HU214245B - Eljárás vakcinák előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány a Mycőplasmatales renden belül a Mycőplasma ésAchőleplasma nemzetségekbe tartőzó őrganizműsők inaktiválásáraszőlgáló eljárásra vőnatkőzik, különös tekintette az említettőrganizműs elleni vakcina előállítása sőrán. Az eljárásban azőrganizműst etilén-iminnel vagy megfelelő származékával kezelik. Azinaktiválást különösen előnyösen úgy végzik, hőgy tenyés etéhez 2-bróm-etil-amin-hidrőbrőmidőt adnak, amelyből in sitű keletkezik azetilén-imin. Eközben a pH-t gyengén alkalikűs értékre állítják. Atalálmány különösen alkalmazható sertések, M. hyőpneűm niae őkőztaenzőőtikűs tüdőgyűlladása ellen védettséget létrehőzó vakcinaelőállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás vakcinák, pontosabban mikoplazmák elleni vakcinák előállítására.

A találmány szerinti „mikoplazma” elnevezés alatt egy a Mycoplasmatales rendbe tartozó organizmust értünk, pontosabban ennek a rendnek a Mycoplasma és Acholeplasma nemzetségekbe tartozó tagjait értjük.

A mikoplazmák a természetben széles körben elterjedtek, és bizonyos kórokozó törzseik felelősek számos emberi, valamint állati megbetegedésért. Okoznak például légúti betegségeket, mint például tüdőgyulladást emberben és állatokban, ezeket a megbetegedéseket elhúzódó lefolyás és magas megbetegedési arány jellemzi. Ebben az összefüggésben megemlítendő a sertések enzootikus tüdőgyulladása (ÉPP), amelynek igen nagy gazdasági jelentősége van, különösen a nagyüzemi körülmények között tartott állatoknál és amelynek kórokozója a Mycoplasma hyopneumoniae (korábbi néven M. suipneumoniae).

Számos próbálkozás irányult mikoplazma fertőzések, különösen ÉPP fertőzés ellen védettséget létrehozó vakcinák előállítására. A vakcina előállítására szolgáló eljárások tipikusan a következő lépésekből álltak: az organizmus, például a M. hyopneumoniae megfelelő mennyiségben történő felszaporítása, az organizmus inaktiválása és összegyűjtése, és az összegyűjtött sejtek vakcinává alakítása, többnyire egy megfelelő adjuvánssal együtt.

A mikoplazmákat általában nehéz tenyészteni, a vakcinák előállításánál fontos annak biztosítása, hogy az élő organizmus antigén sajátságait megőrizzük az inaktiválást követően. Vakcinák előállítása során baktériumok inaktiválására leggyakrabban formalinnal való kezelést alkalmaznak, ezt az eljárást alkalmazták rendszerint a mikoplazmák elleni vakcinák előállítására tett próbálkozásoknál is. Eddig nem sikerült ezen az úton bizonyítottan kielégítő védettséget létrehozó vakcinát előállítani ÉPP ellen.

Vírus okozta fertőzések elleni vakcinák előállítása során a vírusok inaktiválására számos különböző eljárás ismert, többek között az élő vírusok etilén-iminnel való kezelése. Az etilén-imin alkalmazása azonban a gyakorlatban komoly nehézséget jelent, mivel igen toxikus és csak a legszigorúbb elővigyázatossági intézkedések mellett használható.

Vizsgálták a bináris etilén-imin alkalmazását sejttenyésztési célokra használt állati szérumokban található mikoplazma kontamináció inaktiválására [Christianson és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 11 (4), 377-379, (1980)], azonban arra a következtetésre jutottak, hogy a bináris etilén-imin alkalmazása erre a célra nem megfelelő.

A találmány tárgyát egyfelől a Mycoplasmatales rendbe tartozó Mycoplasma és Acholeplasma nemzetségekbe tartozó organizmusok inaktiválására, különösen az említett organizmusok elleni vakcina előállítása során végzett inaktiválására szolgáló eljárás képezi, amely eljárás magában foglalja az organizmus kezelését etilén-iminnel vagy annak egy megfelelő származékával.

A találmány kiterjed másfelől a Mycoplasmatales rendbe tartozó Mycoplasma és Acholeplasma nemzetségekbe tartozó organizmusok elleni vakcina előállítására szolgáló eljárásra, amely eljárás magába foglalja az organizmus tenyésztését, inaktiválását etilén-iminnel vagy egy megfelelő származékával való kezeléssel, az organizmus sejtjeinek összegyűjtését, és a sejtekből vakcina készítését.

A találmány tárgyát képezi továbbá a Mycoplasmatales rendbe tartozó Mycoplasma és Acholeplasma nemzetségekbe tartozó organizmusok ellen előállított vakcina, amely vakcina tartalmazza az említett organizmus etilén-iminnel vagy egy megfelelő származékával inaktivált sejtjeit.

A találmány szerinti eljárás magában foglalja etilén-iminnek vagy egy megfelelő származékának alkalmazását.

A megfelelő származékok lehetnek acil-származékok, például acetil-etilén-imin. A találmány szerinti megoldás ismertetése a továbbiakban különösen az etilén-imin alkalmazására vonatkozik.

A fentiek szerint az etilén-imin igen mérgező és veszélyes vegyszer és a találmány szerint alkalmazható ugyan a mikoplazmák inaktiválására, előnyös azonban, ha az etilén-imin in situ az organizmus tenyészetében keletkezik. Egy olyan eljárásnál, melynél az etilén-imin in situ keletkezik, annak olyan prekurzorból kell keletkeznie, amelyet biztonságos kezelni, és magát az etilén-imint is semlegesíteni kell, miután az organizmust inaktiválva az betöltötte feladatát. Az etilén-imin keletkezését célzó és az azt inaktiváló eljárásoknak olyanoknak kell lenniük, hogy azok ne befolyásolják lényegesen az organizmus antigén sajátságait.

A találmány különösen előnyös megvalósítási módja szerint az etilén-imint in situ állítjuk elő úgy, hogy 2bróm-etil-amin-hidrobromidot (BEA) adunk a mikoplazma tenyészethez. A BEA egy viszonylag közömbös szilárd anyag, azonban gyengén alkalikus közegben ciklikus etilén-iminné alakul. Ennek megfelelően a BEA hozzáadásakor a tenyészet pH-ját gyengén alkalikus értékre kell beállítani, előnyösen 7,0-től körülbelül 8,0-ig, előnyösebben 7,3-tól 7,7-ig, még előnyösebben körülbelül 7,5-re.

Amennyiben az organizmus inaktiválása során nem tartjuk fenn folyamatosan ezt a gyengén alkalikus pHértéket, az hajlamos csökkenni. A BEA hozzáadását követően tehát a tenyészet pH-ját folyamatosan módosítanunk kell, hogy az organizmus teljes inaktiválódásához elegendő ideig biztosítsuk a kívánt gyengén alkalikus pH-érték fenntartását. Lúg hozzáadása elsősorban az első néhány órában szükséges, azonban szükséges lehet a tápfolyadék pH-j ának folyamatos módosítása hosszabb ideig, például 20-24 óráig. A tápfolyadék pH-ját bármely megfelelő lúggal beállíthatjuk a kívánt gyengén alkalikus pH-értékre, például alkálifém-hidroxiddal, előnyösen nátrium-hidroxiddal.

Az organizmus inaktiválását követően maga az etilénimin egy olyan alkalmas reagenssel inaktiválható, amely az etilén-imint biztonságosan kezelhető formává alakítja. Alkalmas inaktiváló ágens például a nátrium-tioszulfát, amely az etilén-imin gyűrűs szerkezetét hasítja, valamint a citromsav. A mikoplazma sejteket ezután összegyűjtjük, például centrifugálással, és hogy a

HU 214 245 Β műveletet végző személy etilén-iminnel történő esetleges kontaminációját elkerüljük, a fennmaradó tápfolyadékot további vizes nátrium-tioszulfát oldatba önthetjük ki.

A találmány szerinti megoldás a Mycoplasmatales renden belül bármely a Mycoplasma és Acholeplasma nemzetségbe tartozó organizmusra alkalmazható. Ilyen organizmusok például a M. hyopneumoniae, a M. bovis, a M. dispar, a M. orale, a M. hominis, a M. arginini, és az A. laidlawii. A találmány különösen alkalmazható az ÉPP elleni vakcina előállítására, és azt a továbbiakban kiemelten a M. hyopneumoniae példáján ismertetjük.

A M. hyopneumoniae elleni vakcina előállítására szolgáló eljárás folyamata a kérdéses organizmus törzs-tenyészetéből indul ki. Megfelelő tenyészetek beszerezhetők törzsgyűjteményekből, például a M. hyopneumoniae 10110, (ATCC 25934/1965/) beszerezhető a National Collection of Type Cultures (Colindale, Anglia) intézettől. A törzstenyészetet megfelelő tápfolyadékban felszaporítjuk, majd a végső tenyésztő tápfolyadékba oltjuk. Az előállítani kívánt vakcina mennyiségétől függően a tápfolyadék térfogata például 40-45 litertől 200 literig vagy annál nagyobb térfogatig teqedhet, és a törzstenyészetet a végső tápfolyadék beoltása előtt a végső térfogat 1-10%-ának megfelelő térfogatig szaporíthatjuk fel.

Megfelelő tápfolyadék lehet például kereskedelemben hozzáférhető, szérummal és élesztőkivonattal dúsított húslevesalap. Ehhez általában hozzáadnak egy energiaforrást például glükózt, és egy antibiotikumot például polymixint. A pH-t általában 7,2-7,6 közé kívánatos beállítani. Az organizmust szabályozott pH mellett tenyészetté szaporítjuk, előnyösen pH 7,1 -7,3 érték mellett, a pH-t lúg, például nátrium-hidroxid hozzáadásával szabályozzuk. A tenyésztést szokásos inkubátor hőmérsékleten például 36 °C-on (+/- 1 °C) végezzük, és addig folytatjuk, amíg a tenyészet anyagcsere aktivitása csökkenni kezd, amit a pH beállításához felhasznált lúgmennyisége jelez.

Amint a tenyészet anyagcsere-aktivitása csökkenni kezd, BEA hozzáadásával az organizmust inaktiváljuk. A BE A-t adagolhatjuk ismert koncentrációjú vizes oldatként a tápfolyadékba körülbelül 0,82 g/1 végkoncentráció eléréséig, ami körülbelül 4 mmol/1 koncentrációnak felel meg. Ezzel egy időben vagy közvetlenül a BEA hozzáadása előtt a tenyészet pH-ját megfelelő lúg, például nátrium-hidroxid hozzáadásával gyengén alkalikus értékre, általában körülbelül pH 7,5-re állítjuk be.

A fenti feltételek mellett a BEA gyűrűs vegyületté alakul, így etilén-imin keletkezik, amely inaktiválja a M. hyopneumoniae-t. Ez az inaktiválási folyamat néhány órát, általában körülbelül 24 órát igényel, mely idő alatt a tenyészetet szokásos inkubációs hőmérsékleten tartjuk. Lényeges, hogy az etilén-imin az inaktiváláshoz szükséges ideig folyamatosan jelen legyen a tápfolyadékban. Ha a pH-t nem szabályozzuk a továbbiakban, az idő múltával a tápfolyadék hajlamos savassá válni. A tápfolyadék pH-ját tehát az inaktiválási eljárás alatt folyamatosan mérni kell, és szükség szerint további lúg hozzáadásával a kívánt gyengén alkalikus értéken kell tartani.

Miután az organizmus inaktiválása befejeződött, a tápfolyadékban található etilén-imint egy megfelelő reagens, például nátrium-tioszulfát, vagy citromsavfeleslegben való hozzáadásával elroncsoljuk. Hozzáadhatjuk például feleslegben a nátrium-tioszulfát vizes oldatát, hogy az a tápfolyadékban 1 g/liter koncentrációt érjen el.

Az etilén-imin inaktiválását követően az organizmus sejtjeit ülepítjük, a megmaradó tápfolyadékot további vizes nátrium-tioszulfát oldathoz adhatjuk, ismét előnyösen 1 g/liter végkoncentrációig.

A sejtek ülepítését követően az antigén mennyiségét proteinmennyiség becslésével állapíthatjuk meg. Az ülepítésből származó sejtkoncentrátumból szokásos eljárás szerint vakcinát készíthetünk. Pontosabban, a sejteket az antigéntartalom alapján például fiziológiás pufferes sóoldattal megfelelő mértékben hígítjuk, és kívánt esetben a vakcinát egy megfelelő adjuváns, például olaj, szaponin, vagy DEAE dextrán felhasználásával készíthetjük. A találmány szerinti előnyös adjuváns olaj.

A M. hyopneumoniae-ból a fent ismertetett általános eljárás szerint előállított vakcina megtartotta az élő organizmus antigén sajátságait és azt sikeresen alkalmaztuk sertésekben ÉPP elleni védettség létrehozására.

Anélkül, hogy bármely elfogadott elmélethez ragaszkodnánk, feltételezzük, hogy a vakcina előállítása során a baktériumok inaktiválására alkalmazott szokásos eljárások (például formalinos kezelés) oly módon befolyásolják a baktériumok felszíni fehérjéit, hogy a baktériumok antigén sajátságai károsodhatnak. Egyes esetekben a baktérium sejtek felszíni fehérjéi oly mértékben károsodhatnak, hogy a sejtek többé nem használhatók fel kielégítő minőségű vakcina előállítására, ez különösen érvényes az olyan baktériumok esetében, mint a mikoplazmák, melyekből nehéz tenyészetet előállítani.

Ilyen körülmények között kielégítő minőségű vakcina előállításához olyan eljárást kell alkalmaznunk az organizmus inaktiválására, amely a lehető legkisebb károsító hatással rendelkezik a sejtek antigén sajátságaira nézve. Az etilén-imin feltehetően az organizmus genetikai anyagának (DNS) roncsolása révén inaktiválja az organizmust, anélkül, hogy lényeges hatással lenne a sejtek felületi fehérjéire.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa

100 ml aktívan szaporodó M. hyopneumoniae 10110 törzstenyészethez BEA-t (0,082 g) adtunk, így a tápfolyadékban 4 mmol/1 végkoncentrációt értünk el. A pH-t vizes nátrium-hidroxiddal (1 normál) 7,5-re állítottuk be, majd a pH-t mértük, és az alább ismertetettek szerint

módosítottuk:
1. óra mért	pH = 6,95	beállítva pH = 7,5-re
2. óra mért	pH = 7,2	beállítva pH = 7,5-re
3. óra mért	pH = 7,4	beállítva pH = 7,5-re
4. óra mért	pH = 7,45	nincs beállítás
5. óra mért	pH = 7,45	nincs beállítás
6. óra mért	pH = 7,45	nincs beállítás

A pH beállítása 0,1 normál nátrium-hidroxiddal történt.

A 6 órás időszak alatt óránként mintákat vettünk hígításra és lemezen történő számolásra, 24 óra elteltével

HU 214 245 Β pedig direkt kioltásra is. A 24 óra elteltével vett mintában élő organizmust nem találtunk.

2. példa

A M. hyopneumoniae 10110 törzset az alábbi összetételű tápfolyadékban tenyésztettük:

Húsleves alap	65 ml
Malacszérum	15 ml
Főzött vérkivonat	10 ml
Élesztő kivonat	10 ml
Cisztein HC1 (1%)	1 ml
Glükóz (20%)	5 ml
Fenolvörös (0,4%)	1 ml
Ampicillin (0,5%)	0,5 ml
Tallium-acetát	2,5 ml
A továbbtenyésztést	a következő térfogatnövelési

sorrendben végeztük: 10 ml; 100 ml; 400 ml; 4000 ml. Amikor a 4 literes tenyészet aktív növekedés jeleit mu- 20 tatta (enyhe zavarosság, és eltolódás savas pH irányába), ezt 40 liter friss tápfolyadékba oltottuk. Ennek a tenyészetnek a pH-ját ha a pH csökkenése annak módosítását szükségessé tette, vizes nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával 7,2-n tartottuk.

nap elteltével a nátrium-hidroxid szükséglet csökkent, és sterilizáló szűrőn át körülbelül 100 ml desztillált vízben oldott 36,5 g BEA-t pumpáltunk a tenyészetbe.

A pH-t szükség szerint vizes nátrium-hidroxid oldat adagolásával 7,5-ön tartottuk. 24 óra elteltével a tényé- 30 szetet centrifugálással ülepítettük és a felülúszót citromsav oldattal kevertük, hogy 0,2%-os végkoncentrációjú oldatot kapjunk. Más eljárás szerint ennél a lépésnél 24 óra elteltével a centrifugálás előtt 1,0 g/1 koncentráció eléréséig nátrium-tioszulfátot adunk a tenyészethez, és 35 az elhasznált tápfolyadékot további vizes nátrium-tioszulfát oldatba öntjük. Ez az eljárás az előzővel megegyező eredményhez vezet.

A centrifugálással keletkező koncentrált antigén készítményt 300 ml foszfát pufferes fiziológiás sóoldatban (PBS) szuszpendáltuk, homogenizáltuk és ismét centrifugáltuk. Az ülepített antigént ismét 300 ml PBSben szuszpendáltuk, és -70 °C-on azonos térfogatokra szétosztva tároltuk.

Megfelelő mennyiségű antigénből egy olaj alapú adjuvánsban (Marcol; Arlacel) emulziót készítettünk és sertésnek egyenként körülbelül 13 mg dózisban adagoltuk bőr alá, 10 nem oltott kontroll mellett. 4 hét elteltével mindegyik malacot három egymást követő napon orron keresztül 5 ml térfogatú M. hyopneumoniae organizmust tartalmazó tüdő homogenizátummal fertőztünk. Négy héttel a fertőzést követően a boncolás szerint a kontroll malacokban kiterjedt elváltozásokat találtunk, míg a vakcinázott állatok tünetmentesek voltak, vagyis a vakcinázással teljes védettséget sikerült létrehozni a fer10 tőzéssel szemben.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás vakcina előállítására, amely sertések

   15 Mycoplasmatales rendbe tartozó Mycoplasma és

   Acholeplasma mikroorganizmusok által okozott fertőzésekkel kapcsolatos állapotok elleni védelmére szolgál, amelynek során az említett mikroorganizmusokat alkalmas tápközegben tenyésztjük, a mikroorganizmus sejteket összegyűjtjük és vakcinává feldolgozzuk, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusokat in situ előállított etilén-iminnel végzett kezeléssel inaktiváljuk, amelynek során a tenyészet pH-ját gyengén alkalikus értékre, célszerűen körülbelül 7,0-től körülbelül 8,0-ig terjedő tar25 tományba állítjuk, és a közeghez 2-bróm-etil-amin-hidrobromidot adunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-értékét 7,3 és 7,7 közöttire, célszerűen 7,5 értékre állítjuk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2-bróm-etil-amin-hidrobromid adagolása után a tenyészet pH-ját folyamatosan szabályozva gyengén alkalikus pH-η a mikroorganizmust teljesen inaktiváljuk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-t egy alkálifém-hidroxid adagolásával állítjuk be.
5. 5. Az 1^4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus inaktiválását

   40 követően az etilén-imint vagy annak származékát egy az etilén-imint vagy származékát biztonságosan kezelhető vegyületté alakító reagens, célszerűen nátrium-tioszulfát hozzáadásával inaktiváljuk.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,

   45 azzal jellemezve, hogy M. hyopneumoniae elleni vakcinát állítunk elő.