CZ280615B6 - Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů - Google Patents

Abstract

Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací, tvořený nádobu (1), jejíž dno (10) je opatřeno středovým kuželem (9), mezi nímž a stěnami (17) nádoby (1) jsou vytvořeny komůrky (2) ze spodní strany uzavřené fritou (3), pod níž je vytvořen výpustný kanálek (16), spojený se sifonem (4), jehož výstup je připojen přes přepínací ventil (15) jednak k zásobníku (13) inertního plynu a jednak k nádobě (11) odpadu. Nádoba (1), jejíž stěny (17) ve spodní části svírají se svislou osou reaktoru ostrý úhel () v rozmezí 1.sup.o .n.do 89.sup.o .n.a v horní části tupý úhel () v rozmezí od 91.sup.o .n.do 179.sup.o .n.pro vytvoření záchytné kapsy obsahu nádoby (1) reaktoru při odstřeďování, je opatřena pohonem (14) pro otáčení kolem její svislé osy, přičemž nad nádobou (1) jsou umístěny přívody (7) rozpouštědel a činidel a nad jednotlivými komůrkami přívody (6) roztoků aminokyselin.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká reaktoru pro multisekvenční syntézu peptidů na pevném nosiči s randomizací.

Dosavadní stav techniky

Syntéza peptidů na pevné fázi podle R.B. Merrifielda, popsaná například v publikaci Stewart J.M. and Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1985 vnesla do této oblasti syntézy peptidů i možnosti částečné nebo úplné automatizace, viz Merrifield R.B., Stewart J.M. and Jarnberg N., Apparatus for the automated synthesis of peptides, US 3,531,258; Brunfeldt K. Roepstorff P. and Halstrom J., Reaction systém, US 3,557,077; Kubodera T., Hara I. and Makabe Η., Apparatus for synthesis of peptides or the like organic compounds, US 3,647,390; Won Kil Park and D. Regoli, Systém for the solid phase synthesis, US 3,715,190; Bridgham J. et al., Automated polypeptide synthesis apparatus, US 4,668,476; Saneii H.H., Solid phase synthesizer, US 4,746,490, a tím i řadu realizovaných nebo navrhovaných syntetizátorů. V zásadě se liší chemickou metodologií syntézy, nejčastěji Fmoc nebo Boc strategií: Atherton E. and Sheppard R.C., 1989, Solid phase peptide synthesis. A practical approach. IRL Oxford University Press; Barany G. and Merrifield R.B., 1980,

Solid-phase peptide synthesis, The peptides, Gross and Meienhofer (Eds.) str. 1-284, Academie Press, nebo nosičem, různé druhy polymerů, bavlna a podobně, Alternativě Carriers and Methods in Solid Phase Synthesis; Lebl Μ., Eichler J. and Bienert M. Peptides 1990, Giralt and Andren (Eds.); str. 153-155, a nebo technickým a konstrukčním řešením.

V krátkosti lze syntézu peptidů popsat jako postupné stavění řetězce z aminokyselin, propojených peptidovou vazbou (-CO-NH-), kdy k připojení každé následující aminokyseliny dojde po odchránění aminokyseliny předchozí, za účasti aktivačního činidla. Na pevné fázi tento proces probíhá tak, že první aminokyselina je navázána vhodným způsobem na pevný nosič a celý peptid tak v závěru syntézy zůstává zachycen na nosiči a k jeho získání je nutné konečné štěpeni z nosiče. Obvyklými rozpouštědly, užívanými k syntéze, jsou dimethylformamid, vhodný spíše pro Fmoc strategii, nebo dichlormethan, vhodný pro Boc strategii. Pro postupné odchraňování koncových aminokyselin se užívá v případě Fmoc syntézy asi 20% piperidin v dimethylformamidu, a v případě Boc syntézy asi 50% trifluoroctová kyselina v dichlormethanu. Pro finální štěpení z nosiče se používá v případě Fmoc syntézy trifluoroctová kyselina s 5 až 10 % specifických látek v různých poměrech, a v případě Boc syntézy obvykle fluorovodík, někdy též s přísadami.

Dosud známá konstrukční řešení syntetizátorů se zaměřují na současnou syntézu maximálního množství daných peptidů, nebo na syntézu pouze jednoho a nebo omezeného počtu peptidů v maximálně možné kvalitě a případné i množství. V nedávné době k těmto dvěma přístupům přibyl ještě další, jehož snahou je získat všechny možné kombinace aminokyselinových řetězců o zvolené délce a z předem zvolených aminokyselin, a tento způsob je popsán v Lam K.S., Sal-1CZ 280615 B6 mon S.E., Hersh E.M., Hrubý V.J., Kazmierski W.M. and Knapp R.J., A new type of synthetic peptide library for identifying ligandbinding activity, 1991, Nátuře vol. 354, str. 82-84; Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E., Appel J.R., Dooley C.T. and Cuervo J.H., Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery, 1991, Nátuře vol. 354 str. 84-86 . Touto takzvanou randomizaci se získá banka neboli knihovna peptidů, jejichž nejrůznější aktivity jsou předmětem dalšího imunologického testování.

Dosud známý reaktor pro syntézu peptidů s randomizaci je tvořen trubicí, nasazenou na kruhovém tělese, po jehož obvodu jsou vytvořeny komůrky s pevným nosičem, z nichž každá je ze spodní strany opatřena fritou s výpustným kanálkem a dalším nezbytným příslušenstvím. Trubice je uzavřena hlavou s přívody roztoků aminokyselin, rozpouštědel a činidel. Randomizačního procesu se v tomto reaktoru dosahuje proudem inertního plynu, přiváděného do vnitřního prostoru, který způsobí vzájemné promísení obsahu všech komůrek. V tomto reaktoru je však možno použít jen malého množství polymerního nosiče a tak randomizovat poměrně krátký úsek peptidového řetězce.

Podstata vynálezu

Výše uvedený nedostatek odstraňuje reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizaci, který je tvořený nádobou, jejíž dno je opatřeno středovým kuželem, mezi nímž a stěnami nádoby jsou vytvořeny komůrky, ze spodní strany uzavřené fritou, pod níž je vytvořen výpustný kanálek, spojený se sifonem, jehož výstup je připojen přes přepínací ventil jednak k zásobníku inertního plynu, a jednak k nádobě odpadu. Jeho podstata spočívá v tom, že·nádoba reaktoru je opatřena pohonem pro otáčeni kolem své svislé osy. Stěny nádoby ve své spodní části svírají se svislou osou reaktoru ostrý úhel a v rozmezí od 1° do 89° a v horní části tupý úhel B v rozmezí od 91° do 179° tak, aby byla vytvořena záchytná kapsa, tvořící randomizační prostor, ve kterém dochází při odstřeďování k randomizaci. Nad nádobou jsou v její ose nad středovým kuželem a při horní části stěny nádoby umístěny přívody rozpouštědel a činidel.

Přívod rozpouštědel a činidel je umístěn v ose reaktoru nad středovým kuželem a při horní části stěny nádoby.

Reaktor podle vynálezu umožňuje syntézu všech možných peptidů, tvořených kombinací daného počtu různých aminokyselin o dané délce řetězce, a to oběma hlavními metodami Fmoc a Boc. Konstrukce reaktoru umožňuje vedle randomizace i jeho využití pro běžnou vícenásobnou syntézu peptidů.

Přehled obrázků na výkresech

Na přiloženém výkresu je znázorněn reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizaci, prováděnou odstředěním kuliček pevného nosiče po každém cyklu syntézy.

-2CZ 280615 B6

Příklady provedení vynálezu

Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací je tvořený rotační nádobou 1, jejíž dno 10 je opatřeno středovým kuželem 9. Mezi ním a stěnami 17 nádoby 1 jsou vytvořeny oddělené komůrky 2 s pevným nosičem, ze spoda uzavřené fritou 3_. Pod ní je vytvořen výpustný kanálek 16, ústící do společného sifonu £, jehož výstup je připojen přes přepínací ventil 15 bud' k zásobníku 13 inertního plynu, nebo k odpadní nádobě 11, která je spojena se zdrojem 12 vakua. Nad komůrkami 2 jsou umístěny přívody 6 roztoků aminokyselin a aktivačního činidla, spojené se zásobníky 5 a přívody 7 rozpouštědel a činidel, spojené se zásobníky 8. Spodní část stěny 17 rotační nádoby 1 svírá se svislou osou reaktoru ostrý úhel, její horní část pak tupý úhel. Stěna 17 tak vytváří po obvodu reaktoru záchytnou kapsu, t.j. randomizační prostor, ve kterém se při randomizačním procesu udržuje odstřeďovaná náplň reaktoru. Nádoba 1 je dále opatřena pohonem 14., například krokovým motorem, který umožňuje její rotaci. Počet komůrek 2, oddělených přepážkami, je dán počtem aminokyselin, které mají být variovány a lze jej měnit podle konkrétní potřeby vložením bloků s požadovaným dělením. Také pro různá množství pevného nosiče lze volit blok s vyššími nebo nižšími přepážkami. Pohon 14 je použit při pomalém pohybu pro dávkování promývacích rozpouštědel, a při vysokých otáčkách pro vlastní randomizací.

Reaktor je vybaven zařízením k dávkování roztoků aminokyselin, přiváděných ze zásobníků 8 do jednotlivých komůrek 2. Při pomalém otáčení krokového motoru pohonu 14 se plní všechny komůrky 2. Rozpouštědla a činidla jsou z komůrek 2 odsávána vakuem přes sifon 4, umístěný ve středovém kuželu 9, do odpadní nádoby 11. Během reakce, odchránění, promývání i při dalších operacích se obsah jednotlivých komůrek 2 promíchává slabým proudem inertního plynu, přiváděného do spodní části reaktoru sifonem 4 a fritami 3. Tlak plynu je volen tak, aby došlo pouze k promísení obsahu v každé komůrce 2, a nikoliv mezi komůrkami navzájem. V reaktoru je možné použít jako nosiče polymerní pryskyřici. Pokud nejsou použity předem aktivované aminokyseliny, aktivační činidlo se přidává následně, postupné do všech komůrek 2 analogicky, jako je tomu u promývaciho rozpouštědla. Do reaktoru je naneseno potřebné množství kuliček syntetické pryskyřice ve vhodném rozpouštědle. Odstředěním vysokou rychlostí jsou kuličky promíchány a rovnoměrně rozděleny po obvodu reaktoru. Snížením otáček nádoby 1 reaktoru suspenze kuliček pryskyřice rovnoměrně steče po stěnách 17 nádoby do jednotlivých komůrek 2. Kuličky pryskyřice, které ulpí na stěně 17 nádoby JL, jsou spláchnuty proudem rozpouštědla z přívodu 7, umístěného při stěně 17 nádoby 1, to vše při pomalém otáčení nádoby 1. Rozpouštědlo se odsaje a po přidání roztoků jednotlivých aminokyselin - v tomto případě se do jedné komůrky 2_ přidává vždy stejná aminokyselina - proběhnou reakce. Promývání, odchránění i aktivace probíhá společně shodnými činidly pro všechny aminokyseliny a ve všech komůrkách 2 současně. Po ukončení jednoho cyklu jsou kuličky pevného nosiče vypláchnuty proudem rozpouštědla, přiváděného do rychle se otáčejícího reaktoru, v jeho randomizačním prostoru. Po randomizací a opláchnutí stěn 17 reaktoru se celý postup opakuje. Dávkování libovolné aminokyseliny do libovolné komůrky 2 je umožněno otáčením nádoby 1 reaktoru. Konstrukce reaktoru zůstává stejná, mění se pouze počet a druh rozpouštědel a činidel. Reaktor umožňuje syntetizovat

-3CZ 280615 B6 peptidy s randomizací využitím principu odstředění, kterým se vytlačuje pryskyřice z reakčního prostoru, tj. ze separovaných komůrek 2 do randomizačního prostoru, vytvořeného po vnitřním obvodu stěny nádoby reaktoru, a jejich statistické rozdělení. Možnost běžné syntézy peptidů spolu s randomizační syntézou ve stejném reaktoru dovoluje automatizovanou přípravu peptidů, které mají randomizovanou pouze část své sekvence. Ve srovnání se známou konstrukcí reaktoru pro automatizovanou přípravu peptidů reaktor podle vynálezu umožňuje řádově vyšší objemové množství polymerního nosiče.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací, tvořený nádobou, jejíž dno je opatřeno středovým kuželem, mezi nímž a stěnami nádoby jsou vytvořeny komůrky, ze spodní strany uzavřené fritou, pod níž je vytvořen výpustný kanálek, spojený se sifonem, jehož výstup je připojen přes přepínací ventil jednak k zásobníku inertního plynu, a jednak k nádobě odpadu, vyznačující se tím, že nádoba (1), jejíž stěny (17) ve spodní části svírají se svislou osou reaktoru ostrý úhel a v rozmezí od 1⁰ do 89° a v horní části tupý úhel β v rozmezí od 91° do 179°, je opatřena pohonem (14) pro otáčení kolem její svislé osy, přičemž nad nádobou (1) jsou umístěny přívody (7) rozpouštědel a činidel a nad jednotlivými komůrkami přívody (6) roztoků aminokyselin.
2. 2. Reaktor podle nároku 1, vyznačující se tím, že přívod (7) rozpouštědel a činidel je umístěn v ose reaktoru nad středovým kuželem (9) a při horní části stěny (17) nádoby (1).