CZ282299A3 - Přípravky a nástroje pro prevenci nebo omezení účinků zánětů - Google Patents

Description

Přípravky a nástroje pro prevenci nebo omezení účinků zánětů

Oblast techniky

Vynález se obecně týká oblasti farmakoterapie a použití fotodynamické terapie (photodynamic therapy, „PDT“) k oslabování nebo prevenci zánětů v důsledku poranění tkáně, ať už vnitřního, například při chirurgickém zákroku, nebo náhodného, jako jsou tržné rány, poranění kloubů a šlach, a při léčbě obětí popálenin. Ve výhodném provedení se vynález týká použití „nízkých dávek“ PDT k léčbě oční tkáně, kde dochází k zánětům vlivem manipulace s oční tkání, zejména pokud zánět představuje komplikaci při zotavování pacienta po nezbytném zákroku. Běžné aplikace zahrnují zánětlivé onemocnění očí a různé typy oční chirurgie nebo laserového zákroku, jako je transplantace a filtrační oční chirurgie, používaná obvykle při léčbě glaukomu. Ve zvláště výhodném provedení se vynález týká prodloužení přežití filtrační vzduchové bubliny pro zlepšení výsledku filtrační chirurgie.

Dosavadní stav techniky

Zánět obecně:

Čtyři hlavní příznaky, obvykle související se zánětem, jsou 1) zarudnutí, 2) otok, 3) teplo a 4) bolest, a případným pátým hlavním příznakem bývá ztráta funkce napadené části. Zatímco poranění spouští složitou řadu dějů, z nichž k mnohým dochází současně a jsou navzájem různým způsobem svázány, je známo, že při vyvolám zánětu se významným způsobem podílejí malé cévy. Zánět je ve skutečnosti jedním z cenných obranných mechanismů těla a obvykle se soudí, že má tři fáze: degenerativní fázi, vaskulámí fázi a fázi hojení; viz Klein, „Defense Reactions in Action“, Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination, kap. 14, 577-84 (1982).

Konkrétně dochází v degenerativní fázi k otoku napadených buněk, primárně epidermálních buněk a fibroblastů, přičemž se vakuolizuje jejich cytoplasma a jejich jádra se zvětšují a fragmentují. Některé z destiček v poškozených cévách desintegrují a uvolňují serotonin a jiné mediátory, působící na zakončení sympatického nervu.

Vaskulámí fáze je charakterizována změnami cév, intenzivní migrací a aktivitou tzv. zánětlivých buněk (granulocyty - zejména neutrofily, lymfocyty, monocyty a makrofágy) a • · · · mizení denegerovaných buněk a zbytků buněk. Dochází k zaplavení, ucpání a přeplnění kapilární sítě a postkapilámích žilek při aktivní hyperémii. Protože vzrůstá také počet kapilár, je pozorováno načervenalé zbarvení zanícené tkáně, nazývané také „zarudnutí“. Zvětšený průtok krve také způsobuje, že teplota zanícené oblasti se přibližuje teplotě aortální krve, teplejší oproti okolní normální tkáni, což dává pocit tepla.

Při poranění uvolňuje poškozená tkáň látky, známé jako příbuzné histaminu, nazývané H substance, které jsou směsí histaminu a serotoninu, uvolněného z rozpadlých žímých buněk tkáně. H substance způsobují aktivní dilataci cév a endoteliální buňky dilatované cévy se navzájem oddělují, čímž se zvětšují mezery mezi nimi. Endotelová výstelka cév se postupně pokrývá leukocyty, přičemž dochází k vytlačování části tekutiny do okolní tkáně. Tekutina bohatá na proteiny, která uniká z cévy do okolní tkáně, způsobuje otok tkáně. Unikající tekutina obsahuje rovněž látky, které neutralizují bakteriální toxiny a napomáhají destrukci původce zánětu.

Leukocyty, zejména neutrofily a monocyty, se pohybují v cévách, dokud nenaleznou vhodnou skulinu, kterou by mohly přejít do perivaskulámích struktur a prostorů tkáně. Leukocyty napadají mrtvé a umírající buňky, tráví je intracelulámě pomocí fagocytosy nebo extracelulámě pomocí proteolytických enzymů, které uvolňují po své smrti z lysozymů. Má se za to, že stimuly pro migraci leukocytů přicházejí z poraněné tkáně ve formě chemotaktických faktorů.

Jinými typy buněk, silně ovlivněných poraněním tkáně, jsou krevní destičky. Krátce po poranění dochází k přilnutí destiček, jednotlivých nebo ve shlucích, ke stěnám cév. Současně se začínají objevovat fibrinová vlákna, tvořící jemné síto, které pomáhá buňky zachycovat. Vzniklá sraženina spojuje navzájem okraje porušené tkáně.

Intra- a extracelulámím trávením nekrotické tkáně neutrofily a monocyty vzniká tekutina, která se spojuje se serózním materiálem vytlačovaným z cév. Vznikne-li absces, je dutina vystlána pyrogenní membránou, která u ran infikovaných bakteriemi brání šíření a množení patogenních mikroorganismů do krve.

V prvních dvou fázích zánětlivého procesu dojde buď ke zničení cizího tělesa, například je-li tímto tělesem organismus, nebo k uvolnění okolní tkáně, je-li cizím tělesem například úlomek. Ve fázi hojení začíná zánět ustupovat, jednotlivé cévy a vaskulámí systémy se stávají opět normálními a začíná hojení rány. Proces hojení má tři hlavní děje: 1) tvorbu

• 0

0 0 · · · * · ♦ 0 0 · · · ·

0 00 0 · 0 ···

0 0 0 0

000 00 00 00 nové pojivové tkáně proliferujícími fibroblasty, 2) regeneraci epitelu a 3) vybudování nových kapilár.

Již před ústupem zánětu se do poraněné oblasti začínají stahovat fibroblasty z okolní normální tkáně, kde obvykle existují v klidovém stavu. Pohybují se améboidním pohybem podél vláken fibrinu a rozptylují se po oblasti hojení. Jakmile jsou fixovány v určité poloze v poraněné tkáni, začínají syntetizovat a vylučovat kolagen, který se uspořádává do vláken. Vlákna se orientují s podélnou osou ve směru největšího namáhání. Jak získávají kolagenové svazky na pevnosti, fibroblasty postupně degenerují a pevně se na tyto svazky uchycují, a tak se poraněná oblast přeměňuje na tkáň jizvy.

Současně s tvorbou tkáně jizvy začínají intaktní epidermální buňky na okraji rány proliferovat a pohybují se jako jedna vrstva ke středu poraněné oblasti. Jak zánět ustupuje, vzrůstá potřeba přímé dodávky krve a do rány začínají vrůstat nové cévy.

Je známo, že v molekulárním pohledu na zánět je spolu navzájem složitým způsobem v interakci množství účinných sloučenin. Mezi buňky poškozené poraněním patří žímé buňky, které uvolňují mediátory spouštějící časnou fázi vasodilatace, doprovázenou oddělováním buněk endotelu a obnažením kolagenových vláken v subendoteliální vrstvě. Vlákna v mezibuněčných mezerách, která se tvoří v cévách, zachycují krevní destičky a spouštějí uvolňování mediátorů z těchto buněk.

Kromě krevních destiček interagují obnažená kolagenová vlákna také s bílkovinami plasmy, které pronikají póry stěny rozšířené cévy, včetně spouštěcího faktoru kaskády srážení krve. Tyto proteiny iniciují rovněž kaskádu kinin-bradykinin, produkující bradykinin, který se účastní vasodilatace, zvyšování průchodnosti cév a chemotaxi.

Čtvrtý molekulární systém, komplementární kaskáda, může být aktivován několika stimuly: poškozenými cévami, proteolytickými enzymy uvolňovanými z poškozených buněk, membránovými složkami přítomných bakterií a komplexy antigen-protilátka. Některé z aktivovaných složek komplementu působí jako chemotaktické faktory, odpovědné za přístup leukocytů do zanícené oblasti. Jiné usnadňují fagocytózu a účastní se buněčné lýze.

Oční zánět

Glaukom je oční onemocnění, při kterém vysoký nitrooční tlak způsobuje poruchu vidění jednotlivce. V normálním oku je epiteliálními buňkami řasnatého tělíska, které je • · • · • 4

umístěno kolem vnitřního obvodu duhovky (směrem dovnitř oční bulvy), produkována tekutina. Funkce této tekutiny zahrnují vyživování buněk v oku a udržování pozitivního tlaku v oční bulvě, který je nezbytný k udržení správného prostorového rozložení zrakových orgánů nutných pro tvorbu obrazu, podobně jako je tomu u nosné konstrukce kamerového tělesa u fotografického přístroje.

Tekutina je normálně z oka odstraňována filtrací přes trabekulámí tkáň, což je kruhové těleso umístěné po obvodu v úhlu mezi duhovkou a rohovkou v přední části oka. Tekutina typicky odchází mikroskopickými otvory v trabekulámí tkáni do Schlemmova kanálu a pak do kolektorových kanálů, které ji vedou do episklerálních cév a ven z oka. V patologii glaukomu je odtok tekutiny z oka snížen, což má za následek ostrý vzrůst nitroočního tlaku, poškození vnitřních tkání oka a nakonec úplnou ztrátu zraku.

Terapeutický cíl při léčbě glaukomu je vždy tentýž, tj. snížení nitroočního tlaku, a to buď snížením produkce tekutiny nebo zvýšením jejího odtoku nebo „filtrace“ ven z oka. Existuje mnoho způsobů, jak tohoto cíle dosáhnout, ale na prvním místě je vždy medikace. Není-li medikace při regulaci zvýšeného nitroočního tlaku úspěšná, používají se jiné, invasivnější metody, jako je ošetření laserem nebo chirurgický zákrok.

Laserové metody zahrnují trabekuloplastiku, při níž se používá laseru k vypálení otvorů v trabekulámí tkáni. Chirurgické metody zahrnují 1) trabekulotomii, kde se používá kovová sonda nebo „trabekulotom“ k vytvoření otvoru mezi Schlemmovým kanálem a přední komorou oka po zhruba jedné třetině obvodu normálního výtokového úhlu, 2) trabekulektomii, při níž se provede řez trabekulámí tkání, a 3) iridektomii, při níž se vyřezávají části duhovky. Sklerostomie zahrnuje řez bělimou buď laserem nebo chirurgickým nástrojem. Trabekulektomie, iridektomie i sklerostomie jsou spojeny s vytvořením filtračního „puchýřku“, tj. váčku, do něhož se svádí přebytečná oční tekutina a tak se urychluje její odchod z oka.

Chirurgická náprava filtrace při glaukomu je obvykle doporučována pro pacienty, kteří mají progresivní glaukomatózní poškození, a pro ty, kteří při své současné úrovni očního tlaku nesou významné riziko postupu onemocnění. U pacientů s vážným poškozením se zlepší dlouhodobá prognóza, je-li možno nitrooční tlak (intraocular pressure, IOP) snížit na méně než 20 mm Hg a udržovat jej pod touto úrovní. Filtrační chirurgie se tedy silně doporučuje u pacientů s pokročilým poškozením a očním tlakem nad 18 až 20 mm Hg.

• 9

9 99

Tato chirurgie obecně spadá do dvou kategorií: 1) postupy v celé tloušťce nebo 2) postupy v chráněném kanálku. Typický postup v chráněném kanálku, který je zobou jednodušší, zahrnuje:

a) odtažení víčka,

b) penetraci limbu (průsvitná tkáň, která představuje přechod mezi neprůhlednou bělimou a čirou rohovkou) za účelem vytvoření otvoru do přední komory (ohraničeného barevnou duhovkou a čirou rohovkou pokrývající duhovku) z vnějšku přední části oka,

c) odhrnutí vnějších vrstev spojivky vmiste pod duhovkou a vyříznutí trojúhelníkového bělimového laloku se základnou trojúhelníku na limbu,

d) vniknutí do přední komory ze základny trojúhelníkového bělimového laloku,

e) vyříznutí části vespod ležící trabekulámí tkáně pro vytvoření spojovacího kanálku,

f) vyříznutí malé části duhovky skrze kanálek,

g) uzavření bělimového laloku šitím,

h) uzavření spojivky šitím a

i) injekční aplikaci fyziologicky přijatelné tekutiny, jako je základní solný roztok (basic salt solution, BSS) do přední komory vnějším otvorem procházejícím limbem, který byl vytvořen v kroku b), pro vyzdvihnutí váčku podél limbu za účelem ověření, že kanálek není ucpán a že váček neuniká.

Postup v celé tloušťce se liší vtom, že se pro spojení přední komory se subkonjunktiválním prostorem přes limbus vytvoří přímý otvor bez bělimového laloku. Po odtažení vnějších vrstev spojivky se kanálek vytvoří sklerotomií (vyříznutí okraje tkáně zbělimy na limbu), tepelnou sklerostomií (vyříznutí mělké drážky vbělimě rovnoběžně s povrchem limbu), laserovou sklerostomií nebo trepanací; viz Stewart, „Filtering Surgery Techniques and Operative Complications“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 10, 333-61 (1990).

Po chirurgickém výkonu se pravidelně kontroluje stav filtračního váčku. Zpočátku je kanálek obvykle dosti vysoko nad bělimou. Oči mnoha pacientů vykazují první den po operaci začínající oblast avaskularity ve spojivce, obvykle kolem místa kanálku. Avaskulámí oblast je identifikována jako lokalizovaný úbytek kapilár a cévek. Při vyšetření přední komory však může být přítomno menší zarudnutí ukazující na zánět. IOP v prvním týdnu po operaci je ·· ·· 4 · · 4 · · · • · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · 4 4 444··· • · · · · 4 4

4··· 4444 444 *· ·· 4» obvykle nižší než 5 mm Hg, ale může být i v rozmezí 6 až 10 mm Hg. Po počátečním vyšetření se u pacienta obvykle zahajuje léčba kombinací antibiotik a steroidů; viz Stewart, „Postoperative Complications of Filtering Surgery“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 11, 363-90(1990).

Ve druhém až čtvrtém týdnu po operaci se snižuje zánět spojivky a váčku a přední komora se s poklesem zarudnutí „uklidňuje“. Jako důsledek zajizvení se také váček obvykle poněkud zmenšuje. Navíc váček obvykle dále vykazuje avaskulámí oblast, jejíž velikost se může zvětšit. IOP ve druhém až čtvrtém týdnu po operaci obvykle stoupne na 10 mm Hg nebo více; viz Stewart, „Postoperative Complications of Filtering Surgery“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 11, 363-90 (1990).

Po čtyřech týdnech po operací bez komplikací má obvykle spojivka pouze malý nebo žádný zánět. Dobře fungující váček si typicky uchovává avaskulámí oblast a může být umístěn buď minimálně nebo v dostatečné výšce nad bělimou. IOP se navíc během této doby stabilizuje, ideálně mezi 10 a 15 mm Hg.. Topické postoperativní steroidy se pomalu snižují v závislosti na velikosti zánětu ve filtračním váčku a přední komoře. Pokud zůstává váček vaskulámí a zánětlivý, dávky steroidů se obvykle udržují a někdy zvyšují pro uspíšení zmizení zánětu jakéhokoli předního segmentu, a tudíž omezení tvorby jizev; viz Stewart, „Postoperative Complications of Filtering Surgery“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 11, 363-90(1990).

Během časné pooperačm doby po filtrační chirurgii mohou u pacienta bohužel nastat různé komplikace, z nichž jednou je selhání váčku. U mnoha pacientů dochází během 1 až 6 postoperačních měsíců k selhání váčku a nakonec váček oční tlak nekontroluje. Klinicky mají špatně fungující váčky malý objem, nejsou dost vysoko a dochází u nich alespoň k částečné vaskularizaci a IOP se opět zvýší nad normální rozsah; viz Stewart, „Postoperative Complications of Filtering Surgery“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 11, 363-90 (1990).

Úspěch filtrační chirurgie závisí na tom, jak dlouho po chirurgickém zákroku zůstane váček funkční. Selhání váčku u pacientů obvykle vzniká buď po ucpání místa kanálku nebo po zajizvení rozhraní mezi spojivkou a bělimou. Je-li blokováno místo kanálku, je možno použít jednu z několika metod laserové terapie. I když se tak však otevře kanálek, může být odtok vody omezen v důsledku předchozího zajizvení váčku do bělimy. Pokud tyto postupy selžou a IOP pacienta nelze omezit maximální medikací, může být nutno provést další filtrační chirurgii v jiném místě. Zůstává-li kanálek otevřený, ale váček je malý, je zvýšený • ·

IOP pravděpodobně důsledkem zajizvení mezi spojivkou a bělimou, což je nej obvyklejší příčina selhání váčku; viz Stewart, „Postoperative Complications of Filtering Surgery“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 11,363-90 (1990).

Manipulace s očními tkáněmi, zvláště spojivkou, při filtrační chirurgii nutně způsobuje zánět a nakonec zajizvení. Obecně čím je manipulace větší, tím je kratší doba přežití váčku. Protože filtrační chirurgie u pacientů s vysokým rizikem glaukomu často vyústí v selhání jako výsledek pooperačního zajizvení, zdá se, že v tomto procesu hrají kritickou roli fibroblasty; viz Katz a spol., „Mitomycin C versus 5-Fluorouracil in High-risk Glaucoma Filtering Surgery“, Ophthalmology, 102:9, 1263-68 (1995). Jedním z primárních důvodů selhání při filtrační chirurgii glaukomu je přítomnost fibroblastů v subkonjunktivální tkáni (Berlin a spol., „The Role of Laser Sclerostomy in Glaucoma Surgery“, Current Opinion in Ophthalmology, 6.T02-114 (1995)) a když operace selže, je to obvykle proto, že ve filtračním místě došlo kproliferaci fibroblastů a zajizvení (Mora a spol., „Trabeculectomy with Intraoperative Sponge 5-Fluorouracil“, Ophthalmology, 103:963-70 (1996)).

U tzv. „vysoce rizikových“ pacientů, kde dochází k velkému procentu selhání váčku vlivem fibrózy, někdy pomáhá střídání chirurgie s léčbou pro prodloužení přežití filtračního váčku. Ke snížení zánětu a zajizvení bylo navrženo mnoho metod, které prodlužují funkči filtračního váčku vytvořeného filtrační chirurgií, jako je jednoduchá masáž oka prsty, prováděná periodicky po dobu asi čtyř týdnů po operaci.

Byly vyzkoušeny rovněž farmakologické metody k omezení zajizvoVání pomocí inhibice zánětlivé odpovědi a prevence tvorby kolagenu v určitých stupních jeho syntézy. Pro lepší prevenci zajizvení váčku inhibicí zánětlivé odpovědi a proliferace fibroblastů se často používají kortikosteroidy, buď topicky jako kapky nebo jako subkonjunktivální injekce; viz Stewart, „Filtering Surgery - Techniques and Operative Complications“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 10, 333-61 (1990). V topickém podávání steroidů se obvykle pokračuje, dokud nezanikne zánět předního segmentu; viz Stewart, „Postoperative Complications of Filtering Surgery“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 11, 363-90 (1990). Typický program léčby by mohl předepisovat postoperativní topickou aplikaci každé tři hodiny s rychlým snižováním během 20 dní apod.; viz Araujo a spol., „A Ten-year Follow-up on a Prospective, Randomized Trial of Postoperative Corticosteroids after Trabeculectomy, Ophthalmology, 102:1753-59 (1995).

• · • · · * · · · · · · · · • · ♦ · · ···· • · · · · ·· ······ • · · · · · · ···· ··*· ·»« ·· ** ··

5-Fluoruracil („5-FU“) je fluorovaný pyrimidinový analog s antimetabolickou aktivitou (kompetitivní inhibitor thymidylátsynthasy), kteiý také vykazuje antifibrotický účinek při snižování proliferace fibroblastů, a tak brání vzniku jizev filtračního váčku. 5-FU se typicky používá v případech se špatnou prognózou chirurgie. Při kontrole po 2 letech vykázal 5-FU úspěšnost při filtrační chirurgii mezi 60 a 70 %. 5-FU se obvykle podává v řadě subkonjunktiválních injekcí.

Kromě nepříjemnosti a nepohodlí častých a opakovaných pooperačních injekcí byly u subkonjunktiválního 5-FU hlášeny četné vážné komplikace, zahrnující epiteliální defekty, subepiteliální zajizvení, rohovkové vředy, únik z poraněné spojivky, únik z váčku, suprachoroidální krvácení, odchlípení rohovky a endoftalmitis. I když tedy 5-FU může prodloužit životnost váčku, zůstává díky obecné toxicitě tohoto prostředku vysoký i výskyt epiteliálních defektů rohovky, zajizvení a vaskularizace; viz Stewart, „Filtering Surgery Techniques and Operative Complications“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 10, 333-61 (1990), dále Khaw a spol., „Five-minute Treatments with Fluorouracil, Floxuridine, and Mitomycin Háve Long-term Effects on Human Tenon’s Capsule Fibroblasts“ Arch. Ophthalmol., 770:1150-54 (1992), Kupin a spol., „Adjunctive Mitomycin C in Primary Trabeculectomy in Phakic Eyes“, Am. J. of Ophthalmology, 779:30-39 (1995), a Katz a spol., „Mitomycin C versus 5-Fluorouracil in High-risk Glaucoma Filtering Surgery“, Ophthalmology, 1020, 1263-69 (1995), dále Kay a spol., „Delivery of Antifibroblast Agents as Adjuncts to Filtration Surgery - Part II: Delivery of 5-Fluorouracil and Bleomycin in a Collagen Implant: Pilot Study in the Rabbit“, Ophthalmic Surg., 17:796-801 (1986), a Khaw a spol., „Effects of Inoperative 5-Fluorouracil or Mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery inthe Rabbit“, Ophthalmology, 10006Ί-Ί2 (1993).

Někteří autoři uvádějí, že otoku rohovky vlivem neúmyslné nitrooční expozice je možno zabránit použitím nižší koncentrace 5-FU, například 0,5 ml 10 mg/ml 5-FU, při obvyklých subkonjunktiválních injekcích; viz Chalfin a spol., „Comeal Endothelial Toxic Effect Secondary to Fluorouracil Needle Bleb Revision“, Arch. Ophthalmol., 773:1093-94 (1993). Jiní uvádějí, že použití 5-FU může být bezpečnější a účinnější při intraoperativní aplikaci s použitím houby nasáklé 50 mg/ml sloučeniny a jejím kontaktem s místem váčku po krátkou dobu; viz Mora a spol., „Trabeculectomy with Intraoperative Sponge 5-Fluorouracil“, Ophthalmology, 703:963-970 (1996). I tehdy jsou však v některých případech nutné

I · · · · · • ·· dodatečné postoperativní injekce, které jsou stále spojeny s nežádoucím vysokým výskytem poškození epitelu rohovky.

Desoxyribosylovaný cukr fluoruracilu, floxuridin, je při dlouhodobé inhibici očních fibroblastů asi lOOkrát účinnější než fluoruracil a může být proto podáván v jedné dávce. Rozdíl v případě usmrcení buněk místo jejich inhibice je však relativně malý. Proto je v případě použití floxuridinu nebezpeční expozice normálních tkání relativně vysokým dávkám potenciálně cytotoxických látek; viz Khaw a spol., „Five-minute Treatments with Fluorouracil, Floxuridine, and Mitomycin Háve Long-term Effects on Human Tenon’s Capsule Fibroblasts“, Arch. Ophthalmol., 110:1150-54 (1992).

Podobné účinky byly pozorovány u mitomycinu nebo mitomycinu C („MMC“). Protože je účinnější než 5-FU, může být mitomycin rovněž podán v jedné intraoperativní aplikaci, typicky s dobou kontaktu asi 1 až 5 min s následným hojným výplachem. MMC je alkylační antiproliferativní prostředek, izolovaný z fermentačního filtrátu určitého druhu Streptomyces. Jedná se o antifibrotické antineoplastické antibiotikum, které brání zajizvení filtračních váčků tím, že inhibuje proliferaci fibroblastů. Je obvykle účinné při snižování postoperativní subkonjunktivální fibrózy, a tudíž vede k prodloužení doby přežití filtračních váčků a ke snížení IOP.

MMC je však ve vysokých koncentracích také cytocidní a vyvolává až u 1/3 ošetřených pacientů nežádoucí oční hypotonii (IOP nižší než 5 nebo 6 mm Hg). Dalšími nežádoucími vedlejšími účinky jsou únik ranou ve spojivce, odchlípení cévnatky a hypotonická makulopatie s asi 25% pravděpodobností pozdního nástupů úniků z váčku; viz Khaw a spol., „Five-minute Treatments with Fluorouracil, Floxuridine, and Mitomycin Háve Long-term Effects on Human Tenon’s Capsule Fibroblasts“, Arch. Ophthalmol., 770:1150-54 (1992), Zacharia a spol., „Ocular Hypotony after Trabeculectomy with Mitomycin C “, Am. J. of Ophthalmology, 116:314-26 (1993), Kupin a spol., „Adjunctive Mitomycin C in Primary Trabeculectomy in Phakic Eyes“, Am. J. of Ophthalmology, 119:30-39 (1995), Katz a spol., „Mitomycin C versus 5-Fluorouracil in High-risk Glaucoma Filtering Surgery“, Ophthalmology, 102:9, 1263-69 (1995), Shin a spol., „Adjunctive Subconjunctival Mitomycin C in Glaucoma Triple Proceduře“, Ophthalmology, 102:10,1550-58 (1995), Nouri-Mahdavi a spol., „Outcomes of Trabeculectomy for Primary Open-angle Glaucoma“, Ophthalmology, 102:12, 1760-69 (1995) a Mora a spol., „Trabeculectomy with Intraoperative Sponge 5Fluorouracil“, Ophthalmology, 103:963-10 (1996). Jedna skupina výzkumníků zaznamenala

A A

AAAA AAAA

AAA

A po topickém ošetření MMC během trabekulektomie dokonce zvýšený výskyt skleritidy doprovázené intenzivní bolestí a zarudnutím bělimy; viz Fourman, „Scleritis after Glaucoma Filtering Surgery with mitomycin C“, Ophthalmology, 102:10, 1569-71 (1995), dále Liang a spol., „Comparison of Mitomycin C and 5-Fluorouracil on Filtration Surgery Success in Rabbit Eyes“, J. Glaucoma, 7:87-93 (1992).

Další vědci popsali použití laserové sklerostomie spolu s aplikací buď 5-FU nebo MMC. Zatímco použití 5-FU, aplikovaného během dvou týdnů po laserovém ošetření, bylo popsáno jako úspěšné, viz Berlin a spol., „The Role of Laser Sclerostomy in Glaucoma Surgery“, Current Opinion in Ophthalmology, 6.11, 102-114 (1995), bylo předpokládáno, že použití MMC aplikovaného různými kanály (subkonjunktivální injekce, subkonjunktivální gelová pěna, topické kapky nebo absorpční houbička) spolu s laserovým ošetřením může být ještě účinnější. Byly však také zaznamenány obvyklé komplikace, tj. komeální toxicita, únik z rány, chronická hypotonie, odchlípení cévnatky a hypotonická makulopatie.

K inhibici síťování kolagenových vláken se používá beta-aminopropionitril („BAPN‘j a D-penicilamin, které mohou napomoci udržovat kolagen po filtrační chirurgii v nezralém stavu a tak omezit zajizvování váčku. Počáteční zpráva o postoperativní aplikaci topické masti BAPN uvádí, že u 74 % pacientů byl IOP udržen pod 22 mm Hg. Studie na zvířatech s použitím jak BAPN, tak D-penicilaminu však vykázaly pouze omezenou účinnost; viz Stewart, „Filtering Surgery - Techniques and Operative Complications“, Clinical Practice of Glaucoma, kap. 10, 333-61 (1990).

Diskusi kbleomycinu viz Khaw a spol., „Effects of Inoperative 5-Fluorouracil or Mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit“, Ophthalmology, 10036Ί-Ί2 (1993). Diskusi k polymerům impregnovaným cytosinarabinosidem viz Lee a spol., „Effects of Cytosine Arabinoside-impregnated Bioerodible Polymers on Glaucoma Filtration Surgery inRabbits“, J. Glaucoma, 2:96-100 (1993).

Fotodynamická terapie

Fotodynamická terapie (photodynamic therapy, „PDT“) je známa jako uznávaná metoda léčby nádorů, která může být použita pro mnoho účelů, jako je léčba solidních tumorů (například patenty USA č. 4,932.934 a 5,283.255), rozrušování cílů v krvi, jako jsou leukemické buňky, imunoreaktivní buňky (patentové přihlášky USA č. 07/889,707, 08/309,509, 08/374,158 a 08/174,211) a nežádoucí mikroorganismy (patent USA č.

• 0 0 0 0 0 0 0 00 0 000 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 0 0 00 000000 • 0 0 0 0 0 0 00000000 000 00 00 00

5,360.734), prevence restenózy (patent USA č. 5,422.362); diagnostika a léčba určitých neovaskulámích očních poruch (patentové přihlášky USA č. 08/209,473, 08/390,591 a 08/613,420); odstraňování aterosklerotických plátů (patentová přihláška USA č. 08/663,890) a prevence odmítání transplantátů (patentová přihláška USA č. 08/371,707).

PDT spočívá v lokální nebo systémové aplikaci fotosensitivního prostředku absorbujícího světlo, obvykle porfyrinového derivátu, který se selektivně hromadí v cílových tkáních. Při ozáření viditelným světlem o aktivační vlnové délce vznikají v buňkách obsahujících fotosensibilizátor reaktivní kyslíkaté látky, které podporují odumírání buněk. Například při léčbě nádorů se má za to, že proces fotosensibilizace vede ke vzniku singletového kyslíku, což je aktivovaný derivát molekulárního kyslíku, který může oxidativně reagovat s různými specifickými místy v buňkách a ve tkáních. V důsledku toho dochází k ireversibilnímu poškození nádorových buněk na subcelulámí úrovni, zejména v buněčné membráně a mitochondriích. Destrukce nádorů in vivo je výsledkem složité souhry několika faktorů ovlivňujících kostru pojivové tkáně, která fyzicky podepírá trámčinu nádoru a vaskulámí tkáň, která vyživuje nádor; viz Zhou, „Mechanisms of Tumor Necrosis Induced by Photodynamic Therapy“, J. of Photochem. and Photobiol., B: Biology, 3,299-318 (1989).

Je zřejmé, že fotosensibilizátory jsou přednostně pohlcovány nádorovou tkání a hromadí se v ní a že určitá nekróza buněk nádorové trámčiny je selektivně a přímo vyvolávána PDT. Při nekrotizačním procesu v nádoru vyvolaném PDT však také dochází k vaskulámímu poškození a následné anoxii nádorových buněk. Zejména v tomto posledním případě se nekróza nádorů vyvolaná PDT považuje za výsledek akutní zánětlivé reakce na fyziologické změny ve vaskulámí stěně. Rychlý pokles dodávky krve, stejně jako nástup otoku v nádoru, vede khypoxii nebo dokonce k anoxii neoplastických buněk poškozených světlem, které nakonec podléhají nekróze. Celkový destrukční proces je násoben uvolňováním vasoaktivních nebo tkáň rozkládajících látek, jako je histamin, proteasy a kyselé fosfatasy ze světlem poškozených žímých buněk a neutrofilů v trámčině nádoru, které jsou také spojeny se zánětlivými procesy; viz Zhou, „Mechanisms of Tumor Necrosis Induced by Photodynamic Therapy“,/. of Photochem. and Photobiol., B: Biology, 3,299-318 (1989).

Uznává se, že akutní zánětlivá fáze, obvykle vyvolávaná pomocí PDT při schválených postupech léčby nádorů, je dvojsečná zbraň. Studium experimentálních modelů nádorů ukázalo, že po aplikaci PDT proniká do extracelulámích buněk exsudát bohatý na proteiny a neutrální lipidy a hromadí se u „stěny“ z perinekrotických živých buněk („hypoxické buňky“), ·· · ·· ·· »· • · · fr · · · · « · · · « · · · · · · « · • · · ······· ··« • · · · · · · ··*· ···· ··· ·· ·· ·· které jsou nalepovány na „duchy“ nekrotických buněk. Z hlediska pozitivní perspektivy léčby nádorů může zánětlivý exsudát napomoci dopravě fotosensibilizátorů vázaných na proteiny do vnitřních oblastí nádoru, kterých by jinak bylo obtížné dosáhnout. Na druhé straně může toto proudění zánětlivého exsudátu také přinášet kyslík a jiné živiny a tak pomáhat vyživovat buňky účastnící se procesů hojení ran. Výskyt zánětlivého stavu spojeného s PDT se proto považuje za životní skutečnost, která často komplikuje léčbu rakovinných nádorů; viz Freitas, „Inflammation and Photodynamic Therapy“, J. Photochem. and Photobiol., B: Biology, 8: 340-41 (1991).

PDT byla podrobena výzkumům za účelem dosažení antifibrózního účinku v souvislosti s filtrační chirurgií glaukomu s použitím cínethyletiopurpurinu („SnET2“) jako fotosensibilizátorů. Konkrétně byli králíci, kteří dostávali subkonjunktivální injekce SnET2, podrobeni filtrační chirurgii s následným pooperačním ozářením světlem; viz Hill a spol., „Photodynamic Therapy with Tin Ethyl Etiopurpurin as an Alternativě Anti-fibrotic Treatment Following Glaucoma Filtering Surgery“, Photochem. Photobiol, 61 dod., 68S, TPM-E9 (1995), a Hill a spol., „Photodynamic Therapy (PDT) for Antifibrosis in a Rabbit Model of Filtration Surgery“, Investigative Ophthalmology and Visual Science, 36Ά, S877 (1995). V těchto předchozích pracích však autoři neuvádějí žádné kontrolní údaje, takže je obtížné zjistit, nakolik ošetření podle Hilla a spol. skutečně prodloužilo životnost filtračního váčku oproti neošetřeným váčkům.

Hill a spol. kromě toho uvádějí, že po injekci fotosensitivního prostředku uběhly více než tři hodiny než byl vykonán chirurgický zákrok a ozařování, což mohlo poskytnout dost času k absorpci fotosensibilizátorů tkáněmi souvisejícími s poraněním, ale mohlo také umožnit fotosensibilizačnímu prostředku rozšířit se do jiných necílových oblastí oka. Protože autoři uvádějí, že vzniky velké přechodné oblasti avaskulámí spojivky, přičemž avaskulámí oblast byla omezena na filtrační váček až po čtyřech týdnech od zákroku, je zřejmé, že ošetřením byly nežádoucím způsobem zasaženy velké oblasti oka. Vzhledem ke známému potenciálně destruktivnímu nekrotickému účinku PDT v jiných aplikacích existuje potřeba snížení nebo prevence zánětu takovým způsobem, aby bylo možno spolehlivě kontrolovat stupeň a rozsah farmakologické aktivity.

ΦΦ *» • φ φ · φ φ φ

Φ C Φ φ φ φφφ φφφφφ φ φφ ·« φφ φ φ φφφφ ♦ φ φφφφ φ φ * φφφ φφφ φ φ φ φ φφ φφ φφ

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že při vhodném výběru fotosensibilizačního prostředku, který je rychle absorbován poškozenými tkáněmi, ale v nepřítomnosti světla je netoxický, může mít PDT předvídatelný a prospěšný protizánětlivý účinek, který je příznivý i pro choulostivé tkáně, jako je oblast oka. Je to zvláště překvapivé zjištění vzhledem k dřívějším poznatkům, že PDT je ve skutečnosti odpovědná za vyvolání zánětlivých odpovědí místo aby je snižovala nebo jim zamezovala.

Konkrétně bylo nyní zjištěno, že účinky zánětu vznikajícího v poraněné tkáni mohou být omezeny nebo jim může být zabráněno aplikací nízkých dávek PDT. Způsob snižování nebo prevence takového zánětu podle vynálezu konkrétně spočívá v tom, že

a) poraněná tkáň nebo tkáň před poškozením se uvede do styku s fotosensibilizačním prostředkem schopným proniknout do tkáně pro dosažení požadovaného stupně biodistribuce za dobu menší než 1 hodina a

b) tkáň takto uvedená do styku se vystaví světlu o vlnové délce absorbované fotosensibilizačním prostředkem na dobu dostačující k omezení nebo prevenci zánětu ve vystavené tkáni, avšak nikoli tak dlouhou, aby způsobila nekrózu nebo erythem vystavené tkáně.

Způsob podle vynálezu je zvláště výhodný, je-li poraněná tkáň vysoce citlivá vůči dalšímu poškození nebo zánětu, jako je oční tkáň, protože příslušné fotosensibilizátory nemají samy o sobě v nepřítomnosti aktivačního záření antiproliferativní nebo cytotoxický účinek vůči jemným tkáním. Protože je dále většina fotosensibilizačních prostředků netoxická pro lidskou tkáň, pokud nejsou aktivovány světlem, a protože fotosensibilizaění prostředek podle vynálezu je schopen poměrně rychlé penetrace do poškozené tkáně, dá se stupeň farmakologické účinnosti snadno kontrolovat jak rozsahem ozáření, tak buď rozsahem fyzikálního kontaktu s fotosensibilizátorem nebo jeho koncentrací, například v krevním řečišti, v době ozáření. V důsledku toho se terapeutický účinek vynálezu reguluje snadněji než v případě známých farmako logických antifibrotických metod.

V dalším provedení se vynález týká přípravku pro omezení nebo prevenci účinků zánětu vzniklého v poraněné tkáni, zahrnujícího • · • · • · · · · · · · ···· • · · · · · · · · • · r · · · β ··· ··· • · · · · · ·

............. ·♦ ··

a) asi 1 pg/ml až asi 2 mg/ml fotosensibilizačního prostředku schopného proniknout do poraněné tkáně nebo do tkáně před poraněním s důsledkem požadovaného stupně biodistribuce za méně než 1 hodinu a

b) farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším provedení se vynález týká nástroje pro omezení nebo prevenci účinků zánětu vzniklého v poraněné tkáni, zahrnujícího

a) fotosensibilizační prostředek schopný proniknout do poraněné tkáně nebo do tkáně před poraněním s důsledkem požadovaného stupně biodistribuce za méně než 1 hodinu a

b) absorpční aplikátor.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 graficky znázorňuje procentický podíl přežití filtračních váčků u králíků v každé ze čtyř skupin.

Obr. 2 graficky znázorňuje rozdíly mezi skupinami s ohledem na rozsah váčku každý den vyšetření až do 12. pooperačního dne.

Obr. 3 graficky znázorňuje rozdíly mezi skupinami s ohledem na výšku váčku každý den vyšetření až do 12. pooperačního dne.

Obr. 4 graficky znázorňuje rozdíly v erythemu spojivky nad filtračním váčkem každý den vyšetření až do 12. pooperačního dne.

Obr. 5 znázorňuje vzorce typických zelených poríyrinů vhodných pro způsoby, přípravky a nástroje podle vynálezu.

Obr. 6 znázorňuje strukturu čtyř sloučenin typu BPD zvláště vhodných jako fotosensibilizační prostředky podle vynálezu.

Výraz „zánět“ se zde vztahuje na řadu změn, která probíhá v živém organismu po poranění. Poranění může být způsobeno fyzikálními prostředky, jako je nadměrné horko nebo chlad, tlak, ultrafialové nebo ionizující záření, řezné rány nebo oděrky; různými anorganickými nebo organickými chemickými látkami nebo biologickými činiteli jako jsou viry, bakterie a další parazité.

• · ·

Fotosensibilizační prostředek „Fotosensibilizační prostředek“ je chemická sloučenina, která, je-li vystavena světlu o vlnové délce, která může být fotosensibilizátorem absorbována, absorbuje světelnou energii, což vede k žádoucímu fyziologickému účinku, například k řízenému protizánětlivému účinku. Fotosensibilizační prostředky podle vynálezu mají výhodně absorpční spektrum v rozmezí vlnových délek mezi 350 a 1200 nm, kteréžto spektrum může být známým způsobem upraveno na požadovanou penetraci, výhodně mezi asi 400 a 900 nm, zejména mezi 600 a 800 nm.

Další vlastností obecně fotosensibilizátorů, která má praktický význam při provádění vynálezu, je relativní absence toxicity vůči buňkám v nepřítomnosti fotochemického efektu a snadná clearance z tkání v nepřítomnosti cílově specifické interakce mezi jednotlivými buňkami a fotosensibilizátorem.

Fotosensibilizátorem podle vynálezu může být jakýkoli fotosensibilizační prostředek vhodný pro fotodynamickou terapii („PDT“), který je schopen proniknout do poškozené tkáně, která má být ošetřena, a vyvolat požadovaný stupeň biodistribuce za méně než 1 hodinu. Zdaje u potenciálního fotosensibilizátorů toto kriterium splněno, lze snadno a rychle zjistit tímto jednoduchým testem:

1. Připravit živou kulturu buněk (výhodně ze suspenzně pěstované kultury; vhodná je jakákoli buněčná linie).

2. Přidat testovaný fotosensibilizátor k buňkám v koncentraci 1 až 3 pg/ml v přítomnosti 10 % séra.

3. Odstranit odstředěním přebytečný fotosensibilizační prostředek po různých dobách inkubace (například 5, 15, 30 a 60 min).

4. Promýt buňky fosfátem tlumeným fyziologickým roztokem a lyžovat je zmrazením a rozmražením.

5. Stanovit koncentraci testovaného fotosensibilizátorů v buněčných lyzátech na základě fluorescence proti vhodným standardům.

Zvláště účinná skupina fotosensibilizátorů zahrnuje zelené porfyriny, které jsou podrobně popsány v patentu US č. 5,171.749 (Levý a spol.), vydaném 15.12.1992. Výraz

• 0 · · · · · · • · · 0 00 000000 • 00 0 000· „zelené porfyriny“ se vztahuje na porfyrinové deriváty, získané reakcí porfyrinového jádra s alkinem reakcí Diels-Alderova typu za vzniku monohydrobenzoporfyrinu. Typicky se zelené porfyriny volí ze skupiny porfyrinových derivátů získávaných Diels-Alderovými reakcemi acetylenových derivát s protoporfyrinem za podmínek, které podporují reakci na pouze jedné ze dvou dostupných konjugováných nearomatických dienových struktur přítomných v kruhových systémech protoporfyrinu IX (kruhy A a B).

Několik struktur typických zelených porfyrinů je znázorněno na obr. 5. Diels-Alderova reakce vede nejprve ke vzniku cyklohexadienu - označovaného zde jako „hydrobenzo“ konjugovaného kpyrrolovému kruhu A nebo B, jak znázorňují vzorce 1 a 2 na obr. 5. Přesmyk π systému v hexadienovém kruhu vede ke vzniku sloučenin vzorce 3 a 4 a redukcí vzniknou sloučeniny vzorce 5 a 6. Z praktických důvodů se však sloučeniny vzorce 5 a 6 vyrábějí výše uvedenou Diels-Alderovou reakcí tak, že obvyklá acetylenová sloučenina je nahrazena odpovídajícím olefmem a vzniká více redukovaná verze výsledné struktury porfyrinového kruhu. Tyto sloučeniny jsou znázorněny vzorci 1 až 6, přičemž dusíky vnitřního kruhu okupuje vodík. Je však nutno mít na paměti, že je možno používat i formy, kde je jeden nebo oba tyto vodíky nahrazeny kovovým kationtem. Příprava zelených porfyrinových sloučenin vhodných pro provedení vynálezu je podrobně popsána v patentu US č. 5,095.030.

Z důvodu pohodlí se pro označení sloučenin vzorce 3 a 4 na obr. 5 obvykle používá zkratka termínu hydromonobenzoporfyrinového derivátu - „BPD“. Sloučeniny vzorců 3 a 4 a jejich směsi jsou zvlášť výhodné.

Jak je patrné z obr. 5, R¹, R², R³ a R⁴ jsou neinterferující substituenty, které významně neovlivňují účinnost sloučeniny ve způsobu a přípravku podle vynálezu. Konkrétně se výraz „neinterferující substituenty“ používá k označení substituentů, které nenarušují schopnost zeleného porfyrinů působit jako fotosensibilizátor schopný absorpce poškozenou tkání a vyvolání farmakologického účinku za méně než 1 hodinu. Pro sloučeniny na obr. 5 a 6 obecně představují substituenty R a R každý nezávisle substituent odebírající elektrony nebo jakýkoli jiný aktivující substituent, který odebírá elektrony dostatečně na to, aby zvyšoval rychlost Diels-Alderovy reakce, která může probíhat jak na kruhu A, tak B, ale přednostně probíhá pouze v jednom kruhu. Jako příklady vhodných skupin R¹ a R² je možno uvést karbalkoxy (2-6C), alkyl (1-6C), sulfonyl nebo aryl(6-10C)sulfonyl, aryl(6-10C)kyano a CONR⁵CO-, kde R⁵ je aryl (6-10C) nebo alkyl (1-6C). Jedním ze substituentů R¹ a R² může • · • · «· < « · ·· · • · · · · · · • · «· · · · · · · • · « « · ··· · · · · ·· být také vodík, pokud druhým je elektrony odnímající substituent o síle dostačující k usnadnění Diels-Alderovy reakce. Obvykle představují R a R karbalkoxyskupiny, výhodně 1 o methyl- nebo ethylkarboxyestery. Výhodné jsou ty sloučeniny, kde R a R jsou stejné a představují karbalkoxy, zejména karbethoxy.

Zde používaný výraz „karboxy“ má obvyklý význam, tj. -COOH, zatímco „karbalkoxy“ představuje -COOR, kde R je alkyl. „Karboxyalkyl“ označuje substituent -R’COOH, kde R’ je alkylen. „Karbalkoxyalkyl“ znamená -R’-COOR, kde R’ je alkylen a R je alkyl nebo alkanol. „Alkyl“ obecně představuje nasycenou uhlovodíkovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem o 1 až 6 uhlíkových atomech, jako je methyl, n-hexyl, 2methylpentyl, terc.butyl, n-propyl atd. „Alkylen“ je totéž co alkyl s tou výhradou, že tato skupina je dvoj vazná a nikoli jedno vazná. „Aryl“ představuje aromatickou cyklickou skupinu, jako je fenyl, naftyl, pyridyl apod. Aryiová skupina podle vynálezu je popřípadě substituována 1 až 3 substituenty, které mohou být nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, jako je fluor, chlor, brom nebo jod, nižší alkyl (1-4C) a nižší alkoxy (1-4C). „Aryl-,, nebo „alkylsulfonylové“ skupiny mají vzorec -SO2R, kde R je alkyl nebo aryl, jak jsou definovány výše.

o

R nezávisle představuje ω-karboxyalkylovou skupinu (2-6C) nebo její sůl, amid, ester nebo acylhydrazon, a nebo znamená alkyl (1-6C). Výhodně představuje R² 2-karboxyethyl nebo jeho alkyl- nebo alkanolester a R⁴ je vinyl. Většině z těchto provedení se však dává přednost z důvodu dostupnosti přírodních poríyrinů spíše než na základě úvah o biologické účinnosti. Jak je znázorněno na obr. 5, adukty vzniklé reakcí R^-C^C-R² s kruhovým systémem protoporfyrinu IX (kde R je chráněná forma 2-karboxyethylu, jako je 2karbomethoxyethyl nebo 2-karboethoxyethyl, a R⁴ je -CH=CH2) jsou sloučeniny vzorců 1 a 2. Sloučeniny vzorce 1 vznikají adicí na kruh A a sloučeniny vzorce 2 vznikají adicí na kruh B.

Výhodné výchozí látky pro zelené porfyriny podle vynálezu zahrnují v přírodě se vyskytující porfyriny, kde R³ je buď -CH2CH2COOH, -CH2CHRCONR2 nebo -CH2CHRCOOR, kde R je alkyl (1-6C) nebo alkanol (1-6C). Přesná povaha R³, pokud ovšem neobsahuje π-vazbu konjugovanou s kruhovou π-vazbou, obvykle není relevantní pro průběh Diels-Alderovy reakce nebo pro účinnost vzniklého produktu. R³ tedy může znamenat kteroukoli z rozmanitých skupin, jako je například nižší alkyl (1-4C) a ω-karboxyalkyl (2-6C) a jeho estery a amidy. Substituent R může být také substituován hydroxyskupinou, halogenem, jako je fluor, chlor, brom nebo jod, nebo jinými nereaktivními substituenty.

·· · ·· ·· ·· • · · · 4 4 4 · · » · · • · 4 4 4 4 4 4 4 « 4 4 44 44 444444

4 4 4 4 4 4

44444444 444 ·4 »4 44

Pokud R³ představuje -CH₂CHR-COOR, ukázalo se výhodným esterifikovanou karboxyskupinu hydrolyzovat nebo parciálně hydrolyzovat. Typicky probíhá hydrolýza v poloze R³ výhodně mnohem větší rychlostí než u esterových skupin R¹ nebo R². Rozpustnost a biodistribuce u výsledných sloučenin mají navíc více žádoucí charakteristiky než u něhydrolyzovaně formy. Produkty hydrolýzy jsou dikyseliny nebo monokyseliny (nebo jejich soli).

Ve sloučeninách vzorce 1 a 2 představuje R⁴ obvykle alespoň z počátku -CH=CH₂, ale tato vinylová skupina je snadno derivatizována na jiná provedení R⁴ adicí nebo oxidací vinylového substituentu v kruhu B nebo A ve vzorci 1, resp. 2. R⁴ tedy může znamenat kterýkoli z různých substituentů, které jsou konsistentní se vznikem snadnou adiční reakcí. Exemplární adiční činidlo může být například ve formě HX, kde H je adován na uhlík sousedící s kruhem, přičemž v poloze R⁴ vznikne struktura

-CHCH₃

I x

V jednom provedení je tedy jedním z adováných substituentů vodík a druhý je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, halogen, jako je fluor, chlor, brom nebo jod, hydroxy, nižší alkoxy, amino, amid, sulfhydryl nebo organosulfid. Například Markovnikovova adice vody poskytuje v relevantním kruhu strukturu substituentů analogickou hematoporfyrinovému kruhovému systému. Je také možno vinylovou skupinu oxidovat a získat jako substituent v poloze R⁴ skupinu -CH2OH, -CHO nebo -COOH nebo její soli nebo estery. Adiční nebo oxidační produkty samy mohou být také substituovány, jsou-li ado vánými substituenty funkční odstupující skupiny. Například je-li substituentem Br, může být nahrazen takovými skupinami, jako je -OH, -OR, kde R je výše uvedený alkyl (1-6C), halogen, -NH3, -NHR, -NR2 apod.

Obecně tedy R⁴ představuje jakýkoli substituent, v nějž se snadno přemění vinylová skupina -CH=CH2 odštěpením nebo adicí, a další substituenty vzniklé reakcí dobře odstupujících skupin s dalšími skupinami. Výhodně však R⁴ představuje vinyl (-CH=CH2), -CHOŘ , kde R je H nebo alkyl (1-6C), popřípadě substituovaný hydrofilním substituentem, jako je -CH2OH, -CHO, -COOR⁴’, jako je COOH nebo -COOCH3, -CH(OR⁴’)CH3, jako je -CH(OH)CH₃ nebo -CH(OCH₃)CH₃, -CH(OR⁴’)CH2OR⁴’, -CH(OH)CH2OH, -CH(SR⁴’)CH3, jako je -CH(SCH3)CH3 a jeho disulfid, -CH(NR⁴’)CH3, -CH(CN)CH₃, » · 4 k * · ··« «

-CH(pyridiniumbromid)CH₃, -CH(COOR⁴’)CH3, -CH(COOCR⁴’)CH3, -CH₂(halo)CH₃, jako je -CHBrCH₃, nebo -CH(halo)CH₂(halo). Alternativně může být R⁴ organická skupina s méně než 12 uhlíkovými atomy vzniklá přímou nebo nepřímou derivatizací vinylu. R⁴ může také poskytovat další porfyrinový nebo příbuzný kruhový systém, jako je skupina obsahující 1 až 3 jádra dále definovaného tetrapyrrolového typu vzorce -L-P. Výhodné jsou sloučeniny, kde R⁴ je -CH=CH₂, -CH(OH)CH₃, -CH(halo)CH₃ nebo skupina obsahující 1 až 3 jádra dále definovaného tetrapyrrolového typu vzorce -L-P.

Zde používaný výraz Jádro tetrapyrrolového typu“ představuje čtyřkruhový systém se skeletem

COjH

CO₂H který je silně konjugovaný, nebo jeho sůl, ester, amid nebo acylhydrazon. Zahrnuje porfyrinový systém, což je ve skutečnosti kompletně konjugovaný systém, chlorinový systém, což je vlastně dihydroforma porfyrinu, a redukovaný chlorinový systém, což je tetrahydroforma konjugovaného porfyrinového systému. Je-li uveden konkrétně „porfyrin“, má se na mysli kompletně konjugovaný systém. Zelené porfyriny jsou ve skutečnosti dihydroforma porfyrinového systému.

V jednom provedení zahrnuje substituent R⁴ alespoň jedno další jádro tetrapyrrolového typu. Výsledné sloučeniny podle vynálezu jsou dimery nebo oligomery, v nichž alespoň jeden kruhový systém tetrapyrrolového typu je zelený porfyrin. Vazba mezi skupinou zeleného porfyrinu v poloze R⁴ a dalším kruhem tetrapyrrolového typu může být etherová, aminová nebo vinylická. Porfyrinové kruhové systémy mající dvě polohy dostupné pro substituci (v kruhu A i B) odpovídající R⁴ mohou být dále derivatizovány, jak je vysvětleno níže.

Jestliže R⁴ znamená „-L-P“, je význam -L- vybrán ze skupiny zahrnující a) -CH-O-CHCH₃ ch₃

b)

c)

d)

e)

f)

-CHNHCHI I ch₃ ch₃

-CH=CH-CHI ch₃

-CH-CH=CHI ch₃ =CH-C-CHII I o ch₃

-CH-C-CH=

CH₃ O a P je porfyrinová struktura nebo druhý zelený porfyrin vzorce 1 až 6, znázorněného na obr. 5, s tou výhradou, že jakákoli druhá skupina R⁴ je nahrazena výše uvedenou skupinou.

(Je dále nutno zdůraznit, že má-li -L- výše uvedený vzorec (e) nebo (f), má kruhový systém, na nějž je vázána dvojná vazba, resonanční systém odpovídající

v kruhu, na nějž je vázána dvojná vazba.) • · ·· · 4 4 ·· 4 4 • 4 · 4 4 · * 4 · · · 4 • 4 4 4 · 4 · 4 4

4 4 4« 44 444444

44444

4444 4444 4·4 44 44 44

Hydro-monobenzoporfyriny, které vznikají přímo výše popsanou Diels-Alderovou reakcí, mohou být isomerizovány na BPD sloučeniny vzorce 3 a 4 na obr. 5. Znázornění sloučenin 3 a 4 na obr. 5 neukazuje relativní polohu exocyklické methylové skupiny (kruh A

A ve vzorci 3 a kruh B ve vzorci 4) vzhledem k substituentu R . Dostupné jsou oba isomery. Sloučeniny vzorce 3 a 4 jsou pro způsoby a přípravky podle vynálezu zvlášť výhodné.

Diels-Alderovy produkty mohou být dále selektivně redukovány působením vodíku v přítomnosti katalyzátoru, jako je palladium na aktivním uhlí, za vzniku analogů s nasyceným kruhem, znázorněných vzorci 5 a 6 na obr. 5, které odpovídají příslušným DielsAlderovým produktům kruhů A a B. Jak je vysvětleno výše, je však v praxi obvyklejší provádět Diels-Alderovu reakci solefinickou výchozí látkou místo obvyklé acetylenické výchozí látky za účelem získání více redukované formy vzniklého porfyrinového kruhového systému. Popis uvedený výše pro sloučeniny vzorců 1 a 2, týkající se derivatizace přeměnou zbylého vinylového substituentu (R⁴) a s ohledem na variabilitu R³, se vztahuje také na sloučeniny vzorců 3,4, 5 a 6.

Výhodná provedení zelených porfyrinů podle vynálezu jsou ta, v nichž je DielsAlderův produkt podroben přesmyku a částečně hydrolyzován. Ještě výhodnější jsou sloučeniny vzorců 3 a 4 (BPD), kde karbalkoxyskupiny v polohách R³ byly také hydrolyzovány nebo částečně hydrolyzovány. Sloučeniny podle vynálezu, které obsahují -COOH mohou být připraveny buď jako volná kyselina nebo ve formě solí s organickými nebo anorganickými bázemi.

Obr. 6 znázorňuje čtyři zvláště výhodné sloučeniny podle vynálezu pokryté vzorci 3 a 4, které se souhrnně označují jako deriváty benzoporfyrinu, tj. BPD-DA, BPD-DB, BPD-MA a BPD-MB. Jsou to hydrolyzované nebo částečně hydrolyzované formy přesmyknutých produktů vzorce 3 a 4, kde byla jedna nebo byly obě chráněné karboxylové skupiny R³ hydrolyzovány. Esterové skupiny v R a R hydrolyzují relativně pomalu, takže konverze na formy znázorněné na obr. 6 probíhá snadno. Nejvýhodnější z těchto zelených porfyrinových sloučenin je PBD-MA.

Na obr. 6 je R³ -CH2CH2COOR³, kde R³ se v jednotlivých sloučeninách liší. Konkrétně v BPD-DA jsou R a R karbalkoxy, R je vodík a derivatizace je na kruhu A. BPD-DN je odpovídající sloučenina s derivatizací v kruhu B. BPD-MA představuje částečně hydrolyzovanou formu BPD-DA a BPD-MB Částečně hydrolyzovanou formu BPD-DB.

9 9

9 9

999 999

V těchto posledně uvedených sloučeninách je tedy R¹ a R² karbalkoxy, jedno R³ je vodík a druhé R³ je alkyl (1-6C).

Sloučeniny vzorců BPD-MA a BPD-MB mohou být homogenní, kde je hydrolyzován pouze karbalkoxyethyl kruhu C nebo karbalkoxyethyl kruhu D, nebo se může jednat o směsi hydrolyzátů substituentů kruhů C a D. Ve způsobech a přípravcích podle vynálezu mohou být kromě toho používány směsi kterýchkoli dvou nebo více sloučenin BPD-MA, -MB, -DA a -DB.

Je nutno upozornit, že mnohé ze sloučenin na obr. 5 obsahují alespoň jedno centrum chirality a tudíž mohou existovat jako optické isomery. Způsob podle vynálezu může používat sloučenin s oběma konfiguracemi na chirálním uhlíku, ať jsou dodávány jako izoláty jediného stereoisomeru nebo jde o směsi enantiomerů a/nebo diastereomerů. Dělení směsí diastereomerů může probíhat jakýmkoli konvenčním způsobem. Směsi enantiomerů mohou být děleny jakoukoli obvyklou metodou, například reakcí s opticky aktivním přípravkem a rozdělením vzniklých diastereomerů.

Dále je nutno upozornit, že reakčními produkty mohou být nerozdělené směsi aduktů na kruhu A a B, například směsi sloučenin vzorců 1 a 2 nebo 3 a 4 nebo 5 a 6. Ve způsobech a přípravcích podle vynálezu mohou být používány jak rozdělené formy, například samotná sloučenina vzorce 3 nebo 4, nebo jejich směsi v jakémkoli poměru.

Dále mohou být používány dimemí formy zeleného poríyrinů a dimemí nebo multimemí formy kombinací zelený porfyrin/porfyrin za účelem absorpce většího množství světla na mol. Dimemí a oligomemí sloučeniny podle vynálezu mohou být připravovány s použitím analogických reakcí jako v případě dimerizace a oligomerizace poríyrinů jako takových. Zelené porfyriny nebo spojení zelený porfyrin/porfyrin mohou být získávána přímo nebo se může provádět kondenzace s následnou Diels-Alderovou reakcí jednoho nebo obou koncových poríyrinů za účelem konverze na odpovídající zelené porfyriny.

Farmaceutické přípravky

Fotosensibilizující činidlo podle vynálezu je nej častěji formulováno do farmaceutického přípravku smícháním fotosensibilizačního činidla, typicky při teplotě okolí, vhodném pH a požadovaném stupni čistoty, s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými nosiči, tj. nosiči, které jsou pro příjemce v použitých dávkách a koncentracích netoxické.

• 4

4 · 4 444 4 · 4 ♦ ·

4 4 4 4 4444 « 4 4 44 44 444444

4 4 4 4 4 4 ···.......... *· ··

Vhodné přípravky jsou ty určené pro systémové nebo topické podávání, včetně přípravků pro injekce, transmukosální aplikaci nebo transdermální aplikaci.

Přípravek podle vynálezu výhodně zahrnuje asi 1 pg/ml až asi 2 mg/ml fotosensibilizačního prostředku v závislosti primárně na způsobu podávání. Pro topickou aplikaci se výhodně používá asi 0,1 až asi 2,0 mg/ml. Pro systémovou aplikaci, například intravenózní injekce, se koncentrace fotosensibilizačního prostředku výhodně pohybuje od asi 0,3 do asi 0,5 mg/ml.

Fotosensibilizaění prostředek se výhodně podává v kapalném, gelovém nebo želatinózním pevném farmaceutickém přípravku, buď samotný s vodou nebo spolu s jinými farmaceuticky přijatelnými excipienty, jaké jsou popsány například v Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pennsylvania (ed. Gennaro, 1990). Jeli farmaceutický přípravek obsahující fotosensibilizátor kapalný, může se jednat o suspenzi v

nebo emulzi. Často jsou žádoucí zejména liposomální nebo lipofílní formulace. Fotosensibilizaění prostředek podle vynálezu může být v liposomech zabudován, nanesen na jejich povrchu nebo oběma způsoby. Vhodné metody pro přípravu liposomů jsou známy. Zabudování zelených porfyrinů v takovýchto přípravcích je popsáno například v US patentu ě. 5,214.036 (Allison a spol.), vydaném 25.5.1993, a v patentové přihlášce ě. 08/489.850 (Desai a spol.), podané 13.6.1995. Pokud se používají suspenze nebo emulze, jsou vhodnými excipienty voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol apod. Tyto farmaceutické přípravky mohou dále obsahovat menší množství netoxických pomocných látek, jako jsou smáčedla nebo emulgátory, antioxidanty, tlumiče pH apod.

Hodnota pH přípravku závisí hlavně na konkrétním použití a koncentraci fotosensibilizátoru, ale výhodně se pohybuje od asi 3 do asi 8. Výhodně se fotosensibilizátor udržuje na neutrálním pH (například asi 6,5 až asi 7,5), aby nedocházelo kjeho adhesi na nádoby, kam je ukládán, jak tomu bývá při hodnotách pH přibližujících se fyziologické hladině, a aby byla zajištěna aktivace fotosensibilizátoru. Vhodným provedením je tedy formulace fotosensibilizátoru v roztoku elektrolytu obsahujícím vyvážený solný pufr o pH 6,5, ale bez fetálního hovězího séra („FBS“). Důvodem vynechání FBS je jeho obsah antigenních složek, které by mohly aktivizovat zánětlivou reakci. Pokud dojde k adhesi fotosensibilizačního prostředku na nádoby, v nichž je uchováván farmaceutický přípravek jej obsahující, je možno popřípadě přidávat vhodnou neantigenní přísadu, jako je lidský sérový ·· φφ φ φ φ φ · • φ • · φ φ · φφ φφ φφ φ φ φφφφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ • φ φ φ •Φ φφ φφ albumin, v množství, které neinterferuje s adhesí fotosensibilizačního prostředku na ošetřovanou poraněnou tkáň.

Fotosensibilizaění prostředek může být kombinován s jedním nebo více imunosupresivy pro zvýšení protizánětlivého účinku na poraněnou tkáň. Zde používaný výraz „imunospresivum“ se vztahuje na sloučeniny, které působí tak, že potlačují nebo maskují reakce T-lymfocytů. Patří sem sloučeniny, které potlačují produkci cytokinu, snižují nebo potlačují expresi autoantigenů nebo maskují antigeny MHC.

Jako příklady je možno uvést 2-amino-6-aryl-5-substituované pyrimidiny, azathioprin nebo cyklofosfamid, bromokryptin, glutaraldehyd, antiidiotypické protilátky pro antigeny MHC, cyklosporin A, jeden nebo několik steroidů, výhodně kortikosteroidy a glukokortikosteroidy jako je prednison, methyl prednisolon a dexamethason, protilátky proti interferonu gamma, protilátky proti a faktoru tumorové nekrózy, protilátky proti β faktoru tumorové nekrózy, protilátky proti interleukinu-2, protilátky proti cytokinovým receptorům, například anti-IL-2 protilátky, heterologní anti-lymfocytový globulin, pan-T protilátky, výhodně OKT-3 monoklonální protilátky, protilátky kCD4, streptokináza, streptodomáza nebo RNA nebo DNA z hostitele.

Toto imunosupresivum může doplňovat nebo být používáno v kombinaci ve stejném dávkování jako fotosensibilizaění prostředek nebo ve sníženém dávkování, a může být podáváno současně nebo zvlášť, systémově nebo lokálně. Účinné množství těchto dalších prostředků je do značné míry na terapeutické úvaze a závisí na množství fotosensibilizačního prostředku přítomného ve formulaci, typu poranění, typu imunosupresiva, místě dodání, způsobu aplikace, režimu aplikace a dalších faktorech známých odborníkům. Nicméně je však množství imunosupresiva vhodné pro použití podle vynálezu typicky nižší než množství obvykle doporučované pro ošetření podobně poraněné tkáně.

Používá-li se imunosupresivum, může být podáváno do poraněné tkáně jakýmkoli vhodným způsobem včetně parenterální aplikace, a je-li to žádoucí pro místní imunosupresi, intralesionálně, tj. topicky. Parenterální infuse zahrnuje intramuskulámí, intravenózní, intraarteriální, intraperitoneální, subkutánní a subkonjunktivalní aplikaci.

Má-li se farmaceutický přípravek podle vynálezu aplikován topicky, například má-li být natírán na poraněnou tkáň, může být výhodné použít viskózní roztok, jako je gel, spíše než neviskózní roztok. Tento gel může být připraven například smísením roztoku ·· • · · · • · · · • · · · • ··· ··· • · ·· ·· fotosensibilizačního prostředku s želatinačním prostředkem, jako je polysacharid, výhodně ve vodě rozpustný polysacharid, například kyselina hyaluronová, škroby a deriváty celulózy (jako je methylcelulóza, hydroxyethylcelulóza a karboxymethylcelulóza). Je-li v gelové formulaci přítomen polysacharid, je přítomné množství obvykle v rozmezí asi 1 až 90 % hmotn., výhodně asi 1 až 20 % hmotn. gelu. Příklady dalších vhodných polysacharidů pro tento účel a stanovení rozpustnosti polysacharidů lze nalézt v EP 267 017, zveřejněném 11.5.1988.

Mezi vhodné povrchově aktivní látky patří poloxamerové povrchově aktivní látky, které představují řadu molekul, tvořených blokovými kopolymery ethylenoxidu a propylénoxidu, buď samotné nebo ve směsi s fosfolipidem, jako je vaječný lecithin. Jiným příkladem emulze, komerčně dostupné od Green Cross, je Fluosol-DA 20%, který obsahuje perfluordekalin a perfluortripropylamin, emulgované poloxamerovou povrchově aktivní látkou Pluronic F-68. Emulze perfluorováných sloučenin a jejich účinky na savce jsou úplněji popsány v Bollands a spol., J. Pharm. Pharmacol., 39:1021-24 (1987).

Farmaceutický přípravek podle vynálezu je výhodně sterilní. Sterility se snadno dosáhne sterilní filtrací přes membrány 0,2 pm. Po formulaci a sterilizaci nemusí být přípravek stálý vůči oxidativní denaturaci. Pro skladování jsou však vhodné lyofilizované formulace pro rekonstituci, obsahující BPD.

Způsob uvádění tkáně do styku s fotosensibilizátorem

Omezování nebo prevence zánětů podle vynálezu se provádí relativně přímočarým způsobem uvedením poraněné tkáně (nebo tkáně, která má být poraněna nebo u které dochází k poranění) do styku s fotosensibilizačním prostředkem za podmínek, které umožňují vznik silné asociace mezi fotosensibilizačním prostředkem a cílovou tkání za současné minimalizace koncentrace fotosensibilizátorů, a pokud je to možné, lokalizace oblasti kontaktu na cílovou poraněnou tkáň.

Jsou-li buňky, které mají být chráněny, obsaženy v živém neporaněném živočichovi, může být fotosensibilizátor podáván lokálně nebo systémově. Přitom může být aplikován injekčně, pokud konkrétní provedení injekce umožňuje rychlou clearanci fotosensibilizátorů z organismu. Alternativně může být fotosensibilizátor aplikován topicky nebo enterálně, například natřením nebo nastříkáním na povrch ošetřované tkáně, nebo pomocí náplastí nebo implantátů, které jsou nej častěji odstranitelné po skončení předem stanovené kontaktní doby.

• 0 00 • 0 0 0

0· 00 00 0 · · 0 0 0

0 0 0 0 0

00 000 000

0 0 0 •0 00 00

Jsou-li cílovou tkání, která má být chráněna před zánětem, choulostivé oční tkáně, dává se přednost topické aplikaci, při které je povaha kontaktu s okem lokalizovaná a zvětšuje tak bezpečnostní faktor. Ve zvlášť výhodném provedení se fotosensibilizátor aplikuje nástrojem podle vynálezu, který zahrnuje fotosensibilizátor a absorpční aplikátor. Absorpční aplikátor zahrnuje jakýkoli absorbující materiál, který je sterilní nebo schopný sterilizace, který snadno uvolňuje fotosensibilizátor při styku s poraněnými tkáněmi a který chemicky nereaguje s fotosensibilizačním prostředkem. Příklady vhodných absorpčních aplikátorů jsou houby a ohebné tkaniny nepouštějící vlas. Výhodným absorpčním aplikátorem je houba, například typu Weck cell. Pokud se používá takový aplikátor, je výhodně nasycen farmaceutickým přípravkem podle vynálezu a topicky aplikován na cílové tkáně během nebo krátce po výskytu poraněné, například během chirurgického postupu.

Stupeň uvádění do styku může probíhat za různých teplot pouze kromě těch, které jsou dost vysoké, aby docházelo k denaturaci nebo jinému poškození poraněné tkáně, nebo dost nízké, aby minimalizovaly příjem fotosensibilizátoru buňkami. Výhodně se kontaktní stupeň provádí při teplotě v rozmezí asi 5 až asi 40 °C, výhodně asi 15 až asi 37 °C a zejména při teplotě okolí.

Dávkování

V provedení způsobu podle vynálezu se subjektu v jedné nebo několika dávkách podává určité množství fotosensibilizátoru nebo směsi fotosensibilizátorů. Fotosensibilizační prostředky podle vynálezu se dávkují způsobem konzistentním s běžnou lékařskou praxí, přičemž se bere v úvahu charakter zánětu, kterému se má předcházet nebo který má být redukován, biologický druh a zdravotní stav subjektu, přítomnost jiného léčiva v těle subjektu, čistota a chemická forma fotosensibilizátoru, způsob aplikace, očekávaná rychlost a stupeň absorpce a další faktory, známé odborníkům. Terapeuticky účinné množství fotosensibilizátoru je množství, které při vystavení světlu významným způsobem účinně omezuje proliferaci fibroblastů, a tak zlepšuje zánětlivou odpověď a nežádoucí účinky, které mohou se zánětem souviset, jako je zvýšená vaskularita a/nebo tvorba jizevnaté tkáně.

Dávka fotosensibilizačního prostředku se mění podle cílové tkáně, a podává-li se intravenózně nebo systémově, je omezena hmotností a optimální hladinou v krvi subjektu. Vhodné systémové množství v dávce je typicky menší než asi 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti, • ftft • · výhodně v rozmezí asi 0,25 až 0,75 mg/kg na dávku a zejména asi 0,15 až asi 0,50 mg/kg na dávku. Systémová dávka BPD jako fotosensibilizátoru překračuje 0,3 mg/kg pouze za neobvyklých okolností. Tato dávkovači rozmezí je nutno považovat za doporučená a nikoli nutně jako omezující, protože se mohou také lišit individuální reakce jednotlivých subjektů.

V závislosti na fotosensibilizačním prostředku a způsobu aplikace je možno stanovit ekvivalentní optimální systémovou hladinu v krvi, ale je to obtížné, protože fotosensibilizátor výhodně velmi rychle z organismu mizí. Může tedy být dramatický rozdíl mezi koncentrací fotosensibilizátoru v krvi v okamžiku injekce a koncentrací v době ozáření světlem. Například koncentrace BPD v okamžiku intravenózní injekce může být v rozmezí asi 1 až 10 mg/ml, zatímco v době vystavení světlu může být pouze v rozmezí 0,5 až 0,05 pg/ml. Jde-li o topickou aplikaci, není fotosensibilizátor v krvi detekovatelný vůbec.

Provádí-li se aplikace topicky nebo systémově, definuje se dávka nejlépe pomocí koncentrace přípravku a délky doby kontaktu s cílovou tkání. Účinné rozmezí koncentrací pro fotosensibilizační rpostředek je obecně asi 0,1 až asi 10 mg/ml, výhodně asi 0,1 až asi 5 mg/ml a zejména si 0,25 až asi 2,0 mg/ml. Kontakt výhodně zahrnuje nanesení přípravku na jeden nebo více povrchů poraněné tkáně s farmaceutickým přípravkem podle vynálezu. Topický kontakt s fotosensibilizátorem probíhá obecně alespoň po dobu 1 min, výhodně pod 5 min a zejména asi 1 až 2 min. Doba kontaktu závisí na takových faktorech, jako je koncentrace fotosensibilizačního prostředku v přípravku, ošetřovaná tkáň a konkrétní typ přípravku.

Po předem stanovené době kontaktu s fotosensibilizátorem se výhodně z oblasti ošetření odstraní přebytečný fotosensibilizátor. Podává-li se fotosensibilizátor systémově, volí se tak, aby měl nejen rychlé farmakokinetické charakteristiky, ale i schopnost rychlé clearance z organismu. Podává-li se fotosensibilizátor topicky, odstraní se přebytek výhodně opláchnutím fyziologicky přijatelnou chemicky inertní kapalinou, jako je fyziologický roztok nebo BSS („basic salt solution“), nebo vodou nebo jiným rozpouštědlem. Tento postup opět nelze považovat vzhledem k šíři jeho možných variací za omezující.

Poté, co proběhl kontakt poraněné tkáně nebo tkáně před poraněním s přípravkem obsahujícím fotosensibilizátor podle vynálezu, se tkáň vystaví působení světla o vlnové délce, kterou absorbuje fotosensibilizační prostředek a která vede k redukci nebo prevenci zánětu. Zde používaný výraz „nízká dávka PDT“ se vztahuje na dávku, která nezpůsobuje zjevné poškození buněk, nekrózu nebo erythem, ale vykazuje pouze protizánětlivý účinek. Protože •4

4« 44 • 4 4 4 ·

4 4

4« • 4 4 4 4

4 4 4 4

444 444

4444 4444

444 44

44 celková dávka PDT závisí na kombinaci dávky fotosensibilizačního prostředku a dávce světelného záření, může být nízká dávka PDT podávána v kombinacích relativně vysokých dávek fotosensibilizátoru a relativně nízkých dávek světla nebo naopak v kombinacích relativně nízkých dávek fotosensibilizátoru a vysokých dávek světla. Posledně uvedenou kombinaci je také možno získat podáváním relativně vysoké dávky fotosensibilizátoru s neobvykle dlouhou „inkubační“ dobou před ozářením světlem. Pro provedení vynálezu jsou tedy vhodné rozmanité podmínky, které všechny vedou k relativně nízké celkové dávce PDT.

Podobně jsou vhodné rozmanité různé kombinace dávek fotosensibilizátoru, kontaktních dob a způsobů podávání. Je však možno aplikovat následující hrubá pravidla. Krátká kontaktní doba (méně než 1 h) s vysokou dávkou fotosensibilizátoru, například 2 mg/ml, aplikovanou topicky, je obecně ekvivalentní nízké dávce fotosensibilizátoru, například 0,15 mg/kg, podávané intravenózně. Avšak odložení ozařování na pozdější dobu, například více než 3 h, po podání fotosensibilizačního prostředku může mít i po vysoké intravenózní dávce fotosensibilizátoru za následek nízkou dávku PDT, protože je-li fotosensibilizátor schopen rychlé clearance, může být ve tkáních po třech hodinách přítomen jen ve velmi malém množství.

Jako konkrétní příklady „nízké dávky PDT“ je možno uvést:

- topickou aplikaci nebo lokalizovanou injekci méně než 2 mg/ml benzoporfyrinového derivátu („BPD“) jako fotosensibilizátoru, který se ponechá ve styku s cílovou tkání po dobu menší než 10 min,

- intravenózní aplikaci méně než 0,15 mg/kg BPD s ozářením kdykoli po aplikaci BPD nebo

- intravenózní aplikaci 0,15 až 0,50 mg/kg BPD s ozářením pod obě více než 6 h po podání PBD ve spojení s ozařováním za těchto podmínek:

- méně než 15 J/cm aplikováno v době 0 až 3 h po podání fotosensibilizátoru nebo

- až 100 J/cm aplikováno později než 6 h po podání fotosensibilizátoru.

Během ozařovacího stupně je možno použít jakéhokoli záření, které je absorbováno fotosensibilizátorem a které je vhodné pro použití pro poraněnou tkáň, například asi 380 až asi 850 nm, v závislosti na fotosensibilizátoru a na požadované hloubce penetrace tkáně, zejména • *· ·· · · • · * ·· 9 99

99

9 9 · • «> 9 9

999 999

9

99 asi 400 až asi 700 nm. Pro obecné protizánětlivé aplikace je možno použít světlo ve viditelné části elektromagnetického spektra, například červené světlo, modré světlo nebo i UVA záření. Světlo o vlnové délce nižší než 400 nm je přijatelné, ale nikoli výhodné v důsledku potenciálně škodlivých účinků UVA záření. Světlo o vlnové délce delší než 700 nm je také přijatelné, ale není zvlášť výhodné proto, že je obtížně viditelné a tak téměř znemožňuje visuální kontrolu ozařování, pro oční aplikace se preferuje červené světlo, protože eliminuje případné potenciálně škodlivé účinky spektrálního rozmezí modrého světla a UVA záření na citlivou oční sítnici.

Příkladem zvláště výhodného postupu, používaného během filtrační chirurgie, je:

1. nasycení houby vodnou dispersí liposomálního BPD o koncentraci 2 mg/ml,

2. umístění nasycené houby do styku s ošetřovanou tkání na dobu 2 min,

3. odstranění přebytku BPD opláchnutím hojným množstvím sterilního fyziologického roztoku nebo vyváženého solného roztoku a

4. vystavení tkáně ošetřené BPD světlu asi 7 až 12 J/cm².

V současnosti se žádný postup nejeví žádoucí pro všechny případy. Typické postupy však zahrnují buď jediné ošetření nebo počáteční ošetření a další 1 až 4 ošetření. Lokální ošetření topickou aplikací fotosensibilizátoru se může opakovat každé 3 nebo 4 dny. Při systémové aplikaci fotosensibilizátoru je však mezi opakovanými ošetřeními obvykle rozestup asi týden nebo déle, aby se předešlo nežádoucím účinkům akumulace přebytečného fotosensibilizátoru.

Příklady provedení vynálezu

Pro ilustraci, avšak nikoli pro omezení vynálezu, jsou uvedeny příklady provedení.

Příklad 1

Dávkování světla

Na oku u šesti normálních králíků byla provedena filtrační chirurgie. Houba Weck cell byla nasycena vodným roztokem fotosensibilizujícího benzoporfyrinového derivátu monokyseliny kruhu A (BPD-ΜΑ, známý také jako „BPD-verteporfin“) o koncentraci 2 mg/ml. Během chirurgického zákroku byl BPD-ΜΑ pomocí houby Weck cell nanesen na 2

AA AA AA

A A AAAA A A AAAA

A AA AAA AAA A A A A

AAA A A A A min topicky na bělimu a spojivku v oblasti zákroku. Po vypláchnutí přebytku léčiva s použitím BSS byla bělima i spojivka vystavena červenému světlu o vlnové délce asi 690 nm, které bylo vydáváno světlo emitující diodou („LED“), umístěnou ve vzdálenosti asi 1 cm od ozařované tkáně. Každý ze šesti králíků, použitých v tomto experimentu, obdržel rozdílnou dávku světla, a to 0, 3, 6, 12, 18 a 24 J/cm po dobu 30 s až 4 min. Ošetření králíci byli sledováni 11 až 12 dní po zákroku a byla zjišťována výška filtračního váčku, vaskularita váčku (indikace zánětu) a snížení nitroočního tlaku („IOP“). Údaje získané 5. a 11. den jsou uvedeny v tabulce 1 A, resp. 1B.

Tabulka 1 A. Výsledky pilotního BPD-MA pro dávky světla 5. den po operaci

králík č.	doba ozařování	pokles IOP (mm Hg)	výška váčku	vaskularita váčku
1	0 (bez BPD)	2-3	střední	vaskulámí
2	30 s	minimální	malá	vaskulámí
3	1 min	>20	maximální	avaskulámí
4	2 min	20	maximální	avaskulámí’
5	3 min	2,5	malá	vaskulámí
6	4 min	0-4	malá až střední	vaskulámí

Tabulka 1B. Výsledky pilotního BPD-MA pro dávky světla 11. den po operaci

králík č.	doba ozařování	pokles IOP (mm Hg)	výška váčku	vaskularita váčku
1	0 (bez BPD)	3-4	střední	vaskulámí
2	30 s	2,3	minimální	vaskulámí
3	1 min	>20	maximální	avaskulámí
4	2 min	>20	maximální	avaskulámí’
5	3 min	3-4	nízká	vaskulámí

min utracen - selhání váčku

Výsledky ukazují, že přežití filtračního váčku bylo nejdelší u očí ošetřených světlem ve středním rozsahu dávek, tj. s relativně nízkými dávkami léčiva i světla („nízká dávka PDT“). Z údajů vyplývá, že je nutná určitá hladina PDT, vyšší dávky jsou však obecně méně ···· · · · · · · · · • · · · · · · · · • · 9 9 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9

............. ·· ·· účinné než nižší. Neočekávalo se, že kombinace krátké inkubační doby s BPD a nízkou dávkou světla 12 J/cm² ošetřené buňky příliš poškodí. Ošetření nicméně mělo jednoznačný farmakologický účinek. Přežití váčku bylo spojeno s absencí zánětu, což demonstruje avaskularita a bledě zbarvený váček.

Na druhé straně byla snížena výška váčku a velikost sníženého nitroočního tlaku u příliš nízkých nebo příliš vysokých dávkách světla. Selhání váčku bylo spojeno se zánětem.

Odpovídající filtrační váčky byly porovnány. U kontrolního (neošetřeného) váčku byla 3. den po zákroku patrná vaskularita. U váčku ošetřeného PDT byla 4 dny po zákroku pozorována minimální vaskularita a velké zvýšení.

Příklad 2

Doba aplikace PDT

Fotosensibilizátor použitý v tomto příkladu byl připraven následujícím způsobem: liposomálně formulovaný derivát benzoporfyrinu - monokyselina na kruhu A (BPD-MA čili BPD-verteporfm) byl dodán z QLT PhotoTherapeutics, lne., jako lyofilizovaný prášek a byl krátce před použitím rekonstituován sterilní destilovanou vodou. BPD byl rekonstituován na 1,98 mg/ml a použit k nasycení 3 mm odřezku houby Weck cell. V kontrolních skupinách byla houba nasycena základním solným roztokem („BSS“).

Nultý den byla provedena filtrační chirurgie v plné tloušťce na jednom náhodně vybraném oku 48 králíků, rozdělených do skupin po 12. Neošetřené oko sloužilo u každého králíka jako kontrola. Filtrační postup byl proveden tímto způsobem: Každé zvíře bylo anestetizováno směsí ketaminu a xylazinu. K oddělení víček bylo použito drátěné spekulum. V horním nasálním nebo horním temporálním kvadrantu byl vytvořen spojivkový lalok se základnou v klenbě. Po jeho vytvoření byla na bělimu za limbus, kde měl být vytvořen kanálek, umístěna houba Weck cell nasycená BPD-MA (nebo BSS jako placebem). Přes houbu byla přetažena spojivka. Houba tak spočívala mezi spojivkou a bělimou a byla rovněž po dobu 2 min v kontaktu s episklerou a Tenonovým pouzdrem. Nástroje a rukavice byly před vniknutím do oka rovněž opláchnuty a pro vstup do přední komory byl použit 1,0 mm třepán.

Spojivkový lalok pak byl upevněn k limbu s použitím dvou 7-0 vicrylových švů.

Bezprostředně po zákroku byl každý králík po dobu 2 min vystaven světlu o vlnové délce 690 nm, přičemž byl 1 cm před oko umístěn světlený zdroj uvedený v příkladu 1 (Quantum • * 4 4 4 4 4 4 4 • 9 · · · · · ···«·· • 4 4 4 4 4 4

444 4444 «44 44 44 44

Devices, lne.). Byl použit maximální výkon světelného zdroje (100 W/cm²), který poskytl celkovou dávku přibližně 7,2 J.

Po chirurgickém zákroku pak byla do každého oka vkápnuta jedna kapka tobramycinu. Po dobu jednoho týdne po zákroku byl do obou očí čtyřikrát denně kapán tobramycin a prednisolon acetát.

Na kontrolní oči byl subkonjunktiválně aplikován stejný fotosensibilizátor a ozařování jako u očí chirurgicky ošetřených, avšak bez vytvoření kanálku. Kontrolní oko bylo použito k testování toxicity a jako základ pro zjištění poklesu IOP v oku chirurgicky ošetřeném. Doba, kdy byl aplikován BPD-MA, se měnila následujícím způsobem:

Skupina 1: během zákroku ošetření placebem 48 h po zákroku ošetření placebem

Skupina 2: během zákroku ošetření BPD h po zákroku ošetření placebem

Skupina 3: během zákroku ošetření placebem 48 h po zákroku ošetření BPD

Skupina 4: během zákroku ošetření BPD 48 h po zákroku ošetření BPD

Ošetření BPD 48 h po zákroku spočívalo v aplikaci 3 mm seříznutého konce houby Weck cell, nasycené vodným roztokem BPD-MA 2 mg/ml (nebo placebem), položené na dobu 2 min na spojivku nad filtračním váčkem, opláchnutí přebytečného fotosensibilizátoru a vystavení na dobu 1 min červenému LED světlu o vlnové délce 688 nm.

V nultý a každý druhý den po operaci byli králíci vyšetřováni biomikroskopicky se štěrbinovou lampou a byla zjišťována velikost filtračního váčku, výška filtračního váčku, erythem spojivky nad váčkem, zarudnutí dutiny přední komory a hloubka přední komory. IOP byl měřen v lokální anestesii aplanačním tonometrem. Bylo rovněž provedeno hodnocení subjektivního diskomfortu na základě zjišťování zvyků zvířete při odpočinku a jídle podle následující stupnice:

0: normální chování

1: potřásání hlavou, naklánění hlavy, šilhání očima

2: sahání packou do oka ·· · ·· ·· ·* • · · · » · · · · • ··· ··«· • · · · · · · · · · · · » · · β · · ·

........ ......* ·*

3: působení škody/sebepoškozování (drápy)

Přežití váčku bylo hodnoceno podle rozsahu a výšky váčku a podle IOP ve srovnání s kontrolním okem. Stupeň zánětlivé odpovědi byl stanoven podle erythemu nad filtračním váčkem a hodnocen stupnicí 0-3. Králíci byli utraceni, bylo-li zaznamenáno selhání váčku, tj., když byl nitrooční tlak v chirurgicky ošetřeném oku stejný jako v kontrolním oku a filtrační váček byl plochý.

Graf na obr. 1 znázorňuje procento přežití filtračních váčků u králíků v každé ze čtyř skupin hodnocených v této studii. Střední doba přežití (± standardní odchylka) byla:

Skupina 1: 10,3 ± 8 dní

Skupina 2: 23,8 + 12 dní

Skupina 3: 10,1 ± 9 dní

Skupina 4: 23,2 ± 8 dní

Statistický rozdíl byl pozorován mezi většinou skupin (P < 0,001), ale nikoli mezi skupinami 2 a 4 (P < 0,05). Ošetření BPD a světlem během zákroku (skupiny 2 a 4) mělo za následek prodlouženou životnost váčku v porovnání s kontrolou splacebem (skupina 1) nebo s ošetřením až 48 h po zákroku (skupina 3). Nezdálo se, že by druhé ošetření BPD a světlem po 48 h (skupina 4) mělo nějaký účinek navíc. K hodnocení rozdílů v době životnosti filtračních váčků mezi skupinami byl použit Kruskal-Wallisův test pro neparametrickou analýzu.

IOP byl hodnocen testem ANOVA a byl pozorován trend k nižšímu IOP, pokud byl BPD podáván během operace (P = 0,057). V důsledku problémů s tonometrem při měření IOP u králíků však byly nejspolehlivějšími parametry rozsah (obr. 2) a výška (obr. 3) váčku, které oba demonstrují účinnost ošetření nízkými dávkami PDT během chirurgického zákroku. Měření erythemu nad váčkem (znázorněno na obr. 4) demonstruje vyšší zánětlivou reakci ve skupinách 1 a 3, u nichž došlo k selhání váčku krátce po zákroku. Na obr. 2, 3 a 4 byl mezi skupinami pozorován statistický rozdíl (P 0,001). Výška a rozsah váčku, stejně jako další charakteristiky štěrbinové lampy, byly analyzovány statistikou metodou chí čtverců („chisquare“). Nepříznivé případy byly rovněž analyzovány touto metodou. Pomocí modelu Coxova proporcionálního hazardu byly stanoveny ty parametry, které nej přesněji předpovídaly přežití filtračního váčku každý den vyšetření.

• ·« · ····

V porovnání s dřívějšími studiemi na králících, zabývajících se přídavnou medikací pro trabekulektomii, které jsou shrnuty v tabulce 2, výsledky ukázaly, že BPD prodlužuje přežití filtračního váčku oproti normální kontrole, Ara-A a 5-fluorouracilu.

Tabulka 2 přežití filtračního váčku antifibrotická terapie (střed dny + SD [rozmezí]) dokumenty bez léčiva 12,06 + 6,2(6-23,2)

Kay a spol., „Delivery of Antifibrotic Agents as Adjuncts to Filtration SurgeryPart II: Delivery of 5-Fluorouracil and Bleomycin in a Collagen Implant: Pilot Study in the Rabbit“, Ophthalmic Surg, 17:796-801 (1986); Khaw a spol., „Effects of Inoperative 5-Fluorouracil or mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit“, Ophthalmology, 700:367-72(1993); Bergstrom a spol., „The Effects of Subconjunctival Mitomycin-C on Glaucoma Filtration Surgery in Rabbits“, Arch. Ophthalmol., 709:1725-30(1991) a Liang a spol., „Comparison of Mitomycin C and 5Fluorouracil on Filtration Surgery Success in Rabbit Eyes“, J. Glaucoma, 7:87-93(1992).

* ·· * · · · « · ·· · • · · · · · · · »

9 « · · * * ·»···· • · · · · · · ···· ···· ··· «« ·* *· antifibrotická terapie 5-fluorouracil přežití filtračního váčku (střed dny ± SD [rozmezí]) 19,5 ±5,5 (14-25) dokumenty

Kay a spol., „Delivery of Antifíbrotic Agents as Adjuncts to Filtration SurgeryPart II: Delivery of 5-Fluorouracil and Bleomycin in a Collagen Implant: Pilot Study in the Rabbit“, Ophthalmic Surg., 77:796-801(1986); Khaw a spol., „Effects of Inoperative 5-Fluorouracil or mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit“, Ophthalmology, 700:367-72(1993)

Bleomycin

25,5 ± 14,5 (21-50)

Mitomycin-C

34,8 ± 28,8 (6-23,2)

Ara-A

15,2 ±1,8

Khaw a spol., „Effects of Inoperative 5Fluorouracil or Mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit“, Ophthalmology, 100Α6Ί72(1993)

Khaw a spol., „Effects of Inoperative 5Fluorouracil or mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit“, Ophthalmology, 100'.3Gl72(1993); Liang a spol., „Comparison of Mitomycin C and 5-Fluorouracil on Filtration Surgery Success in Rabbit Eyes“, J. Glaucoma, 7:87-93(1992).

Lee a spol., „Effects of Cytosine Arabinoside-impregnated Bioerodible Polymers on Glaucoma Filtration Surgery in Rabbits“, J. Glaucoma, 2:96-100 (1993).

44 4 444 4 · «4 · · 4·· 4444

4 · 44 44 444444

4 4 4 4 4 4

.................

Výsledky dále ukázaly, že BPD prodlužuje životnost filtračního váčku u králíků o více než u některých králíků, jimž byl podáván mitomycin C. Střední doba přežití ve studiích s mitomycinem C byla delší, což je konzistentní s hypotézou, že PDT klinicky pravděpodobně způsobuje menší nadměrnou filtraci než mitomycin C, ale má podobně snadnou aplikaci s větší bezpečností.

Získané údaje jasně ukazují, že delší přežití váčku je spojeno s minimálním nebo žádným erythemem a tudíž s omezením zánětlivé reakce. Vyplývá z nich dále, že ošetření pomocí BPD a světla v relativně nízkém rozmezí dávek zamezuje vývoj zánětu, zejména aplikuje-li se během zákroku.

Nepříznivé výsledky byly nepočetné a netýkaly se konkrétně použití fotosensibilizátoru. Fibrinová zátka během prvních čtyř dní byla pozorována u šesti králíků, z nichž tři byli ze skupiny 2 a tři ze skupiny 3. V každém případě se fibrin do konce prvního týdne rozpustil bez následků. Jeden králík uhynul nultý den, což bylo zřejmě způsobeno komplikacemi při anestesii. Jiné neúspěšné případy nebyly zaznamenány.

Sedmý den byl utracen jeden králík z každé skupiny a po selhání váčku dva králíci z každé skupiny za účelem histologických testů a analýzy transmisní elektronovou mikroskopií („TEM“). Histologické hodnocení bylo provedeno poté, co byly oči usmrceného zvířete nejprve promyty neutrálním roztokem formalinu s 10 % pufru. Oči byly zpracovány, rozřezány a barveny hematoxylinem a eosinem stejně jako Massonovým trichromem. Vzorky byly hodnoceny jako maskované a nezávislým pozorovatelem.

Při transmisní elektronové mikroskopii byly tkáňové vzorky fixovány v 2,5% glutaraldehydu, tlumeném 0,1 M kakodylátem s obsahem 7 % sacharózy. Následná fixace byla prováděna 1 h 2% oxidem osmičelým, načež byla tkáň dehydratována stoupající koncentrací alkoholu do 100% ethanolu. Tkáňové bloky 2x5 mm byly nasáknuty katalýzo vanou epoxypryskyřicí. Byly zhotoveny tlusté řezy (0,5 pm), barveny toluidinovou modří a příslušné oblasti byly určovány světlenou mikroskopií. Pak byly zhotoveny tenké řezy (80 nm), vybrány na měděnou síťku a pro TEM mikroskopii barveny uranylacetátem a citrátem olovnatým. Ke zkoumání těchto řezů byl použit transmisní elektronový mikroskop Hitachi H7000.

Světelná mikroskopie, prováděná 7. den po operaci na filtračních váčcích, které byly při zákroku ošetřovány BPD a nikoli placebem, ukázala, že u králíků, kteří dostávali placebo • 9 v nultý i druhý den, byly přítomny fibroblasty a mírná lymfocytová reakce. Kromě toho 7. den vykázaly tyto oči určitou vaskulámí proliferaci a nové ukládání kolagenu.

Naproti tomu králíci, kteří dostali BPD jen druhý den (skupina 3), vykazovali kromě fibroblastů zvětšené lymfatické kanálky, ale žádnou vaskulámí proliferaci. U obou očí, které dostávaly při zákroku BPD, byla u filtračního váčku zaznamenána mírná lymfocytová reakce. Nebyly však zaznamenány žádné fibroblasty, vzrůst vaskularity nebo přírůstek lymfocytických kanálků. Na konci studie (tři týdny po operaci) bylo u očních kanálků, které byly ošetřeny BPD, zaznamenáno pouze málo lymfocytů a žádná proliferace cév v kanálku.

Ve skupinách 2 a 4 byl jak 7. den, tak při utracení pozorován ztenčený epitel. Má se však za to, že se jedná o důsledek zvýšeného váčku a s tím spojeného přerušení slzného filmu spíše než o toxický účinek ošetření BPD.

U kontrolního oka nebyl při vyšetření předního segmentu zaznamenán rozdíl mezi okem ošetřeným placebem a BPD, což klinicky demonstruje absenci toxicity u způsobu nebo přípravku podle vynálezu (P > 0,05). Histologické a transmisní elektronové mikroskopické vyšetření navíc neprokázalo toxicitu nebo zánět mimo místo filtrace ani v operovaném ani v kontrolním oku. Nebyla tedy klinicky, histologicky ani mikroskopicky pozorována toxicita v důsledku BPD.

Claims (30)

1. PATENTOVÉ NÁROKY ·· · · · ·

   1. Použití fotosensibilizačního prostředku pro výrobu léčiva pro omezení nebo prevenci účinků zánětu vznikajícího v poraněné tkáni.
2. 2. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro ošetřování oční tkáně.
3. 3. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva zahrnujícího jako fotosensibilizační prostředek jednu nebo více monohydrobenzoporfyrinových sloučenin.
4. 4. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva zahrnujícího jako fotosensibilizační prostředek BPD-MA.
5. 5. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro topickou aplikaci.
6. 6. Použití podle nároku 5 pro výrobu léčiva upraveného pro aplikaci ve formě roztoku fotosensibilizačního prostředku o koncentraci 2 mg/ml nebo nižší.
7. 7. Použití podle nároku 5 pro výrobu léčiva upraveného pro aplikaci uváděním do styku s houbou nasáklou léčivem.
8. 8. Použití podle nároku 5 pro výrobu léčiva upraveného pro uvádění do styku s poraněnou tkání po dobu kratší než 5 min.
9. 9. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro systémovou aplikaci.
10. 10. Použití podle nároku 9 pro výrobu léčiva upraveného pro aplikaci v dávce nižší než 0,30 mg/kg.
11. 11. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro odstranění přebytečného fotosensibilizačního prostředku po styku s poraněnou tkání.

    «ι ·· 44 ► 4 4 4

    I 4 4 4 •44 444
12. 12. Použití podle nároku 11 pro výrobu léčiva upraveného pro odstranění přebytečného fotosensibilizačního prostředku sterilním fyziologickým nebo vyváženým solným roztokem.
13. 13. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro absorpci alespoň části viditelného záření fotosensibilizačním prostředkem.
14. 14. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro vystavení záření v dávce _t 'y nižší než asi 100 J/cm .
15. 15. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro vystavení záření po dobu mezi asi 0 a 3 h v dávce nižší než asi 15 J/cm².
16. 16. Použití podle nároku 15 pro výrobu léčiva upraveného pro vystavení záření v dávce nižší než asi 7 až 12 J/cm².
17. 17. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva upraveného pro vystavení záření po dobu větší než asi 6 h v dávce asi 15 až 100 J/cm².

    • »

    4 4 · · · 4 4 * 4 · 4 4

    4 4 4 4 4 4444

    4 4 4 44 44 444444

    4 4 4 4 4 4 4

    4444 4444 444 «4 44 44
18. 18. Přípravek pro omezení nebo prevenci účinků zánětu vznikajícího v poraněné tkáni, vyznačující se t í m, že zahrnuje

    a) asi 1 pg/ml až asi 2 mg/ml fotosensibilizačního prostředku schopného proniknout do poraněné tkáně nebo tkáně před poškozením s důsledkem požadovaného stupně biodistribuce za méně než lha

    b) farmaceuticky přijatelný nosič.
19. 19. Přípravek podle nároku 18, v y z n a č u j í c í se t í m, že poraněnou tkání je oční tkáň.
20. 20. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že fotosensibilizační prostředek zahrnuje jednu nebo více monohydrobenzoporfyrinových sloučenin.
21. 21. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že fotosensibilizační prostředek zahrnuje BPD-MA.
22. 22. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že je formulován pro topickou aplikaci.
23. 23. Přípravek podle nároku 22, vyznačující se tím, že fotosensibilizační prostředek je ve formě roztoku o koncentraci 2 mg/ml nebo nižší.
24. 24. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že je formulován pro systémovou aplikaci.
25. 25. Přípravek podle nároku 24, vyznačující se tím, že dávka fotosensibilizačního prostředkuje nižší než 0,50 mg/kg.
26. 26. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že fotosensibilizační prostředek absorbuje světlo s alespoň některými vlnovými délkami ve viditelné části elektromagnetického světla.

    • 0 • 0 •00 000 •000 ····
27. 27. Nástroj pro omezení nebo prevenci účinků zánětu vznikajícího v poraněné tkáni₃ vyznačující se t í m, že zahrnuje

    a) fotosensibilizační prostředek schopný proniknout do poraněné tkáně nebo tkáně před poškozením s důsledkem požadovaného stupně biodistribuce za méně než 1 h a

    b) absorpční aplikátor.
28. 28. Nástroj podle nároku 27, vyznačující se tím, že absorpčním aplikátorem je houba nasáklá léčivem.
29. 29. Nástroj podle nároku 27, vyznačující se tím, že fotosensibilizační prostředek zahrnuje jednu nebo více monohydrobenzoporfyrinových sloučenin.
30. 30. Nástroj podle nároku 29, vyznačující se tím, že fotosensibilizační prostředek zahrnuje BPD-MA.