolní rozpustná aktivní HRPO. Odstředění sedimentované HRPO vázané na polymemí dialdehyd nezanechává v roztoku žádnou asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO. Oxidace guaiakolu peroxidem vodíku není katalyzována a vytváří se sotva znatelné modré zabarvení. Uvolňování HRPO z nosiče není jednoduše výsledkem nespecifického uvolňování HRPO solemi nebo jinými sloučeninami přítomnými v růstovém prostředí.

Pokus ΧΠ

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Sepharose 6MB-kapa-kasein-HRPO] vzorky vaginální tekutiny:

1. Normální vaginální tekutina

2. Normální vaginální tekutina, do které byla přidána kultura Candida albicans

3. Vaginální tekutina od žen s klinicky diagnózovanou vulvovaginální kandidiózou

A. Materiály: (Obchodně dostupná bromkyanem aktivovaná Sepharosa 6 MB) (způsob HRPO hydrazinové vazby)

1. Konjugát Sepharose 6 MB-kapa-kasein-HRPO (Příprava C)

2. Vzorky vaginální tekutiny získané na standardních dekronových tamponech. Vzorky se zmrazí až těsně do použití. Vzorky se rozmrazí a odstředí ve speciálně upravených zkumavkách k umožnění extrakce nezředěné vaginální tekutiny z tamponu. Zkouší se celý vzorek z každého

-52CZ 289902 B6 tamponu. Popřípadě se přidá ke vzorku destilovaná voda na doplnění konečného objemu do 75 μΐ.

Kde je indikována, přidá se 25 μΐ kultury Candida albicans (viz pokus 1) do vzorků vaginální tekutiny získaných od žen bez klinické vulvovaginální candidiasis.

3. Guaiakolem impregnovaný filtrační papír (obchodně dostupné proužky Hermoccult®)

4. Pufry a roztoky

a. 6 mM peroxid vodíku

b. 250 mM glycylglycinový pufr, pH 3,0

B. Postupy

Suspenduje se 30 mg (vlhká hmotnost) konjugátu [Sepharose-kapa-kasein-HRPO] v 75 μΐ zpracované nebo nezpracované vaginální tekutiny. Suspense se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a ostatních částic.

μΐ čirého supematantu se umístí na povrch guaiakolem povlečeného listu a následně se přidá 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku a list se zkoumá na modré zabarvení.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavější modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Tmavě modré zabarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě, kam byl přidán supematant vaginální tekutiny od žen infikovaných vulvovaginální kandidiózou. V místě, kam byl nanesen supematant vaginální tekutiny od kontrolních žen se nevytvoří žádné zabarvení. Silně modré zabarvení se vytvoří také na guaiakolem impregnovaném papim v místě, kam byl nesen supematant vaginální tekutiny od normálních žen, který byl doplněn mediem z pěstované kultury Candida albicans.

-53CZ 289902 B6

Vzorek číslo	Diagnóza	Zabarvení
7757	kandidióza	2,0
7701	kandidióza	2,0
7749	kandidióza	2,0
7760	kandidióza	2,0
7753	kandidióza	2,0
7795	kandidióza	2,0
7779	kandidióza	2,0
7799	kandidióza	2,0
7768	normální	1,0
7770	normální	0,0
7744	normální	0,0
7745	normální	0,0
7750	normální	0,0
7761	normální	0,0
0001	normální	0,0
0001	normální + kultura Candida	2,0
7747	normální + kultura Candida	2,0
7748	normální + kultura Candida	1,0
7750	normální + kultura Candida	2,0
7756	normální + kultura Candida	2,0

D. Interpretace

Vaginální tekutina od žen s klinicky prokázanou vulvovaginální kandidiózou obsahuje asparagovou proteázu, která hydrolyzuje na Sepharosu 6 MB vázaný kapa-kasein při hodnotě pH 3,0 v 15 minutách při teplotě místnosti při uvolňování rozpustné, aktivní HRPO. Odstředěním sedimentovaná na Sepharosou 6 MB vázaná HRPO zanechává pouze uvolněnou solubilizovanou HRPO v roztoku. Oxidace komerčních proužků Hermoccult® katalyzovaná rozpustnou HRPO vytváří modré zbarvení. Tvoření modrého zabarvení na proužcích Hermoccult® představuje tudíž pohodlný způsob jak zjišťovat od Candida odvozenou asparágovou proteázu ve vaginální tekutině a tudíž vulvovaginální kandidiózu.

Vaginální tekutina od normálních žen bez vulvovaginální kandidiózy neobsahuje asparagovou proteázu a nehydrolyzuje na Sepharosu 6 MB vázaný kapa-kasein při hodnotě pH 3,0 v 15 minutách při teplotě místnosti a neuvolňuje rozpustné, aktivní HRPO. Odstředěním sedimentovaná na Sepharosu 6 MB vázaná HRPO zanechává neuvolněnou solubilizovanou HRPO v roztoku. Tím, že chybí katalyzátor HRPO, nenastává na komerčních proužcích Hermoccult® oxidace a nevytváří se modré zbarvení. Chybějící modré zabarvení na proužcích Hermoccult® poskytuje tudíž pohodlný způsob, jak zjišťovat u normálních žen chybějící od Candida odvozenou asparágovou proteázu ve vaginální tekutině a tudíž žen nemajících vulvovaginální kandidiózu.

Konečně jestliže se přidá prostředí z kultury Candida albicans do vaginální tekutiny normálních žen bez vulvovaginální kandidiózy, nastane hydrolysa na Sepharosu 6 MB vázaného kapa-kaseinu při pH 3,0 v 15 minutách při teplotě místnosti a uvolní se rozpustná aktivní HRPO. Odstředění sedimentované na Sepharosu 6 MB vázané HRPO zanechává uvolněnou solubilizovanou HRPO v roztoku. Oxidace komerčních proužků Hermocullt® katalyzovaná rozpustnou HRPO vytváří modré zbarvení. Tvoření modrého zabarvení na proužcích Hermoccult® dokazuje, že lze snadno a pohodlně zjistit uvolnění asparagové proteázy do pěstovaného média buněk Candida albicans i když je přidáno do vaginální tekutiny od normálních žen.

-54CZ 289902 B6

Pokus XIII

Tento pokus se týká uvolňování HRPO ze [Eupergit®C-myoglobin-HRPO] a [Sigmacell® 20-myoglobin-HRPO] vzorky vaginální tekutiny:

1. Normální vaginální tekutina

2. Vaginální tekutina od žen s klinicky diagnózovanou vulvovaginální candidiasis

A. Materiály: (Bromkyanem aktivovaná Sigmacell®20-myoglobin-HRPO-Příprava A a I) a (Eupergit®C-myoglobin-HRPO-Příprava Q) (způsob HRPO aldehydové vazby)

1. Jemně rozemleté oxiranakrylové kuličky vázané na aldehyd myoglobin-HRPO (Příprava Q)

2. Sigmacell® 20 (bromkyanem aktivovaný, Příprava A) vázaný na myoglobin-HRPO aldehyd (Příprava I)

3. Vzorky vaginální tekutiny získané na standardních dakronových tamponech. Vzorky se zmrazí až těsně do použití. Vzorky se rozmrazí a odstředí ve speciálně upravených zkumavkách k umožnění extrakce nezředěné vaginální tekutiny z tamponu. Zkouší se celý vzorek z každého tamponu.

4. Guaiakolem impregnovaný filtrační papír (obchodně dostupné proužky Hemoccult®)

5. Pufry a roztoky

a. 6 mM peroxid vodíku

b. 250 mM glycylglycinový pufr, pH 3,0

c. 1,0 M acetátový pufr, pH 4,0

B. Postupy

Suspenduje se 20 mg (vlhká hmotnost) konjugátu na Eupergit® vázaný myoglobin-HRPO v nezředěné vaginální tekutině a 10 μΐ 1M acetátového pufru. Suspense se inkubuje 10 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a ostatních částic.

μΐ čirého supematantu se umístí na povrch guaiakolem povlečeného listu a následně se přidá 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku a list se zkoumá na modré zabarvení.

mg (vlhká hmotnost) konjugátu na Sigmacell® 20 vázané myoglobin-HRPO se suspenduje v nezředěné vaginální tekutině a 10 μΐ 250 mM acetátovém pufru. Suspense se inkubují 15 minut při teplotě místnosti a suspense se odstředí k sedimentaci pevného konjugátu a ostatních částic.

μΐ čirého supematantu se umístí na povrch guaiakolem povlečeného listu a následně se přidá 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku a list se zkoumá na modré zabarvení.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavší modrá barva možná ve zkuš. systému

-55CZ 289902 B6

C. Výsledky

Tmavě modré zbarvení se utvoří na guaiakolem povlečeném listu v místě, kam byl přidán supematant vaginální tekutiny od žen infikovaných vulvovaginální kandidiózou. V místě, kam byl nanesen supematant vaginální tekutiny od kontrolních žen se nevytvoří žádné zabarvení.

Vzorek číslo	Diagnóza	Substrát	Zabarvení
7823	kandidióza	Sigmacell®	2,0
7824	kandidióza	Sigmacell®	2,0
7844	kandidióza	Sigmacell®	2,0
7848	kandidióza	Sigmacell®	2,0
7820	kontrola	Sigmacell®	0,0
7821	kontrola	Sigmacell®	0,0
7826	kontrola	Sigmacell®	0,0
7831	kontrola	Sigmacell®	0,0
7891	kandidióza	Eupergit®C	2,0
7821	kandidióza	Eupergit®C	2,0
7914	kontrola	Eupergit®C	+/-
7915	kontrola	Eupergit®C	0,0

D. Interpretace

Aktivní asparagová proteáza, sekretovaná do buněk vaginální tekutiny žen s klinickou Candida albicans, hydrolyzuje jak na Sigmacell® 20 vázaný protein, tak na Eupergit® vázaný protein, při uvolňování rozpustné, aktivní HRPO. Odstředěním sedimentovaná na polymer vázaná HRPO zanechává pouze uvolněnou solubilizovanou HRPO v roztoku. Rozpustnou HRPO katalyzovaná oxidace guaiakolu peroxidem vodíku vytváří modré zabarvení. Tvoření modrého zabarvení na proužcích Hermoccult® představuje tudíž pohodlný způsob, jak zajišťovat aktivní asparágovou proteázu ve vaginální tekutině a tudíž vulvovaginální candidiasis.

Aktivní asparagová proteáza se nenachází ve vaginální tekutině kontrolních žen, to je žen bez klinické kandidiózy. Vzorky vaginální tekutiny od kontrolních žen tudíž nehydrolyzují protein vázaný na polymer a neuvolňují rozpustnou, aktivní HRPO z kteréhokoli nosiče. Odstředěním sedimentovaná na polymer vázaná HRPO nezanechává asparagovou proteázou solubilizovanou HRPO v roztoku. Tím, že chybí HRPO, nekatalyzuje supematant z kontrolních vzorků oxidaci guaiakolu peroxidem vodíku a nevytvoří modré zabarvení. Chybějící modré zabarvení na guaiakolem napuštěném papim poskytuje tudíž pohodlný způsob identifikace žen, jež nebyly infikovány vulvovaginální Candida albicans.

Pokus XIV

Tento pokus se týká rozdílné hydrolytické aktivity několika mikrobiálních proteáz na [Sigmacell®-Myoglobin-HRPO]

A. Materiály

1. [Sigmacell®-Myoglobin-HRPO] (Příprava E a F)

2. Asparagová proteáza produkující Candida albicans (kultura ATCC 28366)

3. Kultura buněčné suspense Trichomonas vaginalis (ATCCF 3001)

4. Buněčná suspense Mobiluncus curtisii (ATCC 35241)

-56CZ 289902 B6

5. Pufiy a roztoky

a. 0,2% roztok peroxidu vodíku

b. pufr fosforečnanu draselného pH 7,5,300 mM

c. sodno-acetátový pufr pH 4,0,100 mM

6. guaiakolem impregnovaný papír (obchodní proužky Hermoccult®)

B. Postup

Suspenduje se 20 mg substrátu [Sigmacell®-Myoglobin-HRPO] v 75 μΐ příslušného pufru (viz tabulku) a přidá se 25 μΐ suspense buněčné kultury. Reakční směs se inkubuje 10 až 30 minut, načež se vzorek odstředí k odstranění konjugátu pevné fáze a úlomků buněk. Na guaiakolový proužek se nanese 5 μΐ supematantu a vyvolá se 5 μΐ roztoku peroxidu vodíku. Podmínky reakce a vývoj zabarvení jsou uvedeny na následující tabulce.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavší modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

Nedojde k zabarvení, jestliže se reakční supematant ze zkumavek inkubovaných s pufrem při hodnotě pH 4,0 nebo 7,5 po dobu 30 minut nanese na guaiakolové proužky a vyvolá se peroxidem vodíku. Podobný výsledek (to je nezabarvení) se pozoruje u vařených kultur Candida albicans (pH 4,0 a 7,5). Kultura Candida albicans vytváří sytě modré zabarvení po 10-minutové inkubaci při hodnotě pH 4,0, avšak nikoli pH 7,5 ani po 30-minutové inkubaci. Trichomonas vaginalis vytváří silné modré zabarvení po 30 minutové inkubaci při hodnotě pH7,5, avšak pouze sotva znatelné zabarvení po 30 minutové inkubaci při hodnotě pH 4,0. Kultura Mobiluncus Curtisii nevytváří žádné modré zabarvení po 30 minutách ani při pH 4,0, ani při pH 7,5.

Zdroj enzymu (buněčné kultury)	pH inkubace	Doba inkubace	Zabarvení
Candida albicans	4,0	10 min	2,0
Candida albicans	7,5	30 min	0,0
vařená Candida albicans	4,0	30 min	0,0
vařená Candida albicans	7,5	30 min	0,0
Mobiluncus curtisii	4,0	30 min	0,0
Mobiluncus curtisii	7,5	30 min	0,0
vařený Mobiluncus curtisii	4,0	30 min	0,0
vařený Mobiluncus curtisii	7,5	30 min	0,0
Trichomonas vaginalis	4,0	30 min	0,25
Trichomonas vaginalis	7,5	30 min	2,0
vařený Trichomonas vaginalis	4,0	30 min	0,0
vařený Trichomonas vaginalis	7,5	30 min	0,0
pufr	4,0	30 min	0,0
pufr	7,5	30 min	0,0

-57CZ 289902 B6

D. Interpretace

Z pevného nosiče se neuvolní HRPO 300 mM fosfátovým pufrem při hodnotě pH 7,5 nebo 100 mM acetátovým pufrem při hodnotě pH 4,0 ve 30-minutovém inkubačním intervalu při teplotě místnosti. Podobně vařené suspense Candida albicans, Trichomonas vaginalis nebo Mobiluncus curtisii neuvolní HRPO při hodnotě pH 7,5 nebo 4,0 ve 30-minutovém inkubačním intervalu při teplotě místnosti. Avšak kultura Candida albicans uvolňuje HRPO z pevného nosiče při hodnotě pH 4,0 v 10 minutách, avšak neuvolňuje ji při hodnotě pH 7,5, ani při 30-minutové inkubační periodě. To je ve shodě s pH-profilem asparagové proteázy Candida albicans, která je aktivní při nízkých hodnotách pH, je však málo aktivní nebo neaktivní při vysokých hodnotách pH. Na rozdíl od toho kultura T. vaginalis uvolňuje HRPO z pevného nosiče při hodnotě pH 7,4 ve 30-minutovém inkubačním intervalu, avšak uvolňuje sotva znatelné množství HRPO při pH 4,0. Toto chování je rovněž ve shodě se známým pH-profilem thiolproteázy T.vaginalis (to je aktivní při vysokých hodnotách pH, ale daleko méně aktivní při nízkých hodnotách pH). Konečně Mobiluncus curtisii o kterém je známo, že vylučuje proteázy, neuvolňuje HRPO ani při pH 4,0, ani při pH 7,5 ani při 30-minutovém inkubačním intervalu.

Prováděj í-li se zkoušky za různých podmínek hodnot pH, je možno rozlišovat mezi třemi mikroby: pouze Candida albicans způsobuje barevné zabarvení v 10 minutách při teplotě místnosti při hodnotě pH 4,0; pouze Trichomonas vaginalis způsobuje zabarvení při pH 7,5 ve 30 minutách a Mobiluncus curtisii nezpůsobí zabarvení ve 30 minutách ani při pH 7,5 nebo 4,0.

Pokus XV

Tento pokus se týká rozdílné aktivity různých proteáz a jejich inhibitorů na substrátu [Eupergit®— Myoglobin-HRPO]

A. Materiály

1. Práškovitý [Eupergit®-Myoglobin-HRPO](Příprava Q)

2. Obchodně dostupná asparagová proteáza od Sigma Chemical Co. (Typ ΧΠΙ, od Aspergillus saitoi, aktivita 0,6 J/mg) 40 mg/ml

3. Trypsin (serinová proteáza) z hovězího pankreasu (aktivita 2900 J/mg) od U.S. Biochemicals, 2 mg/ml.

4. Papain (thiolproteáza) z papaya latexu (aktivita 12 J/mg) od Sigma Chemical Co., 2 mg/ml

5. Asparagová proteáza produkující kulturu Candida albicans (ATCC 28366)

6. Hydrochlorid tosyllysinchlormethylketonu (TLCK) 50 mM v ethanolu od Sigma Chemical Co.

7. Pepstatin A z mikrobiálního zdroje od Sigma Chemical Co. 2 mg/ml v ethanolu

8. Pufry a roztoky

a. Pufr fosforečnanu draselného pH 7,0,200 mM

b. Pufr fosforečnanu draselného pH 7,4,100 mM

c. Sodnoacetátový pufr pH 4,0,100 M

d. Roztok 0,02% peroxidu vodíku

e. Absolutní ethanol

-58CZ 289902 B6

9. Guaiakolem impregnovaný papír (obchodní proužky Hermoccult®)

B. Postup

Tato zkouška se provádí ve dvou dílech. Předně se stanoví aktivita různých proteáz na substrátu [Eupergit®-Myoglobin-HRPO]. Enzymy a kontroly (enzymy vařené 15 minut) se inkubují s 20 mg substrátu a pufry (viz množství v tabulce) po dobu 15 minut před zkouškou.

V druhém dílu se enzymy preinkubují s jejich příslušnými inhibitory a s odpovídajícími pufry po dobu 15 minut. Ty se pak přidají do substrátu a inkubují se při teplotě místnosti dalších 15 minut.

V obou případech se reakční směs odstředí k odstranění pevné fáze konjugátu. Supematant (5 μΐ) se nanese na proužky Hermoccult® s 5 μΐ peroxidu vodíku.

Zabarvení	Interpretace
0	Bez patrného modrého zabarvení
±	Možné jemné modré zabarvení
0,25	Nejjemnější modré zabarvení vizuálně zjistitelné
0,5	Zřetelná modrá barva
1,0	Tmavě modrá barva
2,0	Nejtmavší modrá barva možná ve zkuš. systému

C. Výsledky

1. Díl I: Supematanty reakční směsi ze zkumavek obsahujících samotný pufr při pH 4,0 nebo pH 7,5 vytvářejí jen nejjemnější zjistitelné zabarvení, jsou-li naneseny na guaiakolové proužky a vyvolány peroxidem vodíku. Tentýž výsledek se pozoruje se supematanty reakční směsi ze zkumavek obsahujících vařený trypsin při pH 7,4, vařenou kulturu Candida při pH 4,0 a vařený papain při pH 7,4. Silné modré zabarvení se vytvoří v případě nevařeného trypsinu při pH 7,4, nevařené kultury Candida při pH 4,0 a nevařeného papainu při pH 7,0.

2. Díl Π: TLCK inhibitor proteázy schopný inhibovat jak proteázy serinového tak thiolového typu inhibuje vytváření zabarvení jak u trypsinu (serinové proteázy), tak u papainu (thiolové proteázy). Pepstatin, známý inhibitor asparagových proteáz zabraňuje vytváření zabarvení asparagovou proteázou Candida albicans.

Tabulka - Díl I

Zdroj enzymu (obj. = 25 μΐ)	Pufr obj. = 75 μΐ)	Zabarvení
Trypsin	pH7,4	2,00
Trypsin (vařený)	pH7,4	0,25
Kultura Candida	pH4,0	1,50
Candida vařená	pH4,0	0,25
Papain	pH 7,0	1,00
Papin (vařený)	pH7,4	0,25
	samotné pufry	0,25

-59CZ 289902 B6

Tabulka -Díl II

Enzym	Roztok inhibitoru	Ethanol (kontrola)	Pufr pH,	obj.	Zabarvení
Trypsin	TLCK (10 μΐ		7,4	65 μΐ	ι,ο
Trypsin	-	-	7,4	75 μΐ	2,0
Papain	TLCK (25 μΐ)	25 μΐ	7,0	50 μΐ	0,5
Papain	-		7,0	50 μΐ	ι,ο
Asparag. proteáza	Pepstatin (25μ1)		4,0	50 μΐ	0,5
Asparag. proteáza	-	25 μΐ	4,0	50 μΐ	1,5

D. Interpretace

Trypsin, serinová proteáza hydrolyzuje substrát pevné fáze při pH 7,4 za uvolnění rozpustné HRPO, která katalyzuje vytváření modrého zbarvení na vyvolaných guaiakolových proužcích. Totéž platí pro asparagovou proteázu Candida albicans při pH 4,0 a pro papain, thiolovou proteázu při pH 7,0. Vaření inhibuje uvolňování HRPO u každého enzymu. Tudíž každý ze tří různých typů enzymů je schopen hydrolyticky uvolňovat rozpustnou HRPO z nosiče za vhodných reakčních podmínek. Žádný pufr ani teplem aktivované enzymy neuvolňují rozpustnou HRPO, což naznačuje, že uvolňování HRPO není jednoduchým a nespecifickým uvolňováním způsobovaným například solemi v růstovém prostředí nebo v inkubační směsi.

TLCK, proteázový inhibitor schopný inhibovat jak serinové tak thiolové proteázy inhibuje tvorbu zabarvení jak trypsinem (serinovou proteázou) tak papainem (thiolovou proteázou). Pepstatin, známý inhibitor asparagových proteáz inhibuje tvorbu zabarvení asparagovou proteázou Candida albicans. Inkubací v přítomnosti známých specifických enzymových inhibitorů nebo inhibitorů specifických tříd enzymů je tudíž možno dosáhnout specifičnost detekce hydrolázy.

Uvedené pokusy vynález toliko objasňují, nijak ho však neomezují. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že provozní podmínky, jednotlivé operace a jiné parametry způsobů a zkoušek a zde popsaných zkušebních zařízení mohou být dále modifikovány nebo nahrazovány, aniž je to na újmu duchu a rozsahu vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Způsob zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivních hydroláz ve vzorku zejména zjišťování kandidiózy zjišťováním přítomnosti enzymaticky aktivní proteázy kyseliny asparagové.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku, vyznačující se t í m , že zahrnuje

   a) umístění tohoto vzorku na první a druhý pevný nosič, přičemž první pevný nosič má hlásiči enzym kovalentně k sobě připojený tak, že tento hlásící enzym se uvolňuje působením uvedené hydrolázy, a druhý pevný nosič, který není ve styku s tímto prvním nosičem, a má mobilizovaný na sobě indikátor, přičemž uvedený indikátor je citlivý na zjistitelnou změnu působením hlásícího enzymu, kde uvedený vzorek je umístěn takovým způsobem, že vzorek uvádí do styku první a druhý pevný nosič, takže libovolný hlásiči enzym uvolňovaný libovolnou aktivitou hydrolázy přítomnou v uvedeném vzorku dovoluje difundovat tímto vzorkem do uvedeného druhého pevného nosiče, a

   b) pozorování, zda dojde ke zjistitelné změně indikátoru, která je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy v uvedeném vzorku.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hydrolázou je proteáza vybraná ze souboru zahrnujícího aspartovou proteázu, serinovou proteázu, thiolovou proteázu, metaloproteázu, kyselé proteázy a alkalické proteázy.
3. 3. Způsob podle nároku 1, ve kterém uvedeným hlásícím enzymem je peroxidáza a detekce kandidiózy se provádí zjišťováním přítomnosti enzymaticky aktivní aspartové proteázy ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje

   a) uvedení uvedeného vzorku do styku s pevným nosičem, který obsahuje hlásiči enzym na sobě imobilizovaný tak, že hlásiči enzym se uvolňuje působením aspartové proteázy,

   b) kombinování uvedeného vzorku, poté co se uvedl do styku s uvedeným pevným nosičem, s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu po působení uvedeného hlásícího enzymu, a

   c) pozorování zda dojde ke zjistitelné změně indikátoru, přičemž tato zjistitelná změna je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní aspartové proteázy v tomto vzorku a tím kandidiózy.
4. 4. Způsob zjišťování přítomnosti enzymaticky aktivní hydrolázy ve vzorku podle nároku 1, k detekci Trichomonas vaginalis zjišťováním přítomnosti enzymaticky aktivní thiolové proteázy ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje

   a) uvedení tohoto vzorku do styku s pevným nosičem, který obsahuje hlásiči enzym imobilizovaný na něm tak, že hlásiči enzym se uvolňuje po působení thiolové proteázy,

   b) kombinování uvedeného vzorku, poté co se uvedl do styku s uvedeným pevným nosičem, s indikátorem, který je citlivý na zjistitelnou změnu po působení uvedeného hlásícího enzymu, a

   c) pozorování zda dojde ke zjistitelné změně indikátoru, přičemž tato zjistitelná změna je indikací přítomnosti enzymaticky aktivní thiolové proteázy ve vzorku a tím Trichomonas vaginalis.
5. 5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že hlásiči enzym sestává z peroxidázy, fosfatázy, oxidoreduktázy, dehydrogenázy, transferázy, isomerázy, kinázy, reduktázy, deaminázy, katalázy, ureázy nebo glukuronidázy.

   -61 CZ 289902 B6
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že hlásiči enzym sestává z peroxidázy křenu selského.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že pevným nosičem je nerozpustná základní hmota, gel nebo pryskyřice.
8. 8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačuj ící se tím, že pevný nosič zahrnuje celulózu, agarózu, dextran, polyakrylát, polyakrylamid nebo jejich deriváty, chitin, oxiran akrylové kuličky, polymemí dialdehyd, škrob, kolagen, keratin, elastin, prášek z kůže hovězího dobytka, peptidoglykan ze stěn bakteriálních buněk nebo jeho fragmenty, nylon, polyethylentereftalát, polykarbonát nebo sklo s řízenou velikostí pórů.
9. 9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyzn ačuj ící se t í m, že hlásiči enzym je imobilizován na pevném nosiči použitím spojovníkové molekuly, kterou je hydrolyzovatelný substrát pro enzymaticky aktivní hydrolázu nebo proteázu.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že spojovníkovou molekulou je protein nebo peptid.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že proteinem je azokasein, kasein, kappa-kasein, imunoglobulin, hemoglobulin, myoglobin, albumin, elastin, keratin nebo kolagen.
12. 12. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zjistitelnou změnou je změna barvy po působení hlásícího enzymu, který se uvolňuje z pevného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou nebo proteázou.
13. 13. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že hlásící enzym je schopen katalyzovat tvorbu fluorescenčního signálu, fosforescenčního signálu, bioluminiscenčního signálu, chemoluminiscenčního signálu nebo elektrochemického signálu, po svém uvolnění z pevného nosiče enzymaticky aktivní hydrolázou nebo proteázou.
14. 14. Způsob podle některéhoz nároků 1 až 12, vyznačující se t í m, že hlásiči enzym je schopen vytvářet zónu sraženiny, aglutinace, precipitace nebo vyčeření.
15. 15. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačuj ící se t í m, že hlásícím enzym je peroxidáza a indikátorem je vizuální chromogenní indikátor.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že chromogenní indikátor obsahuje peroxid vodíku a guajakol, kyselinu 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou), tetramethylbenzidin, fenol, 4-aminoantipyrin nebo kyselinu 4,5-dihydronaftalen-2,7-disulfonovou.
17. 17. Testovací zařízení (11) pro testování vzorku ke zjištění přítomnosti kandidiózy přítomností enzymaticky aktivní aspartové proteázy, vyznačující se tím, že testovací zařízení (11) sestává

    a) z krabičky (31) vymezené alespoň z části první protilehlou stěnou (13) a druhou protilehlou stěnou (14) s vnitřními lícními povrchy tvořenými vrstvou (35) reakčního činidla, prvním povlakem (36), druhým povlakem (37) a vrstvou (38) přídavného reakčního činidla, mezi nimiž je mezera (47), přičemž první protilehlá stěna (13), druhá protilehlá stěna (14) nebo obě tyto stěny jsou z průsvitného materiálu,

    b) z hlásícího enzymu imobilizovaného na pevném nosiči na uvedeném vnitřním lícním povrchu tvořeném vrstvou (35) reakčního činidla, prvním povlakem (36), druhým povlakem (37) a vrstvou (38) přídavného reakčního Činidla, buď první protilehlé stěny (13), nebo druhé

    -62CZ 289902 B6 protilehlé stěny (14) tak, že hlásiči enzym je uvolnitelný po působení zmíněné aspartové proteázy,

    c) z indikátoru (34) imobilizovaného na vnitřním lícním povrchu tvořeném vrstvou (35) reakčního činidla, prvním povlakem (36), druhým povlakem (37) a vrstvou (38) přídavného reakčního činidla, buď první protilehlé stěny (13), nebo druhé protilehlé stěny (14), přičemž indikátorem je látka, která je podrobitelná zjistitelné změně po působení hlásícího enzymu, a

    d) z otvoru (18) v uvedené krabičce (31) k zavedení zmíněného vzorku.
18. 18. Testovací zařízení (11) pro testování vzorku ke zjištění přítomnosti Trichomonas vaginalis přítomností enzymaticky aktivní thiolové proteázy, vyznačující se tím, že testovací zařízení (11) sestává

    a) z krabičky (31) vymezené alespoň z části první protilehlou stěnou (13) a druhou protilehlou stěnou (14) s vnitřními povrchy s vnitřními lícními povrchy tvořenými vrstvou (35) reakčního činidla, prvním povlakem (36), druhým povlakem (37) a vrstvou (38) přídavného reakčního činidla, mezi nimiž je mezera (47), přičemž tato první protilehlá stěna (13), tato druhá protilehlá stěna (14) nebo obě tyto stěny jsou z průsvitného materiálu,

    b) z hlásícího enzymu imobilizovaného na pevném nosiči na uvedeném vnitřním lícním povrchu tvořeném vrstvou (35) reakčního činidla, prvním povlakem (36), druhým povlakem (37) a vrstvou (38) přídavného reakčního činidla, buď první protilehlé stěny (13) nebo druhé protilehlé stěny (14) tak, že hlásící enzym je uvolnitelný po působení zmíněné thiolové proteázy,

    c) z indikátoru (34) imobilizovaného na vnitřním lícním povrchu tvořeném vrstvou (35) reakčního činidla prvním povlakem (36), druhým povlakem (37) a vrstvou (38) přídavného reakčního činidla, buď první protilehlé stěny (13) nebo druhé protilehlé stěny (14), přičemž indikátorem je látka, která je podrobitelná zjistitelné změně po působení hlásícího enzymu, a

    d) z otvoru (18) v uvedené krabičce (31) k zavedení zmíněného vzorku.