CZ288596B6

CZ288596B6 - Acylfulvenové analogy a farmaceutický prostředek s jejich obsahem

Info

Publication number: CZ288596B6
Application number: CZ19951986A
Authority: CZ
Inventors: Michael J. Kelner; Trevor C. Mcmorris; Raymond Taetle
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-02
Publication date: 2001-07-11
Also published as: JPH08506812A; NZ262282A; US5439936A; DK0683762T3; HUT72450A; NO318648B1; CA2155329A1; KR100311327B1; HU9502358D0; AU6170094A; EP0683762A1; CN1119854A; ATE174894T1; RU2145849C1; BR9405689A; MD1418G2; EP0683762B1; WO1994018151A1; MD1418F2; HU220059B

Abstract

Acylfulvenov analogy obecn ho vzorce I, v n m R m v²znam, uveden² v patentov²ch n roc ch, jsou l tky s protin dorov²m · inkem, kter je mo no ve form farmaceutick²ch prost°edk , kter rovn tvo° sou st °eÜen , pou t nitro iln , peror ln nebo inhalac k l en n dorov²ch onemocn n , zejm na k l en myeloidn ch n dor , epidermoidn ch n dor , leukemie T-bun k nebo zhoubn²ch n dor plic, vaje n k nebo ml n l zy.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká acylfulvenových analogů a farmaceutických prostředků s jejich obsahem k léčení nádorových onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Chemoterapie s použitím většího počtu látek může úspěšně potlačit některé zhoubné krevní nádory i pokročilé, rychle rostoucí pevné nádory. Chemoterapie využívá zjištění nových látek, mezi nimiž neexistuje zkřížená odolnost, současně se účelněji využívají již existující sloučeniny. Zásahy ke zvýšení účinnosti běžných látek zahrnují účinnější schémata jejich podávání, současně dosažení co nejnižší toxicity a zvýšené použití pomocných látek v kombinaci s chirurgickými zákroky nebo různými typy léčby zářením.

Přes uvedené pokroky stále dochází k nebezpečí recidivy nádorů a úmrtí u celé řady nemocných se zhoubnými nádory. Po relapsu je možno u některých nemocných znovu dosáhnout remise s použitím počátečních léčebných opatření. Často je však zapotřebí použít vyšších dávek zvolené látky, což již ukazuje na vznik alespoň částečné odolnosti nádorových buněk. Pokusy prokazují, že se může vyvinout odolnost nádorových buněk současně křadě chemických látek včetně takových látek, které nemocnému ještě nebyly podávány. Vznik nádorů, odolných k řadě látek (mdr) může být funkcí celé nádorové hmoty a v současné době představuje hlavní příčinu selhání léčebných postupů. Aby bylo možno překonat tuto odolnost nádorových buněk proti chemickým látkám, používá se vysokých dávek chemických látek, popřípadě ještě v kombinaci se zářením nebo s transplantací alloggenní nebo autologní kostní dřeně. Léčebný zákrok s použitím vysokých dávek chemických látek může využívat původně použitou látku nebo její kombinaci s dalšími látkami. Použitelnost tohoto postupu byla prokázána pro krevní i pevné nádory. Aby bylo možno dále zlepšit uvedené postupy, je zapotřebí nalézt nové látky bez zkřížené odolnosti pro fenotypu mdr tak, aby bylo možno usnadnit léčení nemocných, kteří byli již dříve léčení chemickými látkami.

V poslední době byla zjištěna in vitro protinádorová účinnost nové skupiny přírodních produktů, označovaných jako illudiny podle publikace Kelner M. a další, Cancer Res., 47, 3186, 1987. Dvěma známými látkami z této skupiny jsou illudin S a M.

Illudin S

Struktura illudinu je zcela odlišná od struktury jiných chemoterapeutických látek. Illudiny byly čištěny a vyhodnoceny vNational Cancer Institute Division of Cancer Treatment (NCI DCT), avšak při zkouškách in vivo měly nízký terapeutický index u experimentálních nádorových systémů, používaných při běžných zkouškách NCI. Velká toxicita těchto látek zabránila jakýmkoliv pokusům tyto látky použít u lidí.

-1 CZ 288596 B6

V mezinárodní patentové přihlášce WO-A-91/04754 se popisuje protinádorová účinnost analogů illudinu. Jde o analogy, které jsou méně toxické než illudin vzhledem k obtížnějšímu otevření cykloprotanového kruhu. Přesto je však jejich toxicita stále ještě příliš vysoká pro možnost jejich použití k léčebným účelům v lidském lékařství.

Je tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí nalézt další chemoterapeutické látky, které by byl toxické pro nádorové buňky, zvláště pro nádory mdr a přitom měly příslušný terapeutický index, umožňující použití in vivo.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří acylfiilvenové analogy obecného vzorce I

Uvedené látky jsou strukturně příbuzné illudinu S nebo M a jsou schopny způsobit inhibici nádorových buněk příliš vysoké toxicity k makroorganismu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna citlivost buněk karcinomu mléčné žlázy a buněk myeloidní leukemie ve srovnání s citlivostí buněk jiných nádorů na illudin S.

Na obr. 2 jsou znázorněna účinná místa illudinu S.

Na obr. 3 je znázorněno NMR-spektrum, prokazující přítomnost krátce působícího meziproduktu typu kyseliny. Signál A pochází od vodíkového atomu na dvojné vazbě pětičlenného kruhu illudinu M. Signál B pochází od vodíkového atomu krátce existujícího meziproduktu, který se tvoří při otevření cyklopropanového kruhu, avšak před reakcí dvojné vazby. Signály C pocházejí z produktu, který je důsledkem reakce dvojné vazby. V průběhu času vymizí signály illudinu M a signály C budou převažující. Signál B vymizí současně se signálem A, což potvrzuje, že běží o krátce existující meziprodukt, tvořící se z illudinu M.

Na obr. 4 je znázorněn účinek illudinu S na růst nádorových buněk Molt-4 u myší bez brzlíku (Balb/c).

Na obr. 5 je znázorněn účinek dehydroilludinu M na růst nádorových buněk.

Na obr. 6 je znázorněna odpověď štěpu HL60/MRI na dehydroilludin M.

Na obr. Ί je znázorněn příjem illudinu S při použití poměrně citlivých buněk HL60 a odolných buněk B.

Na obr. 8 je znázorněna rychlá akumulace illudinu S uvnitř buněk HL60, je zřejmé, že koncentrace illudinu S v buňkách je vysoká.

Na obr. 9 je znázorněna analýza počátečního příjmu illudinu s do buněk HL60 v různých koncentracích, uvedeny jsou Michaelis-Mentonovy konstanty nasycení.

Na obr. 10 je znázorněn účinek 6-hydroxymethylacylfulvenu a dalších běžných protinádorových látek na buňky lidského adenokarcinomu plic MV522.

Na obr. 11 je znázorněn účinek různých dávek 6-hydroxymethylacylfulvenu na lidský adenokarcinom plic MV522.

Pod pojmem „inhibice“ se rozumí snížení rychlosti nádorových buněk ve srovnání s rychlostí, k níž by došlo bez léčení nebo zmenšení nádoru. Inhibice také může spočívat v úplném vymizení nádoru. To znamená, že uvedené analogy jsou buď cytostatické nebo cytotoxické vzhledem k nádorovým buňkám.

Uvedené látky je možno podávat jakémukoliv živočichu s nádorovým onemocněním. Tyto látky jsou účinné v případě lidských nádorů in vivo i v případě lidských nádorových buněčných linií in vitro.

Nádorové buňky je možno uvést se sloučeninami do styku jakýmkoliv známým způsobem. Účinné látky je možno podávat nitrožilně, perorálně, intreperitoneálně nebo orální nebo nosní inhalací. Výhodný způsob podání závisí na léčeném organismu a na typu nádoru.

Je překvapující, že analogy strukturně příbuzné illudinu S a M jsou méně toxické než původní látky, avšak in vivo jsou účinnější. Jak již bylo svrchu uvedeno, mají illudin S a M nízký terapeutický index vzhledem ke své vysoké toxicitě, takže je nyní možno použít k léčebným účelům u lidí. Nyní bylo zjištěno, že různé modifikace molekuly illudinu S a M znemožní reakci nukleofilních látek s těmito sloučeninami. Tím dochází k méně snadnému otevření cyklopropanového kruhu a tím ke snížení toxicity uvedených látek in vivo, takže dojde ke zvýšení terapeutického indexu. Zejména jeden z acylfulvenových analogů, 6-hydroxy-methylacylfulven má výrazně vyšší účinnost a menší toxicitu než dříve známé analogy illudinu S a M.

Léčebně účinné množství analogu se mění s léčeným organismem. Bylo prokázáno, že vzhledem ke snížené toxicitě je možno podávat poměrně vysoké dávky uvedených analogů. Množství 30 až 112 000 mikrogramů na kg tělesné hmotnosti je zvláště účinné při nitrožilním podání, při intraperitoneálním podání jde o množství 300 až 112 000 mikrogramů na kg tělesné hmotnosti. Je zřejmé, že množství se může měnit v závislosti na způsobu podání. Dále se bude množství měnit v závislosti na tom, zda analog je nebo není vázán na toxin.

Analogy mohou být vázány na reakční činidlo za vzniku komplexu, který se váže na antigen, spojený s nádorem. Takové metody jsou v oboru známy a mohou zahrnovat použití spojovníku, který váže reakční činidlo na analog. Spojení může zahrnovat jakoukoliv chemickou vazbu, například kovalentní vazbu. Reakčním činidlem může být jakékoliv činidlo, které se specificky váže na antigen, spojený s nádorem na nádorové buňce nebo v oblasti přítomnosti nádorových buněk. Typicky je reakčním činidlem protilátka, a to polyklonální nebo monoklonální. Uvedené komplexy je možno využít k léčebným účelům. Způsob léčení je možno uskutečnit na jakýchkoliv nádorových buňkách, zvláště účinné jsou však uvedené látky proti myeloidní, epidermoidní leukémii a leukémii T-buněk a v případě karcinomu plic, vaječníku a mléčné žlázy.

-3CZ 288596 B6

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Systém dehydroilludinu M

Směs 200 mg illudinu M a 1 g pyridiniumdichromanu v 60 ml bezvodého dichlormethanu se míchá při teplotě místnosti v baňce, opatřené pryžovou přepážkou tak, aby bylo možno udržovat argonovou atmosféru. Po 20 hodinách se reakční směs zředí 20 ml diethyletheru a pak zfiltruje přes krátký sloupec silikagelu. Další eluce sloupce se provádí diethyletherem, frakce se spojí a odpaří, odparek se chromatografuje na silikagelu při použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 10 : 1 jako elučního činidla. Z příslušných frakcí se získá 140 mg produktu ve formě bílých krystalků s teplotou tání 64 až 65 °C. Pro tuto sloučeninu bylo zaznamenáno NMRspektrum.

Příklad II

Syntéza fulvenu mg illudinu Sbylo rozpuštěno ve 2 ml vody a pak byly přidány 2 ml 3N kyseliny chlorovodíkové. Výsledný roztok se do 30 minut zakalil a vytvořila se žlutá sraženina. Směs byla uložena přes noc do chladničky a pak extrahována 10 ml chloroformu. Žlutý chloroformový roztok byl vysušen síranem hořečnatým a rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku za vzniku oranžovožluté pryžovité látky. Tento materiál byl chromatografován na silikagelu při použití hexanů a ethylacetátu v poměru 6:1, bylo získáno 20 mg fulvenu a 10 mg bisfulvenu. Pro obě tyto látky bylo zaznamenáno NMR-spektrum.

Úplnou syntézu fulvenu je také možno uskutečnit podle následujícího reakčního schématu:

0'

OH

OTHP

-4CZ 288596 B6

Reakcí známého 1,1-diacetylcyklopropanu se znázorněným dianiontem cyklapentadienového derivátu se získá diol, z nějž je působením mírné kyseliny možno získat diolketon. Selektivním odstraněním terciární hydroxylové skupiny se pak získá požadovaný fulven.

Příklad III

Zkoušky in vitro

Aby bylo možno prokázat cytotoxické účinky, byly přidávány různé koncentrace illudinů k buněčným kulturám na 48 hodin, načež byl prokázán růst buněk a jejich životnost pomocí vylučování trypanové modři. Místo expozice na 48 hodin bylo možno postupovat také tak, že buněčný materiál byl v kapalné kultuře uložen na plotny s 96 vyhloubeními, pak byly buňky vystaveny na 2 hodiny působení různých koncentrací illudinů, pak byl na 1 až 2 hodiny přidán ³H-thymidin, načež byl buněčný materiál oddělen na skleněné filtry. Do nádobek se scintilační kapalinou byly uloženy filtrační papíry a zbývající radioaktivita byla stanovena na scintilačním počítači pro záření beta.

Při sledování citlivosti dalších buněčných linií pevných nádorů na illudin S bylo prokázáno, že zvláště citlivá je buněčná linie MCF-7 karcinomu mléčné žlázy, jak je také zřejmé z obr. 1. Další buněčná linie MDA-231 karcinomu mléčné žlázy, udržovaná v laboratoři, byla rovněž velmi citlivá na působení illudinu S, jak je také zřejmé z obr. 1.

Studie s dehydroilludinem M prokázaly, že tento analog má rovněž selektivní toxicitu pro myeloidní leukemické buňky a pro buněčné linie MCF-7 a MDA-231 karcinomu mléčné žlázy, jak je shrnuta v tabulce 1.

Tabulka 1

Specifická cytotoxicita illudinu S a dehydroilludinu M podle inhibice illudinu po působení toxinu 2 hodiny (N = 3)

	IC₅₀ (nM/L)
	Illudin S	Dehydroilludin M
HL60, myeloidní	7± 1	246 ±19
8302, B-buňky	236 ±31	>38 000
8402, T-buňky	669+ 196	>38 000
242, melanom	607 + 70	> 38 000
547, vaječník	607±110	> 38 000
SL-2, myš (brzlík)	142 ± 15	5 23 5± 277
MCF-7, mléčná žláza	58 ±5	653 ± 65
MDA-231, mléčná žláza	2,0 ± 0,2	112±17

zhledem k tomu, že předchozí zkoušky prokazovaly, že CEM mdr-varianty nebyly odolné proti illudinu S, byly zkoušeny další typy mdr-buněk na odolnosti na odolnost nebo citlivost na illudin S a dehydroilludin M. Tyto dceřinné buňky buněčné linie mdr mají 200x až 800x vyšší odolnost proti běžným chemoterapeutickým látkám, avšak mají jen nepatrnou nebo žádnou odolnost proti illudinu S nebo dehydroilludinu M, jak je zřejmé z tabulky 2. To znamená, že buňky mdr s bílkovinou gpl70 nebo napojení na tuto bílkovinu jsou stále citlivé na illudin. Tato nová struktura patrně nevyvolává zkříženou odolnost ani u krvetvorných buněčných linií, které jsou již odolné proti řadě chemických látek. Derivát illudinu dehydroilludin M je o něco méně toxický než původní sloučenina, avšak jak je zřejmé z tabulky 2, neexistuje žádná zkřížená odolnost pro tuto sloučeninu u různých buněčných linií mdr.

-5CZ 288596 B6

Byl studován účinek illudinu S a dehydroilludinu M na buněčnou linii L1210, CFU-gm z kostní dřeně myší a C1498 (buněčná linie AML). Illudin S byl nejúčinnější látkou až dosud použitou při této zkoušce a měl nejvyšší účinek, uváděný pro rozdíl v účinku na buněčné linie L1210 a AMLleukemické buněčné linie v zóně CFU-gm, jak je zřejmé z tabulky 3. Méně toxický derivát 5 dehydroilludin M byl však značně selektivnější pro linie AML. Způsoboval inhibici tvorby kolonií AML v koncentracích, při nichž ještě neměl žádný účinek na buněčnou linii CFU-gm, jak je zřejmé z tabulky 4.

Tabulka 2

Citlivost různých buněčných linií mdr k illudinu S

Buněčná linie	mdr	Illudin S	dehydroilludin M
varianty CEM	původní	8,3 ± 2,6	nt
	VM-1	16,2 ±6,4	nt
	AraC	14	nt
	VLB100 (gp 170+)	3,7 ± 0,7	nt
	Dox(gp 170+)	14	nt
MDA-231	původní	0,85 ± 0,23	54 ±7
(mléčná žláza)	3-1 (gp 170+)	0,89 ± 0,38	58± 11
MCF7-wt	původní	0,88 ±0,11	92 ±15
(mléč, žláza)	ADR (GAH-transferáza)	3,7 ± 0,4	68 ± 15
HL-60	původní	3,1 ±1,1	163 ±11
	ADR (gp 150+)	1,9 ±0,8	191 ±44
KB-varianta	původní	0,58 ±0,12	125 ± 14
	C-l (gp 170+)	0,69 ±0,15	80 ±18
	VBL (gp 170+)	0,6í ± 0,11	78 ± 19
L1210	původní	0,42 ±0,88	62 ±8
	DDPt (cis-plat)	0,46 ±0,12	119 ± 39
	BCNU	0,58 ± 0,08	100 ± 31
	PAM (melphalan)	0,62 ±0,15	73 ±31
	CPA (cyclophos)	0,46 ±0,12	38 ± 15

nt = nebylo provedeno

Tabulka 3

Inhibice růstu illudinem S

koncentrace illudinu S (pg/disk)	zóna inhibice
	L1210	Go	Colon 38
2,50	500	240	30
1,25	400	70	0
0,63	320	30	0

-6CZ 288596 B6

Tabulka 4

Účinek illudinů na tvorbu kolonií

sloučenina	ředění	zóna inhibice
		L1210	CFU-gm	C1498 (AML)
Illudin S	1:1000	850	400	>1000
	1:4000	600	200	800
	1:16000	550	0	550
	1:64000	300	0	250
Dehydroilludin M	1:25	400	200	>1000
	1:125	200	100	750
	1:125
	(opakování)	300	50	700
	1:625	100	0	400

Příklad IV

Studie závislosti struktury a funkce

Studie závislosti struktury a funkce byly provedeny tak, že byly připraveny deriváty illudinů a byla prokazována jejich toxicita in vitro pro leukemické buňky HL60, jak je shrnuto v tabulce 5. Tato studie identifikovala tři kritická místa pro toxicitu uvedených látek. Jde o cyklopropanový kruh (místo A), alfa/beta nenasycenou vazbu (místo B) a o ketonovou skupinu (místo C), jak je také zřejmé z obr. 2. V případě, že dojde k narušení kteréhokoliv z těchto míst, dojde ke snížení toxicity 4 log. Na rozdíl od těchto míst nepřispívá primární hydroxylová skupina (místo D, na obr. 2) k toxicitě. Na toto místo je možno vázat různé velké chemické skupiny bez narušení toxicity. Řada derivátů se zřetelně sníženou toxicitou ve srovnání s illudinem S nebo M je stále ještě účinnější než běžné chemoterapeutické látky, například BCNU nebo cis-platin, jak je zřejmé z tabulky 5.

Tabulka 5

IC50 pro různé illudinové deriváty ve srovnání s jinými látkami u buněk HL-60

sloučenina	nM
illudin S nebo M	10
dihydroilludin S nebo M	100 000
acylfulven	500
dehydroilludin M (diketon)	246
isoilludin M	3 800
ptaguilosid	7 700
pterosin C	12 500
2,5,6,7-tetramethylindenon	475
illudintosylát	38
inhibitor DNA polymerázy Aphidocolin	2 100
alkylační činidlo BCNU	23 300
zesíťující činidlo cis-platin	500 ± 14
alkylační činidlo MNNG	15 000
inhibitor syntézy bílkovin ricin	0,2

-7CZ 288596 B6

Příklad V

Souvislost chemické struktury a funkce

Illudin M se snadno převádí například působením zředěné kyseliny chlorovodíkové na stálé aromatické sloučeniny, které jsou při zkouškách na buněčných kulturách více než lOOOx méně toxické. Tvorba vazby mezi atomem chloru a uhlíku, otevření cyklopropanového kruhu a odštěpení terciární hydroxylové skupiny ve formě vody probíhají současně. Vytvořený meziprodukt je možno prokázat NMR-spektroskopií, jak je zřejmé z obr. 3. Vytvořený meziprodukt je však vysoce reaktivní a rychle se mění na fenol působením další nukleofilní látky, jako vody. To znamená, že v kyselém prostředí je illudin M zcela zřejmé bifunkční.

Svrchu uvedené zkoušky prokazují, že toxicita illudinu souvisí se snadností, sniž je možno odstranit terciární hydroxylovou skupinu a otevřít cyklopropanový kruh. Bylo prokázáno, že toxicita iludinu závisí na spojení účinků cyklopropanové skupiny (místo A na obr. 2), dvou dvojných vazeb (konjugovaný dien, místo B) a ketonu (místo C). Bylo předpokládáno, že oxidace sekundární hydroxylové skupiny v pětičlenném kruhu na keton změní účinnost nebo selektivitu molekuly tím, že způsobí další posun elektronů v molekule. Nová ketonová skupina způsobí, že elektrony cyklopropanových meziuhlíkových vazeb se poněkud posunou směrem ke ketonu místo k atomu uhlíku, který nese terciární hydroxylovou skupinu. To znamená, že vazba již není tak stálá jako v případě illudinu M, protože kyslík v terciární hydroxylové skupině se může odštěpit, což je méně příznivé a snižuje se reaktivita. Tento ketonový derivát, který byl nazván dehydroilludin M, byl syntetizován a byl in vitro pro buněčnou linii HL-60 méně toxický než illudin S nebo m, jak je uvedeno v tabulce 4. Jak již bylo svrchu rovněž uvedeno, je toxicita dehydroilludinu M poměrně selektivní in vitro pro buněčné linie meyloidní leukemie a karcinomu mléčné žlázy, jak je také zřejmé z obr. 1 a z tabulky 1.

Se svrchu uvedeným předpokladem jsou v souladu také výsledky kinetiky reakce illudinu M a dehydroilludinu M se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Ve zředěné kyselině chlorovodíkové probíhá v případě illudinu M pseudoreakce prvního řádu (k = 4,7 x 10'³ min'¹, tl/2 = 148 minut). V případě dehydroilludinu M jde rovněž o kinetiku prvního řádu, avšak reakce je podstatně pomalejší (k = 2 x 10⁴ min¹, tl/2 = 2765 minut). Při reakci s dehydroilludinem M bylo možno prokázat NMR-spektroskopií žádný meziprodukt. Pravděpodobně se vytvářel příliš pomalu nebo existoval příliš krátce, než aby mohl býti prokázán. Nižší reaktivita dehydroilludinu M je v souladu s jeho vyšší selektivitou při reakci s nukleofilními látkami a tedy s nižší toxicitou ve srovnání s původním illudinem. M.

Byla také studována reakce illudinů s přirozeně se vyskytujícím nukleofilem glutathionem. Při širokém rozmezí pH v oblasti 3 až 9 dochází k samovolné reakci glutathionu s illudinem M, illudinem S nebo dehydroilludinem M za vzniku produktů, které jsou analogické produktům, vznikajícím při reakci illudinu M a kyseliny chlorovodíkové. Reakční rychlost je optimální při pH v rozmezí 6,1 až 7,0, což prokazuje, že by reakce mohla probíhat i uvnitř buněk.

Toxicita illudinů pro buněčnou linii MCF7-wt kacinomu mléčné žlázy a pro odolnou mdrdceřinnou linii MCF/Adr byla rovněž studována. Dceřinná buněčná linie, gpl70-negativní, je odolná proti působení chemických látek vzhledem k 50násobnému vzestupu koncentrace glutathiontransferázy, což má za následek 200 až 800-násobný pokles citlivosti na běžné chemoterapeutické sloučeniny. Tato buněčná linie prokazuje také 4,1-násobný pokles obsahu glutathionu. Mimoto prokazuje tato buněčná linie 4,2-násobná pokles citlivosti na illudin S (IC₅₀pro původní linii je 0,88 nmol/litr, pro dceřinnou liniii 3,70 nmol/litr), pokles citlivosti v případě dalších látek je 200 až 800-násobný. Kinetické studie schopnosti illudinů způsobit inhibici glutathiontransferázy prokazují, že nedochází k přímé inhibici účinnosti enzymu. Tyto studie prokazují, že toxicita illudinu je nepřímo závislá na obsahu glutathionu uvnitř buňky, avšak nezávisí na účinnosti glutathiontransferázy.

-8CZ 288596 B6

Příklad VI

Studie na zvířatech

Při použité postupů podle publikací leonard J. E. a další, Cancer Res., 47:2899 - 02, 1987 a Dillman R. O. a další, Cancer Res., 45:5632 - 36, 1985, byly připraveny xanoštěpy lidské leukemie T-buněk, Molt-4 pro čtyři týdny staré athymické myši Balb/c nu/nu. Po třech celkových dávkách záření vždy v odstupu jednoho týdne 600 cGy, byla myším podána podkožní injekce buněk Molt-4 spolu s ozářenými (6000 cGy) živnými buňkami HT-1080. Dvěma zvířatům byly podány pouze ozářené buňky HT-1080, aby bylo zřejmé, že tyto buňky nevyvolávají tvorbu nádorů. U všech zvířat byla sledována tvorba nádorů Molt-4 a jakmile byly nádory hmatné (přibližně 4x4 mm po 5 až 7 dnech), byly myši náhodně rozděleny do skupin po pěti. Kontrolním myším byl intraperitoneálně podán fyziologický roztok chloridu sodného, ostatním myším bylo podáno intraperitoneálně dvakrát týdně 300 mikrogramů/kg illudinu S nebo 30 nebo 300 mikrogramů/kg dehydroilludinu M. U myší, jimž byl podán illudin S, bylo možno pozorovat opožděný růst nádoru, jak je zřejmé z obr. 4.

Na druhé straně u bezsrstých myší, jimž byl podán dehydroilludin M v nízké dávce 30 mikrogramů/kg, bylo možno pozorovat úplný ústup tří z pěti nádorů, avšak dva nádory nereagovaly, jak je zřejmé z obr. 5. Později bylo prokázáno, že tato sloučenina je pro myši netoxická až do dávky 60 000 mikrogramů/kg intraperitoneální dvakrát týdně. Oba zřejmě odolné nádory byly vyjmuty a zkoumány in vitro na odolnost proti illudinu S a dehydroilludinu M. Nebylo možno prokázat žádnou odolnost k těmto látkám. Dvě z myší, u nichž došlo k ústupu nádoru byly pozorovány 12 týdnů, aniž by došlo k novému růstu nádoru.

Tytéž pokusy byly opakovány při použití jiného zdroje bezsrstých myší bez brzlíku. Při těchto studiích bylo možno pozorovat jen velmi malý účinek illudinů na růst nádorů. Příčinou této variability v odpovědi je patrně nízká dávka dehydroilludinu M, rozdíl v metabolismu glutathionu u různých zvířat nebo rozdíl na distribuce účinné látky.

Účinnost dehydroilludinu M pak byla sledována na modelu při použití myší buněčné linie SL-2. Buňky lymfomu SL-2 byly podány ve formě podkožní injekce a metastazovaly do mízních uzlin, sleziny a plic, účinnost byla sledována podle prodloužení života (ILS). Buňky SL-2 byly podány v množství 2,5 milionů buněk na zvíře, léčení bylo zahájeno po 7 dnech, kdy nádory již byly hmatné. Jde tedy o poměrně přesně vymezenou zkoušku na účinnost proti již vyvinutým nádorům na rozdíl od obvyklých zkoušek v modelu SL-2, při nichž se užívá pouze půl milionu buněk a účinná látka se počíná podávat po 3 dnech. Při uvedené zkoušce měl dehydroilludin M jen malý účinek při dávce 30 mg/kg HP dvakrát týdne ILS 5 % a v dávce 60 mg/kg IP dvakrát týdně, ILS 18 %. V případě nitrožilního podání v dávce 0,03 mg/kg dvakrát týdně se prodloužení života ILS prodloužilo o 38 %. To znamená, že účinná látka je pravděpodobně metabolizována v játrech a je proto účinnější při nitrožilním podání.

V průběhu těchto pokusů in vivo se potvrzuje to, co již bylo zřejmé z pokusů in vitro, že totiž tkáňová specifičnost illudinů závisí na přítomnosti účinného energetického čerpadla. Buněčné linie SL-2 a Molt-4 byly podrobněji sledovány a bylo stanoveno, že v těchto případech není přítomen mechanismus, který může umožnit příjem. Z tohoto důvodu byly zkoušky změněny a byly použity štěpy, při nichž bylo užito buněk myeloidní linie.

Lidské buněčné linie HL-6é, které jsou schopné růst ve formě štěpů u bezsrstých myší bez ozáření zvířat, byly získány od Dr. Theodora Brightmana, NCI. Tyto buňky jsou označovány HL-60 MRI a bylo potvrzeno, že u nich existuje příjem, závislý na energetickém čerpadle, což není neočekávané zjištění vzhledem ktomu, že u původních buněk je možno prokázat stejnou situaci. V případě, že byl dehydroilludin M podáván dvakrát týdně IP, došlo k inhibici nádoru v závislosti na dávce účinné látky, jak je zřejmé z obr. 6. Dávka MTD při IP podání pro

-9CZ 288596 B6 dehydroilludin M byla dosažena při použití dvou dávek týdně IP. Podobný ústup nádoru bylo možno pozorovat při nitrožilním podání dehydroilludinu M.

Účinky dehydroilludinu M in vivo byly dále sledovány například v případě buněk L1210. Při dávce 2,5 mg/kg IP denně po dobu 5 dnů došlo k ILS pouze o 5 %. Pak byl dehydroilludin M podáván ve formě infuze, trvající 24 hodin, byla použita dávka 5,0 mg/kg, ILS 11 %. Pak bylo prokázáno, že v případě lidských myelocytů bylo pro příjem s energetickou závislostí nutno zkoušet dehydroilludin M in vivo proti myšímu modelu AML při použití buněk Cl498 a mimoto byla použita jediná injekce iludinu S v dávce 2,5 mg/kg IP, bylo dosaženo ILS 35 %. Ve druhém pokusu byla použita tatáž dávka IP jednou denně po dobu 5 dnů, bylo dosaženo ILS 44 %. Vzhledem k tomu, že zvířatům je možno podat 60 mg/kg IP nebo 1 mg/kg nitrožilně do ocasní žíly dvakrát týdně po dobu 4 týdnů, aniž by došlo k poškození zvířat se ztrátou hmotnosti nebo se níženým příjmem krmivá a vody, je možno dále optimalizovat použité dávky a dobu jejich podávání.

Příklad VII

Pokus na myší HL60/MRI při použití acylfulvenu a dehydroilludinu M myším bylo podkožně podáno v oblasti ramene 500 000 buněk HL60/MRI (lidská myeloidní leukemie). Léčení bylo zahájeno jedenáctého dne. Tento odklad počátku léčení je důležitým vymezením pro účinnost zkoumané látky vzhledem k tomu, že po této době již nádorové buňky rostou v cizorodé tkáni.

Myši byly rozděleny do šesti skupin po pěti myších. Jedna skupina byla kontrolní, těmto zvířatům byl podáván pouze roztok, užitý v ředění účinné látky. Ostatním skupinám byly podávány následující sloučeniny a dávky: dehydroilludin M v dávce 1,0 mg/kg, dehydroilludin M v dávce 3,0 mg/kg, acylfulven v dávce 0,3 mg/kg, acylfulven v dávce 1,0 mg/kg a acylfulven v dávce 3,0 mg/kg. Všem zvířatům bylo podáno rozpouštědlo nebo účinná dávka nitrožilně do ocasní žíly dvakrát týdně.

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 6. Dehydroilludin M i acylfulven byly účinné při inhibici růstu nádoru v závislosti na dávce. Zvířata, jimž byla podána nejvyšší dávka neměla žádné příznaky toxicity, například snížený příjem krmivá nebo vody ani pokles hmotnosti. Tyto výsledky prokazují, že je možno podávat vyšší dávky těchto látek. Bylo také možno uvedené látky podávat denně.

Tabulka 6

Buňky HL60/MRI, denní nitrožilní podání účinných látek

	celková hmotnost ná<	ořu (mg)
kontrola	den 11	den 18	den 25	den 32	den 40
rozpouštědlo	99+36	845+282	3299+1080	10162+4123	16747+5061
Dehvdroilludin M
1 mg/kg IV	114+55	883+311	2274+992	6025+1772	11507+3707
3 mg/kg IV	101+40	911+309	2127+1092	2854+1260	4784+2303
Acylfulven
0,3 mg/mg IV	73+38	540+167	1352+520	3204+1147	9501+4605
1 mg/kg	58+32	582+297	964+685	2321+1434	6275+2865
3 mg/kg	38+30	369+250	336+215	437+238	1201+501

-10CZ 288596 B6

Příklad VIII

Zkoušky in vitro a zkoušky na příjem do buněk

Vzhledem k výsledkům, dosaženým v předchozích příkladech a s ohledem na mechanismus působení illudinů a na specificitu pro tkáně je možno studovat příjem illudinu i u dalších buněčných linií myeloidní leukemie, například KG1, KGla, HEL, K562, 0CI-M1, AML-193.

Postup sledování in vitro byl vysvětlen v předchozích příkladech. Cytotoxicita nových analogů pro buněčné linie se vyhodnocuje v oblasti 5 log při použití růstu na pevném nebo polotuhém prostředí, mimoto se sleduje příjem thymidinu. Inhibice příjmu thymidinu se sleduje z toho důvodu, že předchozí zkoušky prokazovaly, že dochází k inhibici příjmu thymidinu působením illudinů a tato inhibice je přímo úměrná uhynutí buněk. Analogy účinných látek byly sledovány při použití normálních zárodečných buněk kostní dřeně a při použití řady buněčných linií včetně různých leukémií, B- a T-buněk a také v případě pevných nádorů, jako melanomu a nádoru vaječníků.

Zkoušky in vitro na účinnost dehydroilludinu M na různých buněčných liniích včetně MDR je také možno uskutečnit u DNA-deficientních buněčných linií a u normálních zárodečných buněk kostní dřeně. Je možno také připravit řadu dalších analogů. Vzhledem ktomu, že tyto analogy budou měněny na známých místech, je u nich možno očekávat obdobnou inhibici nádoru. Tyto analogy by měly být sledovány na různých linicích MDR tak, aby bylo zřejmé, že nedochází ke zkřížené odolnosti a také na DNA-deficientních buněčných linií.

Zkoušky in vitro mohou také sledovat citlivost dalších buněčných linií karcinomu mléčné žlázy, aby bylo možno stanovit, zda jsou také přednostně citlivé na illudin S, dehydroilludin M a na fuivenový analog.

Příklad IX

Stanovení příjmu illudinu v nádorových buňkách

Lidské buňky myeloidních nádorů jsou citlivé na illudidiny, avšak jejich normální prekurzory pro tvorbu granulocytů nebo makrofágů jsou poměrně odolné k působení illudinů v oblasti 1,5 až 2,0 log, což prokazuje, že u normálních buněk kostní dřeně chybí transportní systém, což může zajistit terapeutickou úroveň bezpečnosti.

Specifický příjem illudinu S byl zkoumán při použití poměrně citlivých buněk HL60 a u odolných B-buněk. Při teplotě 37 °C je možno u buněk myeloidní leukemie HL60 prokázat rychlý příjem illudinu S, kdežto u poměrně odolných 8392 B-buněk dochází k poměrně nízkému příjmu, jak je zřejmé z obr. 7. Nitrobuněčná akumulace illudinu v B-buňkách byla pomalá a lineární po dobu 7 hodin (r = 0,984), po této době se koncentrace uvnitř buněk blížila koncentraci v inkubační směsi. U buněk HL60 naproti tomu došlo k rychlému nahromadění účinné látky v průběhu 1 hodiny. U buněk HL60, vystaveným lOnM illudinu S došlo k 19násobnému zkoncentrování účinné látky, kdežto u B-buněk vůbec nedošlo k aktivnímu zkoncentrování této látky. Jak je zřejmé z obr. 8, došlo k rychlému koncentrování illudinu S uvnitř buněk HL60. Na druhé straně hromadění této látky u buněk 8392 B bylo závislé na koncentraci v okolním prostředí. Analýza počátečního příjmu illudinu S do buněk HL60 v různých koncentracích prokázala, že koncentrace illudinu S je v souladu s kinetikou Michaelis-Mentonova sycení, jak je zřejmé z obr. 9. Maximální hodnota pro buněčnou linii HL60 byla 27 pikomolů/min/mg bílkoviny, Km = 4,2 mikromol. To znamená, že buněčná linič HL60 má velmi vysokou schopnost transportu illudinu, maximální hodnota pro illudin je pětkrát vyšší než pro folát, což je vitamin, který je pro tuto buněčnou linii nezbytný.

-11CZ 288596 B6

Chladný (4 °C) jednoprocentní azid a metabolické blokátory 2-deoxyglukóza a antimycin A blokují příjem illudinu S do buněk HL60, avšak má jen malý vliv na odolné buňky 8392 B, jak je zřejmé z tabulky 7. Tyto pokusy prokazují, že illudin Sje transportován a koncentrován v buněčné linii HL60 systémem s energetickou závislostí, kdežto transport do odolných B-buněk 5 se uskuteční pouhou difusí, která je pasivní bez energetické závislosti. U buněk MCF7 karcinomu mléčné žlázy také docházelo k inhibici příjmu působením chladu. Zjištění transportního mechanismu s energetickou závislostí vysvětluje, proč jsou myeloidní buňky a buněčné linie nádorů mléčné žlázy tak citlivé na působení illudinů i po krátké době, kdežto B-buňky citlivé nejsou.

o

Tabulka 7

Příjem ³H-illudinu S u myeloidních buněk HL60 a 8392 B-buněk

	maximální příjem za hodinu v pikomolech³
podmínky	HL60	8392B	MCF7
37 °C	35 ± 16^b	5,5 ±1,4	29 ±4
4°C	4,3 ± 0,9	3,4+1,0	4,0 ±2,1
1% azid	8,7+1,4	4,3 ± 1,3	NT⁵
2-deoxyglukóza + antimycin A	16,7 + 3,5	3,6 ± 1,4	NT

Buněčné linie byly vystaveny na jednu hodinu působení 100 ng/ml ³H-illudinu S a pak byly výsledky vyjádřeny jako průměr ± SE, výsledky jsou průměrem ze tří pokusů.

^a na 10 milionů buněk ^b NT = nebylo provedeno.

Příklad X

Syntéza a struktura 2,5,6,7-tetramethyl-l-indenonu a dehydropterosinových sloučenin

Nejprve byl připraven 2,4,5,6-tetramethyl-l,3-indanion tak, že byl připraven roztok 1,2,3trimethylbenzenu a methylmalonylchloridu v sirouhlíku a v průběhu 2 hodin se přidá po kapkách chlorid hlinitý. Směs se vaří ještě 2 hodiny pod zpětným chladičem, přidá se drcený led a směs se třikrát extrahuje chloroformem. Extrakty se spojí, promyjí se nasyceným roztokem chloridu 30 sodného, vysuší a rozpouštědlo se odpaří na odparek, který se čistí chromatografií při použití 1% ethylacetátu v benzenu. Odstraněním rozpouštědla a čištěním sublimací se získá požadovaný produkt.

2,5,6,7-tetramethyl-l-indenon se připraví redukcí 2,4,5,6-tetramethyl-l,3-indanionu práško35 vým zinkem při teplotě 50 °C. Produkt se čistí chromatografií při použití 1% ethylacetátu v benzenu, čímž se získají dva izomery. Hlavní izomer se zpracovává působením 10% hydroxidu draselného a pak se čistí sublimací. Tato sloučenina má strukturu vzorce

-12CZ 288596 B6

Syntéza dehydropterosinu O

3-acetoxy-6-(beta-methoxy)ethyl-2,5,7-trimethyl-l-indanon se rozpustí ve směsi tetrahydrofuranu a 10% hydroxidu draselného a směs se vaří 2 hodiny pod zpětným chladičem. Pak se roztok třikrát extrahuje etherem a extrakty se spojí a chromatografují při použití 2% ethylacetátu v benzenu, čímž se získá dehydropterosin O vzorce

R = H dehydropterosin B

R = CH₃ dehydropterosin O.

Obě tyto látky jsou toxické pro buňky in vitro a mají antifungální vlastnosti.

Příklad XI

Syntéza acylfulvenových analogů

Řada acylfulvenových analogů, které mají klíčovou struktur, nutnou pro protinádorovou účinnost, může být připravena z illudinu S nebo úplnou syntézou z jednoduchých výchozích látek. Illudin S vzniká při fermentaci Omphalotus illudens. V případě, že se tato sloučenina rozpustí ve vodě a přidá se zředěná kyselina sírová, mění se tato látka na acylfúlven, v němž R] a R₂ jsou atomy vodíku a R₃ je methyl, s výtěžkem 55 %. Z acylfulvenu je možno získat velké množství analogů modifikací substituentu R₂, který je možno nahradit například hydroxymethylovou skupinou, atomem bromu, jodu, chloru nebo fluoru, nitroskupinou, p-hydroxybenzylovou nebo p-methoxybenzylovou skupinou. R₂ je možno nahradit také polynukleámí nebo heterocyklickou aromatickou skupinou.

Skupina Ri může znamenat acyl nebo alkyl. Analogy s různými skupinami R₃ (a také R₂) je možno připravit úplnou syntézou podle schématu

-13CZ 288596 B6

Kondenzace aldolu 1,1-diacetylcyklopropanu s dianiontem, odvozeným od příslušně substituovaného cyklopentadienu dává vznik meziproduktu, který se snadno mění na acylfulven. Je možná široká škála sloučenin vzhledem k tomu, že R? a R₃ mohou být alkyl, aiyl nebo substituovaný alkyl nebo aryl.

Syntéza acylfulvenu g 9,2 mmol illudinu S se rozpustí v 700 ml vody a přidá se 236 ml 4M kyseliny sírové. Roztok se míchá přes noc a pak se extrahuje ethylacetátem. Organická fáze se promyje nasyceným hydrogenuhličitanem sodným, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří. Chromatografií na oxidu křemičitém při použití hexanu a pak ethylacetátu se ve výtěžku 50 % získá 0,82 g acylfulvenu.

'H-NMR: 0,73 až 1,50 (m, 4H), 1,38 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 3,93 (s, 1H), 6,43 (s, 1H), 7,16 (s,lH), hmotové spektrum m/u 216 (M+), 202 (M+-CH₂), 188 (M+-CH₂CH₂), 173 (M+-2CHr-CH3), 170 (M+-2CHr-H₂O).

UV-spektrum 325 nm (8,3 x 10³), 235 nm (16,6 x 10³).

Sloučenina má strukturu

-14CZ 288596 B6

Syntéza 6-hydroxymethylacylfulvenu

550 mg, 2,5 mmol acylfulvenu se rozpustí ve 40 ml THF a přidá se 40 ml 30% roztoku formaldehydu ve vodě. Pak se přidá ještě 26,4 ml 4N kyseliny sírové, čímž se konečná koncentrace kyseliny sírové upraví na IN. Roztok se míchá přes noc a pak se extrahuje ethylacetátem. Organická fáze se promyje nasyceným hydrogenuhličitanem sodným, vodou a nasyceným chloridem sodným a vysuší síranem hořečnatým. Chromatografií na silikagelu při použití hexanu a pak ethylacetátu se ve výtěžku 64 % získá 400 mg hydroxymethylacylfúlvenu.

'H-NMR: 0,72 až 1,48 (m, 4H), 1,38 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 3,90 (s, 1H), 4,66 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 7,10 (s, 1H).

Hmotové spektrum m/z 246 (M+), 228 (M+-H2O), 218 (M+-CH2CH2), 186 (M+-CH₃-CH₂CH2-OH), 185 (M+-H₂O-CH2-CH2-CH₃).

UV-spektrum 233 nm (1,0 x 10⁴), 325 nm (7,7 x 10³).

Sloučenina má strukturu

Syntéza jodacylfulvenu

K roztoku 60 mg, 0,28 mmol acylfulvenu v 15 ml methylenchloridu se přidá 63 mg, 0,29 mmol trifluoracetátu stříbrného. Pak se při teplotě 0 °C po kapkách přidá ještě 8 ml roztoku 70,5 mg, 0,28 mmol jodu v methylenchloridu. Směs se míchá ještě 3 hodiny při uvedené teplotě, pak se zfiltruje přes celit a extrahuje etherem. Odpařením filtrátu se získá jodacylfúlven ve výtěžku 77 % jako 73 mg červené pryžovité látky.

'H-NMR: 0,76 až 1,54 (m, 4H), 1,38 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,87 (s, 1H), 7,16 (s, 1H).

Hmotové spektrum m/z 342 (M+), 314 (M+-CH2CH2), 299 (M+-CH2CH2-CH₃), 296 (M+CH2CH2-H2O), 215 (M+-I), 187 (M+-I-CH2CH2), 127 (I+).

Sloučenina má strukturu

-15CZ 288596 B6

Syntéza bromacylfulvenu mg, 0,28 mmol acylfulvenu se rozpustí při teplotě 0 °C v 9 ml acetonitrilu. Přidá se 50 mg, 0,28 mmol N-bromsukcinimidu a směs se míchá při uvedené teplotě ještě 3,5 hodiny. Pak se reakce zastaví přidáním vody a produkt se extrahuje etherem. Etherový extrakt se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší síranem hořečnatým. Chromatografíí se získá ve výtěžku 94 % celkem 77 mg bromacylfulvenu ve formě oranžových krystalků, které mají po překrystalování ze směsi ethylacetátu a hexanu teplotu tání 92 až 94 °C.

'H-NMR: 0,75 až 1,55 (m, 4H), 1,40 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 3,89 (s, 1H), 7,15 (s, 1H).

Hmotové spektrum m/z 295 (M+), 293 (M+-2), 267, 265 (M+-CH₂CH₂), 252, 250 (M+CH₂CH₂-CH₃), 249,247 (M+-CH₂CH2-H₂O), 215 (fulven-1).

Sloučenina má strukturu

Syntéza p-hydroxybenzylacylfulvenu mg, 0,4 mmol fenolu se přidá k roztoku 70 mg, 0,28 mmol hydroxymethylacylfulvenu ve 25 ml bezvodého methylenchloridu. Směs se zchladí na -78 °C a po kapkách se přidá 0,3 ml, 2,7 mmol etherátu trifluoridu boritého. Reakční směs se při uvedené teplotě ještě 1 hodinu míchá a pak se přidá voda k zastavení reakce. Organická vrstva se promyje vodou, nasyceným hydrogenuhličitanem sodným a nasyceným chloridem sodným a pak se vysuší síranem hořečnatým. Chromatografii na silikagelu při použití hexanu a ethylacetátu se ve výtěžku 98 % získá 90 mg produktu ve formě červených krystalků s teplotou tání 143 až 144 °C.

'H-NMR: 0,59 - 1,43 (m, 4H), 1,36 (s, 3H), 1,76 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 3,95 (s, 1H), 3,97 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 4,83 (s, 1H), 6,74 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,91 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H).

Hmotové spektrum m/z 322 (M+), 294 (M+-2 CH₂), 279 (M+-2 CHr-CH₃) 251 (M+-2 CH₂CH₃-CO), 215,107,

UV-spektrum nm (1,2 x 10⁴, s ohybem při 243 až 262 nm), 325 (7,1 x 10³), 410 nm (2,6 x 10³).

Sloučenina má strukturu

-16CZ 288596 B6

Syntéza p-methoxybenzylacylfulvenu

0,04 ml, 0,37 mmol anisolu se přidá k roztoku 10 mg, 0,04 mmol hydroxymethylacylfulvenu v 5 ml bezvodého methylenchloridu. Směs se zchladí na -78 °C a po kapkách se přidá 0,04 ml, 0,36 mmol etherátu trifluoridu boritého. Reakční směs se ještě 1 hodinu míchá při uvedené teplotě a pak se přidá voda k zastavení reakce. Organická vrstva se promyje vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného a pak se vysuší síranem hořečnatým. Roztok se odpaří a odparek se suší ve vakuu, čímž se v kvantitativním výtěžku získá 14 mg produktu.

’Η-NMR.· 0,59 - 1,40 (m, 4H), 1,36 (s, 3H), 1,76 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,95 (s, 1H), 3,99 (d, J = 16,12 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H).

Hmotové spektrum m/z 336 (M+), 308 (M+-CH2CH2), 215, 121 ((CH2-Ph-OCH3)+). UV-spektrum 410 nm (2,7x 10³), 325 nm (7,0 x 10³), 267 nm (1,0x 10⁴), 245 nm (ohyb), 226 nm (1,9 10⁴), 203 nm (1,4 x 10⁴).

Sloučenina má strukturu

Příklad XII

Sledování acylfulvenových analogů v buněčných kulturách in vitro

Studie in vitro při použití pokusů s buněčnými kulturami prokázaly, že 6-hydroxymethylacylfulven, bromacylfulven a jodacylfulven mají značnou toxicitu pro cílové nádorové buňky, zejména pro buněčné linie HL60 a MV522 po působení 2 a 48 hodin, jak je zřejmé z následujících tabulek 8 a 9. Relativní poměr toxicity po 2 a po 48 hodinách ukazuje na to, že by uvedené analogy mohly být účinnější in vivo než původní sloučenina illudin S i než analogy, které byly popsány v původní patentové přihlášce.

Tabulka 8

Cytotoxicita nových analogů po 2 hodinách při stanovení inhibice příjmu thymidinu ve srovnání s původními analogy a illudinem S

	IC50 po 2 hodinách (nanomol/litr)
	LH60	8392	MV522
Illudin S	10+1	236 ±22	19 ± 6
Dehydroilludin M	377 ±81	61,335 ±9,810	1,826 ±378
Acylfulven	998 ± 244	66,435 ± 13,006	727±180
6-hydroxymethylacylfulven	150+11	7,359 ± 2,096	114 ±28
acetátový analog 6-HMAF	3,333 ± 192	47,455 ±2,951	1,066 ±87
bromoacylfulven	803 ± 88	17,175 ±890	4,180 ±424
iodoacylfulven	2,602 ± 345	10,331 ±497	956 ±152
p-hydroxybenzylacylfulven	264 ±38	95,236 ±11,984	1,180 ± 180
p-methoxybenzylacylfulven	1,964 ±84	35,714 ±7,292	2,045 ± 208

-17CZ 288596 B6

Tabulka 9

Cytotoxicita nových analogů po 48 hodinách ve srovnání s původními analogy a s illudinem S

	IC₅o po 48 hodinách (nanomol/litr)
	LH60	8392	MV522
Illudin S	3±1	8±2	4± 1
Dehydroilludin M	296 ± 66	269 ±100	313 ±23
Acylfulven	364 ± 74	833 + 152	349 ± 23
6-hydroxymethylacylfulven	4± 1	76±4	73 ±8
acetátový analog 6-HMAF	806 ± 30	4,434 ± 163	486 ± 42
bromoacylfulven	412 + 21	1,186 ± 138	356 ±61
iodoacylfulven	290 ± 12	1,696±183	556 ±47
p-hydroxybenzylacylfúlven	382 ± 39	11,078 ± 388	615 ±56
p-methoxybenzylacylfulven	1,051 ± 104	7,143 ±244	1,548 ±214

Příklad XIII

Pokusy in vivo ío Na základě uvedených výsledků in vitro byl zvolen jeden z analogů, 6-hydroxymethylacylfulven po zkouškách in vivo, aby bylo možno stanovit, zda analogy jsou skutečně účinnější než acylfulven. Byl užit opět lidský adenokarcinom plic MV522 jako buněčná linie, která není citlivá na běžné protinádorové látky a snadno metastazuje, takže neběží o místní invazi nádoru. Jako kontrolní látky byly použity běžné protinádorové látky cis-platin, taxol, mitomycin C, 15 adriamycin a illudin S. Kontrolní skupině bylo podáváno pouze rozpouštědlo, použité pro přípravu roztoků účinných látek, šlo o směs 40 % dimethylsulfoxidu ve fyziologickém roztoku chloridu sodného (40% DMSO/NS). 6-hydroxymethylacylfulven způsobil ústup nádoru u zvířat. Před použitím tohoto modelu nebylo nikdy možno pozorovat přímý ústup nádoru. Tohoto ústupu nebylo možno dosáhnout běžnými sloučeninami ani illudinem S, jak je zřejmé z obr. 10.

Zvířatům bylo podáno pouze devět dávek 6-hydroxymethylacylfulvenu. U zvířat nebylo možno pozorovat žádné toxické vedlejší účinky, jako pokles aktivity, pokles přírůstků nebo příjmu krmivá nebo vody. Nebylo také možno pozorovat žádné prodloužení života po podání cisplatiny, taxolu, mitomycinu C ani adriamycinu ve srovnání s kontrolními zvířaty (DMSO/NS). Illudin S dokonce způsobil svou toxicitou předčasné uhynutí, jak je zřejmé z tabulky 10. Zvířata, 25 léčená 6-hydroxymethylacylfulvenem přežívala déle než kontrolní skupina a než zvířata, léčená cis-platin, taxolem, mitomycinem C a adriamycinem, p je menší než 0,001 pro všechny skupiny, jak je zřejmé z tabulky 10.

Tabulka 10

Účinnost 6-hydroxymethylacylfulvenu ve srovnání s jinými látkami na metastatickém modelu lidského plicního adenokarcinomu MV522 - první pokus

účinná látka		přežívání
kontroly DMSO/NS IP	3 x týdne	100±7%
cis-platin	3,2 mg/kg IP lx týdně	102 + 8%
taxol	4,0 mg/kg IP 5 x týdně	100 ±10 %
mitomycin C	2,4 mg/kg IP lx týdně	111 ±2%
adriamycin	2,6 mg/kg IP lx týdně	98 ± 12 %
illudin S	2,5 mg/kg IP 3x týdně	< 26 % (5/5 uhynulo po třech dávkách)
6-hydroxymethylacylfúlven	10 mg/kg IP 3x týdně	233 ± 18%

-18CZ 288596 B6

Pokus byl opakován při použití různých dávek 6-hydroxymethylacylfulvenu, aby bylo možno stanovit závislost odpovědi na dávce. Jako kontrolní látky bylo použito taxol a illudin S v nízkých dávkách, jak je zřejmé z tabulky 11. Opět byla zařazena kontrolní skupina, jíž bylo podáváno pouze rozpouštědlo (40 % DMSO/NS). Regrese nádoru byla pozorována při 10 mg/kg a inhibice nádorového růstu při dávkách 1 a 5 mg/kg. Taxol a illudin S v nízkých dávkách opět nezabránily růstu nádoru, jak je zřejmé z obr. 11. Při tomto druhém pokusu opět nebylo možno pozorovat prodloužení života u zvířat, léčených taxolem nebo illudisinem Sve srovnání s kontrolními zvířaty (40 % DMSO/NS). Zvířata, jimž bylo podáváno 10 mg/kg nebo 5 mg/kg 6hydroxymethylacylfulvenu přežívalo statisticky významně déle než kontrolní zvířata a zvířata léčená taxolem nebo illudinem S. Hodnota pravděpodobnosti nebo statistické významnosti pro zvířata s dávkou 10 mg/kg 6-hydroxymethylacylfulvenu proti kontrolám nebo jinak léčeným zvířatům byla ve všech případech nižší než 0,001 (p je menší než 0,001). Pravděpodobnost pro dávku 5 mg/kg téže látky proti kontrolám nebo zvířatům, léčeným taxolem nebo illudinem S byla rovněž ve všech případech nižší než 0,001 (p je menší než 0,001). Zvířata s dávkou 1 mg/kg 6hydroxymethylacylfulvenu rovněž přežívala statisticky významně déle než kontrolní zvířata (p je menší než 0,01).

Tabulka 11

Účinnost 6-hydroxymethylacylfulvenu ve srovnání s jinými látkami na metastatickém modelu lidského plicního adenokarcinomu MV522 - druhý pokus

účinná látka		přežívání
kontroly MDSO/NS	IP 3 x týdně	100 ± 16% (definováno jako 100 %)
taxol	4,0 mg/kg IP 5 x týdně	120+10% (nevýznamná)
illudin S	0,025 mg/kg IP 3 x týdně	104 ±20%
6-hydroxymethylacylfulven	10 mg/kg IP 3 x týdně	232 ± 20 %
6-hydroxymethylacylfúlven	5 mg/kg IP 3 x týdně	154 ±13%
6-hydroxymethylacylfulven	1 mg/kg IP 3 x týdně	135 ± 10%

Pokus byl opakován potřetí, výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Množství taxolu, podaného IP bylo zvýšeno na maximální dávku a bylo přidáno podkožní podání vzhledem ke zprávám, že by tento způsob podání mohl být účinnější. Znovu byly použity také adriamycin a mitomycin C. Byly zařazeny dva žňových derivátů acylfulvenu, jodacylfúlven a p-hydroxybenzylfúlven. Diketonový analog byl zařazen k průkazu značného zlepšení 6-hydroxymethylacylfúlvenu. 6hydroxymethylacylfuíven značně prodlužoval dobu přežití oproti kontrolám a zvířatům, léčeným jakoukoliv jinou sloučeninou. Hodnota pravděpodobnosti nebo statistické významnosti pro 6hydroxymethylacylfulven proti kontrolní skupině, mitomycinu C, adriamycinu a taxolu byla méně než 0,005 (p je menší než 0,0005). Jde o vysokou statistickou významnost. Je důležité uvést, že vzhledem k délce přežívání dvou určitých zvířat není možno vyloučit, že zvířata byla zcela vyléčena. Přestože diketon rovněž značně zvyšoval dobu přežívání ve srovnání s kontrolními zvířaty (p je menší než 0,002) a ve srovnání s jinak léčenými zvířaty není tato látka tak účinná jako 6-hydroxymethylacylfulven. Doba přežívání u zvířat, léčených vysokou dávkou taxolu 6 mg/kg IP nejen poklesla pod dobu u zvířat, jimž byla podávána dávka 4 mg/kg taxolu, nýbrž je ještě kratší než u kontrolních zvířat. To znamená, že byla překročena maximální dávka taxolu, jehož toxicitou nyní zvířata hynou. Další nové analogy, bromacylfulven a phydroxybenzylacyl fulven byly na tomto modelu rovněž účinné.

-19CZ 288596 B6

Tabulka 12

Účinnost 6-hydroxymethylacylfulvenu ve srovnání s dalšími látkami na metastatickém modelu lidského adenokarcinomu plic MV522 - třetí pokus

účinná látka		přežívání
kontroly MDSO/NS	IP 3 x týdně	100 ±29%
taxo!	6,0 mg/kg IP 5 x týdně	93 ± 22 %
taxol	20,0 mg/kg IP 5 x týdně	113 ±22%
mitomycin	2,4 mg/kg IP 1 x týdně	149 ±12%
adriamycin	2,6 mg/kg IP 1 x týdně	105 ±25%
diketon	30 mg/kg IP 3 x týdně	153 ±6%
jodacylfulven	20 mg/kg IP 3 x týdně	120 ±34%
p-hydroxybenzylacylfulven	15 mg/kg IP 3 x týdně	125 ± 16 %
p-hydroxybenzylacylfulven	20 mg/kg IP 3 x týdně	126 ±22%
6-hydroxymethylacylfulven	10 mg/kg 3 x týdně	>204 % (dvě zvířata jsou na živu, a jsou možná vyléčena)

Přestože byl vynález popsán na základě výhodných provedení, je zřejmé, že by bylo možno navrhnout ještě řadu modifikací, rovněž spadajících do rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

OCHj, I, nebo Br.
2. Acylfulvenové analogy podle nároku 1 obecného vzorce I, v němž R znamená skupinu CH₂OH.
3. Acylfulvenové analogy podle nároku 1 obecného vzorce I, v němž R znamená phydroxybenzyl.
4. Acylfulvenové analogy podle nároku 1 obecného vzorce I, v němž R znamená pmethoxybenzyl.

-20CZ 288596 B6
5. Acylfulvenové analogy podle nároku 1 obecného vzorce I, v němž R znamená atom jodu nebo bromu.
6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje účinné nádory inhibující množství acylfulvenového analogu obecného vzorce I

OCHj, I, nebo Br.

spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje acylfulvenový derivát vzorce I, v němž R znamená skupinu CH₂OH.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje acylfulvenový derivát vzorce I, v němž R znamená p-hydroxybenzyl.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje acylfulvenový derivát vzorce I, v němž R znamená p-methoxybenzyl.
10. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje acylfulvenový derivát vzorce I, v němž R znamená atom bromu nebo jodu.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tím, že je ve formě pro nitrožilní perorální nebo intraperitoneální podání nebo pro podání inhalací.
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje v dávkové jednotce 30 až 100 mg účinné látky spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.