CZ288186B6 - Porphocyanines and CNC-expanded porphyrins - Google Patents

Description

Porfokyaniny a CNC-expandované porfyriny

Oblast techniky

Vynález se týká CNC-expandovaných porfyrinů, jako jsou porfokyaniny, způsobu jejich přípravy a použití těchto sloučenin při detekci nebo destrukcí cílových buněk či tkání světelným zářením. Jde zejména o použití sloučeniny podle vynálezu při zobrazovacích metodách, které využívají záření nebo nukleární magnetické rezonance.

Dosavadní stav techniky

Přestože bylo věnováno značné úsilí syntéze a výzkumu vlastností porfyrinů a jiných tetrapyrrolových makrocyklických sloučenin, jsou více méně známy větší aromatické systémy, obsahující pyrrol, tak zvané „expandované porfyriny“. Tyto porfyriny mají větší počet π elektronů, přídavné koordinační heteroatomy a větší molekulu, a proto se nabízejí jako výhodné oproti porfyrinům. Mnohé expandované porfyrinové systémy obsahují více než 4 pyrrolové kruhy. Syntézu safyrinu z tripyranu dikarboxylové kyseliny a bipyrroldikarboxaldehydu, při které vzniká pentapyrrolová sloučenina, popsal před několika desetiletími Woodward, R.B., Aromaticity Conference, Scheffield, England, 1966. Viz také Broadhurst et al. J. Am. Chem. Perkins Trans. (1972) 1:2111 a Baier et al. J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6429. Syntéza smaragdyrinu z bipyrroldikarboxaldehydu a pyrroldipyrrolmethanu dikarboxylové kyseliny byl popsán v r. 1970 M.M. Ringem (Ph. D. Dissertation, Harvard University, Cambridge, MA).

Uranylový komplex superftalokyaninu je jinak pentapyrrolová makrocyklická sloučenina historického významu. Tato sloučenina byla připravena přímou kondenzací dikyanbenzenu s chloridem uranylu avšak volná báze je nestabilní (Day et al. J. Am. Chem. Soc. (1975) 97:4519). Demethylace vede ke zmenšení kruhu a vznikají ftalokyaniny. (Marks, TJ. a D.R. Stojakovic J. Am. Chem. Soc. (1978) 100:1695).

Gossauer syntetizoval první hexafyrin kondenzací ůw-tripyranu s tripyrandialkahydem s následnou oxidací (Bull. Sod. Chim. Belg. 1983, 92:493). Ze šesti methanových můstků, přítomných v hexafyrinu, mají dva konfiguraci E (Id.). Charriere uvádí, že hexafyriny tvoří bimetalické komplexy s několika přechodovými kovy (1987, Thesis, Universita Fribourg, Švýcarsko). Další hexapyrrolový systém, rubyrin, byl nyní syntetizován včetně struktury (Sessler et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991a, 30:977)

Další důležitou skupinou makrocyklů obsahujících pyrrol jsou vinylové porfyriny nebo platyriny, které popsali R.A. Berger a E. LeGoff (Tetra. Lett. 1978 44:4225) viz také LeGoff, E. a O.G. Weaver J. Org. Chem. 1977, 52:711 a Franck et al. Proč. SPIE Int. Soc. Opt. Eng., Ser. 5 (1988) 997:107. Obecně se tyto sloučeniny připravují reakcí dipyrromethanu s dipyrromethanem substituovaným akrylaldehydem (Beckman et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990, 29:1395). Bisvinylové expandované porfyriny byly dále expandovány na tetravinylové porfyriny, ve kterých jsou všechny čtyři meso můstky prodlouženy. Tetravinylové porfyriny se vyrábějí kysele katalyzováno usamovolno kondenzací allylalkoholů sustituovaných pyrrolem s chráněným Natomem. Tetravinylové porfyriny mají silný posun Soretovy vazby o více než 100 nm oproti normálním porfyrinům (Gosman, M. a B. Franck Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986 25:1100; Kniibel, g. a B. Franck Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1988 27:1170). Dále byly nyní popsány syntézy bisvinylových porfycenů (Jux et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990 29:1385; Vogel et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990 29:1387).

Další skupinu makrocyklických sloučenin s obsahem pyrrolu představují Schiffovy báze, reprezentované taxafyriny (Sessler et al. J. Org. Chem. 1987 52:4394; Sessles et al. J. Org.Chem. 1988 110:5586: Sessler J. L. et al. Acc. Chem. Res. 1994 27:43 až 50. Texafyriny se připravují

-1 CZ 288186 B6 kysele katalyzovanou kondenzací dialdehydtripyranu s o-fenylendiaminem. Několik texafyrinů už bylo připraveno jednoduchými postupy (Sessler et al. 1991 Abstrakt 201. Nati. Soc. Mtg., Inorganic Division; Sessler et al. Inorg. Chem. 1992 28:529).

Použití porfyrinů v kombinaci s ozařováním pro detekci a ničení maligních buněk má v současné době již za sebou dosti výrazný vývoj. (Viz např. „Porfyrin Photosenzitization“ Kessel. D. et al., eds. Plenům Press, 1983). Některé porfyriny projevují přirozenou schopnost shromažďovat se v maligních buňkách. Při ozařování mají porfyriny dvě užitečné vlastnosti. Jednak mohou projevovat fluorescenti při ozařování ultrafialovým nebo viditelným světlem a tím být užitečné při diagnostických metodách detekce malignity (viz např. Kessel et al. supra; gregory H.B. Jr. et al., Ann. Surg. 1968 167: 287 až 829).

Dále některé porfyriny vykazují při ozařování cytotoxický účinek vůči buňkám, v nichž se shromažďují (viz např. Diamond I. et al., Lancet 1972: 2: 1175 až 1177; Dougherty, TJ. et al. Cancer Research 1978 38: 2628 až 2635; Doughert TJ. et al., The Science of Photo Medicine 625 až 638 (J.D. Regan & J. A. Parrish, eds., 1982); Dougherty TJ. et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology 1836 až 1844 (V.T. DeVita Jr. et. al., eds., 1982). Určité expandované porfyriny jako safyrin, texafyrin a vinylované porfyriny mají unikátní vlastnosti při aplikaci dlouhých vlnových délek a vzniku atomárního kyslíku, pro které mohou být také zajímavé jako potencionální fotosenzitizery, použitelné při fototerapeutickém léčení rakoviny (Maiya et al. J. Phys. Chem. 1990,94:3597; Sessler et al. SPIE Soc. 1991 1426:318: Franck et al. supra).

Porfyriny jako například hematoporfyrin, monohydrobenzoporfyrinové deriváty (BPD) a porfimer sodný, už byly konjugovány s immunoglobuliny, specifickými pro cílové buňky, pro ovlivnění jejich schopnosti dostat se do požadovaných buněk či tkání.

Jedním z problémů zavedení fotodynamické terapie v praxi je, že potřebná vlnová délka je v oblasti 630 nm, což je záření, které je pohlcováno jinými porfyriny a přírodními chromofory, které jsou normálně přítomny v krvi i v jiných tkáních. Proto je hloubka účinného působení limitována na několik milimetrů v důsledku blokovacích účinků přírodních chromoforů pohlcujících světlo, jako je například hemoglobin, pokud je požadovaná větší hloubka, je potřebná podávat látky, které zprostředkují účinky záření a mohou být excitovány při delších vlnových délkách, jako BPD. Tím se lze vyhnout stínícímu účinku přírodních chromoforů, přítomných uvnitř ošetřovaného organismu.

Kromě fototerapie jsou expandované porfyriny užitečné pro magnetické rezonanční zobrazování (MRI). MRI je nenarušující, neionizující metoda, která umožňuje pozorování a rozlišování tkání v ranných stadiích vývoje. V současné době má MRI výraznou nevýhodu v tom, že rozdíl signálů nemocné a zdravé tkáně je většinou nedostatečný k tomu, aby se mohla metoda použít pro klinickou praxi. Pro překonání tohoto problému se vyvíjejí kontrastní přísady pro MRI. Pro jednotlivé klinické případy byly v tomto směru nyní například použity paramagnetické kovové komplexy například odvozené do trojmocného gadolinia (Gd).

Dnes se dosáhlo přípravy koordinačních sloučenin gadolinia, použitelných jako kontrastní činidla, pomocí ligandů karboxylátového typu včetně porfyrinů, ale mnohem lepší výsledky mají texafyriny. (Viz např. Lauffer, R.B. Chem. Rev. 1987, 87:901; Komguth et al. J. Neurosurg. 1987 66:898; Koenig et al. Invest. radiol 1986 21:697; Chacheris et al. Inorg. Chem. 1987 26:958; Loncin et al Inorg. Chem. 1986 25:2646; Chang, C.A. a V.C. Sekhar Inorg. Chem. 1987 26:1981. Sessler et al. uvádějí, že texafyriny tvoří extrémně stabilní gD(III) komplex in vitro (Sessler et al. Inortg. Chem. 1989 28:3390. gd(III) netvoří stabilní komplexy s normálními porfyriny. Podle publikovaných informací tvoří texafyriny kromě gadolinia komplexy ještě s řadou přechodových kovů jako je Cd a Eu (Sessler, J. L. a A.K. Burrell Tpo. Cur. Chem. 1992 161:177.

-2CZ 288186 B6

Podstata vynálezu

Vynález řeší nové sloučeniny absorbující světlo, použitelné pro detekci a/nebo ošetřování cílových tkání, buněk a patogenů. Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné ve fotodynamické terapii a při diagnóze podobným způsobem jako porfyriny, ttalokyaniny, BPD a jejich deriváty. Sloučeniny podle vynálezu lze podávat, pokud je to žádoucí, v relativně nízkých dávkách, protože mají schopnost pohlcovat záření mimo oblast vlnových délek, pohlcovanou normálně složkami, přítomnými ve vysoké koncentraci v krvi nebo vjiných tkáních, zejména porfyrinové zbytky, navázané normálně na hemoglobin a myoglobin. To je výhodné tehdy, jestliže se požaduje hlubší pronikání světla do tkání. V některých případech, je-li postačující povrchové působení, lze použít kratších vlnových délek.

Tyto sloučeniny se přednostně hromadí v cílových tkáních a buňkách, ve srovnání s necitovými tkáněmi a buňkami, tato vlastnost však není nezbytná pro účinnost léčebného zákroku. Viz US přihláška č. 07/948113, podaná 21. září 1992 a 07/979546, podaná 20. listopadu 1992, jejichž obsahy jsou začleněny do popisu formou odkazu.

Předmětem vynálezu je CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina vzorce 1

Pi- Zi- (Pi- Zi)_n- Pi- Zi (1)

I________________________________________________________________________I v němž n je celé číslo od 1 do 4 a index i u každého symbolu P; a Z; nabývá ve vzorci odleva doprava postupně hodnoty od 1 do n+2;

v němž každé -Pí-je nezávisle pyrrolový zbytek vzorce

v němž index i u každého Rj_a a R,_b má tutéž hodnotu jako v každém -Pj- a v němž každé Žije nezávisle (a) kovalentní vazba, (b) meso můstková skupina vzorce

=C- <—>

-3CZ 288186 B6 (c) N-meso můstková skupina vzorce =N- <—> -N= / (d) vazba uhlík-uhlík vzorce

(e) vazba uhlík-dusík-uhlík-uhlík-dusík-uhlík vzorce ^if ^ig

-CH=N-O=C-N=CH- <—>

nebo (f) vazba uhlík-dusík-uhlík vzorce

-CH=N-CH= <—> =CH-N=CH- / kde každé R_ia, Rj_b, Ri_C, Rid, Rj_e, Rif a R,_g je nezávisle vodík, halogen, skupinu nitro, kyano, N(R')2, SR', OR', SOR', SO₂R', COOR', NOC(R')₂, kde každé R'je nezávisle vodík, Ci^alkyl, popřípadě substituovaný Ci^alkyl, popřípadě substituovaný C₂_6alkenyl, popřípadě substituovaný C^alkinyl, popřípadě substituovaný C4_₁₂aryl nebo popřípadě substituovaný Cs-igarylalkyl, kde uvedeným případným substituentem je výše uvedeno halogen, skupinu nitro, kyano, NÍR'^, SR' nebo OR' a/nebo C^alkyl, C₂_6alkenyl nebo C₂_6alkinyl v substituovaném arylu a kde mohou být amino-, sulfhydrylové a hydroxylové substituenty Ci_6acylovány, kde alespoň jedno Z, znamená shora uvedenou vazbu uhlíku k dusíku k uhlíku, a její formy metalované paramagnetickým iontem nebo radiozotopem, formy kovalentně konjugované s cílově specifickou jednotkou a farmaceuticky přijatelné soli.

Prototypem této skupiny „CNC-expandovaných porfyrinů“ je porfokyanin, popsaný dále.

Předmětem vynálezu jsou dále konjugáty, v nichž jsou vynalezené sloučeniny kovalentně vázány na cílově specifické jednotky, jako immunoglobuliny, použitelné stejně jako sloučeniny podle vynálezu při fotodynamické terapii nebo diagnóze. Dále jsou zahrnuty formy vynalezených sloučenin, použitelné při zobrazování pomocí záření a magnetickém rezonančním zobrazování jako kontrastní činidla. Vynález zahrnuje rovněž farmaceutické prostředky s obsahem sloučenin podle vynálezu a jejich konjugátů. Dalším aspektem vynálezu jsou syntézy vynalezených sloučenin.

-4CZ 288186 Β6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje emisní spektrum oktaethylporfokyaninu ve formě volné báze.

Obr. 2 ukazuje emisní spektrum oktaethylporfokyaninu ve formě adiční soli s kyselinou.

Obr. 3 ukazuje některá výhodná provedení sloučenin podle vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu, označované zde jako „CNC-expandované porfyriny“, obsahují alespoň 3 pyrrolová jádra navázaná kovalentními vazbami nebo popřípadě substituovanými meso řetězci, které jsou původní součástí porfyrinů, nebo N-znaro řetězci, nebo popřípadě substituovanými CC řetězci, jak se nacházejí v porfacenech nebo popřípadě substituovanými CNCCNC řetězci analogickými o-fenylendiaminovým řetězcům, nacházejícím se v texafyrinech, nebo CNC řetězci, přičemž alespoň jeden řetězec je CNC řetězec vzorce — CH=N—CH= ► =CH— N=CH

Členy jedné specifické třídy, která náleží do této skupiny, jsou označovány jako porfokyaniny. Jsou reprezentovány vzorcem

Různé R substituenty jsou takové, které neinterferují se základním porfokyaninovým jádrem a jejichž schopnost absorbovat světlo vhodných vlnových délek a dosáhnout alespoň jednoho žádoucího účinku jako je zprostředkování destrukce cílových tkání a buněk v souvislosti s fotodynamickou terapií, působení jako MRI kontrastní látka a podobně. Charakterizace vhodných substituentů R které nepůsobí rušivě (neinterferují), je diskutována dále. Lze však říci, že použitelné je veliké množství substituentů, při nichž nedochází k rušení užitečných vlastností těchto sloučenin. Vhodná volba těchto neinterferujících substituentů závisí na konkrétním požadovaném použití. Například pokud jde o použití in vivo, musí být substituenty netoxické. Pokud se používá sloučenin in vitro, zejména je-li možno sloučeniny z cílového materiálu odstranit, není tato podmínka nutná. Průměrný obchodník v oboru rozumí na základě shora uvedeného, jakými zásadami se má řídit při volbě jednotlivých Rj.

Kromě sloučenin vzorce la patří do rozsahu vynálezu CNC-expandované porfyriny. V jednom z výhodných provedení, kde n = 2, může vzorec 1 vypadat následovně:

-5CZ 288186 B6 p, z, P₂

Z₂ p<—Zi---^P3 přičemž každé P, a Zi má význam uvedený shora. Příkladem těchto - CNC - sloučenin, v nichž n = 2, jsou sloučeniny následujících vzorců lb, lc, ld ale:

l(b)

-6CZ 288186 B6 nebo obecně:

( í )

Jak je vidět z těchto strukturních vzorců, musí být mezi čtyřmi pyrrolovými jádry alespoň jeden CNC řetězec. Na druhé straně řetězec však může být vázány nejen kovalentně, ale může se jednat o obvyklý meso jednoatomový methinový můstek, popřípadě substituovaný Rj_C či o další shora popsané řetězce. Výsledné uspořádání π- vazeb v CNC porfyrinech podle vynálezu závisí na volbě řetězce, jak je zřejmé organickému chemikovi. Tak například změna lichého počtu meso řetězců, obsahujících CNC změní aromatický systém na nearomatický, avšak stabilní systém. Změna sudého počtu zachovává aromatický charakter.

Další provedení zahrnuje ty případy, kdy η = 1:

nebo pokud n = 3:

nebo pokud n = 4:

Zejména výhodná provedení jsou na obr. 3.

Pokud jde o substituenty Ru, R*, Rj_c, Rj_d, Rj_e, Rif a Rj_g obecně, každý z nich může nezávisle znamenat H, halo, nitro, kyan, NR'₂, SR', OR', SOR', SO₂R', COOR', CONR'₂, popřípadě substituovaný alkyl, popřípadě substituovaný alkenyl, popřípadě substituovaný alkinyl, popřípadě substituovaný aryl nebo popřípadě substituovaný arylalkyl. Substituent R' označuje vodík nebo alkyl (1 - 6C). Aminové, thiolové a hydroxylové substituenty mohou být také acylovány (1 6C). Vhodnými substituenty pro uvedené případné substituenty jsou ty, které byly shora jmenovány, tj. halo, nitro, kyano, NR'₂, SR', OR' a podobně. Pochopitelně aromatická jádra mohou být také substituována alkylovou, alkenylovou nebo alkinylovou skupinou.

Výrazy „alkyl“, „alkenyl“ a „alkinyl“ jsou zde míněny v obvyklém významu jako uhlovodíkové substituenty, obsahující 1 - 6C, které jsou nasycené nebo nenasycené a mají lineární nebo větvený řetězec nebo jsou zčásti či zcela cyklické. Tedy například výraz „alkyl“ může zahrnovat methyl, terciární butyl, cyklohexyl, n-hexyl a podobně. .Alkenyl“ může zahrnovat uhlíkový skelet s jednou nebo více dvojnými vazbami a „alkinyl“ může zahrnovat jednoduchý uhlíkatý skelet s jednou nebo více trojnými vazbami. .Arylalkyl (5 - 18C)“ označuje arylový substituent, spojený s CNC-expandovaným porfyrinovým jádrem alkenovou skupinou, přičemž „alkylen“ je zde definován analogicky jako alkyl (1 - 6C).

Výraz „aryl“ je míněn aromatický zbytek se 4 - 12C, popřípadě obsahující jeden nebo více heteroatomů. Takže použitelná arylová skupina zahrnuje fenyl, naftyl, pyridyl, pyrimidyl, chinolyl a podobně.

Pokud substituenty obsahují karboxylovou, kyselou nebo aminovou skupinu, patří do rozsahu vynálezu i jejich odpovídající soli.

Soli -COOH mohou být odvozeny od anorganických nebo organických zásad, včetně farmaceuticky přijatelných netoxických anorganických nebo organických zásad. Vhodnými anorganickými zásadami jsou sodík, draslík, lithium, ammonium, vápník a hořčík, hydroxidy a podobně. Zejména jsou výhodné draselné a sodné soli. Mezi farmaceuticky přijatelné netoxické zásady patří primární, sekundární, terciární a kvartemí aminy včetně cyklických aminů a zásaditých iontoměničů na bázi pryskyřic. Příkladem jsou izopropylamin, trimethylamin, ethanolamin, dicyklohexylamin, lysin, arginin, histidin, kofein, prokaín, cholin, betain, glukosamin, theobromin, puriny, pyperazin, polyaminové pryskyřice a podobně.

-8CZ 288186 B6

Kterákoliv z aminových skupin, obsažená v substituentech, může být také přítomna ve formě adiční soli s kyselinou. Také CNC-expandované porfyrinové jádro jako takové může být přítomno ve formě adiční soli s kyselinou. Tyto soli se tvoří z anorganických kyselin jako ke kyselina chlorovodíková, sírová a fosforečná nebo s organickými kyselinami jako je octová, šťavelová, benzoová a podobně.

Převedení sloučenin podle vynálezu z volné kyseliny nebo zásady ne odpovídající sůl a zpět lze provést metodami, které jsou v oboru dostatečně známy.

Výhodná provedení R_ia a Rj_b představují vodík, popřípadě substituovaný alkyl, popřípadě substituovaný aryl a popřípadě substituovaný arylalkyl. Zejména výhodným substituentem je karboxyl. Nejvýhodnější je vodík a alkyl, Dále Rj_a a Ra, jsou sice definovány jako nezávislé, ale volba symetrických substituentů usnadňuje přípravu sloučenin vzhledem k nižšímu počtu složek ve výsledném reakčním produktu. Výtěžek je totiž vyšší jestliže je nižší počet možných produktů. Proto jsou zejména výhodné ty sloučeniny podle vynálezu, v nichž všechny Rj_a jsou stejné jako všechny R_ib a zejména když všechny Rj_a a Rj_b jsou stejné. Dalším výhodným provedením je takové, kdy ve sloučenině 1 a jsou substituenty Ri_a, R]_b, R^ a R|_b stejné a kdy R_2a, R_2b, R_3a a R_3b jsou navzájem stejné ale odlišné od Ri_a, Ri_b, R»_a a R_4b.

Zejména výhodná provedení R_ic - R_ig zahrnují H a popřípadě substituované aromatické (arylové) zbytky. Zejména výhodné jsou jako R_IC vodík a popřípadě substituovaný fenyl.

Příkladem výhodných sloučenin podle vynálezu je η = 1 jsou:

1. Zi je CNC, Z₂ je meso přičemž R_2c je H, Z₃ je kovalentní vazba, Rj_a a R_2b jsou H a Ri_b, R_2a, R_3a a R_3b jsou methyl.

2. Z] je CNC, Z₂ je meso přičemž R_2c je fenyl, Z₃ je kovalentní vazba, R_u, R_2a, R_3a a R_3b jsou (CH₂)₂COOH, Ri_b je methyl a R_2b je H.

3. Zi je CNC, Z₂ je CNCCNC, přičemž R₂f a R_2g jsou H, Z₃ je CC kde R_3d a R_3e jsou H, přičemž R_)a a R_2b jsou H, a R_Ib, R_2a·, R_3a a R_3b je methyl.

4. Z] je CNC, Z₂ je CNCCNC, přičemž R_2f a R_2g jsou fenyl, Z₃ je CC přičemž R_3d je R_3e jsou fenyl, R_ta, R_2a, R_2a, R_3a a R_3b jsou (CH₂)₂COOH, Ri_b je methyl R_2b je H.

5. Zi je CNC, Z₂ je CNCCMC kde R_2f je fenyl a R_2g je H a Z₃ je CC řetězec kde R_3d je fenyl a R_3e je H a kde Ri_a, R_2a a R_3a jsou fenyl a Ri_b, R_2b a R_3b jsou H.

Výhodná provedení v případě, že n = 2 jsou:

1. Z] je CNC, Z₂ je N-meso, Z₃ je meso přičemž R_3e je methyl, a Z₄ je CNC a kde Ri_a a R_2b jsou H a R]_b, R_2a, R_3a a R_3b jsou methyl.

2. Zi je CNC, Z₂ je N-meso, Z₃ je meso přičemž R_3c je fenyl a Z₄ je CNC a kde Ri_a, R_2a, R_3a, R_3b a R|_a jsou (CH₂)₂COOH, Ri_b, R₂b a R^ jsou H.

3. Zi je CNC, Z₂ je N-zneso, Z₃ je meso přičemž R_3c je H, Z₄ je CNC přičemž R_ia, R_2a, R_3a a R_4a jsou fenyl a Ri_b, R₂b, R_3b a R41, jsou ethyl.

4. Zi je CNC, Z₂ je CNCCNC, přičemž R₂f a R_2g jsou oba fenyl, Z₃ je CC řetězec přičemž R_3d a R_3d jsou H, Z₄ je kovalentní vazba a kde Ri_a a Ř_2b jsou H a Ri_b, R_2a, R3a, R31» R»a a Rib jsou methyl.

-9CZ 288186 B6

5. Zi je CNC, Z₂ je CNCCNC kde R_2f a R_2g jsou H nebo Z₃ je CC řetězec přičemž R_3d je ethyl a R_3e je H a Z₄ je meso přičemž Rte je ethyl a kde Ru, R_2a, R_3a, R₃b a R4_a jsou (CH₂)₂COOH a Ri_b, R_2b a R4_b jsou H.

6. Zi je CNC, Z₂ je CNCCNC kde R₂f je ethyl a R_2g je H, Z₃ je meso přičemž R_3c je fenyl a Z₄ je CC řetězec přičemž R3_d a R3_e jsou methyl Ru a přičemž Ru, R_2a, R3_a a R4_a jsou fenyl a Ri_b, Rab, Ríb a Ru jsou ethyl.

V příkladech, kde n = 3, výhodnými sloučeninami jsou:

1. Z] je CNC, Z₂ je meso přičemž R_2c je methyl, Z₃ je meso přičemž Ru je methyl, Z₄ je kovalentní vazba a Z_s je CNC a kde R_Ia, Ru, R3a, Ria a R_5a jsou methyl a R_lb, R_2b, R_3b, Rib a R_5b jsou H.

2. Z] je CNC, Z₂ je N-meso, Z₃ je meso přičemž R_3c je fenyl a Z₄ je CNC a Z5 je CC kde Rs_d a R_5c jsou fenyl a kde R_u, Ri_b, R_3a, R3b, R?a a R_5b jsou (CH^COOH a R_2b, R_2b, Kb a R|_b jsou methyl.

3. Z] je CNC, Z₂ je N-wieso, Z3 je meso přičemž R_3c je H, Z₄ je N-meso a Z5 je CNC a přičemž Ria, R_3a a R_Sa je fenyl, Ri_b, R_3b a R» jsou H a R_2a, R_2b, Ru a R_4b jsou methyl.

4. Z] je CNC, Z₂ je meso přičemž R_2c je methyl, Z₃ je CNCCNC, přičemž R₃f a R_3g je fenyl, Z₄ je N-meso, Z₅ je CC řetězec kde R_3d a R_3c jsou H a Ru a R_2b jsou H, a přičemž Ri_b, Ru, R3a, R3b, Ru a Rtb jsou ethyl.

5. Zi je CNC, Z₂ je CNCCNC kde R_2f a R_2g jsou H, Z₃ je CC řetězec přičemž R3<| je ethyl a R_3e je H a Z4 je meso přičemž Ru je ethyl a Z_s je kovalentní vazba a kde Ru, Ru, R3a, Ř3b a Ria jsou (CH₂)₂COOH a Ri_b, R_2b, Ru a R_5b jsou H.

6. Z] je CNC, Z₂ je CNCCNC kde R_2f je ethyl a R_2g je H, Z₃ je meso přičemž R_3c je fenyl a Z₄ je CC řetězec přičemž Ru a Ru jsou methyl a Ri_b, R_2b, Rsb, Rib a R_5b jsou ethyl.

7. Z] je CNC, Z₂ CC řetězec kde R_2d a R_2ejsou fenyly, Z₃ je CNCCNC kde R₃f a R_3gjsou H, Z₄ je N-meso a Z5 je meso přičemž R_5c je methyl a přičemž R_)a, Rib, R3a, R3b, Rsa a R» jsou (CH^COOH a R_2a, R_2b, Ru a Rujsou methyly.

8. Zi je CNC, Z₂ je kovalentní vazba, Z₃ je meso přičemž R_3e je fenyl, Z* je CNC a Z5 je CC řetězec, kde R_Sd a R_Je jsou methyl, přičemž Ru, R_3a a R_5a jsou fenyly, Rib, R3b a R_Sb jsou H a R_2a, Ríb, R»a a Rib jsou methyly.

V případě sloučenin, v nichž n = 4 jsou výhodná provedení následující:

1. Z] a Ze jsou CNC, Z₂ a Z₅ jsou CC řetězce, kde všechny R_2d, R_2e, R_5d a R_Je jsou fenyly, Z₃ a Z₄ meso přičemž R_3c a Ru jsou ethyly a Ru, R2a, R3a, Ria, Rsa a Róa jsou izopropyly a Rib, a R_2b, R3b> Rib, Rsb a Rib jsou (CH^COOH:

2. Zi je CNC, Z₂ a Z₄ jsou N-meso, Z₃ a Z₄ jsou kovalentní vazby a Z₆ je meso přičemž Ru, R2a, R3a, Ria, Rsa, a Rs Jsou fenyly a Ri_b, R₂b, R3b, Rib, Rsb Rób jsou methyly.

Možnost získání CNC-expandovaných porfyrinů s multiplicními substituenty má tu výhodu, že vlastnosti povrchové vrstvy jádra CNC-expandovaného porfyrinů lze modifikovat volbou těchto substituentů. Tak například rozpustnost sloučeniny lze zvýšit zavedením substituentů s polárními skupinami. Změnou symetrie uspořádání těchto skupin lze získat sloučeninu ampifilní, tj. která má rovněž rozložení + a - nábojů. Tato vlastnost napomáhá při řešení problémů biodistribuce, průchodu membránou a podobně. Dále pohlcování světla povrchovou vrstvou jádra lze ovlivnit

-10CZ 288186 B6 zvýšením počtu konjugovaných π-vazeb v substituentech, v nichž může nastat účinný auxochromní posun.

Metalace/připoiení radioizotopů

Mezi CNC-expandované porfyrinové sloučeniny podle vynálezu patří také takové, kde CNCexpandovaný porfyrin se spojí s radioizotopem, vhodným pro radioaktivní zobrazovací metodu (scintigrafické zobrazování) nebo s takovými kovy, které jsou kontrastními přísadami pro iontovou nebo magnetickou rezonanční zobrazovací metodu nebo prostě sloučeniny v takové formě, která je vyhovující. Příklady vhodných radioisotopů pro přípravu těchto značených sloučenin jsou jod-123, jod-131, technecium-99m, indium-111 agalium-67. Příklady kovů, které se dají použít jako MRI kontrastní přísady jsou paramagnetické ionty prvků jako je Gd, Mn, Eu, Dy, Pr, Pa, Cr, Co, Fe, Cu, Ni, Ti a V, s výhodou Gd a Mn.

Koniugáty sloučenin podle vynálezu

Pro použití tohoto typu může být vhodné připojit sloučeniny podle vynálezu ke skupině, specifické pro cíl, jako je immunoglobulin nebo ligandy pro receptor. Schopnost sloučenin podle vynálezu obsadit nemocné tkáně a buňky, jako tumory lze, pokud je to žádoucí, ještě zvýšit připojením sloučeniny ke skupině, která specificky váže epitopy či receptory, umístěné na povrchu zmíněných cílových tkání nebo buněk.

Skupinami, specifickými pro cíl se v rámci vynálezu míní ligandy jako jsou steroidy, jako je estrogen a testosteron a jejich deriváty, peptidy obsahující pro receptory T-buněk, sacharidy, jako je mannoza, pro které mají monocyty a makrofágy receptory a H₂ agonisty.

Skupinami, specifickými pro cíl (dále také „TSM“ podle anglického „target-specific moieties“) mohou být rovněž imunospecifické složky. Tyto TSM mohou být odvozeny od přípravku na bázi polyklonální nebo monoklonální protilátky. Mohou obsahovat buď celé protilátky, nebo imunologicky reaktivní fragmenty těchto protilátek. Jako jsou F(ab')₂, Fab nebo Fab' fragmenty. Použití těchto imunologicky aktivních fragmentů jsou substituentů pro celé protilátky je v oboru velmi dobře známo. Viz například Spiegelberg, H.G., „Immunoessays in the Clinical Laboratory“ (1978) 3:1-23.

Polyklonální antisera se připravují obvyklým způsobem tak, že se injekčně vstřikuje vhodnému savci antigen, vůči kterému je požadována protilátka, vytvořená hladina protilátky v séru se testuje a při dostatečně vysokém obsahu protilátky se připravuje protilátka. Monoklonální protilátkové přípravky lze také připravovat známými metodami, jako je Koehlerova-Milsteinova metoda, využívající periferních krevních lymfocytů nebo slezinových buněk imunizovaných zvířat. Tyto buňky se immortalizují buď virovou infekcí, fuze s myelomy, nebo jiným známým způsobem, načež se sleduje produkce protilátky v jednotlivých izolovaných koloniích. Vytvoření fragmentů z monoklonálních či polyklonálních přípravků je proveditelné známými způsoby, popsanými v publikaci Spielgelberg, H.L., supra.

Mezi mimořádně účinné protilátky, které jsou zde uvedeny konkrétně formou příkladů, patří monoklonální protilátkový přípravek CAMAL-1, který lze připravit postupem, popsaným vMalcolm et al. Ex. Hematol. (1984) 12:539-547, dále polyklonální nebo monoklonální přípravky anti-Ml protilátky, jak jsou popsány v Mew et al. J. Immunol (1983) 130:1473-1477 a B16G protilátka, která se připravuje způsobem, popsaným Maierem et al. v J. Immunol (1983) 131:1843 a Steele et al. v Cell. Immunol. (1983) 131:1843 a Steele et al. v Cell. Immunol. (1984) 90:303:

-11CZ 288186 B6

Tento výčet představuje jen příklady a není omezující. Pokud je známa cílová tkáň, lze připravit vůči ní specifické protilátky známými prostředky. Vynález lze proto použít pro zesílení toxicity vůči jakékoliv požadované cílové tkáni.

Spojení TSM s CNC-expandovaným porfyrinem podle vynálezu lze dosáhnout jakoukoliv metodou, známou ze stavu techniky, podle povahy substituentů na CNC-porfyrinových molekulách. Tak například pokud alespoň jedno R, obsahuje karboxylovou skupinu, lze vytvořit kovalentní vazbu s MS, která obsahuje aminoskupinu použitím dehydratačního činidla jako je například karbodiimid. Zejména je výhodné vytvořit kovalentní vazbu CNC-expandovaného porfyrinu k TSM působením l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropylkarbodiimidu (EDCI) v reakčním prostředí, tvořeném převážné dimethylsulfoxidem (DMSO). Příprava využívající tohoto výhodného postupu je dále ilustrována. Lze použít také jiných dehydratačních činidel, jako je dicyklohexylkarbodiimid nebo diethylkarbodiimid při použití běžného vodného nebo částečně vodného reakčního prostředí.

Dále lze napojit na aktivní části konjugátu bifunkční vazebné sloučeniny, schopné kovalentně vázat dvě aktivní komponenty. Komerčně je dostupné velké množství těchto bifunkčních napojitelných sloučenin a příkladem seznamu, kde je lze nalézt, je katalog firmy Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Tyto „linkery“ mají homo- nebo heterobifunkční molekuly a obsahují funkční skupiny, schopné tvořit disulfidy, amidy, hydrazony a řadu dalších skupin. Jiné „linkery“ mohou být polymery jako polyaminy, polyethery, polyaminoalkoholy, deriváty ketonů, kyselin, aldehydů, izokyanatú či mnoha dalších skupin.

Techniky, používané při napojování k aktivním částem konjugátu, jsou o sobě známé a nejsou součástí tohoto vynálezu.

Použití sloučenin podle vynálezu v PDT a v jiných aplikacích

Vynalezené sloučeniny lze použít při fotodynamické terapii analogickým způsobem, který je známý pro aplikaci porfimeru sodného a BPD sloučenin. Tyto sloučeniny se mohou použít ke zničení nebo ovládnutí nežádoucích buněk nebo tkání, které mají určité funkční skupiny nebo pro inaktivaci patogenů jako jsou bakterie a viry.

Příklady cílových buněk a tkání, pro které je PDT použitelné jsou, aniž by se tím jejich rozsah omezoval, tumory včetně krevních tumorů, maligní kostní dřeň, viry infikované krevní buňky nebo viry infikovaná kostní dřeň, dysplastické buňky nebo tkáně, zanícená nebo infekční místa, hyperproliferativní tkáň jako psoriatické plochy nebo papilomavirové léze (bradavice) nebo neiontimální hyperplastické léze, hypervaskularizace jako jsou pigmentové skvrny a hemangiomas, arterosklerotické plaky, vlasové folikuly, volné viry, bakterie, prvoci (protozoa) a další druhy patogenních parazitů.

Mezi patogeny, které lze potlačit působením PDT, patří určité viry, bakterie, protozoa a další patogenní parazité. Jde například o viry obalené, jako jsou lidské cytomegaloviry, EpsteinBarrův virus, herpetický virus Marekovy nemoci, lidské viry herpes simplex, virus varicellazoster, viry z rodiny Poxviridae, viry z rodiny Hepadnaviridae jako je virus lidské hepatitidy A (HAV) a virus lidské hepatitidy B (HBV) a viry hepatitidy non-A a non-B, včetně viru lidské hepatitidy C, viry z rodiny Orthomyxoviridae jako je chřipkový virus, viry z rodiny Retroviridae jako jsou viry lidské leukemie T-buněk, viry lidské immunodeficience a viry z rodiny Flaviviridae jako je virus klíšťové encefalitidy nebo žluté horečky.

Příklady parazitů jsou Plasmodium malariae, P falciparum, P. ovále, P. vivax a Tripanosoma cruzi. Příklady bakterií jsou Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis, Pseudomonas spp., Mycobacterium spp. a další příležitostné organismy, které jsou citlivé na fotodynamickou aktivaci.

-12CZ 288186 B6

Způsob použití sloučenin podle vynálezu ve zmíněných aplikacích je popsán ve stavu techniky. Volba absoipční vlnové délky pro CNC-expandované porfyriny závisí na povaze použití. Tak v případě, že se cílová tkáň nachází mezi mnoha dalšími rušivými materiály jako jsou složky krve, hodí se lépe CNC-expandované porfyriny, které pohlcují v oblasti vlnových délek, kde nedochází k rušení těmito materiály. Na druhé straně pokud jsou cílové tkáně povrchové, není taková úvaha relevantní. Také je třeba vzít v úvahu přítomnost různých látek v prostředí, kde má být cílová tkáň ozařována a podle toho volit příslušnou konkrétní látku ze třídy CNC-expandovaných porfyrinů podle vynálezu a vhodnou vlnovou délku.

Dále kromě použití k fotodynamické terapii mohou být sloučeniny podle vynálezu použitelné pro diagnózu analogickým způsobem jako samotné porfyriny. CNC-expandované, jako porfyriny samotné, jsou schopny fluorescence při excitaci světlem vhodné vlnové délky. Stejně tak se CNC-expandované porfyriny, jako porfyriny samotné, hromadí v určitých cílových tkáních jako arterosklerotické plaky, tumory a podobně. Pokud je to účelné, lze sloučeniny podle vynálezu přizpůsobit tak, aby se vázaly na cílově-specifícké skupiny a tím regulovat toto „hromadění“. Tak se dosáhne akumulace sloučenin podle vynálezu v těchto cílových tkáních nebo buňkách, jsou-li přítomny, načež mohou být detekovány nebo lokalizovány pomocí fluorescenční metody.

Dále mohou sloučeniny podle vynálezu obsahovat radioizotopy buď jako kovalentně vázané substituenty, nebo v komplexech s kovy, takže sloučeniny podle vynálezu mohou být lokalizovány radioaktivní nebo scintilační zobrazovací metodou. Určité kovové ionty také umožňují použití sloučenin podle vynálezu MRI kontrastní látky. Tyto kontrastní látky se používají obvyklým způsobem při získávání MRI skeletovací zobrazení se zvýšenou zřetelností.

Příprava sloučenin podle vynálezu

Pro získání určitého CNC řetězce podle vynálezu lze použít řadu metod. Jednoduchý CNC řetězec lze vytvořit například reakcí pyrrolu, substituovaného ve 2-poloze s methylaminem. Tato obecná metoda pro vytvoření CNC řetězce je znázorněna na reakčním schématu 1:

reakční schéma 1:

O

-13CZ 288186 B6

Jak je vidět, vyrobí se běžným způsobem amid, načež se dehydratací vytvoří CNC řetězec podle vynálezu. CNC řetězec je stabilizován inkluzí v rezonančním systému expandovaného porfyrinového jádra.

Další postup znázorňuje reakční schéma 2, v kterém se vytváří řetězec kondenzací dvou kyanoskupin, připojených ve 2-poloze ke spojeným pyrrolům.

Reakční schéma 2:

Jak je na tomto reakčním schématu vidět, dipyrrol substituovaný kyanoskupinami se v případě 15 napřed redukuje lithiumaluminiumhydridem a pak se vytvoří výsledný řetězec působením kyslíku. Redukovaná sloučenina 3 se zčásti ionizuje a tato ionizovaná forma reaguje s sloučeninou 3 za přítomnosti O₂ čímž poskytuje produkt 1.

Alternativa kreakčnímu schématu 2 je znázorněna na reakčním schématu 3. Místo působení 20 kyslíku na dikyanosloučeninu, redukovanou LÍAIH4, se používá DDQ v methylenchloridu a THF.

-14CZ 288186 B6

Reakční schéma 3:

Z tohoto reakčního schématu 3 je zřejmé, že vycházet z bisnitrilu není tak výhodné, jako když výchozí materiál obsahuje také ůis-aminomethyl substituovaný dipyrromethan vzorce 3. Tento výchozí materiál je výhodně používat při výrobě asymetrických porfokyaninů vzorce Ja. Toto ukazuje reakční schéma 3' které znázorňuje kondenzaci dvou různých „polovin“ porfokyaninového jádra pro získání požadovaného asymetrického produktu. Pochopitelně, vznikají i dva symetrické produkty, které se ihned oddělují od žádaného asymetrického produktu obvyklými schematografickými metodami.

Reakční schéma 3':

R. R; R; R_:

HjN----N N

Η H

V jiné variantě reakčního schématu 3' se místo kondenzace dvou diaminomethyldipyrromethanů, jak je znázorněno, raději přidává bis-aldehyd (kteiý lze připravit stejně jako meziprodukt v déle uvedeném reakčním schématu 5). To zahrnuje výrobu asymetrických profokyaninů, ve kterých struktura R]_a, Ru>, Ráa a Rfb (stejně tak R_ic) může být odlišná od R_2a, R₂b, R3a, R3b a R3c· Tudíž substituenty na sloučenině vzorce 3 zobrazené v reakčním schématu 3 se mohou lišit od substituentů na dialdehydu, čímž se získá jediný asymetrický produkt.

V této alternativě se může kondenzovat dialdehyd dipyrrolový meziprodukt přímo působením amoniaku v etanolu a vodě, jak je znázorněno na reakčním schématu 4.

-15CZ 288186 B6

Reakční schéma 4:

Dipyrrolové části molekuly, obsahující dvě kyanoskupiny pro kondenzaci podle reakčních schémat 2 a 3 nebo dialdehydy pro kondenzaci v reakčním schématu 4 se dají připravit podle reakčního schématu 5.

Reakční schéma 5:

(7)

10% Pd/C; H_? A --------------------ΑΣ. C_sHjCCl/DMF O (6)

1. HjNOH, NaOAc

2. AC,0 ▼

+ ch₂o

R, R R.R, ^H (2) ^H

Jak je vidět, dipyrroly se připravují kondenzací dvou molekul 2-benzyloxykarbonyl-5-acetoxy· methylpyrrolu. Výsledný dipyrrol se redukuje na odpovídající dialdehyd a převádí na kyanoderivát pomocí známých činidel.

-16CZ 288186 B6

Poslední reakční schéma 6 ukazuje další alternativu získání dikyanového meziproduktu typu, který je znázorněn vzorcem 2. Dikyanoderivát lze pak převést na požadovaný porfokyanin pomocí metod, které byly již v předešlém textu uvedeny v reakčních schématech 2 nebo 3.

Reakční schéma 6:

V prvním stupni postupu podle tohoto reakčního schématu 6 se používá k vytvoření meso můstku mezi dvěma kondenzovanými pyrrolovými jádry benzaldehyd, popřípadě substituovaný 1 až 5 nezávisle zvolenými substituenty. Lze však použít i jiné aldehydy včetně formaldehydu a jednoduchých alkylaldehydů jako je acetaldehyd, butyraldehyd, hexylaldehyd a podobně. Dále se mohou použít i jiné arylaldehydy jako je například 1-naftylaldehyd. Ve druhém stupni se pro vytvoření požadovaných kyanoskupin v 5-poloze na pyrrolovém jádru používá chlorsulfonylizokyanat (C1SO2N=C=O; CSI) v polárním aprotickém rozpouštědle jako je například DMF. Konkrétní komponenty, uvedené v reakčním schématu 6, je třeba chápat jako příklady, které nejsou omezující.

Pro ilustraci je třeba ještě ke schématu 5 uvést, že tetraethyl-substituovaný dikyandipyrrol se připraví například následovně: na výchozí materiál, kterým je 2-benzyloxykarbonyl-3,4-diethyl5-methylpyrrol (není zobrazen) se v prostředí ledové kyseliny octové působí octanem olovičitým. Pro zredukování veškerých zbytků Pb(IV) se přidá ethylenglykol. Po přidání vody se pak izoluje filtrací s následným promytím vodou 5-acetoxymethyl-2-benzyloxykarbony-3,4diethylpyrrol, který je zobrazen jako výchozí materiál v reakčním schématu 5.

5-acetoxymethyl-2-benzyloxykarbonyl-3,4-diethylpyrrol se smísí s kyselinou octovou a zahřeje. Po ochlazení získaného roztoku na pokojovou teplotu se vysráží pevný produkt v podobě velkých kusů. Přidá se voda, produkt se oddělí filtrací a potom promývá další vodou. Filtrát se extrahuje CH₂C1₂ a odpařením se získá další pevný produkt. Oba pevné produkty se pak spojí a rekrystalizují z roztoku CH2CI2 a hexanu, čímž se získá 5,5'-ůís(benzyloxykarbonyl)-3,3',4,4'tetraethyl-2,2'-dipyrromethan.

-17CZ 288186 B6

Tento produkt se rozpustí v tetrahydrofuranu (THF) a míchá za přítomnosti Pd/C katalyzátoru s vodíkem a triethylaminem. Po odfiltrování katalyzátoru přes celit filtrát se odpaří do sucha, rozpustí v Ν,Ν-dimethylformamidu a zahřívá k varu pod argonem. Roztok se ochladí a přidá se k němu v přebytku ochlazený benzoylchlorid. Reakční směs se míchá a pevný produkt se oddělí filtrací. Oddělený pevný produkt se smísí s vodou, zalkalizuje pomocí NaHČO₃ a zahřeje na 60 °C. Z roztoku krystalizuje světle žlutý produkt, kterým je 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-diformyl2,2'-dipyrromethan, který se pak odfiltruje a promyje vodou.

Tento produkt se rozpustí v ethanolu, probublává argonem a přidá se k němu chlorovodík a octan sodný. Tato směs se zahřívá pod argonem, odstraní se rozpouštědlo a produkt se přes noc vakuově suší. Získaný ů/s-oxim se rozpustí v acetanhydridu a sytí argonem, načež po odstranění acetanhydridu a vysušení ve vakuu vznikne surový bis-nitril v podobě černé pevné látky. Takto získaná sloučenina, která je znázorněna jako finální produkt reakčního schématu 5, se čistí na silikagelové koloně s použitím 0,5% methanolu v CH2CI2, dále na aluminové koloně s použitím 10 až 20% EtOAc. Odpařením rozpouštědla krystaluje 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-kyanodipyrromethan jako světle růžové krystaly.

Produkt, získaný postupem uvedeným shora, se pak může převést na příslušný požadovaný porfokyanin, jak je znázorněno na reakčním schématu 2. 3,3',4,4'-Tetraethyl-5,5'-kyanodipyrromethan v THF se při 0 °C pod argonem přidá k THF suspenzi L1AIH4. Směs se míchá a ochladí přidáním vody, načež se vzniklá sraženina odfiltruje. Zlatě zbarvený roztok se pak převede do dvouhrdlé baňky, obsahující ekvimolámí množství Pb(SCN)2 a bezvodého síranu sodného. Přidá se bezvodý methanol a směs se uvede do varu pod refluxem. Barva se postupně změní z purpurové na tmavě zelenou. Reakce se zastaví a roztokem se pomalu probublává vzduch. Surový produkt se pak rozpustí v methylenchloridu a nerozpuštěný pevný podíl se odfiltruje. Objem zeleného roztoku se pak sníží na asi 5 ml, zavede do aluminové kolony a eluuje ethylacetatem v CH2CI2. Jasně zelený eluent obsahující porfokyanin se sbírá a odpaří do sucha.

Pokud následuje reakční schéma 3 za účelem získání vhodného porfokyaninu, lze ilustrovat vedení této sekvence reakcí, opět například s použitím tetraethylsubstituovaného dipyrromethanu, následujícím postupem:

3,3',4,4'-Tetraethyl-5,5'-kyanodipyrromethan v THF se při 0°C pod argonem přidá kTHF suspenzi L1AIH4. Směs se míchá a ochladí přidáním vody, načež se vzniklá sraženina odfiltruje. Při 0 °C se přidá k 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-ůis-aminomethyl-2,2'-dipyrromethanu v bezvodém THF/CH2CI2 pod dusíkem desetinásobný přebytek 2,3-dichlor-5,6-dikyan-l,4-benzochinonu (DDQ) v THF/CH2CI2 suspenzi. Roztok ihned změní barvu na tmavě zelenou. Surový produkt se pak rozpustí v methylenchloridu a nerozpuštěný pevný podíl se odfiltruje. Objem zeleného roztoku se pak sníží na asi 5 ml, zavede do aluminové kolony a eluuje ethylacetatem v CH₂C1₂. Jasně zelený eluent obsahující porfokyanin se sbírá a odpaří do sucha. Při tomto postupu se získá výrazně vyšší výtěžek ve srovnání s výtěžkem, dosaženým při oxidaci vzduchem.

Pokud se má připravit produkt z úis-aldehydu a bis-nitrilu, 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-kyanodipyrromethan v THF se při 0 °C pod argonem přidá k THF suspenzi L1AIH4. Směs se míchá a ochladí přidáním vody. Vznikne pevný produkt, který se odfiltruje. Takto vzniklý Z>is-aminový produkt se rozpustí v bezvodém methanolu a přidá se k němu ú/s-aldehyd. Roztok se pak probublává dusíkem a při tom se uvede do varu pod refluxem. Přidá se thiokyanat olovnatý (Pb(SCN)₂) a roztok se refluxuje. Při pokojové teplotě se pak probublává roztokem plyn s obsahem kyslíku. Po odpaření rozpouštědla se pak surový porfokyaninový produkt suší ve vakuu. Produkt se čistí na koloně s náplní AI2O3 pomocí ethylacetátu a CH₂C1₂. Zelený eluent se shromažďuje a koncentruje. Odpařením rozpouštědla se získají krystaly porfokyaninu, který je produktem.

Konkrétní provedení další alternativy, reakčního schématu 4, lze ilustrovat následovně. (6) 3,3',4,4'-Tetraethyl-5,5'-diformyl-2,2'-dipyrromethan se rozmíchá v bezvodém EtOH. Získaný

-18CZ 288186 B6 ethanolický roztok se ochladí na 0 °C a probublává se jím plyn s obsahem amoniaku. Baňka se pak umístí do olejové lázně při 60 °C na dobu 72 hodin. Reakce se poté ukončí a směs se ochladí na 0 °C. Ethanol se odstraní na rotační odparce, zbytek se podrobí chromatografii na AI2O3 pomocí ethylacetatu a CH2CI2. Tento výrazně zjednodušený postup syntézy má vysoké výtěžky porfokyaninu.

Pro přípravu dalších alternativních provedení CNC-expandovaných porfokyaninů podle vynálezu lze reakční schémata upravit na základně znalosti chemie a tím získat vhodné sloučeniny. Tak například pro přípravu CNC-expandovaného porfyrinu vzorce lb se může použít kondenzační reakce uvedená v reakčním schématu 2 nebo 3 přičemž se vychází z 2,5-dikyanopyrrolu. Pro získání sloučeniny vzorce lc se s výhodou může použít kondenzace diaminomethylderivátu s dialdehydem. Pak reaguje dialdehyd dipyrrolmethanu s diaminomethylovaným pyrrolylpyrrolem za vzniku požadovaného produktu. Pro výrobu sloučenin vzorců ld a le se vytváří CNC vazba způsobem, popsaným shora, přičemž se vychází zodpovídajícího tetrapyrrolu. Takové modifikace jsou zřejmé každému průměrnému praktikovi v oboru a používá se při jejich provedení známých syntézních metod.

Způsob podávání a použití

Ze sloučenin podle vynálezu nebo jejich konjugátů se připravují farmaceutické kompozice pro podávání subjektům metodami, které jsou obecně v oboru známé. Přehled takových farmaceutických kompozic lze například nalézt v publikaci „Remington Pharmaceutical Sciences“ (Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, poslední edice).

Sloučeniny podle vynálezu a jejich konjugáty se podávají při některých indikacích systemicky, zejména injekčně. Injekce mohou být intravenózní, subkutánní, intramuskulámí nebo dokonce intraperitoneální. Do podoby vhodné pro injekce se uvedou sloučeniny podle vynálezu obvyklým způsobem jako tekuté roztoky, suspenze nebo pevné formy rozmíchatelné na roztoky nebo suspenze před injekcí nebo jako emulze. Vhodnými excipienty jsou například voda, solanka, dextróza, glycerin a podobně. Pochopitelně konkrétní kompozice většinou dále obsahují malá množství pomocných přísad jako jsou smáčecí nebo emulgační činidla, pH pufrovací přísady a podobně.

Systemického podání může být také dosaženo implantací systémů s pomalu nebo trvale se uvolňující účinnou látkou, pomocí čípků nebo v případě vhodné formulace i orálně. Formulace pro tyto způsoby podávání jsou v oboru dobře známy a jejich přehled lze nalézt například v publikaci „Remingtonů Pharmaceutical Sciences“ (supra).

Při léčení je třeba podat látku na přesné místo. U povrchových nádorů nebo kožních chorob lze sloučeninu podle vynálezu nanést v běžné topické kompozici umožňující natírání jako je suspenze, pasta nebo krém. Dávka účinné látky závisí na konkrétní volbě aktivní složky, podmínkách ošetřování, typu podávání, individuálním subjektu a posouzení na základě zkušeností lékaře. Podle specifického přípravku mohou být potřebné dávky menší či větší. Pro systemické přípravky mohou být potřebné dávky menší či větší. Pro systemické podávání se doporučuje dávkování v rozmezí 0,05 až 10 mg/kg a pro topické aplikace lze uvést jako doporučené rozmezí koncentrací asi 0,01 až 20 %, výhodně 1 až 5 % účinné složky. Pro orální podávání se doporučuje celková denní dávka 10 až 300 mg. Tato uvedená rozmezí mají pouze charakter doporučených hodnot, neboť lze očekávat mnoho faktorů, které ovlivňují velmi silně u individuálního léčebného režimu dávku a mohou působit podstatné odchylky od těchto navržených hodnot.

Při radioaktivní zobrazovací metodě (scintigrafic imaging) se parenterálně vstříkne kontrastní radioaktivní porfokyanin. „Parenterálně“ znamená například intravenózně, intratekálně, intrasticiálně nebo intrakavitálně. Předpokládá se, že jedinec obdrží dávku 1 mCi až 50 mCi radioaktivní kontrastní látky, jejíž množství pak závisí na tom, o jaký jde konkrétně radioizotop a na

-19CZ 288186 B6 způsobu podávání. Při intravenózním injekčním podání jsou množství normálně: asi 10 až 40 mCi, výhodně asi 20 mCi Tc-99m; asi 2 až 5 mCi, výhodně asi 4 mCi In-111 nebo ga-67.

Kontrastní radioaktivní látka se obvykle používá ve formě injekčního přípravku, s výhodou jako sterilní injekční přípravek pro humánní cílené použití pro určitou nemocnou tkáň nebo buňky, který výhodně zahrnuje: sterilní injekční roztok obsahující účinné množství radioaktivně značeného činidla ve farmaceuticky přijatelném sterilním farmaceutickém vehikulu, kterým je výhodně fosfátem pufrovaná solanka (PBS) o fyziologické koncentraci. Lze použít i jiná vehikula, podle místa parenterálního podávání.

Reprezentativní přípravek pro parenterální podávání podle vynálezu obsahuje normálně 0,1 až 20 mg, výhodně kolem 2 mg, radioaktivně značené látky, ve sterilním roztoku.

Poté co dojde k dostatečnému nahromadění izotopu v cílovém místě, provede se skenování libovolnou planámí a/nebo SPÉCT gamma kamerou nebo se použije ruční vnější nebo vnitřní gamma sondy a lokalizuje se zánět či léze. Scintigram se obvykle pořizuje gamma zobrazovací kamerou, která má jedno nebo více oken pro detekci energií v roztahu 50 až 500 KeV.

Podání kontrastní látky pro magnetické rezonanční zobrazování (MRI) se provádí analogicky jako při zobrazování radioaktivní látky s tím rozdílem, že sloučeniny podle vynálezu se používají v metalované formě s paramagnetickými ionty. Získaný signál je normálně v korelaci s relaxačními dobami magnetických momentů protonů jádra vodíkových atomů molekul vody, která je přítomna v zobrazované oblasti. Kontrastní látky při magnetickém rezonančním zobrazování způsobují zvýšení hodnoty relaxace, čímž zvyšují kontrast mezi molekulami vody v oblasti jejich nahromadění a ostatními částmi těla. Účinek však působí na Ti i na T₂, takže dřívější výsledek má větší kontrast a pozdější výsledek má menší kontrast. Zároveň jde o jev závislý na koncentraci, takže existuje optimální koncentrace paramagnetických členů, při které je účinnost maximální. Tato optimální koncentrace se mění podle konkrétně použitého činidla, místa zobrazování, typu zobrazovací metody, tj. spinecho, saturačním zisku, inverzním zisku a jiných silně T] nebo T₂ závislých zobrazovacích technikách a sloužení nosiče, ve kterém se kontrastní látka rozpouští či suspenduje. Tyto faktory a jejich relativní vliv jsou známy ze stavu techniky. Viz např. Pykkett: Scientific America (1982) 246:78 a Runge et al..: Am: J. Radiol. (1987) 141:1209.

MRI metoda podle vynálezu se provádí v praxi injekčním parenterálním podáním účinného množství MRI kontrastní látky podle vynálezu, která obsahuje prvky kovové povahy jako je gadolinium. Předpokládá se, že jedinec obdrží dávku kontrastní látky dostatečnou pro zvýšení MRI signálu v cílovém místě při koncentraci alespoň 20 %, výhodně 50 až 500 % přičemž množství je funkcí zejména charakteru paramagnetického členu a způsobu podávání.

Kontrastní látka se v rámci vynálezu připravuje ve formě injekčního přípravku, zejména sterilního pro humánní použití, pro cílové nemocné tkáně nebo buňky, který výhodně zahrnuje: sterilní injekční roztok obsahující účinné množství kontrastní látky ve farmaceuticky přijatelném sterilním injekčním vehikulu, výhodně fosfátem pufrovaném slaném roztoku. Lze použít i jiná vehikula, podle místa parenterálního podávání.

Reprezentativní přípravek pro parenterální podávání podle vynálezu obsahuje normálně 0,1 až 20 mg, výhodně kolem 2 mg, kontrastní látky ve sterilním roztoku.

-20CZ 288186 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklad jsou míněny jako ilustrace ale nějako omezení jeho rozsahu.

Příklad 1

Syntéza Oktaethylporfokyaninu

Reakční schéma 5 s následnou redukcí a vytvořením iminu

Tento příklad popisuje způsob provádění reakce podle reakčního schématu 5 pro přípravu obou ňw-aldehydů a ó/s-nitrilbipyrrólových meziproduktů. Také ilustrace kondenzaci bis-nitrilů s Z>ís-aldehydy pro získání CNC řetězců vzorce ja.

Do míchaného roztoku 2-benzyloxykarbonyl-3,4-diethyl-5-methylpyrrolu (10,1 g, 0,037 molu) v ledové kyselině octové byl přidán octan olovičitý (18,2 g, 0,041 molu). Směs se krátce zahřála na 60 °C. Pro zredukování zbytků Pb(IV) bylo pak přidáno deset ml ethylenglykolu. Poté bylo přidáno dvacet ml vody a 5-acetoxymethyl-2-benzyloxykarbonyl-3,4-diethyl-pyrrol byl smísen s 80% kyselinou octovou ve 100 ml vody a zahřívá 1 hodinu na 100 °C. Po ochlazení na pokojovou teplotu vykrystaloval ve velkých kusech produkt. Bylo přidáno 100 ml vody, produkt byl oddělen filtrací a poté promyt další vodou. Filtrát byl extrahován CH2CI2 a získaný extrakt byl odpařen na pevný produkt. Pevné produkty byly spojeny a rekrystalovány z roztoku CH₂C1₂ a hexanů, čímž se získal 5,5'-6ž.s(benzyloxykarbonyl)-3,3,4,4-tetraethyl-2,2'-dipyrol-methan 7.

Výtěžek 6,6 g, 67,4 %

Mol. hm. počítaná na C33HMO4N2: 526,2831

MS s vysokým rozlišením: 526,2835 ’H NMR v CDC1₃: 1,05 (t, 6H), 1,12 (t, 6H), 2,43 (q, 4H), 2,75 (q, 4H), 3,85 (s, 2H), 5,25 (s, 4H), 7,28-7,40 (m, 10H), 8,70 (br s, 2H).

Získaný produkt (8,1 g, 0,015 mol) byl míchán ve 200 ml tetrahydrofuranu (THF) pod dusíkem za atmosférického tlaku při pokojové teplotě přes noc za přítomnosti 0,4 g 10% Pd/C a 5 kapek triethylaminu. Po odfiltrování katalyzátoru na celitu byl filtrát odpařen do sucha na rotační odparce za vzniku dikarboxylové kyseliny. Dikarboxylová kyselina pak byla rozpuštěna ve 100 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a zahřívána k varu pod argonem jednu a půl hodiny. Pak byl roztok ochlazen ledem, po kapkách byl přimícháván přebytek ochlazeného benzoylchloridu (7,2 ml), reakční směs byla 2 hodiny míchána při 5 °C a pevný produkt byl oddělen filtrací. Pevný produkt byl přidán do 50 ml vody a zalkalizován pomocí NaHCO₃. Roztok byl zahřát a udržován po dobu 1 hodiny při 60 °C. Světle žlutý produkt, který z roztoku poté vykrystaloval byl odfiltrován a promyt vodou, byl 3,3',4,4 -tetraethyl-5,5'-diformyl-2,2'-dipyrromethan 6.

Výtěžek 3,4 g, 70,0 %

Mol.hm. počítaná na C19H26O2N2: 314,1994

MS s vysokým rozlišením: 314,1994 ’H NMR v CDC1₃: 1,10 (t, 6H), 1,25 (t, 6H), 2,50 (q, 4H), 2,70 (q, 4H), 4,00 (s, 2H), 9,55 (s, 2H), 10,90 (s, 2H)

Tento produkt (1,03 g, 0,0033 mol) byl ve 300 ml ethanolu probubláván argonem po dobu 20 minut. K roztoku byl přidán hydroxylamin hydrochlorid (0,51 g, 0,0073 mol) a octan sodný (1,20 g, 0,015 mol). Tato směs byla zahřívána pod argonem dvě a půl hodiny na 60 °C. Rozpouští tědlo bylo odstraněno na rotační odparce a produkt byl vakuově sušen. Βώ-oxim byl rozpuštěn v 5 ml acetanhydridu a sycen 30 minut argonem. Po odstranění acetanhydridu a sušení ve vakuu přes noc byl získán surový ůis-nitrilový produkt 2 v podobě černé sraženiny. Tento produkt byl čištěn na silikagelové koloně (40 g) s použitím 0,5% methanolu v CH₂C1₂ a poté na aluminové koloně (40 g) s použitím 10 až 20% EtAc. Odpařením rozpouštědla vznikly světle růžové krystaly 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-kyandipyrro-methanu 2.

Výtěžek 0,43 g, 42 %

Mol.hm. počítaná na C19H24N4: 308,2001

MS s vysokým rozlišením: 308,2002 ‘H NMR v CDCI3: 1,10 (t, 6H), 1,25 (t, 6H), 2,45 (q, 4H), 2,60 (q, 4H), 3,90 (s, 2H), 8,45 (s, 2H).

Tento produkt 2 (0,053 g, Ι,ϊχΙοΛηοΙ) byl rozpuštěn v 10 ml bezvodého THF a po kapkách přidán kTHF suspenzi LÍAIH4 (0,050 g, l,5xl0'³mol) pod N2 při 0°C. Výsledná směs byla 30 minut míchána a byly kní přidány dvě kapky vody. Vytvořila se sraženina, která byla odfiltrována. Bis-aminový produkt se pak získal odpařením zbylého roztoku a sušením přes noc ve vakuu. Bů-amin 3 byl rozpuštěn v 50 ml bezvodého methanolu a byl k němu přidán bisaldehyd 6 (0,050 g, 1,6x10⁴). Roztok pak byl probubláván 20 minut N2 a pod touto atmosférou přiveden do refluxního varu. Poté byl do tohoto roztoku přidán thiokyanat olovnatý (Pd(SCN)2) (0,055 g, l,7xl0⁴mol) a směs byla refluxována 4 hodiny, načež byla při pokojové teplotě přes probublávána plynem s obsahem kyslíku. Po odpaření rozpouštědly byl surový porfokyaninový produkt sušen přes noc ve vakuu. Produkt byl přečištěn na AI2O3 koloně (4% přídavek vody) s pomocí ethylacetátu VCH2CI2. Zelený eluent byl spojen a zahuštěn na rotační odparce. Po odpaření rozpouštědla byly získány krystaly 2,3,9,10,14,15,21,22-oktaethylporfokyaninu J.

Výtěžek: 19,3 mg, 19,1 %makrocyklu

Mol.hm. počítaná na C₃₈H.4₈N6: 588,3941

MS s vysokým rozlišení: 588,3933 'H NMR (300 MHz, CDC1₃), -4,50 (bs, 2H), 2,05 (t, 12H), 2,13 (t, 12H), 2,13 (t, 12H), 4,28 (q, 8H), 4,40 (q, 8H), 10,50 (s, 2H), 13,0 (s, 4H).

UV/VIS v CH₂C1₂ 455, 592, 800 nm.

Příklad 2

Syntéza oktaethylporfokyaninu (reakční schéma 2)

Tento příklad ilustruje vytvoření porfokyaninu vzorce la s použitím kondenzačního postupu, jak je naznačen na reakčním schématu 2.

Metodou uvedenou v příkladu 1 byl napřed připraven 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-kyandipyrromethan. Poté bylo 0,102 g (3,3xl0⁴mol) 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-kyandipyrromethanu v 10 ml bezvodého THF pomalu přidáno ke 20 ml THF suspenze LiAlH» pod N₂ při 0 °C. Směs byla míchána 30 minut a pro ochlazení reakce byly přidány dvě kapky vody. Sraženina byla odfiltrována. Zlatě zbarvený roztok se pak převede do dvouhrdlé baňky, obsahující ekvimolámí množství Pg(SCN)2 a bezvodého síranu sodného. Přidá se bezvodý methanol a směs se uvede do varu pod refluxem. Barva se postupně změní z purpurové na tmavě zelenou. Reakce se zastaví a roztokem se pomalu probublává vzduch. Surový produkt se pak rozpustí v methylenchloridu a nerozpuštěný pevný podíl se odfiltruje. Objem zeleného roztoku se pak sníží na asi 5 ml,

-22CZ 288186 B6 zavede do aluminové kolony (120 g, 4% přidané vody) a eluuje ethylacetatem νΟΗ₂Ο1₂. Jasně zelený eluent (2 1) obsahující porfokyanin se sbírá do sucha.

Výtěžek: 23,4 mg, 24,1 %

Spektroskopické hodnoty této sloučeniny jsou identické se sloučeninou připravenou v příkladu 1, uvedeném shora.

Příklad 3

Syntéza oktaethylporfokyaninu (reakční schéma 3)

Tento příklad ilustruje reakční schéma 3. Metodou uvedenou v příkladu 1 byl napřed připraven 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'-kyandipyrromethan 2. Poté byl k 69mg 3,3',4,4'-tetraethyl-5,5'kyandipyrromethanu v 10 ml bezvodého THF přidán desetinásobný přebytek 2,3-dichlor-5,6dikyan-l,4-benzochinonu (DDQ). Získaný roztok ihned změnil barvu na tmavě zelenou. Chromatografie byla provedena stejně jako v příkladu 2. Byl získán výrazně vyšší výtěžek ve srovnání s oxidací vzduchem.

Výtěžek: 32 mg, 48 %

Spektroskopické hodnoty jsou u takto získané sloučeniny shodné s hodnotami téže sloučeniny, získané podle příkladu 1, uvedeném shora.

Příklad 4

Syntéza porfokyaninu (reakční schéma 4)

Tento příklad ilustruje reakční schéma 4. Metodou uvedenou v příkladu 1 byl napřed připraven dialdehyd. Poté bylo 25 mg 3,3',4,4 -tetraethyl-5,5'-diformyl-2,2'-dipynomethanu 6 rozmícháno ve 30 ml bezvodého EtOH. Získaný ethanolický roztok byl ochlazen na 0 ’C a po dobu 30 minut byl vháněn a probubláván tímto roztokem plyn a obsahem amoniaku. Poté bylo vhánění plynu přerušeno a baňka byla umístěna na olejovou lázeň při 60 °C po dobu 72 hodin. Reakce byla ukončena ochlazením na 0°C. Ethanol byl odstraněn na rotační odparce a zbytek byl chromatografován na neutrální alumině (s přísadou 4 % H₂O) dichlormethanem.

Výtěžek: 4,6 mg 20 %

Spektroskopické hodnoty jsou u takto získané sloučeniny shodné s hodnotami téže sloučeniny, získané podle příkladu 1, uvedené shora.

Dalších 1,5 mg produktu bylo získáno z oxidace polárnější složky působením DDQ.

Příklad 5

Syntéza 2,2'-ů«-kyan-meso-aryldipyrromethanů

Tento příklad ilustruje reakční schéma 6.

Obecný postup: 250 ml baňka se naplní methanolem (115 ml), pyrrolem (10 ml, 105 mmol) a ptoluensulfonovou kyselinou (2,15 g, 11,5 mmol). K tomuto míchanému roztoku na 100 minut

-23CZ 288186 B6 přidá roztok aromatického aldehydu (11,25 mmol) v methanolu (30 ml). Poté se do reakční směsi vlije do vody (350 ml) a extrahuje dichlormethanem (3 x 150 ml). Organická fáze se protřepe se solankou (2 x 200 ml) a suší nad bezvodým uhličitanem draselným. Poté následuje odpaření roztoku ve vakuu a rychlá chromatografie (silikagel, 100 g), zbytku, čímž se získá mesoaryldipyrromethan.

Tento meso-aryldipyrromethan (0,32 mmol) se rozpustí v N,N-dimethylformamidu (5 ml), získaný roztok se pak zředí acetonitrilem (5 ml) a míchaná směs se ochladí na -78 °C po dobu 1 hodiny a poté se udržuje na -40 °C další hodinu, načež se teplota může zvýšit na teplotu místnosti. Reakční směs se vlije do směsi 5% hydrogenuhličitanu sodného (3M, 2,7 ml) a ledu, pak se zředí solankou (200 ml) a extrahuje se dichlormethanem (3 x 50 ml). Organická fáze se suší nad bezvodým uhličitanem draselným, roztok se odpaří ve vakuu a zbytek se chromatografuje na silikagelu, čímž se získá 2,2'-ów-kyano-meso-aryldipyrromethan.

Příklad 6

Kondenzace 2,2'-ó«-kyano-meso-aryldipyrromethanů za účelem přípravy symetrických porfokyaninů

Tento příklad ilustruje reakční schéma 3, kde alespoň jeden R_1C je aryl.

Obecný postup: roztok 2,2'-ůw-kyano-me5o-aryldipyrro-methanu (0,124 mmol) v tetrahydrofuranu (5 ml) se po kapkách přidává k míchané suspenzi lithiumaliminiumhydridu (1,3 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) pod atmosférou N₂ při 0 °C. Po redukci se provede chromatografie na tenké vrstvě (silikagel) a pokud je ukončena, odstraní se přebytečný LÍAIH4 přidáním vody, pak se přidá dichlormethan (15 ml) a směs se přefiltruje. Filtrát se suší nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Zbytek se znovu rozpustí v suchém dichlormethanu (100 ml) a do tohoto míchaného roztoku se přidá, po kapkách, roztok dichlordikyanbenzochinonu (5 ekvivalentů) v toluenu (5 ml). Po oxidaci následuje UV-vis Spektroskopie a pokud se zjistí, že se netvoří již další porfokyanin, reakční směs se zfiltruje přes neutrální aluminu, čímž se odstraní nadbytečný DDQ a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Surový difenylporfokyanin se čistí chromatografií na alumině.

Příklad 7

Aplikace postupů podle příkladu 5 a 6

V následujících příkladech, které popisují různé porfokyaniny, se používá následující systém číslování:

3579

-24CZ 288186 B6

Pomocí postupů z příkladů 5 a 6 byly připraveny následující sloučeniny:

1. 12.24-difenylporfokvanin: 1 g benzaldehydu poskytne 732 mg (35 %) ZMeso-fenyldipyrromethanu po chromatografii (silikagel, 10% hexan v dichlormethanu). 500 mg meso fenyldipyrromethanu poskytne 195 mg (32 %) 2,2'-Z>Zs-kyano-meso-fenyldipyrrmethanu po chromatografii (silikagel, 5% acetonitril v dichlormethanu). 100 mg 2,2'-ůZs-kyano-meso-fenyldipyrrmethanu dává 28 mg (29%) 1,11-difenylporfo-kyaninu po chromatografii (60 až 325 mesh neutrální alumina, 10% ethylacetat v dichlormethanu).

Spektroskopické hodnoty: *H NMR (CDC1₃), 7,92 (m, 6H), 8,44 (m, 4H), 9,38 (d, j=5, 7Hz, 4H), 9,8 (d, J=5,7Hz, 4H), 12,95 (s, 4H);

UV-vis: lambda: 452, 598, 640, 814 nm vCH₂C1₂; HRMS (El) pro C₃₄H₂₄N₆ (M⁺) vypočteno: 516,2062, nalezeno: 516,2058.

2. 12.24-di(3^,.4'.5'-trimethoxvfenvl)porfokvanin: 2,21 g 3,4,5-trimethoxybenzaldehydu dává 1,147 g (33 %) meso(3,4,5-trimethoxyfenyl)dipyrromethanu po chromatografii (silikagel, 3% aceton v dichlormethanu). 1 g me5o(3,4,5-trimethoxyfenyl)-dipyrromethanu dává 460 (40 %) w,w'-ůís-kyan-/Heso(3,4,5-tri-methoxyfenyl)dipyrromethanu po chromatografii (silikagel, 10% ethylacetat v dichlormethanu). 100 mg 2,2'-ůZ5-kyan-me5o-(3,4,5-tri-methoxyfenyl)dipyrromethanu poskytne 31 mg (32 %) l,ll-di(3',4',5'-trimethoxyfenyl)porfokyaninu po chromatografii (60 až 325 mesh neutrální alumina, ethylacetat/dichlormethan 1:1).

Spektroskopické hodnoty: *H NMR (CDC1₃) 4,1 (s, 12H), 4,25 (s, 6H), 7,67 (s, 4H), 9,44 (d, J=4,8Hz, 4H), 9,8 (d, J=4,8Hz, 4H), 12,95 (s, 4H);

UV-vis: lambda: 460, 602, 644, 818 nm v CH₂C1₂; HRMS (El) pro C₄₀H₃₆N₆O₆(M⁺) vypočteno: 696,2696, nalezeno: 696,2690.

3. 12,24-di(pentafluorfenyl)por fokvanin: 2,22 g pentafluorbenzaldehydu poskytne 1,48 g (42 %) meso(pentafluor-fenyl)dipyrromethanu po chromatografii (silikagel, 25% hexan v dichlormethanu). 200 mg /Mčso(pentafluorfenyl)dipyrromethanu dává 89 mg (38 %) 2,2'-Z>Zs-kyanozneso(pentafluorfenyl)dipyrroethanu (silikagel, 5% ethylacetat v dichlormethanu. 89 mg (38 %) 2,2'-Z>Zs-kyano-/Meso(pentafluorfenyl)dipyrromethanu dává 23 mg (28%) l,ll-di(pentafluorfenyl)-porfokyaninu po chromatografii (60 až 325 mesh neutrální alumina, 5% aceton v dichlormethanu).

Spektroskopické hodnoty: ’H NMR ((D₃C)₂CO) 9,55 (dd, Ji=15,22Hz, J₂=4,15Hz, 4H), 10,1 (d, J=4,15Hz, 4H), 13,24 (s, 4H), ^,9F NMR ((D₃C)₂CO) 6é,53, 60,92, 61,45 ukazující na F₃CCOOH);

UV-vis... 442,582,624,814nm v acetonu,

HRMS (El) pro C₃₄Hi₄F,₀ (M⁺): vypočteno 696,1120, nalezeno 696,1124

-25CZ 288186 B6

Příklad 8

Příprava asymetrických porfokyaninů kondenzací

Tento příklad využívá postupu podle reakčního schématu 3.

Obecný postup: dva různě substituované 2,2'-te-kyanodipyromethany (0,1 mmol) se rozpustí v suchém tetrahydrofuranu (5ml) a vzniklé dva roztoky se smísí. Smíšený roztok se po kapkách přidá k suspenzi LiAlH, v suchém THF (10 ml) pod atmosférou N₂ při 0°C. Po redukci následuje TLC a po ukončení se přebytek LiAlH₄ odstraní vodou a přidá se dichlormethan (5 ml). Výsledná kaše se gravitačně zfiltruje a filtrát se suší nad bezvodým síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla ve vakuu následuje opětně rozpuštění v dichlormethanu (20 ml), při kterém vznikne roztok zlaté barvy. K tomuto roztoku se po kapkách přidá roztok DDQ (5 ekvivalentů) v toluenu (5 ml). Po oxidaci následuje UV-vis spektroskopie a v případě, že se nezjistí tvorba dalšího porfokyaninů, reakční směs se zfiltruje přes nanesenou neutrální aluminu. Odpařením rozpouštědla z filtrátu se získá surová směs porfokyaninů, které se znovu rozpustí chromatografií.

Příklad 9

Aplikace postupu z příkladu 8

S použitím postupu z příkladu 8 byl připraven:

12-fenvl-2.3.21.22-tetraethvlDorfokvanín: 51 mg 2,2'-ůis-kyano-meso-fenyldipyrromethanu + 58 mg 2,2'-ůis-kyan-3,3',4,4-tetraethyldipyrromethanu poskytne 48 mg surového smíšeného porfokyaninů. Po chromatografii (C₁₈ reversní fáze, 20% 0,1% vodné kyseliny trifluoroctové v 0,1% kyselině trifluoroctové/acetonitrilu) se získá 21,7 mg (21%).

Spektroskopické hodnoty: *H NMR (CDC1₃) 2,05 (t, Ji=7,5Hz, 3H), 2,07 (t, J₂=7,5Hz, 3H), 4,21 (q, J=7,5Hz, 2H), 4,32 (q, J=7,5Hz, 2H), 7,88 (m, 3H), 8,41 (m, 2H), 9,31 (d, J=4,5Hz, 2H), 9,7 (d, J=4,5Hz, 2H), 10,3 (s, 1H), 12,72 (s, 2H), 12,96 (s, 2H),

UV-vis. lambda. 442,582,624,814nm, v CH₂C1₂

HRMS (El) pro C36H₃N₆ (M*): vypočteno 552,3001, nalezeno 552,2996

Příklad 10

12,24-difenyl-P-alkylporfokyanin

Tento obecný postup, zahrnující části reakčního schématu 5 a reakčního schéma 2, vychází z biskarboxydipyrro methanu:

2,2'-ózs-karboxy-3,3',4,4'-tetraalkyl-wes’o-fenyldipyrromethan (0,25 mmol) nebo 2,2'-biskarboxy-3,3'-dialkyl-zneso-fenyl-dipyrromethan (0,25 mmol) se rozpustí v N,N-dimethylformamidu (10 ml) a roztok se zahřívá pod refluxem pod parami N₂. Reakce se monitoruje pomocí TLC a když je dekarboxylace ukončena, směs se rozpustí v acetonitrilu (10 ml) a ochladí na 78 °C. K tomuto míchanému roztoku se pod dusíkovou atmosférou přidá po kapkách roztok chlorsulfonylizokyanatu (2,9 mmol) v acetonitrilu (1 ml). Směs se 1 hodinu promíchává při

-26CZ 288186 B6

-78 °C a pak ještě další hodinu při -40 °C, načež se nechá ohřát na pokojovou teplotu. Reakční směs se pak vlije do směsi 5% vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (20 ml), 5% vodného roztoku hydroxidu draselného (4 ml) a ledu, pak se zředí solankou (200 ml) a extrahuje dichlormetham (3 x 50 ml). Organická fáze se promyje solankou (5 x 100 ml), suší nad bezvodým uhličitanem draselným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Chromatografií zbytku se oddělí 2,2'-ázs-kyan-3,3',4,4'-tetraalkyl-meso-fenyldipyrrolmethan (0,25 mmol) nebo 2,2'-tó-kyan3,3 '-dialkyl-meso-feny ldipyrromethan.

Tyto tó-nitrilové sloučeniny (0,11 mmol) se rozpustí v bezvodém THF (10 ml) a získaný roztok se po kapkách přidá do míchané suspenze L1AIH4 (1,3 mmol) v bezvodém THF (10 ml) pod dusíkovou atmosférou při 0 °C. Redukce se sleduje TLC a když je ukončena, odstraní se přebytečný L1AIH4 vodou, přidá se dichlormethan (15 ml) a výsledná kaše se gravitačně zfiltruje. Filtrát se suší nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se vakuově vypaří. Zbytek se znovu rozpustí v dichlormethanu (100 ml) a k vzniklému roztoku se za stálého míchání přidá po kapkách roztok DDQ (5 ekvivalentů) v toluenu (5 ml). Po oxidaci následuje UV-vis spektroskopie a pokud se již nepozoruje vznikání dalšího porfokyaninu, reakční směs se zfiltruje přes nanesenou vrstvu aluminy. Filtrát se odpaří ve vakuu a zbytek se chromatografuje, čímž se oddělí 1,1 l-difenylokta-p-ethylporfokyanin nebo 1,1 l-difenyl-|3-tetra-alkylporfokyanin.

Příklad 11

Aplikace příkladu 10

Pomocí metody uvedené v příkladu 10 byla připravena následující sloučenina:

12.24-difenyl-3.9.15.2 l-tetraethyl-2.10,14.22-tetramethvlporfokyanin: 100 mg 2,2'-biskarboxy-3,3'-diethyl-4,4'-dimethyl-/neso-fenyldipyrromethan poskytlo 40 mg (44%) biskyano-3,3'-diethyl-4,4'-dimethyl-7neso-fenyldipyrromethanu. 40 mg óis-kyan-3,3'-diethyl4,4'-dimethyl-meso-fenyldipyrromethanu poskytlo po chromatografii (60 až 325 mesh neutrální alumina, 10% ethylacetat v dichlormethanu) 90 g (0,23 %) titulní sloučeniny.

Spektroskopické hodnoty: UV-vis: 462,604,642,802nm v CH₂C1₂,

HRMS (El) pro C^gNefM*) vypočteno: 684,3940 nalezeno: 684,3932.

Příklad 12

Toxicita porfokyaninu In vitro

Buňky se promyjí třikrát v séra prosté tekutině (DME), spočítány a upraveny na koncentraci 10⁷ buněk na ml.

Pro stanovení „afinity“ ve tmě se smísí 100 ml buněčné suspenze a 100 ml testované nebo kontrolní látky. „Značení“ se nechá probíhat jednu hodinu při 4 °C a značené buňky se promyjí ve tmě třikrát 3 ml tekutiny, přičemž každé nové promíchání se provádí s čerstvou tekutinou. Resuspendované buňky se pak podrobí expozici světla o vlnové délce 300 až 850 nm po dobu 300 minut.

V „přímém“ testu se buňky ozařují ihned po přidání testované či kontrolní sloučeniny. Účinek ozáření se hodnotí pomocí metod závislých na typu cílových buněk.

-27CZ 288186 B6

Pokud se jako testovaných buněk používá lidských erytrocytů (RBCs), hodnotí se vizuálně hemolýza, vyvolaná ozářením kontroly (hematoporfyrinem, Hp)-značených a porfokyaninem (vzorce l)-značených buněk.

Pokud se používá murin mastocymová buněčná linie P815, výsledky se zjišťují následujícím způsobem:

Buňky se značí způsobem uvedeným shora s použitím koncentrací 10 až 50 ng/ml Hp jako kontroly a porfokyaninu vzorce la jako testované látky. Resuspendované buňky se podrobí osvětlení při 300 až 850 nm po dobu 30 minut a výsledná životnost buněk se hodnotí přímým spočítáním za pomoci eosin-Y exkluze, což je standardní metoda pro odlišení živých buněk od mrtvých.

Při dalších stanoveních se postupuje jako shora, přičemž životnost buněk získaných ze světelné expozice se zkouší 18 hodinovou inkubací v tritiem značeném roztoku o koncentraci 10 Ci/ml v thymidinu podle standardní metody, založené na tom, že průnik thymidinu do buňky je úměrný její životnosti. Buňky se vyloví a měří se zvýšení radioaktivity scintilačním počítačem.

Příklad 13

Selektivní navázání porfokyaninů

Buňky P815 linie se inkubují jak je popsáno v příklad 12 s použitím 1 až 200 mg/ml Hp nebo porfokyaninu vzorce la. Buňky se značí ve tmě po dobu 30 minut, promyjí se pro odstranění neabsorbovaných porfyrinů, resuspendují a pak se vystaví po dobu 30 minut 300 až 850 nm světlu po dalších 30 minut. Životnost buněk je pak testována podle pronikání tritiovaného thymidinu po značení 30 Ci/ml a inkubací při 37 °C po dobu 18 hodin.

Příklad 14

Příprava immunokonjugátů

Tento příklad popisuje metody získání immunokonjugátů čtyř různých přípravků na bázi protilátek s hematoporfyrinem (Hp) nebo porkokyaninem (Pc) vzorce la. Použitými protilátkami jsou CAMA1-1, protilátka anti-Ml a protilátka B16G, všechny připravené jak je popsáno shora a projevují afinitu k čištěnému králičímu anti-myšímu Ig (R MIg). Dále byl čištěný irelevantní monoklonální přípravek (C-MAb), pokud byla nutná kontrola.

První příprava konjugátů se provádí v podstatě podle Mew et al. J. Immunol. (1983) 130:1473. Krátce, do 220 mg Hp . 0,2 HC1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ve 25 ml vody a 0,8 N,Ndimethylformamidu se přidá 20 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimidu HC1 (EDCI) v 0,6 ml vody. Po 30 minutách se tento roztok smíchá s 15 mg proteinové protilátky rozmíchané v 5 ml destilované vody a inkubuje se po dobu 5 hodin. V průběhu tohoto období se sleduje pH roztoku a jeho hodnota se udržuje v rozmezí 6 až 7. Pak se přidá 50 1 monoethanolaminu a roztok se nechá stát přes noc při pokojové teplotě. Roztok se pak dialyzuje proti 0,001 M fosfátovému pufru s pH 7,4 po dobu čtyř dnů s třemi výměnami za den a za noc proti PBS. Konjugát porfokyaninu se připravuje analogicky.

Ve výhodném protokolu se připraví 2 ml disperze v DMSO, obsahující 5 mg Hp a 5 mg Pc a dehydratační činidlo mícháním složek 30 minut pod dusíkem při pokojové teplotě. K získanému roztoku se přidá disperze obsahující 2 mg příslušného immunoglobulinu ve 2 ml DMSO a výsledná směs se míchá dalších 10 minut. Tato směs se pak zředí fosfátem pufrovanou solan

-28CZ 288186 B6 kou o pH 7,4 (PBS) s obsahem 50 1 monoethanolaminu a dialyzuje se proti PBS s použitím tří výměn lázně.

Alternativně se připraví a asi 15 minut promíchává při pokojové teplotě pod dusíkem 2 ml disperze, obsahující 5 mg Hp nebo 5 ml Pc, vázací činidlo a dehydratační činidlo. K ní se poté přidá disperze obsahující asi 2 mg immunospecifického proteinu ve 2 ml tetrahydrofuranu a výsledná směs se míchá dalších 10 minut. Pak se tato směs zpracuje stejným způsobem jak je popsán shora.

Popsaný postup je vhodný pro CAMAL-1 a pro ostatní protilátky, uvedené shora.

Dále následují postupy, specifické pro B16G a R MIg:

B16G

Jedenáct mg hematoporfyrinu plus 11 mg EDC1 ve 4 ml spektrálně čistého DMSO se míchá 30 minut pod dusíkem při pokojové teplotě před přidáním 20 mg lyofylizovaných protilátek B16G, připravených podle postupu popsaného Maierem et al. v J. Immunol. (1983) 131:1843. v DMSO. Získaná směs se míchá 40 sekund při pokojové teplotě a zpracuje postupem popsaným shora. Výsledný produkt obsahuje přibližně 375 g Hp/mg B16G.

RxMIg

Čtyři sta pg EDCI a 400 g hematoporfyrinu v 1 ml DMSO se míchá 30 minut pod dusíkem při pokojové teplotě jako shora před přidáním 800 pg lyofylizovaných protilátek R MIg, připravených podle popisu v Mew et al. J. Immunol. (1983) 130:1473. v 1 ml DMSO. Výsledná směs se míchá 30 sekund a zpracuje postupem, uvedeným shora, čímž se získá produkt s obsahem 200 pg Hp/mg R MIg. Podobně se postupuje pokud se místo Hp používá Pc.

Příklad 15

Specifita immunokonjugátů in vitro

TSM-Hp a TSM-Pc konjugáty, v nichž TST představuje immunoglobulin se testují na buňkách in vitro smícháním konjugátu s vhodným typem buněk, spolu s vhodnými kontrolami, a poté se značené buňky podrobí ozáření. Způsoby provádění tohoto testu jsou popsány v Mew et al. Cancer Research (1985) pro CAMAl-1, a Mew et al., J. Immunol. (1983) pro Anti-Ml, což jsou oba již shora citované odkazy, zahrnuté touto formou do popisu.

Krátce, pro CAMAL-1 se značí tři buněčné linie WC4, WC6 a WC2 (WC4 a WC6 produkují CAMAL antigen, avšak WC2 nikoliv) vhodným TSM-Hp nebo TSM-Pc postupem popsaným shora v příkladu 14. Přípravky značených buněk, každý s obsahem 10⁶ buněk se vloží do ozařovacích komor a exponují se laserovým světlem o vlnové délce 630 nm. Výsledky pro jednotlivé přípravky se pak shrnou.

Pro anti-Ml konjugát se používají pro cílové Ml tumorové buňky a ošetření se provádí TSMHp, TSM-Pc, látkou, samotnou protilátkou nebo kombinací protilátky a látky v nespojeném stavu, inkubací v 6% CO₂ ve vlhkém inkubátoru při 37 °C po dobu 2 hodin. Buňky se promyjí třikrát v PBS, pak se umístí ve vrstvách do misek a podrobí se přes noc fluorescenčnímu osvětlení. Hodnocení životnosti tritiovaným thymidinem se provádí jak je uvedeno shora.

Pro konjugáty B16G se používají jako cílové buňky A10, P815 a L1210. (A10 jsou T buňky hybridomu, který vylučuje B16G-reaktivní T-supressorový faktor, P815 buňky jsou také reaktivní s B16G).

-29CZ 288186 B6

Testy in vitro byly provedeny pomocí přímé metody s použitím B16G-Hp nebo B16G-Pc konjugátu nebo nepřímo s použitím neznačených B16G protilátek a značených R MIg-Hp nebo R MIg-Pc.

Při přímé metodě se suspenduje 5 x 10⁵ buněk v 1 ml DME/Hepes obsahujícím vhodný TSM konjugát příslušné testované či kontrolní látky při koncentraci Hp nebo Pc 320, 160, 80, 40 a 20 ng látky/ml. Buňky se inkubují ve tmě 1 hodinu při teplotě 37 °C, pak se 3 x promyjí v 5 ml DME/Hepes a pak se resuspendují v 1 ml stejného pufru. Poté se na ploché dno v mikrotitračních zásobnících umístí tři stomikrolitrové testovací vzorky značených přípravků a zbytek buněčné suspenze (asi 700 μΐ) se podrobí po dobu 1 hodiny působení světla ze žárového zdroje (22,5 mW/cm²) ze vzdálenosti 20 cm. Potom se do mikrotitračních zásobníků umístí tři další stomikrolitrové alikvotní vzorky. Pak se k mikrotitračním zásobníkům přidá ke stomikrolitrovým alikvotním dílům tritiem značený thymidin rozpuštěný v DME/Hepes tak, aby do každého zásobníku se přidalo 2 Ci značeného thymidinu. Kultury se inkubují po dobu 18 hodin při 37 °C a navlhčí 10% CO₂, načež se seberou do MASh harvesteru. Průnik thymidinu se měří Hp scintilačním počítačem (Tri-Carb model 4550).

Při přímém testu se suspendované buňky A10, připravené dle popisu uvedeného shora, vystaví působení 50 pg/ml B16G nebo kontrolní protilátky C-MAb při 4 °C po dobu 30 minut, promyjí se DPE/Hepes a poté se vystaví dalších 30 minut ve tmě různým koncentracím RaMIg-Hp nebo RaMlg-Pc v rozmezí 2 1/ml a 15ng/ml Hp nebo Pc. Buňky se testují na životnost pomocí značeného thymidinu postupem popsaným shora.

Příklad 16

In vivo toxicita Porfokyaninů a jejich konjugátů

Dále byla testována škodlivost porfokyaninů a jejich konjugátů. Pro CAMAL-1 a anti-Ml konjugáty se použilo postupů popsaných ve dvou publikacích Mew et al., citovaných shora v příkladu 15. Pro B16G-Hp a B16G-Pc konjugáty a pro Pc (vzorce 1) samotný se prováděl test in vivo následovně:

Test in vivo byl založen na stanovení nepřímého vlivu populace T-supressorových buněk na tumory, což pak slouží jako prostředek k hodnocení efektivity léčení ozařováním. P815 mastocytomové buňky, pěstované na syngenové DBA/2 myši stimulují T-supressorové buňky specificky pro tumor. Tyto T-supressorové buňky mohou vyvolat vývoj specifických T-zabíjecích buněk, které mimo jiné mohou přispět k regresi tumoru. Hybridom T-buněk, shora označených jako A10, vylučuje T-supressorový faktor, který je spojen s těmito T-supressorovými buňkami. Tudíž selektivní zabíjení těchto populací T-supressorových buněk reakcí s konjugáty, v nichž TMS je protilátka specifická pro T-supressorový faktor na povrchu buněk (konkrétně B16G) by mělo mít za následek u myši s tumory P815 regresi tumorů.

Proto se při tomto testu naočkuje DBA/2 myši do pravého boku subkutánně 10⁴ buněk P815 pro vyvolání tumoru. Po osmi dnech, kdy jsou tumory hmatné (asi 25 až 42 mm²), se myši náhodně rozdělí do skupin po osmi a naočkují IV 150 μΐ PBS obsahujícím nic (srovnávací), Hp nebo Pc, B16G-Hp nebo B15G-Pc, B16G plus další látka, B1G samotná nebo C-MAb-Ηρ nebo CMAb-Pc. Koncentrace Hp jsou ve všech případech 50 pg na zvíře a u B16G pg ve všech případech (pokud je použito).

Zvířata se udržují ve tmě po dobu 2 hodin a pak se vystaví silnému světlu o vlnové délce 300 až 850 nm a výkonu 22,5 mW/cm². Poté se zvířata normálně ošetřují a denně monitorují.

-30CZ 288186 B6

Příklad 17

Diagnostické zobrazování

Dvaatřicetiletá pacientka trpí horečkou a abdominálními bolestmi. Pacientka je udržována na antibiotické terapii po dobu jednoho týdne bez účinku. CAT sken nedokázal zobrazit žádnou abnormální hmotu. Byla provedena radiografická studie s použitím porfokyaninu, značeného Tc99m. Pacietce bylo naočkováno 20 mCi radioaktivně značeného porfokyaninu a byla skenována gama kamerou ve SPÉCT modu. Sken abdemonu pacientky ukázal ohnisko akumulovaného Tc-99m. Použije se chirurgického zákroku a ohnisko se nalezne v místě aktivity TC-99m.

Příklad 18

Příprava konjugátu BPD-Ra-Mig

Fotosenzibilizátor BPD-Ma se v temnu zředí z koncentrace 1 mg/ml na 200 pg/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku a smísí se známým množstvím krysího anti-myšího Ig (RaMIg), který se získá od Cedar Lané Laboratories nebo připraví imunizací králíků myším imunoglobulinem a čištěním protilátek na imunoabsorpčních kolonách. Směs se inkubuje 1 h v temnu při teplotě místnosti a získaný konjugát se dialyzuje přes noc při 4 °C přes membránu propustnou pro molekulu o molekulové hmotnosti menší než 12 až 14 kD proti třem litrům PBS. Modelové studie se značeným BPD-MA ukazují, že zadržený konjugát má poměr BPD:Ab 10 až 20. Retentát z dialýzy se pak zmrazí a lyofilizuje a uchovává v temnu.

Příklad 19

Ošetření tkáně aloimplantátu konjugátem

Dárcovská tkáň pankreatických ostrůvků byla izolována z krys tímto způsobem:

Samci krys SD (200 až 250 g) byli anestetizováni intraperitoneálně urethanem (lOOmg/kg) a pomocí laparotomie středovou čárou byla bilaterálními pneumotoraxy vyvolána kardiorespirační zástava. Proximální společný žlučovod byl kanylován a distálně okludován v místě vstupu do dvanáctníku. Pankreas pak byl retrográdně rozšířen chladným (4 °C) roztokem kolagenasy (typ XI, Sigma Chemicals) o koncentraci 0,42 mg (650 U)/ml. Po rozšíření kolagenasou in šitu byla provedena totální pankreatektomie.

Žlázy byly vyluhovány po dobu 22 min ve vodní lázni 37 °C. Vyluhované žlázy byly dispergovány triturací přes sterilní silikonovou pipetu. Surová tkáňová suspenze byla podrobena průchodu filtrem o velikosti síta 200 pm k odstranění nevyluhovaných trubic, krevních cév a lymfatických uzlin a pak odstřeďována s diskontinuálním gradientem dextranu, tvořeným dvěma monovrstvami o specifické hmotnosti 1,065, resp. 1,031. Z rozhraní monovrstvy byla odsáta ostrůvková tkáň o menší hustotě, promyta a dále přečištěna ručním vysbíráním pod disekčním mikroskopem. Touto metodou bylo získáno 300 až 400 funkčně a morfologicky neporušených ostrůvků na pankreas.

Ostrůvky byly kultivovány in vitro po dobu 1 dne v Hamově médiu F-12, doplněném 25 % telecího séra, 15 mm pufru HEPES a 1 % strepfungizonu. Kultivované ostrůvky byly nejprve inkubovány po dobu několika hodin při 0 °C s komerčně dostupnou myší anti-krysí monoklonální protilátkou Ia (označenou OX-6), dostupnou od SeraLab, v množství 0,2 mg/ml. OX-6 je imunospecifická proti produktu MHC třídy II.

-31CZ 288186 B6

Části ostrůvků, ošetřených OX-6, byly inkubovány při 20 °C po dobu 2h v temnu s (1) konjugátem Ra-MigG-BPD s poměrem 6,5 BDP: 1 Ab, (2) tímtéž konjugátem s poměrem 20 BPD : 1 Ab, (3) konjugátem BDP s irelevantní protilátkou gA-7sIgG s poměrem 6,5 BPD : 1 Ab, (4) BPD samotným a (5) médiem samotným. Inkubační směsi pak byly vystaveny světelné energii 10 J/cm² o vlnové délce 400 až 800 nm. Ozářené kultury pak byly testovány histologicky a na úbytek APC. >

Příklad 20

Charakterizace dárcovské tkáně

V histologických studiích bylo asi 75 až 100 ostrůvků, které byly ošetřeny konjugátem 6,5 BPD: 1 Ab, transplantováno pod tukové pouzdro ledviny příjemcovských syngenních krys SD a alogenních krys WF. Jak u syngenních, tak u alogenních transplantátů poskytli všichni příjemci úspěšné výsledky. Zejména byla jak u syngenních, tak alogenních transplantátů pozorována kompletní náhrada štěpu lymfocytickým infiltrátem a byla pozorována identifikovatelná endokrinní tkáň.

Ve studiích úbytku APC byly ostrůvky primárně imunobarveny protilátkou OX-6. Takto ošetřené buňky byly podrobeny sekundárnímu barvení kozím anti-myším Ig, značeným FITC (Jackson Laboratories) a podrobeny fluorescenční mikroskopii. V preparátech, které byly ošetřeny konjugáty, nebyly patrné identifikovatelné buňky MHC třídy II. V kontrolních preparátech (konjugát s irelevantní protilátkou, samotný BPD a médium) však byla přítomnost těchto buněk fluorescenční mikroskopií detekována, protože sekundární protilátka, značená FITC, označila APC a emitovala zelenou fluorescenci.

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina vzorce 1

   I__________________________________________________________________I v němž n je celé číslo od 1 do 4 a index i u každého symbolu Pí a Z, nabývá ve vzorci odleva doprava postupně hodnoty od 1 do n+2;

   v němž každé -Ρ,—je nezávisle pyrrolový zbytek vzorce

   -32CZ 288186 B6 v němž index i u každého R_ia a R_ib má tutéž hodnotu jako v každém -P,— a v němž každé Z; je nezávisle (a) kovalentní vazba, (b) meso můstková skupina vzorce =C- <—>

   (c) N-meso můstková skupina vzorce =N- <—> -N= (d) vazba uhlík-uhlík vzorce (e) vazba uhlík-dusík-uhlík-uhlík-dusík-uhlík vzorce nebo (f) vazba uhlík-dusík-uhlík vzorce

   CH=N-CH= <—> =CH-N=CH- / kde každé R_ia, R_ib, R_ic, R_ld, R_ie, R,_f a Rj_g je nezávisle vodík, halogen, skupina nitro, kyano, N(R')₂, SR', OR', SOR', SO₂R', COOR', CON(R')2, kde každé R' je nezávisle vodík, C^alkyl, popřípadě substituovaný Ci₆alkyl, popřípadě substituovaný C₂_6alkenyl, popřípadě substituovaný C₂_6alkinyl, popřípadě substituovaný C^aryl nebo popřípadě substituovaný Cs-igarylalkyl, kde uvedeným případným substituentem je výše uvedený halogen, skupina nitro, kyano, N(R')2, SR' nebo OR' a/nebo Ci^alkyl, C₂_6alkenyl nebo C^alkinyl v substituovaném arylu a kde mohou být amino-, sulfhydrylové a hydroxylové substituenty Cj^acylovány, kde alespoň jedno Z, znamená shora uvedenou vazbu uhlíku k dusíku k uhlíku, a její formy metalované paramagnetickým iontem nebo radioizotopem, formy kovalentně konjugované s cílově specifickou jednotkou a farmaceuticky přijatelné soli.
2. 2. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde n má hodnotu 2.

   -33CZ 288186 B6
3. 3. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde Zi a Z₃ jsou vazby uhlík-dusík-uhlík a Z₂ a Z₄ jsou meso můstkové skupiny.
4. 4. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde Zi je vazba uhlíkdusík-uhlík a Z₂, Z₃ a Z₄ jsou meso můstkové skupiny.
5. 5. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde Zi je vazba uhlíkdusík-uhlík, Z₂ a Z₄ jsou kovalentní vazby a Z₃ je vazba uhlík-uhlík.
6. 6. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde Zi a Z₃ jsou vazby uhlík-dusík-uhlík, Z₂ je kovalentní vazba a Z₄ je meso můstková skupina.
7. 7. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde Zj a Z₃ jsou vazby uhlík-dusík-uhlík, Z₂ je meso můstková skupina a Z₄ je vazba uhlík-dusík-uhlík-uhlík-dusíkuhlík.
8. 8. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde Zj a Z₃ jsou vazby uhlík-dusík-uhlík, Z₂ je N-weso můstková skupina a Z₄ je meso můstková skupina.
9. 9. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vzorce 1 kde všechny Z_b Z₂, Z₃ a Z₄ jsou vazby uhlík-dusík-uhlík.
10. 10. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde n má hodnotu 1.
11. 11. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 10, vzorce 1 kde Zi je vazba uhlíkdusík-uhlík a Z₂ a Z₃ jsou meso můstkové skupiny.
12. 12. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde n má hodnotu 3.
13. 13. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 12, vzorce 1 kde Zi a Z₂ jsou vazby uhlík-dusík-uhlík Z₃, Z₄ a Z₅ jsou meso můstkové skupiny.
14. 14. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde n má hodnotu 4.
15. 15. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde Z] a Z* jsou vazby uhlík-dusík-uhlík a Z₂, Z₃, Z5 a Ze jsou meso můstkové skupiny.
16. 16. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde každý R,_c je nezávisle vodík nebo substituovaný aryl, alkyl nebo arylalkyl ve významu podle nároku 1.
17. 17. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 16, vzorce 1 kde každý R,_c je nezávisle vodík nebo substituovaný aryl ve významu podle nároku 1.
18. 18. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 3, vzorce 1 kde jeden R,_c je substituovaný aryl ve významu podle nároku 1 a další Ric je vodík.
19. 19. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, vzorce 1 kde všechny R,_a a všechny R^ jsou stejné.
20. 20. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 3, vzorce 1 kde substituenty Ri_a, Rib, Rfa a Rib jsou stejné, přičemž R_2a, R_2b, R_3a a Ř_3b jsou navzájem stejné, ale odlišné od R_ta, Rib, Ría a R4b.

    -34CZ 288186 B6
21. 21. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 20, vzorce 1 kde každý Rá a R* je nezávisle vodík nebo substituovaný alkyl ve významu podle nároku 1.
22. 22. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 2, vybraná ze skupiny zahrnující porfokyanin, 2,3,9,10,14,15,21,22-oktaethylporfokyanin, 12,24-difenylporfokyanin, 12,24-di(3,4,5-trimethoxyfenyl)porfokyanin, 12,24-di(pentafluor-fenyl)porfokyanin, 12-fenyl2,3,21,22-tetraethylporfokyanin, 12,24-difenyl-2,3,9,10,14,15,21,22-oktaethylporfokyanin a 12,24-difenyl-3,9,15,2 l-tetraethyl-2,10,14,22-tetramethyl-porfokyanin.
23. 23. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, kde uvedená cílově specifická jednotka je kovalentně konjugována přes vazebnou skupinu.
24. 24. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 23, kde cílově specifickou jednotkou je immunoglobulin nebo fragment immunoglobulinu, steroid nebo sacharid.
25. 25. Farmaceutický prostředek, cytotoxický vůči specifickým buňkám nebo tkáním při ozařování světlem, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny podle nároku 1 s příměsí alespoň jednoho farmaceuticky přijatelného excipientu.
26. 26. Farmaceutický prostředek, cytotoxický vůči specifickým buňkám nebo tkáním při ozařování světlem, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství produktu podle nároku 23 s příměsí alespoň jednoho farmaceuticky přijatelného excipientu.
27. 27. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, která je ve formě metalované paramagnetickým iontem.
28. 28. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 27, ve které prvkem paramagnetického iontu je gadolinium (III) nebo mangan (II).
29. 29. Kontrastní látka pro zobrazování magnetickou rezonancí, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 v metalované formě s paramagnetickým iontem.
30. 30. CNC-expandovaná porfyrinová sloučenina podle nároku 1, obsahující radioizotop, vybraný ze skupiny zahrnující technecium, indium a gallium.
31. 31. Způsob přípravy CNC-expandované porfyrinové sloučeniny podle nároku 1 vzorce l(a)

    1(3 ) kde jednotlivé substituenty mají v nároku 1 uvedený význam, vyznačující se tím, že zahrnuje působení sloučeniny vzorce

    -35CZ 288186 B6

    Rža^ Ržb Rja y^R3b h₂nh₂c. JI J H Λ JL ^Xjj^^*CH₂NH₂ R_2e na sloučeninu vzorce RiDk R1. R«b Au X Λ Ji Π L i Η₂ΝΗ₂σ H v '^^ch₂nh₂

    ve kterých mají jednotlivé substituenty význam uvedený v nároku 1, za přítomnosti přebytku 2,3-dichlor-5,6-dikyano-l,4-benzochinonu v nepolárním aprotickém rozpouštědle.
32. 32. Způsob přípravy CNC-expandované porfyrinové sloučeniny podle nároku 1 vzorce l(a)

    15 kde jednotlivé substituenty mají v nároku 1 uvedený význam, vyznačující se tím, že zahrnuje působení sloučeniny vzorce

    -36CZ 288186 B6 na sloučeninu vzorce ,R4.

    ,^R1.

    R«i>,

    H(O=)C

    C(=O)H

    R4C

    5 ve kterých mají jednotlivé substituenty význam uvedený v nároku 1, přebytkem amoniaku v polárním rozpouštědle.
33. 33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že se použijí výchozí dipyrrolové o sloučeniny, připravené redukcí odpovídajících kyano-substituovaných dipyrrolů připravených působením chlorsulfonylizokyanatem na dipyrroly za přítomnosti polárního aprotického rozpouštědla.