CZ282089B6 - Způsob výroby očkovacích látek - Google Patents

Abstract

Předmětem tohoto řešení je způsob inaktivace organismu rodu Mycoplasma a Acholeplasma řádu Mycoplasmatales, zejména v průběhu výroby očkovací látky proti tomuto organismu, jehož podstata spočívá v tom, že se tento organismus ošetří ethyleniminem nebo jeho vhodným derivátem. Organismus se může inaktivovat zejména působením ethyleniminu vytvářeného in situ přídavkem hydrobromidu 2-bromethylaminu ke kultuře organismu za současného nastavení hodnoty pH do mírně alkalické oblasti. Řešení je zejména použitelné pro výrobu očkovací látky proti Mycoplasma hyopneumoniae poskytující ochranu proti enzootické pneumonii u vepřů.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby očkovacích látek, zejména očkovacích látek proti mykoplasmám. Pod pojmem mykoplasma se rozumí organismus řádu Mycoplasmatales a zejména organismy rodu Mycoplasma a Acholeplasma, které spadají do tohoto řádu.

Dosavadní stav techniky

Mykoplasmy jsou ve značném rozsahu rozšířeny v přírodě a jejich určité patogenní kmeny jsou zodpovědné za četné choroby lidí a zvířat. Tak například, choroby dýchacího systému, jako jsou zápaly plic, jak u lidí, tak u zvířat, jsou způsobovány těmito organismy a vyvolané choroby jsou charakteristické dlouhodobým průběhem a vysokou úmrtností. V této souvislosti je třeba se zmínit zejména o chorobě vepřů označované názvem enzootická pneumonie (EPP), která má značné ekonomické důsledky, zejména v případě intenzivního chovu zvířat. Původcem této choroby je Mycoplasma hyopneumoniae (dříve známý též pod označením Mycoplasma suipneumoniae).

Bylo učiněno mnoho pokusů získat očkovací látky, kterými by bylo možno chránit zvířata před mykoplasmovými infekcemi, zejména EPP. Takový způsob výroby očkovacích látek obvykle zahrnuje stupeň pěstování organismu, například M. hyopneuoniae, v kultuře, až do dosažení požadovaného výtěžku, stupeň inaktivace a sklizně organismu a stupeň zpracování sklizených buněk na očkovací látku, popřípadě za spolupoužití vhodného adjuvans. Mykoplasmy se obvykle obtížně pěstují v kultuře a při výrobě očkovací látky je důležité zajistit, aby si očkovací látka po inaktivaci podržela antigenové vlastnosti živého organismu. Nejčastějším způsobem inaktivace bakterií při výrobě očkovacích látek je způsob, který zahrnuje zpracování s formalinem a právě tohoto způsobu se obvykle používalo při pokusech o výrobu očkovacích látek proti mykoplasmám. Až dosud se neukázalo, že by bylo možné vyrábět tímto způsobem očkovací látky, které by poskytovaly uspokojivou ochranu proti EPP.

Je také známa řada různých metod inaktivace virů při výrobě očkovacích látek proti virových chorobám, jejichž podstatou je zpracování živého viru ethyleniminem. Používání ethyleniminu však v praxi způsobuje značné obtíže, poněvadž se jedná o vysoce toxickou látku, s níž lze manipulovat pouze při dodržování velice náročných bezpečnostních opatření.

Bylo také zkoumáno použití binárního ethyleniminu pro inaktivaci mykoplasmové kontaminace ve zvířecích sérech používaných pro propagaci buněčných kultur (Christianson a další, J. Clin. Microbiol. 11 (4), 377 až 379 (1980)), ale byl učiněn závěr, že pro tento účel není možno binární ethylenimin doporučit.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby očkovací látky, která je účinná pro ochranu zvířat proti chorobám spojeným s infekcí organismem rodu Mycoplasma a Acholeplasma řádu Mycoplasmatales, jehož podstata spočívá v tom, že se tento organismus pěstuje v kultuře, potom se inaktivuje působením ethyleniminu nebo jeho vhodného derivátu, buňky organismu se sklidí, přičemž se inaktivuje zbytek ethyleniminu, a zpracují na očkovací látku.

Způsob podle vynálezu zahrnuje tedy použití ethyleniminu nebo jeho vhodného derivátu. Pod označením vhodné deriváty se rozumějí acylované deriváty, například acetylethylenimin. V dalším textuje pro jednoduchost vynález popisován na konkrétním případu použití samotného ethyleniminu.

Jak již bylo uvedeno výše, ethylenimin je vysoce toxická a nebezpečná chemikálie a, ačkoliv je možno jej používat pro inaktivaci mykoplasem při způsobu podle vynálezu jako takového, vysoce se doporučuje vytvářet jej v in šitu v kultuře organismu. Způsob, při němž se ethylenimin vytváří in šitu, by měl být takový, aby zajišťoval tvorbu ethyleniminu z prekursoru, s nímž se bezpečně manipuluje, přičemž samotný ethylenimin by měl být inaktivován, poté, co splnil svou funkci při inaktivaci organismu. Způsoby tvorby a inaktivace ethyleniminu by samy o sobě měly být takové, aby podstatně neovlivňovaly antigenicitu organismu.

Při obzvláště přednostním provedení tohoto vynálezu se ethylenimin vytváří in šitu přídavkem hydrobromidu 2-bromethylaminu (BEA) ke kultuře mykoplasmy. BEA je poměrně inertní pevná látka, která však za mírně zásaditých podmínek cyklizuje, za vzniku ethyleniminu. V důsledku toho je třeba v době přidání BEA přizpůsobit hodnotu pH v kultuře na mírně alkalickou hodnotu, která přednostně leží v rozmezí od hodnot vyšších než 7 do 8,0, přednostně v rozmezí od 7,3 do 7,7, s výhodou pak při asi 7,5.

Pokud se nezajistí kontinuální udržování hodnoty pH na této mírně alkalické úrovní v průběhu inaktivace organismu, má hodnota pH tendenci se snižovat. Po přidání BEA je tedy zapotřebí pH kultury kontinuálně nastavovat, aby se udržela požadovaná mírně alkalická hodnota po dostatečnou dobu pro zajištění úplné inaktivace organismu. Přidávání alkálie je nutné především v prvních několika hodinách, například v prvních třech hodinách, ale může být také nutné kontinuálně přizpůsobovat pH v kultivačním médiu po delší dobu, například po dobu od asi 20 do 24 hodin. Hodnota pH kultivačního média se může nastavovat na požadovanou mírně alkalickou hodnotu přídavkem jakékoliv vhodné alkálie, například hydroxidu alkalického kovu, přednostně hydroxidu sodného.

Po inaktivaci organismu se samotný ethylenimin může inaktivovat přídavkem vhodného reakčního činidla, které převádí ethylenimin na formu, s níž se bezpečně manipuluje. Jako příklad vhodných inaktivačních činidel je možno uvést thiosíran sodný, který inaktivuje ethylenimin rozštěpením kruhové struktury této sloučeniny. Dalším příkladem inaktivačního činidla je kyselina citrónová. Buňky mykoplasmy se potom sklidí, například odstřeďováním, a aby se vyloučila možná expozice obsluhy ethyleniminu, může se zbytkové kultivační médium zlikvidovat nalitím do dalšího vodného roztoku thiosíranu sodného.

Vynálezu lze použít v souvislosti s jakýmkoliv organismem rodu Mycoplasma a Acholeplasma, kde rody spadají do řádu Mycoplasmatales. Jako příklady takových organismů je možno uvést: M. hyopneumoniae, ,M. bovis, M. dispar, M. orale, M. hominis, M. arginini a A. laidlawii. Vynález se obzvláště hodí pro výrobu očkovací látky proti EPP a v dalším textu je vynález popisován na příkladu organismu M. hyopneumoniae.

Při způsobu výroby očkovací látky proti organismu M. hyopneumoniae se vychází z inokulační kultury organismu. Vhodné kultury lze získat ze sbírek kultur. Tak například M. hyopneumoniae 10110 je dostupný ve sbírce National Collection of Type Cultures, Colindale, Velká Británie. Inokulační kultura se nechá růst ve vhodném médiu a potom se jí zaočkuje finální objem kultivačního média. V závislosti na měřítku výroby očkovací látky, může finální objem kultivačního média ležet například v rozmezí od 40 až 45 litrů do až asi 200 litrů nebo více. Inokulační kultura se může pěstovat v objemu, který činí 1 až 10% finálního objemu kultivačního média.

-2CZ 282089 B6

Vhodná kultivační média zahrnují například obchodně dostupné základní půdy obohacené sérem a kvasničním extraktem. Také s k nim obvykle přidává zdroj energie, jako je glukóza a antibiotikum, jako je polymyxin. Hodnota pH by měla být obvykle v rozmezí od 7,2 do 7,6. Organismus se pěstuje v kultuře za podmínek regulavaného pH, přednostně při pH v rozmezí od 7,1 do 7,3, přičemž pH se reguluje přidáváním alkálie, jako je hydroxid sodný. Růst probíhá při normální teplotě inkubátoru, například při 36 Ž 1 °C a pokračuje se v něm tak dlouho, dokud metabolická aktivita kultury nezačne klesat, což reflektuje spotřeba alkálie používané pro úpravu pH.

Když metabolická aktivita kultury začne klesat, organismus se inaktivuje přídavkem BEA ke kultivačnímu médiu. BEA se například může přidávat ve formě vodného roztoku o známé koncentraci, až do dosažení finální koncentrace v kultivačním médiu přibližně 0,82 g/litr, což odpovídá koncentraci přibližně 4mM. Ve stejnou dobu nebo bezprostředně před přidáním BEA se hodnota pH kultivačního média nastaví do mírně alkalické oblasti, obvykle na pH asi 7,5, přídavkem vhodné alkálie, jako je hydroxid sodný.

Za těchto podmínek BEA cyklizuje, přičemž vzniká ethylenimin, který inaktivuje M. hyopneumoniae. Proces inaktivace vyžaduje dobu několika hodin, obvykle asi 24 hodin a v průběhu této doby se kultura udržuje při normální inkubační teplotě. Je důležité, aby byl ethylenimin stále přítomen v kultivačním médiu v průběhu doby, která je nutná pro inaktivaci. Pokud by se hodnota pH kultivačního média dále neupravovala, měla by sklon se během doby měnit do kyselé oblasti. Hodnota pH kultivačního média by tedy měla být v průběhu inaktivačního procesu kontinuálně monitorována a udržována na mírně alkalické úrovni přidáváním další alkálie podle potřeby.

Po dokončení deaktivace organismu se musí samotný ethylenimin v kultivačním médiu rozložit přídavkem nadbytku vhodného reakčního činidla, jako je thiosíran sodný nebo kyselina citrónová. Tak například se ke kultuře přidává nadbytek vodného roztoku thiosíranu sodného, aby se dosáhlo jeho koncentrace v kultivačním médiu přibližně 1 g/1.

Po deaktivci ethyleniminu se buňky organismu sklidí a zbytkové kultivační médium se může přidat do dalšího vodného roztoku thiosíranu sodného, opět tak, aby výsledná koncentrace thiosíranu sodného ve vzniklé směsi činila přibližně 1 g/1.

Po sklizení buněk se může výtěžek antigenu měřit odhadem obsahu proteinu. Buněčný koncentrát, který se po sklizení buněk získá, se může zpracovávat na očkovací látku konvenčním způsobem. Při tom se postupuje zejména tak, že se buňky, podle obsahu antigenu, zředí na vhodnou koncentraci, například tlumeným fyziologickým solným roztokem. Při výrobě očkovací látky se popřípadě může použít vhodného adjuvans, jako je olej, saponin nebo DEAE dextran. Přednostním adjuvans je olej.

Zjistilo se, že očkovací látka, která se vyrobí výše popsaným obecným postupem z organismu M. hyopneumoniae, si podržuje antigenové vlastnosti živého organismu a lze ji úspěšně použít pro ochranu vepřů před EPP.

Aniž by se původci tohoto vynálezu chtěli vázat nějakou konkrétní teorií, předpokládají, že konvenční metody inaktivace bakterií v průběhu výroby očkovacích látek (například ošetření formalinem) působí na povrchové proteiny bakterií a tím mohou nepříznivě ovlivňovat antigenové vlastnosti bakterií. V některých případech může být účinek na povrchové proteiny bakteriálních buněk takový, že buněk již nelze použít pro výrobu uspokojivé očkovací látky a tento případ může nastávat zejména v případě bakterií, jako jsou mykoplasmy, které se v kultuře pěstují jen obtížně.

-3 CZ 282089 B6

Za těchto okolností je pro výrobu uspokojivé očkovací látky zapotřebí používat způsobu inaktivace organismu, který má co nejmenší nepříznivý účinek na antigenové vlastnosti buněk. Předpokládá se, že ethylenimin deaktivuje organismus tím, že ničí genetický materiál (DNA) organismu, aniž by podstatně ovlivňoval povrchové proteiny těchto buněk.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a vynález v žádném ohledu neomezují.

io Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

BEA (0,082 g) se přidá ke 100 ml aktivně rostoucí kultury M. hyopneumoniae 10110, až do dosažení konečné koncentrace v kultivačním médiu 4mM. Hodnota pH se nastaví na 7,5 přídavkem vodného roztoku hydroxidu sodného (IN) a potom se pH měří a přizpůsobuje stejným způsobem podle následujícího režimu:

20 1. hodina	změřené pH 6,5	hodnota pH nastavena 7,5
2. hodina	změřené pH 7,2	hodnota pH nastavena 7,5
3. hodina	změřené pH 7,4	hodnota pH nastavena 7,5*
4. hodina	změřené pH 7,45	hodnota pH neupravována
5. hodina	změřené pH 7,45	hodnota pH neupravována
25 6. hodina	změřené pH 7,45	hodnota pH neupravována

* hodnota pH byla upravována 0,lN roztokem hydroxidu sodného

Každou hodinu, celkem po dobu 6 hodin, se odebírají vzorky pro ředění a počítání živých organismů v misce. Také se odebere vzorek po 24 hodinách a v něm se počítají mikroorganismy přímo. Po 24 hodinách se nezjistí žádné životaschopné organismy.

Příklad 2

M. hyopneumoniae 10110 se použije pro výrobu dceřiných kultur v kultivačním médiu následujícího složení:

základní půda	65	ml
vepřové sérum	15	ml
vařený krevní extrakt	10	ml
kvasničný extrakt	10	ml
hydrochlorid cysteinu (1%)	1	ml
glukóza (20%)	5	ml
fenolová červeň (0,4%)	1	ml
ampicilin (0,5%)	0,5 ml
octan thalný (1%)	2,5 ml

Sekvence dceřiných kultur je 10 ml, 100 ml, 400 ml, 4 000 ml. Když čtyřlitrová kultura vykazuje 50 známky aktivního růstu (mírný zákal a pohyb směrem ke kyselejšímu pH), inokuluje se do litrů čerstvého média. Hodnota pH této kultury se udržuje při 7,2 přidáváním vodného roztoku hydroxidu sodného, kdykoliv si pokles hodnoty pH vynucuje úpravu.

-4CZ 282089 B6

Po 13 dnech se požadavky na přidávání hydroxidu sodného sníží a do kultury se přes sterilizační filtr načerpá 36,5 g BEA v přibližně 100 ml destilované vody. Hodnota pH se udržuje na 7,5 přidávání vodného roztoku hydroxidu sodného podle potřeby. Po 24 hodinách se kultura sklidí odstředěním a zbytkové kultivační médium se rozloží přidáním do roztoku kyseliny citrónové, tak aby vznikl roztok o koncentraci kyseliny citrónové 0,2 %. Při alternativním postupu by se v tomto stadiu před odstředěním přidal thiosíran sodný (po 24 hodinách inaktivace), až do hodnoty 1,0 g/1, přičemž využité kultivační médium by se přidalo do dalšího vodného roztoku thiosíranu sodného. Tento alternativní postup by poskytl stejné výsledky.

Koncentrovaný antigen získaný při odstřeďování se homogenizuje ve 300 ml fosfátem tlumeného solného roztoku (PBS), homogenizuje a znovu odstředí. Resedimentovaný antigen se znovu resuspenduje ve 300 ml PBS a uloží ve formě alikvotních dílů při -70 °C.

Dostatečné množství antigenu se emulguje v olejovitém adjuvans (Marcol: Arlacel) tak, aby bylo možno při subkutánní dávce dodat zvířeti přibližně 13 mg antigenu a vzniklá očkovací látka se podá šesti vepřům, přičemž se použije 10 neočkovaných kontrolních zvířat. Po 4 týdnech se všichni vepři vystaví, po dobu 3 po sobě následujících dnů, intranasální provokaci 5ml objemy plicního homogenátu obsahujícího organismy M. hyopneumoniae. Po 4 týdnech od infíkace se vepři usmrtí a provede se hodnocení. U kontrolních vepřů se zjistí rozsáhlé léze, zatímco očkovaná zvířata vůbec žádné léze nemají. Očkováním se tedy dosáhne úplné ochrany zvířat před touto infekcí.

Claims (11)

1. Způsob výroby očkovací látky, která je účinná pro ochranu zvířat proti chorobám spojeným s infekcí organismem rodu Mycoplasma a Acholeplasma řádu Mycoplasmatales, vyznačující se tím, že se tento organismus pěstuje v kultuře, potom se inaktivuje působením ethyleniminu nebo jeho vhodného derivátu, buňky organismu se sklidí, přičemž se inaktivuje zbytek ethyleniminu, a zpracují na očkovací látku.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se organismus ošetřuje ethyleniminem vytvořeným in šitu v kultuře tohoto organismu.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že ethylenimin vytváří in šitu přídavkem hydrobromidu 2-bromethylaminu k této kultuře.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, v době přídavku hydrobromidu

2-bromethylaminu se pH kultury nastaví na hodnotu v rozmezí od >7,0 do 8,0.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se pH nastaví na hodnotu v rozmezí od 7,3 do 7,7.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se t í m , že se pH nastaví na 7,5.

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že se po přidání hydrobromidu 2-bromethylaminu nastavuje hodnota pH kultury kontinuálně tak, aby se udržela v rozmezí od >7,0 do 8,0, po dobu alespoň 3 hodin pro zajištění úplné inaktivace organismu.

-5CZ 282089 B6

8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 7, vyznačující se tím, že se pH upravuje přidáváním hydroxidu alkalického kovu.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tí m , že se zbytek 5 ethyleniminu inaktivuje přídavkem thiosíranu sodného nebo kyseliny citrónové.

10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž9, vyznačující se tím, že se jako organismu použije M. hyopneumoniae, M. bovis, M. dispar, M. orale, M. hominis, M. arginini a A. laidlawii.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se jako organismu použije M. hyopneumoniae.