CZ204799A3 - Použití zelených porfyrinů pro výrobu léčiva k ošetřování sekundárního šedého zákalu - Google Patents

Abstract

Fotodynamickáterapie pro prevenci sekundárního šedého zákalu se provádí s použitímfotosensitizátorů,jako například zeleného pyrfýrinujako fotoaktivního činidla, pro zničení zbylých epiteliálních buněk čočky.

Description

Použití zelených porfyrinů pro výrobu léčiva k ošetřování sekundárního šedého zákalu

Oblast techniky

Vynález se vztahuje na použití fotodynamického způsobu léčení (PDT) pro prevenci sekundárních šedých zákalů, zejména na použití zelených porfýrinů pro uvedený PDT způsob léčení.

Dosavadní stav techniky

Odstranění šedých zákalů je jedním z nejběžnějších chirurgických zákroků ve Spojených státech. Sekundární šedé zákaly, konkrétně zakalení zadního pouzdra čočky, jsou nejběžnější komplikací při operativním odstranění šedého zákalu, s implantací nebo bez implantace intraokulární čočky do zadní komory oční. V závislosti na věku pacientů tento stav postihuje 15 až 50 % všech pacientů a obecně je druhotným po proliferaci a migraci zbylých epiteliálních buněk čočky. I když si jsou oční chirurgové vědomi výskytu sekundárního šedého zákalu a pečlivě odstraňují co nejvíce zbytků epiteliálních buněk čočky, například dříve než zasadí umělou intraokulární čočku, je obtížné identifikovat všechny takové buňky a nezřídka je obtížné jejich odstranění na vnitřním povrchu pouzdra čočky.

Sekundární šedý zákal jako pooperační efekt, se označuje také jako druhotný šedý zákal. Jeden komentář naznačil, že termín sekundární šedý zákal je dvojznačný, protože je to také často používaný výraz pro šedý zákal, který se vyskytuje sekundárně u různých očních chorob. Srovnej nap.ř Kappelhoff, J.P., a kol., „The pathology of After-Cataract. A Mini Review,' „Acta Opthamol. Suppl. 205: 13 (1992). V případě předloženého vynálezu je však termínem sekundární šedý zákal míněno bujení, založené na histolog ických pozorováních, lentikulárních epiteliálních buněk, fibroblastů, makrofágů a dokonce pigmentových buněk odvozených z duhovky na zadním pouzdru po odstranění šedého zákalu, ale nejsou tím míněny důsledky nesouvisejících změn ve zbývajícím zadním pouzdru samotném.

Ačkoli se má za to, že samotné implantované intraokulární čočky inhibují zakalení pouzdra, nejsou dosud dobře pochopeny mechanismy, pomocí nichž

Λ» ······ ” ” ····· ·· ·· ·· ·· k tomu dochází. Předpokládá se, že intraokulární čočky ovlivňují tvorbu druhotného šedého zákalu omezováním prostoru dostupného pro tvorbu lentoidů a udržováním lineární kostry pro epiteliální fibrózní metaplasii čočky. Nasisse, M.P. a kol, Lens Capsule Opacification in Aphakic and Pseudophakic Eyes, Graefes Arch. Clin. Exp. Opthalmol. 233(2):63 (1995). Jiní autoři jsou toho názoru, že intraokulární čočka povzbuzuje vývoj druhotného šedého zákalu. Nishi, O. a kol, Intercapsular Cataract Surgery with Lens Epithelial Cell Removal, J. Cataract Refract. Surg. 17:411-411 (1991). Nicméně druhotný šedý zákal se vyskytuje často a vyžaduje lékařský zákrok.

Rozličné techniky pro snížení opacifikace druhotného šedého zákalu zahrnují například, atraumatickou chirurgii a kortikální vyčištění. Přehled těchto a dalších technik je obsažen v Apple, D. J. a kol, Posterior Capsule Opacification, Survey of Ophthalmology, 37(2):73(1992). Tyto konvenční způsoby léčení druhotného šedého zákalu v sobě skrývají vážné vedlejší účinky, včetně odchlípení sítnice a poškození implantované intraokulární čočky. Viz, např. Lundgren, B, a kol, Secondary Cataract: An In vivo Model for Studies on Secondary Cataract in Rabbits, “Acta Opthalmol Suppl. 205:25 (1992). Metoda zvolená pro prevenci tvorby druhotného šedého zákalu má zvláštní význam v ohledu na úspěšný výsledek původní operace šedého zákalu.

Pro prevenci druhotného šedého zákalu tak byly navrhovány a hodnoceny různé experimentální metody. Tyto techniky zahrnují použití heparinu k inhibici migrace a proliferace fibroblastů na povrchu zadního pouzdra. Xia, X.P, a kol A Cytological Study of Inhibition of Secondary Cataract with Heparin Chung Hua Yen Ko Tsa Chih, 30(5):363 (1994); a Xia, X.P, a kol. A Clinical Study of Inhibition of Secondary with Heparin, Chung Hua Yen Ko Tsa Chih, 30(6):405 (1994).

Jiné přístupy k prevenci druhotného šedého zákalu zahrnují chemickou modifikaci zadního povrchu pouzdra čočky kovalentní vazbou určitých sloučenin a jejich následnou polymeraci. Lindquist, B, a kol Method for Preventing Secondary Cataract, U.S. Patent No. 5,375,611 (1994). Alternativní příspěvek se vztahuje kvstříknutí substance usmrcující buňky mezi přední pouzdro a přirozenou čočkou před odstraněním přirozené čočky z oka. Takovou látkou usmrcující buňky je výhodně vodný roztok upravený relativně silnou kyselinou nebo zásadou, který může zahrnovat viskoelastický materiál nebo barvivo. Dubroff, S, “Composition for • · • · • ···· · · · · • · · · · · · · ·

9 9 · ···· · · · ··· • · · · · · • · · · ·· ·· · ·

Preventing Clouding of Posterior Capsule After Extracapsular Cataract Eye Surgery and Method of Performing Cataract Surgery, U.,S. Patent No. 5,273,751 (1993).

Poněkud podobné jsou chemické metody zabránění nebo odvrácení šedého zákalu zahrnující podávání chemických přípravků, které snižují u čočky teplotu separace fází a zabraňují nebo inhibují vytváření opacity, agregátů s vysokou molekulární hmotností a dalších fyzikálních charakteristik šedého zákalu. Viz, např., Clark, J.I., a kol., „Chemical Prevention or Reversal of Cataract by Phase Separation Inhibitors, U.S. Patent No. 5,401,880 (1995).

Je rovněž popsáno použití monoklonálních protilátek v prevenci druhotného šedého zákalu. Například po extrakapsulární extrakci může být do přední komory oka zaveden komplement fixující monoklonální protilátky specifické pro epiteliální buňky čočky. Po navázání takových monoklonálních protilátek na veškeré přítomné epiteliální buňky čočky se komplement zavede do přední komory a tím způsobí lýzu zbývajících epiteliálních buněk čočky. Emery, J.M., a kol., „Monoclonal Antibodies Against Lens Epithelial Celíš and Methods for Preventing Proliferation of Remmant Lens Epithelial Celíš After Extracapsular Extraction,“ U.S. Patent No. 5,202,252 (1993).

Byla rovněž použita aplikace elektrické nebo tepelné energie sondou vloženou mezi duhovkou a pouzdrem čočky pro zničení zbytků epiteliálních buněk v pouzdru čočky. Bretton, R.H., Method and Apparatus for Preventing Posterior Capsular Opacification, U.S. Patent No. 51455,637 (1995).

Je také popsána fotodynamická therapie pro kontrolu proliferace epitelu čočky. Ve fotodynamické therapii jsou použité fotosensitizátory schopny zaměřit se na cílové buňky, buď přirozeným sklonem nebo protože byly záměrně zacíleny na specifický typ tkáně, či oběma způsoby. Pokud jsou ozářeny, mohou být schopny fluorescence a mohou být tedy užitečné v diagnostických metodách, které se vztahují k nalezení cílové tkáně. Nicméně ještě významnější je, že má fotosensitizátor schopnost při ozáření světlem o vlnové délce, kterou sloučenina pohlcuje, cytotoxicky působit proti buňkám, ve kterých je fotosensitizátor lokalizován. Ačkoli to ještě není definitivně potvrzeno, má se za to, že cytotoxický účinek je důsledkem vzniku singletového kyslíku po ozáření.

• 44 • · ·

Pokud jde o PDT terapii pro sekundární šedý zákal, byla zveřejněna experimentální studie použití Photofrinu II (PII); Parel, J.M. a kol., „Endocapsular Lavage with Photofrin II as a Photodynamic Therapy for Lens Epithelial Proliferation, Lasers and Medical Science 5:25 (1990). Tito autoři zaznamenali několik technických potíží v tomto způsobu, včetně stálého unikání PII z pouzdrového váčku a minimálního příjmového času kratšího než 15 minut po vstříknutí. Fluorescence z PII byla ještě rozeznatelná po 30 hodinách, ale nebyla dostatečně specifická pro zaručený bezpečný fotodynamický způsob léčení.

Příbuzná studie, Lingua, R. a kol., „Preclínical Evaluation of Photodynamic Therapy to Inhibit Lens Epithelial Proliferation,“ Lasers and Light in Ophthalmology 2(2): 103 (1988), popisuje dřívější testování fotodynamické terapie s použitím Photofrinu II. Tito autoři oznámili, že jejich technika sice měla za následek lokální usmrcení epiteliálních buněk, ale také usmrcení vazivových buněk a že odstranění těchto činitelů z pouzdra mělo za následek místní okulární toxicitu jako například uveitidu a otok rohovky. Navrhli, že účinná inhibice proliferace buňky čočky by vyžadovala pouzdro obsahující fotoaktivní činidlo a metodu pro rovnoměrné dodávání světla do pouzdra v průběhu fotoozařování. Jedna z aplikací sloučeniny zahrnuje její míšení s Healonem® za účelem vzrůstu viskozity preparátu.

V jiné popsané studii byl aplikován ftalocyanin hliníku in vitro na prekonfluentní kultury epiteliálních buněk čočky prasete. Po jednohodinové absorpci byly kultury pět minut exponovány červeným světlem a byl nalezen toxický efekt. Wunderlich, K. a kol., „Photodynamic Activity of Phthalocyanines in Cultivated Lens Epithelial Celíš of the Pig, Ophthalmology 92(3):346 (1995).

Jako související praktické omezení vyslovili chirurgové obavu, že i desetiminutové zpoždění absorpce fotosensitizátorů je pro tento účel příliš dlouhé. Zvlášť významná je tedy rychlost absorpce a řádně lokalizovaná aplikace fotosensitizátorových přípravků. Dosavadní přípravky takovéto optimální parametry absorpce neposkytují.

V souladu s předloženým vynálezem byla vyvinuta alternativní PDT metoda, která používá výhodnou skupinu fotosenzitizátorů, které jsou rychle absorbovány zbytkem epiteliálních buněk čočky, a které mohou být obsaženy v pouzdru a dodány do cílové buňky během poměrně krátkých období inkubace. Obsah fotosensitizátorů ·«· · ···· ·· · ··· • · · · · · ·· · · ·· ·· v pouzdru zabrání fotosensitizaci necílových částí oka. Protože se tyto fotosensitizátory jeví jako zelené spíše nežli červené, byly pojmenovány zelené porfýriny. Tyto sloučeniny umožnily provádět fotodynamickou terapii se světlem, které má vlnovou délku mimo rozsah vlnových délek světla, které je obyčejně silně pohlcováno krevní nebo jinou normální tkání, specificky při kolem 670 až 780 nm. Kromě poskytnutí účinné léčby in vivo v cílovém místě a v důsledku toho snížení hypersensitivity necílové tkáně lze také snadno při ozáření světlem dosáhnout jeho vhodnou hloubku průniku.

Je známo, že zelené porfyriny mohou být použity pro detekci a léčbu atherosklerotického povlaku způsobem fotodynamické therapie. Viz například Levý a kol., U.S. patent č.. 5,399,583 vydaný 21. března 1995 (sloupec 2, řádky 14-15); Levý a kol., U.S. Patent No. 4,920,143 vydaný 24. dubna 1990 (sloupec 10, řádka 58-59); Levý a kol., U.S. Patent No. 5,095,030 vydaný 10. března 1992 (sloupec 2, řádky 8-9 a sloupec 15, řádky 29-30); a Levý a kol., U.S. Patent No. 5,171,749 vydaný 15. prosince 1992 (sloupec 2, řádky 12-13 a sloupec 18, řádky 1-4 a 35-47).

Zvláštní třídou určitým způsobem klinicky zajímavých zelených porfyrinů je skupina sloučenin, nazývaná deriváty benzoporfyrinu (BPD). Tyto fotosensitizátory byly do určité míry testovány v souvislosti s jinými očními onemocněními. Například Schmidt, U. a kol. popsal experimenty s použitím BPD pro léčení Greenova melanomu (nepigmentovaný nádor), implantovaného do očí králíka a docílil v této souvislosti nekrozy (IOVS 33:1253 Abstract 2802 (1992)). Lin, C.P. a kol. dále popsal měření kinetiky a distribuce v cévách sítnice a cévnatky fluorescenčním zobrazováním s použitím čáry 458 nm z argonového iontového laseru k excitaci BPD (/OVS 34: 1168 Abstract 2293 (1993)). Kromě toho Lin, S.C. a kol. popisuje fotodynamický uzávěr choroidálních cév s použitím BPD v IOVS 34: 1303 Abstract 2953 (1993).

Výzkumní pracovníci spojení s přihlašovatelem této přihlášky popsali léčbu choroidální neovaskularizace s použitím BPD v několika abstraktech zveřejněných

15. března 1993 a v jejich patentové přihlášce (S. N. 08/390,591), která je zahrnuta jako odkaz. Tyto abstrakty zahrnují Schmidt-Erfurth, U. a kol. Photothrombosis of Ocular Neovascularization Using BPD; Haimovici, R. a kol. Localization of Benzoporphyrin Derivative Monoacid in the Rabbit Eye; a Walsh, .W. a kol. Photodynamic Therapy of Experimental Choroidal Neovascularization Using BPD• · · · * 9 » 99 99 • · 9 9 · · 9 · 9 »99 999 999

MA. Všechny uvedené práce jsou publikovány v IOVS 34: 1303 jako abstrakty 256, 255 a 254 (1993) a Moulton, R.S. a kol. Response of Retinal and Choroidal Vessels to Photodynamic Therapy Using Benzoporphyrin Derivative Monoacid, IOVS 34: 1169 abstrakt 58 (1993).

Formulace a PDT metody, které používají zelené porfyriny, v souladu s prezentovaným vynálezem nabízejí výhody selektivity pro buňky, které způsobují sekundární šedý zákal a schopnosti provést fotodynamicky zprostředkovanou destrukci takových buněk. Zelené porfyriny se také projevují relativně rychlejší absorpcí cílovými buňkami, čímž klesá zpoždění během pracovních postupů, jež jsou spojeny se současnými technikami PDT. Při aplikaci pro prevenci sekundárního šedého zákalu mají tedy tyto typy zelených porfyrinů obzvlášť výhodné vlastnosti, pokud jde o selektivitu a rychlosti absorpce.

Podstata vynálezu

Vynález je zaměřen na použití fotodynamické terapie (PDT) k prevenci sekundárního šedého zákalu s použitím fotodynamických metod, v první řadě s použitím zelených porfyrinů jako fotoaktivních sloučenin. Tyto materiály nabízejí výhody rychlé absorpce epiteliálními buňkami čočky, selektivitu a účinnost, jsou-li používány v postupech zaměřených na destrukci zbývajících epiteliálních buněk čočky.

Předmětem vynálezu je tedy způsob prevence sekundárního šedého zákalu, při němž se pacientovi, který takové ošetření potřebuje, podává určité množství zeleného porfyrinů, který bude lokalizován v epiteliálních buňkách čočky, které vyvolávají sekundární šedý zákal, a tyto buňky se ozařují světlem, které pohltí zelený porfyrin.

Konkrétně je předmětem vynálezu způsob prevence druhotného šedého zákalu v oku pacienta, při němž se do pouzdra čočky pacienta podává určité množství zeleného porfyrinů, dostatečné k lokalizaci účinného množství v epiteliálních buňkách čočky, nechá se uplynout dostatečná doba k lokalizaci účinného množství uvedeného zeleného porfyrinů v epiteliálních buňkách čočky a tyto epiteliální buňky čočky se ozařují světlem absorbovaným zeleným porfýrinem při úrovni energie postačující k destrukci v podstatě všech těchto epiteliálních buněk • · * • · · ♦·· ♦·· čočky. Konkrétně způsob zahrnuje destrukci epiteliálních buněk čočky, které zbývají po odstranění čočky chirurgickým zákrokem.

V jiném provedení vynález zahrnuje krok, ve kterém je před podáním zeleného porfyrinu na ochranu rohovky aplikován viskózní roztok. Rovněž může být zelený porphyrin kombinován s činidlem zvyšujícím viskositu. Taková činidla, která zvyšují viskozitu, mohou být popřípadě vybrána ze skupiny, která zahrnuje kyselinu hyaluronovou a její deriváty, škroby a celulózu a její deriváty.

V konkrétních provedeních zahrnuje způsob podle vynálezu podání účinného množství zeleného porfyrinu v rozsahu kolem 0,2 až kolem 2 mg/ml a kolem 150 až kolem 250 μί. Zvlášť výhodně je podaná dávka v rozsahu kolem 0,03 až kolem 0,5 mg a ještě výhodněji kolem 0,3 mg. Tyto formulace také mohou být podávány v liposomální formě, ve kterých může být zelený porfyrin vázán v liposomech, načež se liposomy smísí s viskózním vehikulem, jako je Ophthalin, Hymacel nebo AMVISC.

Způsoby podle vynálezu se konkrétně předpokládají pro podávání zeleného porfyrinu, který je vybrán ze skupiny, která se skládá z BPD-DA, BPD-DB, BPD-MA a BPD-MB, stejně jako z derivátů uvedených sloučenin. Zvláště preferované BPD zahrnují BPD-MA a BPD-DA.

Předmětem vynálezu jsou dále farmaceutické přípravky pro prevenci nebo inhibici vývoje sekundárního šedého zákalu, kde tyto přípravky obsahují množství zeleného porfýrinu, které je účinné pro prevenci nebo inhibici vývoje sekundárního šedého zákalu při podávání pacientovi, který podstupuje operaci šedého zákalu; a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient.

Přehled obrázků na výkresech

Snadnější pochopení představovaného vynálezu usnadní popis přiložených obrázků:

Obr. 1 ukazuje vzorce typických zelených porfyrinů, použitého při způsobu a v přípravku podle vynálezu.

Obr. 2 ukazuje vzorce čtyř zvláště výhodných forem zelených porfyrinů podle vynálezu, tj. BPD-DA, BPD-DB, BPD-MA a BPD-MB.

• · · · • fl ·· ·· flfl • ·· · · » · · • · ···· · · · · • · · · · flflfl · flflfl flflfl ····· * fl fl g .·· ·· ·· ·· ·· ··

Obr. 3 ukazuje přežití lidských epiteliálních buněk čočky po inkubaci s BPD za nepřítomnosti světla. Buňky byly inkubovány v 10-minutových inkubacích s BPD v rozsahu koncentrací od 0 až 800 ng/ml za nepřítomnosti světla. Životaschopné buňky byly určeny 5 dnů po inkubaci pomocí kolorimetrické zkoušky (MTT).

Obr. 4 ukazuje cytotoxický účinek BPD a světla na lidské epiteliální buňky čočky. Buňky získané od dvou rozdílných dárců byly inkubovány po dobu 10 minut s BPD v určitém rozsahu koncentrací a po odstranění přebytku léčiva byly exponovány světlem 10 J/cm² LED (690 nm). Životaschopné buňky byly stanoveny MTT zkouškou a procento usmrcených buněk bylo vypočítáno ve vztahu k buňkám exponovaným pouze světlem.

Obr. 5 ukazuje že, cytotoxický účinek PDT je dlouhodobý. Přežití HLE buněk bylo zjišťováno 24 hodin (A) a 20 dnů (B) po PDT (BPD 0 až 800 ng/ml, 10 minutová inkubace, 10 J/cm²) pomocí MTT zkoušky. Procenta usmrcených buněk byla vypočítána ve vztahu na buňky exponované pouze světlem.

Obr. 6 ukazuje účinek zkráceného času inkubace s BPD. HLE buňky od dvou rozdílných dárců byly inkubovány po dobu 1 až 1,5 minut s BPD (0 až 30 pg/ml), načež byly exponovány světlem 10 J/cm² LED. Buňky, které přežily, byly určeny pomocí MTT zkoušky a procenta usmrcených buněk byla vypočítána ve vztahu na buňky exponované pouze světlem.

Obr. 7 ukazuje fotosensitizaci lidských epiteliálních buněk čočky se ZnPc. Buňky byly inkubovány po 1 až 15 minutách se ZnPc (CGP 55 841; 0 až 200 pg/ml) a byly exponovány světlem 10 J/cm² LED (672 nm). Buňky, které přežily, byly určeny pomocí MTT zkoušky a procenta usmrcených buněk byla vypočítána s ohledem na buňky exponované pouze světlem. Byly provedeny dva oddělené experimenty v rozdílných časech po trypsinizaci.

Obr. 8 ukazuje účinek podání BPD ve viskózním roztoku. HLE buňky byly inkubovány s BPD v určitém rozsahu koncentrací a dodávány buď v 5% FCS (A) nebo v 25% Amvisc (B) a byly exponovány světlem 10 J/cm² LED. Životaschopné buňky byly určeny o 24 hodin později s použitím MTT zkoušky. Procenta usmrcených buněk byla vypočítána s ohledem na buňky exponované pouze světlem.

• φφφφ • φ φ • φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ φφ φφ φ · φ φ * φ φ φ · φ φ φ φ · φ φφφφ φφφ φφφ

Obr. 9 ukazuje difúzi BPD buď zAmvisc nebo Hymecel do rovnovážného roztoku soli. Difúze byla vyhodnocena spektrofotometricky po „0, 1 a 5 minutovém kontaktu.

Obr. 10 ukazuje epiteliální buňky králíka ošetřené BPD a červeným světlem. Obr. 10A jsou kontrolní buňky v temnu a obr. 10B ukazuje světlem exponované buňky. Epiteliální buňky čočky byly ošetřeny 30 pg/ml BPD ve 100% Hymecelu (1 min) a červeným LED světlem (1 J/cm²) in šitu (na pouzdro). Buňky byly probarveny zkušební soupravou s cytosondou, kde živé buňky mají barvu zelenou a mrtvé buňky mají barvu červenou.

Obr. 11 ukazuje Věro buňky ošetřené BPD a červeným světlem. Věro buňky byly ošetřeny BPD (1 min inkubace) a červeným světlem (1 J/cm²). Buňky byly probarveny zkušební soupravou s cytosondou. V tomto systému jsou živé buňky zelené, mrtvé buňky jsou červené. (11A) neošetřené buňky, (11B) 17 pg/ml BPD ve 100% Ophthalinu, (11C) 30 pg/ml BPD ve 100% Hymecelu, (11D) 30 pg/ml BPD ve 100% Amviscu.

Představovaný vynález je určen k postupu, ve kterém je fotodynamická therapie (PDT) zaměřena na jisté buňky, tj. epiteliální buňky čočky, které vyvolávají sekundární šedý zákal v nějakém časovém stadiu (například měsíce až roky) po operaci šedého zákalu. Pro prevenci sekundárního šedého zákalu je tento způsob léčby zamýšlen jako dodatečný postup během obvyklé operace šedého zákalu. Po odstranění čočky a před vložením např. náhrady intraokulární čočky, se obvyklý postup operace šedého zákalu přeruší. Po dobu asi jedné minuty se zavede do pouzdra vhodná sloučenina porfyrinu, výhodně zelený porfyrin, a potom se odstraní. Během této doby se sloučenina porfyrinu lokalizuje v epiteliálních buňkách čočky. Pomocí vhodného světelného zdroje se pak aplikuje světlo vhodného kmitočtu a intenzity, čímž dojde k aktivaci porfyrinu a usmrcení epiteliálních buněk. Po tomto PDT postupu pokračuje obvyklý chirurgický postup a dokončí se.

Nárokované formulace a způsoby se obecně vztahují k léčbě pacientů pomocí zeleného porfyrinu, který patří do skupiny sloučenin nazývané benzoporfyrinové deriváty (BPD). BPD je porfyrin podobný syntetickému chlorinu s různými strukturními analogy, jak ukazuje obrázek 1. Výhodně je zeleným porfýrinem kruh A dikyseliny nebo monokyseliny benzoporfyrinového derivátu (BPD-DA nebo BPD-MA), « »·· · ·· * • · • · ft ftft· ft · ♦ ftft • ft ftft • ftft · • ftft · • · ftftft ftft ft • ft ftft • ft ·· • ftft · • ftft · • ·· · ··* • · ·· ·· který pohlcuje světlo při vlnové délce asi 692 nm a který má zlepšené vlastnosti tkáňové penetrace. Například BPD-MA je lipofilní účinný fotosensitizátor a zdá se také, že je fototoxický pro neovaskulární tkáně, nádory a pro zbylé epiteliální buňky čočky. Po asi méně než jedné minutě pro absorpci vhodné formulace, např. BPD-MA přípravku, epiteliálními buňkami čočky se v podstatě na všechny epiteliální buňky čočky nacházející se na vnitřním předním a ekvatoriálním povrchu pouzdra dodává světlo vhodné vlnové délky. Pro svou farmakokinetiku se BPD zdá být nejlepším kandidátem pro použití při této indikaci, ale místo něj lze použít i jiné zelené porfyriny jako BPD-DA nebo další deriváty (viz vzorce 1 až 6 na obr. 1). Další fotosensitizátory, jako například ftalocyaniny, by mohly být použity ve vysokých koncentracích, které jsou dostačující na vyvážení jejich relativně pomalé absorpce. U těchto sloučenin by však odborník potřeboval formulovat jakýkoliv sensitizátor, vybraný tak, aby omezil možnost neúmyslné kontaminace jiných částí oka.

Obzvlášť výhodná formulace v souladu s představovaným vynálezem vyhovuje následujícím obecným kritériím. Zaprvé se musí použit fotosensitizátor, schopný rychlého vstupu do cílových epiteliálních buněk čočky. Za druhé, viskozita produktu musí zajišťovat, že substance nevyteče z pouzdra během inkubační doby. Za třetí zde mohou být zahrnuty složky, které usnadní absorpci tohoto fotosensitizátoru cílovými buňkami. Příkladem konkrétní formulace,je přídavek 0,1 ml roztoku BPD-MA k 1,9 ml viskoelastického roztoku, jako je například Ophthalin, a míšení v souladu s příklady uvedenými dále.

Během operace šedého zákalu se přední stěna čočky buď nařízne pro usnadnění extrakapsulární extrakce čočky nebo částečně odstraní (capsulorhesis) pro usnadnění zavedení fakoemulsifikátoru pro provedení interkapsulární extrakce čočky. Úspěšné setrvání fotosensitizátoru v pouzdru po indikovanou inkubační dobu bude proto záviset na viskozitě formulace, ve které je fotosensitizátor zaváděn do pouzdra. Doba takové inkubace je pro setrvání také významná a výhodně je kratší než asi jedna minuta, ideálně kratší než kolem 45 sekund a nejlépe kratší než kolem 30 sekund.

Výřez vnitřku povrchu pouzdra a podání PDT sloučeniny může mít za následek únik fotosensitizátoru podávaného k prevenci sekundárního šedého zákalu a může limitovat jeho retenci v zamýšleném intrakapsulárním umístění. Dalším důležitým znakem představovaného vynálezu je proto pokrytí endotelu rohovky

9499

9 • 9

9 9 • 9 9

9*4 9 9 «4 49 • 9 9 ·

9 9 9

9 4*9 4

9 9 *9 • 9 99

9 9 9

9 9 9

999 994

9

49 viskoelastickým materiálem neobsahujícím léčivo před aplikací fotosensitizátoru, za účelem ochrany této citlivé části oka před kontaminací fotosensitizátorem.

(

Při aplikaci PDT pro prevenci sekundárního šedého zákalu by měly být brány v úvahu i další skutečnosti. Například tvar pouzdra, tj. protáhlá koule, s buňkami majícími vysoký mitotický potenciál v ekvatoriální poloze, a jeho malá velikost způsobuje potíže při dodání stejnoměrného světla pro zamýšlenou fotodynamickou terapii. Další zábranou je nabitý operační program očních chirurgů, který neposkytuje čas pro časově nároční postup, prováděný po vlastním chirurgickém odstranění šedého zákalu. Proto musí být optimální fotosensitizátor k prevenci sekundárního šedého zákalu pomocí PDT rychle absorbován epiteliálními buňkami čočky a měl by být ve významném rozsahu fyzikálně obsažen v pouzdru.

Po fotosensitizaci je podán zelený porfýrin, výhodné je, když sloučenina působí na epiteliální buňky čočky po dobu kratší než asi jedna minuta. Epiteliální buňky čočky jsou potom osvětleny světlem o vlnové délce maximální absorbance zeleného porfyrinu, obvykle s délkami mezi kolem 550 a 695 nm, jak bylo diskutováno výše. Zejména je výhodné červené světlo z důvodu své relativně nižší energie a z toho vyplývající nepřítomnosti toxicity pro oční tkáň, zatímco epiteliální buňky čočky jsou ničeny.

Přípravky a způsoby podle vynálezu poskytují užitečný způsob léčení PDT pro prevenci sekundárního šedého zákalu. Následuje popis přípravků a formulací podle vynálezu a jejich klinické aplikace. Uvádějí a popisují se také experimentální data. Zelené porfyriny:

Zelené porfýriny, použitelné při způsobu podle vynálezu, jsou popsány podrobně v Levý a kol., U.S. Patent No. 5,171,749 vydaný 15. prosince 1992, který je začleněný jako odkaz. Zelené porfyriny se vztahují na porfyrinové deriváty získávané Diels-Alderovou reakcí porfyrinového jádra s alkinem za vzniku monohydrobenzoporfyrinu. Typicky jsou zelené porfyriny vybrány ze skupiny porfyrinových derivátů získaných Diels-Alderovou reakcí derivátů acetylenu s protoporfyrinem za podmínek, které podporují reakci pouze v jedné ze dvou dostupných konjugovaných nearomatických dienových struktur přítomných v kruhovém systému protoporfyrinu IX (kruhy A a B).

Několik struktur typických zelených porfyrinů je uvedeno na obr. 1. DielsAlderova reakce vede nejprve ke vzniku cyclohexadienu, označovaného zde jako hydrobenzo, kondenzovaného s pyrrolovým kruhem A nebo B, jak ukazují vzorce 1 a 2. Přesmyk π systému v hexadienovém kruhu vede ke vzniku sloučenin se vzorci 3 a 4 a redukcí vznikají sloučeniny vzorců 5 a 6. Tyto sloučeniny jsou uvedeny ve vzorci 1 až 6 s vodíkem obsazujícím dusíky vnitřního kruhu. Je však samozřejmě možno použít methylované formy, ve kterých jeden nebo oba tyto vodíky jsou nahrazeny kationtem. Příprava zelených porfýrinových sloučenin použitelných podle tohoto vynálezu je popsána podrobně v U.S. Patentu No. 5,095,030, který je začleněný jako odkaz.

Pro pohodlnost se pro označení sloučenin vzorců 3 a 4 na obr. 1 obvykle používá zkratka termínu hydromonobenzoporfyrinový derivát ~BPD. Sloučeniny o vzorci 3 a 4 a směsi z nich jsou obzvlášť preferovány.

Substituenty R¹, R², R³ a R⁴, jak jsou zobrazeny na obr. 1, jsou neinterferující substituenty, které významně neovlivňují aktivitu sloučeniny při způsobu a v přípravku podle vynálezu. Výraz neinterferující substituenty je konkrétně použit ve významu substituenty, které nezasahují do farmakologických funkcí BPD. Pro sloučeniny na obr. 1 a 2 jsou R¹ a R² obecně každý nezávisle mírně elektrony přitahující substituenty nebo jakékoli jiné aktivující substituenty, které nejsou dostatečně elektrony přitahující, aby u nich Diels-Alderova reakce probíhala na obou kruzích A a B místo pouze na jednom. Příklady vhodných R¹ a R² skupin zahrnují karbalkoxy skupinu se dvěma až šesti atomy uhlíku, alkylsulfonyl skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku v alkylové části nebo arylsulfonyl skupinu se šesti až deseti atomy uhlíku v arylové části, aryl skupinu se šesti až deseti atomy uhlíku, kyano skupinu a skupinu -CONR⁵CO- kde R⁵ je aryl se šesti až deseti atomy uhlíku nebo alkyl s jedním až šesti atomy uhlíku. Jeden ze substituentů R¹ a R² může také být vodík, pokud druhý je elektrony přitahující substituent dostatečné síly k usnadnění Diels-Alderovy reakce. Nejběžněji jsou R¹ a R² karbalkoxy skupiny, nejlépe methyl nebo ethyl karboxy estery. Preferované sloučeniny jsou ty, ve kterých R¹ a R² jsou stejné a jsou to karbalkoxy, zejména karboethoxy skupiny.

Zde použitý termín „karboxy má obvyklý význam -COOH, zatímco „karbalkoxy reprezentuje -COOR, kde R je alkyl. „Karboxyalkyl se vztahuje na substituent -R'-COOH, kde R' je alkylen. „Karbalkoxyalkyl se vztahuje na -R-COOR, • · · · · · · · · · • · · · · ··· · ··· ··· . _ ······ ·· ··· ·· *· ·· ·· ·· kde R' a R jsou alkylen, respektive alkyl. „Alkyl obecně reprezentuje nasycenou uhlovodíkovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem, jako je například methyl, n-hexyl, 2-methylpentyl, terc.butyl, n-propyl a tak dále. „Alkylen je stejný jako „alkyl kromě toho, že tato skupina není jednovazná, ale dvojvazná. “Aryl reprezentuje fenylovou skupinu, popřípadě substituovanou 1 až 3 substituenty, které mohou být nezávisle vybrány ze skupiny, která zahrnuje halogen, například fluor, chlor, brom nebo jod; nižší alkyl s jedním až čtyřmi atomy uhlíku a nižší alkoxy skupinu s jedním až čtyřmi atomy uhlíku. „Aryl nebo „alkyl sulfonylové skupiny mají vzorec -SO2R, kde R je alkyl nebo aryl, jak jsou definovány výše.

R³ je nezávisle ω-karboxyalkylová skupina se dvěma až šesti atomy uhlíku nebo její sůl, amid, ester nebo acylhydrazon, nebo alkyl s jedním až šesti atomy uhlíku. Přednostně je R³ 2-karboxyethyl nebo jeho alkylester a R⁴ je vinyl. Tato provedení jsou však preferována z důvodu dostupnosti přírodního porfyrinu spíše než aby byla diktována úvahami o jejich biologické účinnosti. Jak je zřejmé z obr. 1, adukty vznikající reakcí R¹-OC-R² s protoporfyrinovým-IX kruhovým systémem (kde R³ je chráněná forma 2-karboxyethylu, například 2-karbomethoxyethyl nebo 2karboethoxyethy, a R⁴ je -CH=CH₂) jsou sloučeniny o vzorci 1 a 2. Sloučeniny o vzorci 1 vznikají adicí na kruh A a sloučeniny o vzorci 2 vznikají adicí na kruh B.

Výhodné výchozí látky pro sloučeniny zeleného porfýrinu podle vynálezu zahrnují v přírodě se vyskytující porfyriny, kde R³ je buď -CH2CH2COOH nebo -CH₂CHRCOOR, kde R je alkyl s jedním až šesti atomy uhlíku. Avšak přesná povaha R³, pokud neobsahuje π-vazbu konjugovanou k kruhové π-vazbě, obvykle není relevantní pro průběh Diels-Alderovy reakce nebo pro účinnost výsledného produktu. R³ tak může být kterákoli z široké škály skupin jako například nižší alkyl s jedním až čtyřmi atomy uhlíku a ω-karboxyalkyl se dvěma až šesti atomy uhlíku v alkylové části a jeho estery či amidy. R³ substituent může také být substituován halogenem, jako například fluorem, chlorem, bromem nebo jodem nebo jinými nereaktivními substituenty.

Když R³ je CH2CHRCOOR, bylo zjištěno, že je výhodné hydrolyzovat nebo částečně hydrolyzovat esterifikovanou karboxy skupina. Typicky probíhá hydrolýza v R³-pozici obvykle mnohem vyšší rychlostí než u esterových skupin z R¹ nebo R². Rozpustnost a biodistribuční vlastnosti výsledných sloučenin jsou navíc mnohem výhodnější než u nehydrolyzované formy. Hydrolýza vede k produktům ve formě dikyselin nebo monokyselin (nebo jejich solí).

Ve sloučeninách o vzorci 1 a 2 je R⁴ je obvykle alespoň na počátku -CH=CH₂, ale tato vinylová skupina se snadno derivatizuje na jiná provedení R⁴ adicí na vinylový substituent kruhu B nebo A ve vzorci 1, resp. 2, nebo jeho oxidací. R⁴ tedy může být kterýkoli ze široké škály substituentů, které jsou konzistentní se substitutentem vznikajícím snadnou adiční reakcí. Exemplární adiční činidlo může mít například formu HX, kde H se aduje na uhlík, sousedící s kruhem, za vzniku pozici R⁴ mající vzorec:

-CHCH₃

X

V jednom provedení je tedy adovaným substituentem vodík a druhý je vybrán ze skupiny, která se skládá z vodíku, halogenu jako například fluoru, chloru, bromu nebo jodu, hydroxyskupiny; nižší alkoxy skupiny, aminoskupiny, amidické skupiny, sulfhydrylu nebo organosulfidu. Například Markovnikovova adice vody poskytuje strukturu substituentů analogickou k hematoporfyrinovému kruhovému systému na relevantním kruhu. Vinylová skupina může být také oxidována k získání substituentu v pozici R⁴ -CH2OH, -CHO nebo COOH nebo jejích solí nebo esterů. Adiční nebo oxidační produkty mohou být samy také substituovány, jestliže jsou adovanými substituenty funkční odstupující skupiny. Například když je substituentem Br, může být skupinami jako -OH, -OR kde R je alkyl s jedním až šesti atomy uhlíku, jak je popsáno výše, halogen, -NH2, -NHR, -NR₂ apod .

R⁴ tedy obecně reprezentuje jakékoli substituenty, na něž snadno přechází vinylová skupina -CH=CH2 štěpením nebo adicí, a dále substituenty, vznikající reakcí dobře odstupujících skupin s dalšími skupinami. Přednostně je však R⁴ vinyl (-CH=CH2) -CHOŘ⁴, kde R⁴ je H nebo alkyl s jedním až šesti atomy uhlíku, popřípadě substituovaný hydrofilním substituentem jako například -CH2OH, -CHO, -COOR⁴, například COOH nebo -COOCH3: -CH(OR⁴')CH3, například -CH(OH)CH₃ nebo -CH(OCH₃)CH₃; -CH(OR⁴’)CH2OR⁴’, -CH(OH)CH2OH, -CH(SR⁴’)CH3 jako -CH(SCH3)CH3 a jeho disulfid; -CH(NR⁴’)CH3, -CH(CN)CH₃, -CH(pyridiniumbromid)CH₃, -CH(COOR⁴’)CH, -CH(COOCR⁴’)CH_3; -CH₂(halo)CH₃ jako -CHBrCH₃ • · • · ···· · · · · • · · · · ··· 9 9·9 999

IC · 9 9 · 9 · · ·

ID ··· ·· ·· ·· ·· 9· nebo -CH(halo)CH₂(halo). Eventuelně může R⁴ být organická skupina o méně než 12 uhlíkových atomech, vznikající přímou nebo nepřímou derivatizací vinylu. Nebo může R⁴ poskytovat další porfyrinové nebo porfyrinů příbuzné kruhy, jako je skupina obsahující 1 až 3 jádra tetrapyrrolového typu o vzorci -L-P, jak bude definováno dále. Výhodné jsou sloučeniny, ve kterých R⁴ je -CH=CH2, -CH(OH)CH₃, -CH(halo)CH₃ nebo skupina obsahující 1 až 3 jádra tetrapyrrolového typu vzorce -L-P, jak bude definováno.

Zde použitý termín jádra tetrapyrrolového typu reprezentuje kruhový systém ze čtyř kruhů se strukturou

Me —NH v-N

Me'\_r-^A i

co₂h

HN —(

X

I co₂h nebo jeho sůl, ester, amid nebo acylhydrazon, který je vysoce konjugovaný. Zahrnuje porfyrinový systém, což je ve skutečnosti zcela konjugovaný systém; chlorinový systém, což je ve skutečnosti dihydroforma porfýrinu, a redukovaný chlorinový systém, což je tetrahydroforma konjugovaného porfyrinového systému. Je-li uvedeno „porfyrin“, označuje to plně konjugovaný systém. Zelené porfyriny jsou ve skutečnosti dihydroforma porfyrinového systému.

V jednom provedeni zahrnuje substituent R⁴ alespoň jedno další jádro tetrapyrrolového typu. Výsledné sloučeniny podle vynálezu jsou dimery nebo oligomery, ve kterých alespoň jeden z kruhových systémů tetrahydropyrrolového typu je zelený porfyrin. Vazba mezi skupinou zeleného porfyrinů v poloze R⁴ k dalšímu kruhovému systému tetrapyrrolového typu může být uskutečněna prostřednictvím éteru, aminu nebo vinylu. Porfyrinové kruhové_x systémy, které mají dvě volné substituovatelné pozice (v obou kruzích A a B),(odpovídající R⁴, mohou být dále derivatizovány, jak bude vysvětleno níže.

Když R⁴ je -L-P , je substituent -L- vybrán ze skupiny, která zahrnuje:

444 444 • · · 4 4 • · · 4 (a) (b) (c) (d) (e)

-CH-O-CH-,

I I ch₃ ch₃

-CHNHCH-,

CH₃ ch₃

-CH=CH-CH-,

CH₃

-CH-CH=CH-,

I ch₃ =CH-C-CH- a

II I o ch₃

-CH-C-CH=

I II ch₃ o a P je porfyrinová struktura nebo sekundární zelený porfyrin vzorce 1 až 6, uvedeného na obr. 1, vyjma toho, že kterákoli druhá skupina R⁴ je nahrazena výše uvedeným L.

(Je také samozřejmé, že když -L- má výše uvedený vzorec (e) nebo (f), bude mít kruhový systém, ke kterému je navázána dvojná vazba, rezonanční systém odpovídající

4··· 4 4 · ·

4 · 4 ·4· 4 44· ···

4 4 4 · · • «4 44 4 · 4« v kruhu, k němuž je připojena dvojná vazba, jak je ukázáno.)

Hydromonobenzoporfýriny, které přímo vznikají výše popsanou DielsAlderovou reakcí, mohou být také isomerizovány na BPD sloučeniny vzorce 3 a 4 z obr. 1. Zobrazení sloučenin 3 a 4 na obr. 1 neukazuje relativní polohu exocyklické methylové skupiny (kruh A ve vzorci 3 a kruh B ve vzorci 4) vzhledem k substituentu R². Dostupné jsou jeden i druhý isomer. Sloučeniny vzorce 3 a 4 jsou obzvlášť výhodné pro způsob a přípravky podle vynálezu.

Diels-Alderovy produkty mohou být kromě toho selektivně redukovány za použití vodíku v přítomnosti katalyzátoru, jako například palladia na dřevěném uhlí, k získání analogů s nasycenými kruhy jak ukazují vzorce 5 a 6 na obr. 1, které odpovídají příslušným Diels-Alderovým produktům z kruhů A a B. Popis uvedený výše s ohledem na sloučeniny vzorce 1 a 2, týkající se derivatizace konverzí zbývajícího vinylového substituentu (R⁴) a vzhledem k proměnlivosti R³ je aplikovatelný také pro sloučeniny vzorce 3, 4, 5 a 6.

Výhodná provedení zelených porfyrinů podle vynálezu jsou ta, ve kterých Diels-Alderův produkt je výsledkem přesmyku a částečně hydrolyzován. Ještě výhodnější jsou sloučeniny vzorce 3 a 4 (BPD), ve kterých karbalkoxy skupiny v R³polohách byly také hydrolyzovány nebo částečně hydrolyzovány. Sloučeniny podle vynálezu, které obsahují -COOH, mohou být připraveny buď jako volná kyselina nebo ve formě solí s organickými nebo anorganickými zásadami.

Obr. 2 ukazuje čtyři obzvlášť preferované sloučeniny podle vynálezu znázorněné vzorci 3 a 4, které jsou souhrnně označovány jako deriváty benzoporfyrinu, tj. BPD-DA, BPD-DB, BPD-ΜΑ a BPD-MB. Jedná se o hydrolyzované nebo částečné hydrolyzované formy přesmyknutých produktů vzorce 3 a 4, kde byla hydrolyzována jedna nebo obě z chráněných karboxylových skupin R³. Esterové skupiny R¹ a R² hydrolyzují poměrně pomalu, takže konverze na formy uvedené na obr. 2 je lehce proveditelná. Nejvýhodnější z těchto zelených porfyrinových sloučenin je BPD-MA.

Na obr. 2 je R³ skupina -CH2CH2COOR³, kde se R³ mění podle jednotlivé sloučeniny. Konkrétně ve vzorci BPD-DA jsou R¹ a R² karbalkoxy skupiny, R³ je vodík a derivatizace je v kruhu A. BPD-DB je odpovídající sloučenina s derivatizací

• · · 4 * ·· · f · · 4 4 4 4 444 444 • 44 ··

4· «4 44 44 v kruhu B. Sloučenina BPD-MA reprezentuje částečně hydrolyzovanou formu BPDDA a BPD-MB reprezentuje částečně hydrolyzovanou formu BPD-DB. V těchto posléze uvedených sloučeninách jsou R¹ a R² karbalkoxy skupiny, jeden R³ je vodík a druhý R³ je alkyl s jedním až šesti atomy uhlíku.

Sloučeniny vzorce BPD-MA a BPD-MB mohou být homogenní, tzn. že by bylo hydrolyzován pouze karbalkoxyethyl kruhu C nebo pouze karbalkoxyethyl kruhu D, nebo se může jednat o směsi hydrolyzátů substituentů kruhů C a D. Při způsobech a v přípravcích podle vynálezu mohou být navíc používány směsi kterýchkoli dvou nebo více sloučenin BPD-MA, -MB, -DA a -DB.

Je nutno připomenout, že mnoho sloučenin z obr. 1 obsahuje alespoň jedno chirální centrum a mohou tedy existovat jako optické isomery. Při způsobu podle vynálezu je možno používat sloučeniny, které mají obě konfigurace chirálních uhlíků, ať už jsou sloučeniny dodávány jako izoláty jednotlivých stereoisomerů nebo jako směsi enantiomerů a/nebo diastereomerů. Separace směsí diastereomerů může být provedena jakýmkoli obvyklým způsobem. Směs enantiomerů může být rozdělena jakýmkoli obvyklým způsobem, jako například reakcí s opticky aktivními preparáty a dělením výsledných diastereomerů.

Dále je třeba zdůraznit, že reakčními produkty mohou být neseparované směsi adičních produktů kruhů A a B, např. směsi sloučenin vzorců 1 a 2 nebo 3 a 4 nebo 5 a 6. Pro způsoby a přípravky podle vynálezu může být použita kterákoliv z oddělených forem, např. samotná sloučenina vzorce 3 nebo 4, nebo směs v jakémkoliv poměru.

Jako další mohou být použity dimerní formy zeleného porfyrinu a dimerní nebo multimerní formy zeleného porfyrinu / porfýrinových kombinací. Dimerní a oligomerní sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny reakcemi analogickými reakcím pro dimerizaci a oligomerizaci porfyrinů jako takových. Zelené porfyriny nebo spojení zelený porfyrin/porfyrin mohou být vyráběny přímo nebo mohou být porfyriny spojovány s následnou Diels-Alderovou reakcí jednoho nebo obou koncových porfyrinů a převedením na odpovídající zelené porfyriny.

Zelené porfyriny podle vynálezu mohou být podávány jako jednotlivá sloučenina, výhodně BPD-DA nebo BPD-MA, nebo jako směs různých zelených porfyrinů. Vhodnými formulacemi jsou formulace uzpůsobené k podávání • · 9 · « ·

99 *♦ • · · 9 ·

99 9 9 ·9 ·

999 9 9999 999 9 * ·

9 9 9 9 ·

99 99 99 terapeutických sloučenin do oka. Dále mohou být do takové formulace začleněny i jiné složky. Mezi ně patří například viditelná barviva nebo rozličné enzymy k usnadnění přístupu fotosensitizující sloučeniny k cílovým buňkám napříč zbytkem tkáně čočky.

Formulace zelených porfýrinů:

Přípravky podle předkládaného vynálezu mohou také zahrnovat další složky, jako například obvyklé pomocné přísady a excipienty včetně isotonisujících činitelů, pH regulátory, rozpouštědla, solubilizátory, barviva, želírující činidla a zahuštovadla a pufry a jejich kombinace.

Typicky je fotosensitizující činidlo je formulováno tak, že se při vhodné teplotě, např. při okolní teplotě, a při vhodných pH a požadovaném stupni čistoty míchá s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými nosiči, to jest nosiči, které jsou v použitých dávkách a koncentracích netoxické. Obecně závisí pH formulace zejména na konkrétním použití a koncentraci fotosensitizátoru, ale výhodně se pohybuje kdekoli v rozsahu od asi 3 do asi 8. Výhodně se udržuje pH fotosensitizátoru ve fyziologickém rozsahu (tj. kolem 6,5 až kolem 7,5). Přítomnost solí není nutná, a proto tedy formulace výhodně není roztokem eletrolytu. Popřípadě mohou být přidávána vhodné neantigenní přísady, jako je lidský sérový albumin, v množstvích, která neinterferují s fotosensitizujícím činidlem absorbovaným epiteliálními buňkami čočky.

Protože formulace fotosensitizujícího činidla má být aplikována na pouzdro čočky během extrakce šedého zákalu, kde je nežádoucí únik, je výhodné používat viskózní roztok podobný gelu spíše než neviskózní roztok. Výhodně se formulace připravuje tak, aby její viskozita dostačovala k setrvání fotosenzibilizujícího léčiva v podstatě v pouzdru, které je do šířky rozříznuto. Výhodná formulace používá kolem 5 % obj. zeleného porfyrinů, formulovaného v liposomech, a kolem 95 % obj. hyaluronatu sodného, jako například Ophthalinu.

Výše uvedený poměr fotosensitivního činidla k viskóznímu nosiči je výhodný a může být obměňován v závislosti na jednotlivém viskózním činidle a na dalších volitelných přísadách, které jsou rovněž použity ve formulaci pro podávání. Navíc může být stejná konečná viskozita dosažena s rozmanitými odlišnými přísadami jako jsou polysacharidy, výhodně ve vodě rozpustné polysacharidy, např. kyselina • · · · • ·

hyaluronová, škroby a deriváty celulózy, jako methylceluloza, hydroxyethylcelulóza a karboxymethylcelulóza. Je-li v gelové formulaci přítomen polysacharid, je přítomný obvykle v množství v rozsahu kolem 1 až 90 % hmotnostních gelu, výhodněji kolem 1 až 20 %. Příklady jiných vhodných polysacharidů pro tento účel a stanovení rozpustnosti polysacharidů jsou uvedeny v EP 267,015, který byl zveřejněn 11. května 1988. K přípravku podle vynálezu mohou být přidána ve standardních množstvích další zahušťovací prostředky, typicky organické étery celulózy, jako například hydroxypropyl methyl celulóza, nebo soli kyseliny hyaluronové, jako například sodná sůl kyseliny hyaluronové. Rovněž mohou být k přípravku přidány ve standardních množstvích.obvyklé pufry

Jednotlivé koncentrace daného zeleného porfyrinů by měly být přizpůsobeny v souladu s jeho fotosensitizující účinností. Například může být použit BPD-DA, ale asi v pětinásobně vyšší koncentraci než BPD-ΜΑ. Kromě toho může být BPD rozpuštěn odlišným způsobem než pomocí formulace v liposomech. Například může být zásobní roztok BPD-ΜΑ nebo některého jiného zeleného porfyrinů zředěn DMSO (dimethylsulfoxidem), polyethylenglykolem nebo kterýmkoli jiným rozpouštědlem, přijatelným pro použití v oku. Dále by měl být poměr mezi objemem léčiva a objemem viskózního materiálu udržován relativně stálý, z důvodu zachování viskozity a tedy setrvání léčiva v pouzdru.

Obvykle není požadována úprava pH, pokud je použit liposomální BPD-MA, protože obě složky (tj. BPD a viskózní materiál) mají neutrální pH. Avšak když jsou použita jiná rozpouštědla než liposomy, mělo by být pH upraveno před smícháním léčiva s viskózním materiálem. Do formulace mohou být přidávána bakteriostatická činidla, schválená pro použití v oku, ale obecně by měly být vyloučeny antioxidanty , které mohou ovlivňovat léčbu.

Je také možná příprava suchých formulací, které se rekonstituují těsně před použitím. Příprava suché nebo lyofilizované formulace o složení podle předloženého vynálezu může je rovněž prováděna známým způsobem, výhodně z roztoků podle vynálezu. Suché formulace podle tohoto vynálezu jsou také skladovatelné. Obvyklými technikami je možné roztok odpařit do sucha za mírných podmínek, zvláště po přídavku rozpouštědel pro azeotropické odstranění vody, typicky směsí toluenu a ethanolu. Zbytek se potom výhodně suší, např. několik hodin v sušárně.

• · φ φ φ ··♦·

Φ · · · ΦΦΦ · 999 ·Φ· • Φ Φ · · · Φ ·« ·· «Φ ·· ··

Vhodnými ísotonízujícími činidly jsou výhodně neiontová isotonizující činidla, jako například močovina, glycerol, sorbitol, mannitol, aminoethanol nebo propylenglykol. Na rozdíl od nich, jsou iontová isotonizující činidla, jako například chlorid sodný, obecně nevhodná pro účely vynálezu. Roztoky podle tohoto vynálezu by měly obsahovat isotonizující činidlo, pokud je přítomno, v množství dostatečném pro vznik přibližně isotonického roztoku. Výraz přibližně isotonický roztok znamená v tomto kontextu roztok, který má osmolaritu kolem 300 milliosmol (mOsm), obvykle 300 + 10 % mOsm. Je třeba počítat s tím, že k osmolaritě přispívají všechny složky roztoku. Neiontové isotonizující činidlo, jestliže je přítomno, se přidává v obvyklých množstvích, to je výhodně v množství asi 1 až asi 3,5 procent hmotnostních, výhodně v množství od asi 1,5 do 3 procent hmotnostních.

Do roztoků podle vynálezu mohou být přidávány solubilizátory, jako například Cremophor různých typů, výhodně Cremophor RH 40, nebo Tween nebo jiné obvyklé solubilizátory ve standardních množstvích.

Další výhodné provedení vynálezu se týká roztoku, obsahujícího zelený porfýrin a částečně etherífikovaný cyklodextrin, jehož etherovými substituenty jsou hydroxyethylové, hydroxypropylové nebo dihydroxypropylové skupiny, neionizující isotonizující činidlo, pufr a popřípadě rozpouštědlo. Vhodné cyklodextriny všakmusí být velikostně a konformačně vhodné k použití společně s fotosensitizujícími činidly, která jsou zde uvedena.

Podávání zeleného porfyrinu:

Jak bylo uvedeno výše, léčebný postup podle předkládaného vynálezu je prováděn mezi odstraněním čočky a zavedením intraokulární čočky. To představuje relativně krátký mezičas v průběhu typické operace šedého zákalu. Chirurgický zákrok na oku se tedy provádí podle standardního postupu až do chvíle, kdy je extrahována čočka. Dutina čočky je výhodně promyta fyziologickým rovnovážným roztokem soli a je aplikován přípravek obsahující zelený porfýrin v souladu s tímto vynálezem, výhodně ve formě viskózní formulace, jak je uvedeno výše, za účelem zvýšení retence v pouzdru čočky a omezení úniku. Preparáty podle prezentovaného vynálezu jsou výhodně podávány přes kanylu připojenou k nádržce, jako je stříkačka. Roztok se nechá působit po dobu asi 1/2 až asi 10 minut, výhodně asi 1 až asi 3 minuty, výhodněji méně než kolem 1 minuty a nejvýhodněji od 15 do 30 • fl • flfl « • flfl · fl flfl · • flfl · flflfl flflfl • · flfl flfl sekund. Po takové inkubaci je dutina čočky výhodně ještě jednou vymyta vyváženým solným roztokem pro odstranění přebytečného zeleného porfyrinu. Okamžitě po vymytí se aplikuje příslušné světelné záření.

Použitím vhodného světelného zdroje, přednostně laseru nebo laserové diody, v oblasti asi 550 až asi 695 nm jsou epiteliální buňky čočky vystaveny světlu po dobu, která je dostatečná ke zničení zbytku epiteliálních buněk čočky. Vhodná a preferovaná vlnová délka pro takový laser by byla 690 ± 12.5 nm v polovině maxima. Obecně dojde k destrukci epiteliálních buněk během 60 sekund a pravděpodobně je dostatečná za asi 15 až asi 30 sekund. Konečně se pouzdro čočky popřípadě promyje ještě jednou vhodně tlumeným solným roztokem a operace šedého zákalu se dokončí standardním postupem vložením např. umělé čočky. Eventuelně mohou být buňky v epitelu pouzdra čočky také zničeny injekcí roztoku zeleného porfyrinu přímo subkapsulárně do ještě neporušené čočky (hydrodissekce). Přebytek sloučeniny je vymyt společně s fragmenty a následné ozáření cílových buněk je provedeno vhodným zdrojem světla. Celkový chirurgický postup je možné vhodně upravit.

V alternativním a výhodném provedení se zelený porfyrin pro další zvýšení účinnosti jako fotosensitizátor připravuje jako liposomální preparát nebo je spojován s ligandem, jako je monoklonální protilátka, která se váže ke specifické povrchové složce epiteliálních buněk čočky. Výhodně zahrnuje ligand protilátku nebo její imunologicky reaktivní fragment. Jak je uvedeno výše, schopnost selektivní lokalizace zeleného porfýrinu může být během očního chirurgického zákroku dále zlepšena použitím přípravku s vyšší viskozitou než vodné preparáty, čímž se sníží únik z pouzdra během chirurgického postupu. Tímto přístupem je do cílové tkáně dodávána vyšší koncentrace zeleného porfyrinu.

Dávka zeleného porfyrinu může být optimalizována kvalifikovaným odborníkem v závislosti na fyzikálním systému podání přípravku, například ve formě liposomů, nebo zda je spojen s cílově specifickým ligandem, například protilátkou nebo imunologicky aktivním fragmentem.

Je třeba upozornit, že různé parametry použité pro účinnou, selektivní fotodynamickou terapii jsou ve vzájemném vztahu. Proto by dávka měla být také přizpůsobena i jiným parametrům, například hustotě, intenzitě a stálosti světla • 4 44

4 4 4 • 4 4 4

4 4 4 4

4 4

44

44

4 4 4 ♦· · ♦ 444 444 • 4

4 44 použitého ve fotodynamické terapii a časovému intervalu mezi podáním dávky a terapeutickým ozářením. Všechny tyto parametry by měly být přizpůsobeny k tomu, aby vyvolaly významné poškození zbytku epiteliálních buněk čočky bez způsobení významného poškození okolní tkáně. Typicky se dávka zeleného porfýrinu podává aplikací méně než 200 mikrolitrů objemu formulace na vnitřní pouzdro čočky. V závislosti na velikosti řezu, provedeného do pouzdra čočky, stavu čočky a přítomnosti nebo nepřítomnosti jiných látek jako krve nebo vymývacího roztoku je možno aplikovat více nebo méně formulace. Odborník by se měl obecně pokusit o lokální expozici dostatečným množstvím zeleného porfyrinů a případný přebytek sloučeniny se vymyje a v žádném případě nebude představovat podstatné riziko toxicity. Koncentrace zeleného porfyrinů obvykle použitého je v rozsahu od asi 0,2 do asi 2,0 mg/ml, výhodně od asi 0,5 do asi 1,5 mg/ml, a výhodněji kolem 1,0 mg/ml. Výše uvedené koncentrace mohou být odborníkem obměňovány tak, aby parametry absorpce a buněčné destrukce byly konzistentní s terapeutickým záměrem, uvedeným výše.

Má se za tom, že v důsledku ozáření interaguje zelený porfyrin vtripletovém stavu s kyslíkem a jinými sloučeninami za vzniku reaktivních meziproduktů, jako je například singletový kyslík, které mohou způsobit zhroucení buněčných struktur. Možné buněčné cíle zahrnují membránu buňky, mitochondrie, lysosomální membrány.

Dávka světla, aplikovaná během zamýšleného PDT způsobu léčení podle vynálezu, se může měnit, ale výhodně v oblasti mezi asi 10 až asi 150 J/cm². Preferováno je rozmezí mezi asi 50 až 100 J/cm² je preferována. Zvýšená intenzita může snížit dobu expozice.

Čas ozáření světlem po aplikaci zeleného porfyrinů může být důležitý jako jedna z cest k maximalizaci selektivity léčebného postupu, tedy minimalizace škody na jiných tkáních než jsou cílové buňky a usnadnění zakončení chirurgického zákroku. Obecně by měla být snaha o terapii okamžitě po aplikaci fotosensitizátoru.

•Φ φφ φφ φφ φ φφφφ φφφφ • φ φφφφ «φφφ • φφφ ΦΦΦΦΦ φφφφφφ φφφφ* φ * · φφφ φφ φφ ·» φφ ·· φφφφ φφ

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vyhodnocení toxicity BPD v kultivovaných HLE buňkách.

Za účelem stanovení celkové toxicity byla stanovena technika pro kultivaci lidských epiteliálních buněk čočky (HLE), získaných buď z očí dárce nebo při operaci šedého zákalu.

Většina lidských epiteliálních buněk čočky (HLE) byla vypěstována z čoček získaných z očí dárců 12 až 48 hodin po smrti, dodávaných jako zadní pól (rohovka předem odstraněna) Oční bankou v Britské Kolumbii. Příležitostně byly dodávány celé oči. Příležitostně byly rovněž dodávány vyříznuté čočky, uskladněné po 1 až 5 hodin v chladném PBS. Pouzdra čoček byla odebírána od mužských i ženských dárců v rozsahu od 20 do 72 let stáří. Ve všech případech byl proveden obvodový ekvatoriální řez (a/nebo až 0,5 mm před ekvatoriální rovinou) v předním pouzdru čočky. Tato explantovaná tkáň byla umístěna buněčnou stranou dolů na plastickou tkáňovou kultivační misku (35 mm) s DME doplněným 15% FCS. Pouzdra byla potom rozřezána na řadu 1 mm širokých rovnoběžných proužků s použitím kyvného pohybu zaoblené čepele skalpelu, který přitavil konce proužků na povrch misky. Explantátům bylo každé dva až tři dny dodáváno čerstvé médium. Buněčný růst byl ponechán pokračovat, dokud nebyla monovrstva konkfluentní nebo téměř konfluentní, načež byla pasážována 0,25% roztokem trypsinu v EDTA. Buňky HLE byly použity v pasáži dvě i tři. Ledvinové buňky kočkodana zeleného VĚRO (dodávané z QLT) byly vypěstovány ve stejných podmínkách prostředí jako HLE a použity před dosažením pasáže 20 ze zmrazené zásoby.

V tomto systému bylo stanoveno, že 10 min. inkubace se samotným BPD (v 5% plodovém telecím séru, FCS) v rozsahu koncentrací (0 až 800 pg/ml) neovlivní přežití buňky (obr. 3).

»4**

Příklad 2

Ošetření buněk HLE světlem po inkubaci s BPD

Buňky z příkladu 1 byly exponovány červeným světlem 10 J/cm² (690 + 12,5 nm), dodaným diodou (LED), okamžitě po 10 min. inkubaci s BPD, ale po odstranění přebytku léčiva. Jak bylo předpovězeno, přežití buněk bylo velice redukováno. V přítomnosti 5 % FCS, vedla dávka 400 až 800 ng BPD/ml následovaná červeným světlem k usmrcení 80 až 100 % buněk. Při podobných experimentech, které byly prováděny in vitro, se citlivost HLE buněk na BPD a světlo lišila v závislosti na dárci a počtu pasáží v kultuře (obr. 4). Přežití buněk bylo hodnoceno pomocí kolorimetrické zkoušky MTT, která měří jak metabolický stav, tak proliferaci buněk, a tak odráží jak cytotoxické, tak cytostatické účinky. Viz Mossman, „Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, Journal of Immunological Methods 65: 5.563 (1983). Bylo proto zajímavé zkoumat, zda účinky PDT jsou dlouhodobé. Výsledky experimentů, ve kterých byly HLE buňky testovány na přežití buď 1 den nebo 20 dnů (stejná kultura byla rozšdělena) po inkubací s BPD (v 5% FCS nebo 25% Amviscu) a expozici červeným světlem 10 J/cm², poskytly srovnatelné zničení buněk (obr. 5). To znamená, že účinky PDT jsou dlouhotrvající.

Podle názorů lékařů, kteří léčí šedý zákal, byl dokonce 10 min. inkubační čas, považovaný za vhodný na začátku studie, nepřijatelně dlouhý. Účinky PDT byly proto rovněž testovány po 1 min. inkubaci s BPD. Výsledky těchto experimentů ukázaly, že ačkoli koncentrace BPD musely být zvýšeny z nanogramových na mikrogramová množství na mililitr, bylo dosaženo uspokojivého usmrcení buněk (obr. 6). Jednominutový kontakt buněk s BPD v množství 3 až 5 pg/ml a 10 J/cm² červeného světla měl za výsledek velmi podstatné usmrcení buněk. Byly pozorovány některé individuální rozdíly v citlivosti buněk (obr.6). Nicméně jsou tyto koncentrace z farmakologického hlediska poměrně nízké a mohou být snadno optimalizovány na vyšší hladiny s cílem dosáhnout totálního usmrcení buněk Pro BPD je velmi charakteristická rychlá absorpce buňkami.

Jeden z fotosensitizátorů, ZnPc, byl zkoušen ve zde uvedeném systému (1 min. inkubace, světlo 10 J/cm²). Výsledkem nejvyšší testované koncentrace (200 • ftftft • ft ftft « ftft · • ftft · • · ftftft ft • · · ·· ftft

99 • · · · • · · · · ··· ft · ftft ftft gg/ml), která byla omezena koncentrací zásobního roztoku ZnPc (200 gg/ml ve vodě), bylo maximálně 62 až 78% usmrcení buněk (obr. 7).

Příklad 3

Ošetření HLE buněk pomocí BPD ve viskózním roztoku

Jak bylo uvedeno výše, bude v klinických podmínkách optimální dodávat BPD ve viskózním roztoku. Pro tento účel jsou v současnosti vhodná a odborníkům známá jako činidla hydroxypropylmethylcelulóza (HPMC; Hymecel®) nebo hyaluronát sodný (SH: Amvisc, Ophthalin, Biolon). Proto byla fotosensitizace HLE buněk pomocí BPD dodaného ve viskózním roztoku hodnocena v dalších vehikulech. Kvůli vysoké viskozitě byl v kultivačním systému HLE zkoušen pouze 25 % hyaluronát sodný Amvisc v rovnovážném solném roztoku (BSS, pro použití v chirurgii) a porovnán k 5% FCS v živné půdě podle příkladu 2. Z výsledků je vidět, že 10 min. inkubace HLE buněk s BPD v obou roztocích, následovaná ozářením 10 J/cm² červeného světla, způsobí podobné usmrcení buňky (obr. 8). To znamená, že buňkám může být účinně dodán BPD, když je ve viskózním roztoku.

Setrvání BPD v pouzdru čočky a zabránění jeho kontaktu s jinými očními buňkami/tkáněmi záleží do určité míry na jeho difúzi z viskózního roztoku buď do jiného viskózního roztoku bez obsahu léčiva nebo do rovnovážného solného roztoku (BBS), jež se oba v chirurgii používají k udržování očního tlaku v průběhu chirurgického zákroku. Předběžné experimenty in vitro ukázaly, že BPD nedifunduje do BSS rychle ani z Hymecelu ani z Amviscu, a mnohem méně z Amviscu než Hymecelu (obr. 9). Výhodným vehikulem pro BPD tedy může být Amvisc nebo jakýkoli jiný roztok hyaluronátu sodného jako například Ophthalin. Ošetření 30 gg/ml BPD ve 100% Hymecelu byla podrobena také pouzdra čoček králíka s epiteliálními buňkami ještě neporušenými. Byla inkubována po dobu 1 min. a exponována červeným světlem 10 J/cm² a výsledkem byl velmi vysoký počet usmrcených buněk (obr. 9).

44

4 4 4

4 4 4

444 444

4

44

4444

Ošetření Věro buněk BPD ve viskózním roztoku.

44

4 4 4

4 4 4

4 444 4

4 4

4· 44

Příklad 4

Kvůli potížím při získávání dostatečného počtu HLE buněk pro testování byly některé experimenty provedeny s použitím Věro buněk jako modelových. Buňky byly pěstovány na krycím sklíčku a impregnovány BPD ve 100% viskózních roztocích (Hymecel, Amvisc a Ophthalin). Vždy byla aplikována jedna minuta inkubace, ale dávky světla a koncentrace BPD byly různé. BPD byl zkoušen v dávkách 5 až 30 μg/ml s použitím světelné dávky 1, 5 a 10 J/cm². Přežití buněk bylo určeno pomocí fluorescence za použití zkušební soupravy s cytosondou (PerSeptive Bio Science: ethidium homodimer a calcein-AM). Výsledky indikující usmrcení buněk HLE jsou představeny na fotografiích (obr. 10).

Příklad 5

Příprava oftalmické formulace_A

Za sterilních podmínek a za tlumeného světla byla rekonstituována ampulka liposomálního BPD-MA (zásobní roztok o koncentraci 2 mg/ml) sterilní vodou pro injekce. Bylo vzato 0,1 ml roztoku BPD-MA a přidáno k 1,9 ml Ophthalinu do 3 ml skleněné stříkačky. V tomto stupni mohou být volitelně přidány další složky, jako například činidla usnadňující penetraci buňky nebo barvy pro vizualizaci formulace během aplikace v oku. Byl odstraněn přebytek vzduchu a stříkačka byla připojena k další 3 ml skleněné stříkačce pomocí antikorozní ocelové luerové spojky. BPD byl smíšen s viskózním materiálem střídavým vytlačováním z jedné stříkačky do druhé, přičemž může být třeba minimálně přibližně 30 vytlačení k získání homogenní formulace. Barva konečného roztoku je zelená a obsahuje BPD-MA v konečné koncentraci kolem 0,1 mg/ml. Na stříkačku pro podávání je připojena jehla o průměru 20 a roztok je aplikován do pouzdra čočky po odstranění čočky, přičemž je věnována pozornost pokrytí ekvatoriální krajiny pouzdra.

• 9

Příklad 6

Příprava oftalmické formulace B ·«··

9* ·· · • 9 9 · *

9 9 9 9 9·· • 9 999 9 99· 999 · 9 9 9

9 99 9 9 99

Za aseptických podmínek a za tlumeného světla je upraveno pH formulace BPD-DA, rozpuštěného v PEG 400 (v koncentraci 10 mg/ml) na téměř neutrální a následně je v průběhu filtrace formulace sterilizována. Potom je odebráno 0,1 ml sterilizovaného roztoku BPD-DA a přidáno k 1,9 ml Ophthalinu v 3 ml skleněné stříkačce. V tomto stupni mohou být přidány další volitelné složky, jako například činidla pro usnadnění penetrace buňky nebo barvy pro vizualizaci formulace během aplikace v oku. Přebytek vzduchu je odstraněn a stříkačka je připojena k další 3 ml skleněné stříkačce pomocí antikorozní ocelové luerové spojky. BPD je míchán s viskózním materiálem střídavým vytlačením z jedné stříkačky do druhé, přičemž může být třeba minimálně přibližně 30 vytlačení pro získání homogenní formulace. Barva konečného roztoku je zelená a roztok obsahuje BPD-DA v konečné koncentraci kolem 0,5 mg/ml. Na stříkačku je připojena jehla o průměru 20 pro podávání a formulace je aplikována do pouzdra čočky po odstranění čočky, přičemž je dbáno na pokrytí ekvatoriální oblasti pouzdra.

Příklad 7

Aplikace formulace A in vivo

Je zkoumán cytotoxický účinek ozáření formulace BPD-MA z příkladu 5 při 690 nm délce světla in vivo na epitel čočky králíka. Nejprve je léčené oko králíka roztaženo a před operací je podáno vhodné anestetikum. Chirurgický postup zahrnuje přeseknutí limbu (8 PM) a je provedeno čepelí (stilet pro přední komoru, 0,9 mm, VISITEC). Rovnovážný roztok soli (BSS) je zaveden přes držák přední komory za účelem udržení konstantního tlaku v přední komoře (odvíjející se od výšky, ve které je umístěna nádoba s BSS nad králíkovou hlavou). Tlak udržuje komoru mírně roztaženou a duhovku stlačenou, což umožňuje lepší přístup k pouzdru a poskytuje více místa pro manipulaci a homeostasi.

Na okraji se provede další vstup (12 AM) pomocí stiletu (0,9 mm průměru) a v přední části pouzdra se pomocí zahnuté jehly 25G na rukojeti provede kruhová přední kapsulektomie.

Použitím 3 mm keratomu se zvětší otevření ve 12 AM. (Toto otevření je použito pro vstup nástrojů do přední komory a všechny manipulace.)

Dále je zaveden fakoemulsifikátor a čočka se systematicky odstraní (tato část postupu trvá asi 1 až 1,5 min). Po fakoemulsifikaci je rohovka pokryta viskózním roztokem bez obsahu léčiva pro ochranu před únikem BPD.

Ve viskózním roztoku je BPD aplikován systematickým povlakem na ekvatoriální stěnu pouzdra, použitím Raycroftovy kanyly a stříkačky. Speciální péče je věnována pokrytí celé oblasti a zvláště ekvatoriální oblasti.

Po inkubaci (1 min; mohou být použity delší časy), je vypláchnut BPD s použitím BSS z držáku přední komory a odsát z pupily a váčku.

Teoreticky by měl být světelný zdroj zaveden otevřením pouzdra ve 12 AM a měl by být takového tvaru, aby umožňoval zavedení do pouzdra a ozáření hlavně ekvatoriální krajiny s velmi omezeným osvětlením duhovky, rohovky a sítnice (očekávaná hloubka ekvatoriální krajiny zepředu pouzdra s držákem přední komory (ACM) = 1 mm).

Ozáření při 10 J/cm² je aplikováno laserovou diodou po dobu 30 sekund pro usmrcení zbytku epiteliálních buněk čočky. Zbývající část chirurgického zákroku je dokončena obvyklým způsobem.

Na základě předcházejícího popisu a doložených příkladů by odborník v oboru mohl zdokonalit a využít různé roztoky vhodné pro prevenci sekundárního šedého zákalu. Podobné roztoky mohou využít fotosensitizující činidla, jiná než zelený porfyrin, pokud jsou činidla rychle absorbována zbytkem epiteliálních buněk čočky, jejich roztok může být v podstatě udržen uvnitř pouzdra a způsobit usmrcení epiteliálních buněk po aplikaci s relativně krátkou expozicí s vhodnou dávkou světla. Rozsah předloženého vynálezu je definován následujícími patentovými nároky, není však omezován předcházejícími příklady. Všechny publikace citované výše jsou zde začleněny jako odkaz.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití zeleného porfyrinu k výrobě léčiva pro upotřebení při prevenci sekundárního šedého zákalu v oku pacienta, přičemž tato prevence zahrnuje:

   aplikaci zeleného porfyrinu na pouzdro čočky pacienta v množství umožňujícím lokalizaci účinného množství v epiteliálních bukách čočky a ozáření uvedených epiteliálních buněk čočky světlem absorbovaným zeleným porfýrinem o energetické úrovni dostačující ke zničení uvedených epiteliálních buněk čočky.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde se jedná o epiteliální buňky čočky zbylé po odstranění čočky během operace šedého zákalu.
3. 3. Použití podle nároku 2, kde se před aplikací zeleného porfyrinu použije na ochranu rohovky viskózní roztok.
4. 4. Použití podle nároku 2, kde uvedený zelený porfyrin se kombinuje s činidlem zvyšujícím viskozitu.
5. 5. Použití podle nároku 4, kde uvedené činidlo zvyšující viskozitu je vybráno ze skupiny, která zahrnuje kyselinu hyaluronovou a její deriváty, škroby a celulózu a její deriváty.
6. 6. Použití podle nároku 1, kde uvedené účinné množství představuje formulace zeleného porfyrinu v rozsahu asi 0,2 až asi 10 mg/ml.
7. 7. Použití podle nároku 1, kde uvedeným účinným množstvím je aplikovaná dávka v rozsahu asi 0,03 až asi 2,5 mg.
8. 8. Použití podle nároku 7, kde uvedené účinné množství je asi 0,1 mg.

   • φ · · ·· 44 ··

   4 4 4 «··· 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4444 · · · 4 · 444 » ·4· ···

   31 444444 44 «4« 44 44 «« 44 «4
9. 9. Použití podle nároku 1, kde uvedený zelený porfyrin je aplikován v liposomální formulaci.
10. 10. Použití podle některého z nároků 1 až 9, kde uvedený zelený porfyrin je vybrán ze skupiny zahrnující sloučeniny vzorců 1 až 6 ··#· • · · kde R¹, R², R³ a R⁴ mají zde uvedený význam.
11. 11. Použití podle nároku 10, kde R¹ a R² představují nezávisle karbomethoxyskupinu nebo karboethoxyskupinu a/nebo každý ze substituentů R³ je -CH₂CH₂COOH nebo jeho sůl, amid, ester nebo acylhydrazon a/nebo

    R⁴ je -CHOHCH3 nebo -CH=CH₂.
12. 12. Použití podle nároku 11, kde uvedený zelený porfyrin má vzorec nebo
13. 13. Použití podle nároku 12, kde uvedený zelený porfyrin je BPD-MA.
14. 14. Farmaceutický přípravek vhodný k prevenci nebo inhibici vývoje sekundárního šedého zákalu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    ··« · ·· ·· ·· · ·· · ···· · · · · « · · ·« · ···· • · · · · ··· · ··· ··· ····· * · » ··· ·· ·· ·· ·· ·· zelený porfyrin v koncentraci, po ozáření při 10 J/cm po dobu asi 30 sekund účinné při prevenci nebo inhibici vývoje uvedeného druhotného šedého zákalu, je-li umístěn v pouzdru čočky pacienta podstupujícího operaci šedého zákalu: a činidlo zvyšující viskozitu typu a v množství postačujícím k zajištění, aby uvedený přípravek v podstatě setrval v pouzdru čočky oka pacienta po dobu alespoň asi 1 minuty po uvedené operaci a během uvedeného ozáření.
15. 15. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedeny zelený porfyrin je vybrán ze skupiny zahrnující sloučeniny vzorců 1 až 6 r’ p2 í rt1 n·»

    6 k³

    9999

    9# 99 99 99

    9 9999 999 9

    9 9999 9999 • 9 9 9 999 9 999 999

    9 9 9 9 9 9 9

    9 99 99 99 99 99 kde R , R , R a R mají zde uvedený význam.
16. 16. Přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že R¹ a R² představují nezávisle karbomethoxyskupinu nebo karboethoxyskupinu a/nebo každý ze substituentů R³ je -CH2CH2COOH nebo jeho sůl, amid, ester nebo acylhydrazon a/nebo

    R⁴ je -CHOHCH3 nebo -CH=CH₂.
17. 17. Přípravek podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený zelený porfyrin má vzorec nebo
18. 18. Přípravek podle nároku 17, vyznačující se tím, že zeleným porfyrinem je BPD-MA.

    • · · · ·· ·· ······· • · ···· ···· · · · · · ··· · ··· ···

    35 ······ ·· ····« ·· ·· ·· ··
19. 19. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedené činidlo zvyšující viskozitu je vybráno ze skupiny zahrnující kyselinu hyaluronovou a deriváty, škroby a celulózu a její deriváty.
20. 20. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedené účinné množství poskytne zelený porfyrin o koncentraci v rozsahu asi 0,2 až asi 10 mg/ml.
21. 21. Způsob prevence nebo inhibice vývoje sekundárního šedého zákalu v oku pacienta po odstranění čočky během operace šedého zákalu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    aplikaci zeleného porfyrinu na pouzdro čočky pacienta v množství umožňujícím lokalizaci účinného množství v epiteliálních bukách čočky, které zůstávají po uvedené operaci a ozáření uvedených epiteliálních buněk čočky světlem absorbovaným zeleným poríyrinem o energetické úrovni dostačující ke zničení v podstatě všech uvedených epiteliálních buněk čočky.
22. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že před podáním zeleného porfýrinu se použije viskózní roztok na ochranu rohovky.
23. 23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený zelený porfyrin se kombinuje s činidlem zvyšujícím viskozitu.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedené činidlo zvyšující viskozitu je vybráno ze skupiny, která zahrnuje kyselinu hyaluronovou a její deriváty, škroby a celulózu a její deriváty.
25. 25. Způsob podle jednoho z nároků 21 až 24, vyznačující se tím, že uvedený zelený porfyrin je vybrán ze skupiny zahrnující sloučeniny vzorců 1 až 6 • · · · • ·

    6 &

    kde R', R², R³ a R⁴ mají zde uvedený význam.
26. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že R¹ a R² představují nezávisle karbomethoxyskupinu nebo karboethoxyskupinu a/nebo • · · ··· ··· o

    každý ze substituentů R je -CH₂CH₂COOH nebo jeho sůl, amid, ester nebo acylhydrazon a/nebo

    R⁴ je -CHOHCH3 nebo -CH=CH₂.
27. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedeným zeleným porfyrinem je BPD-MA.