CZ278787B6

CZ278787B6 - Reactor for multisequential synthesis of peptides and oligonucleotides

Info

Publication number: CZ278787B6
Application number: CS922934A
Authority: CZ
Inventors: Manfred Ing Csc Pavlik; Vit Ing Pokorny; Zdenek Ing Votruba; Marketa Mgr Rinnova; Jan Kalousek; Karel Ing Zenisek; Martin Ing Csc Fusek; Petr Ing Mudra; Zdenek Bartak; Jan Bolf
Original assignee: Ustav Organicke Chemie A Bioch
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1994-06-15
Also published as: CZ293492A3

Abstract

A reactor for multisequential synthesis of peptides and oligonucleotides on a solid support, formed by a pipe (1) closed from above by a head (34) with central cone (32). In the body (34), between the cone (32) and walls of the pipe (1), around the perimeter of the reactor, there are chambers (2) with solid supports, closed from the lower end by sintered glass (3). Under that there is a discharge channel (8) connected through the discharge block (38) with the block (15) of switching valves for connection to the inert gas feeds (12), drain (11) and collector (14 ). The reactor head (5) is equipped with both the solvent and reagent feed (37), terminated in the inner reactor space by the atomiser (4), and above each chamber (2) by the feed (6) for amino acid and nucleotide solutions. The reactor is further equipped with a drive (22) for turning the head (5) around the vertical axis of the reactor.<IMAGE>

Description

Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů a oligonukleotidůReactor for multi-sequence synthesis of peptides and oligonucleotides

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká reaktoru pro multisekvenční syntézu peptidů a oligonukleotidů na pevném nosiči.The present invention relates to a solid support multi-sequence peptide and oligonucleotide synthesis reactor.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Syntéza peptidů na pevné fázi podle R.B. Merrifielda, popsaná například v publikaci Stewart J.M. and Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesís, Freeman, San Francisco, 1985, vnesla do této oblasti syntézy peptidů i množnosti částečné nebo úplné automatizace, viz: Merrifield R.B., Stewart J.M. and Jarnberg N., Apparatus for the automated synthesís of peptide. US 3 531 258; Brunfeldt K. Roepstorff P. and Halstrom J. , Reaction systém, US 3 557 077; Kubodera T., Hara I. and Makabe H., Apparatus for synthesís of peptides or the like organic compounds, US 3 647 390; Won Kil Park and D. Regoli, Systém for the solid phase synthesís, US 3 715 190; Bridgham J. et al. Automated polypeptide synthesís apparatus, US 4 668 476; Saneii H.H., Solid phase synthesizer, US 4 746 490, a tím řadu realizovaných nebo navrhovaných syntetizátorů. V zásadě se liší chemickou metodologií syntézy, nejčastěji Fmoc nebo Boc strategie: Atherton E. and Sheppard R.C., 1989, Solid phase peptide synthesís. A practical approach. IRL Oxford University Press; Barany G. and Merrifield R.B., 1980, Solid-phase peptide synthesís, The peptides, Gross and Meienhofer (Eds.) str. 1-284, Academie Press, nebo nosičem, různé druhy polymerů, bavlna a podobně, Alternativě Carriers and Methods in Solid Phase Synthesís; Lebl M., Eichler J. and Bienert M.: Peptides 1990, Giralt and Andren (Eds.); str. 153-155, a nebo technickým a konstrukčním řešením.Solid phase peptide synthesis according to R.B. Merrifield, described, for example, in Stewart J.M. and Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1985, has introduced in this field peptide synthesis a number of partial or complete automation, see: Merrifield R.B., Stewart J.M. and Jarnberg N., Apparatus for the automated synthesis of peptide. U.S. 3,531,258; Brunfeldt K. Roepstorff P. and Halstrom J., Reaction System, US 3,557,077; Kubodera T., Hara I. and Makabe H., Apparatus for Synthesis of Peptides or Like Organic Compounds, US 3,647,390; Won Kil Park and D. Regoli, Solid Phase Synthesis System, US 3,715,190; Bridgham J. et al. Automated polypeptide synthesis apparatus, US 4,668,476; Saneii H.H., Solid Phase Synthesizer, US 4,746,490, and thus a series of realized or proposed synthesizers. In principle, they differ in chemical synthesis methodology, most often in Fmoc or Boc strategies: Atherton E. and Sheppard R.C., 1989, Solid phase peptide synthesis. A practical approach. IRL Oxford University Press; Barany G. and Merrifield RB, 1980, Solid-phase peptide synthesis, The peptides, Gross and Meienhofer (Eds.) Pp. 1-284, Academic Press, or carrier, various types of polymers, cotton and the like, Alternative Carriers and Methods in Solid Phase Synthesis; Lebl, M., Eichler, J., and Bienert, M .: Peptides 1990, Giralt and Andren (Eds.); pp. 153-155, or technical and design solutions.

Dosud známá konstrukční řešení syntetizátorů se zaměřují na současnou syntézu maximálního množství daných peptidů, nebo na syntézu pouze jednoho a nebo omezeného počtu peptidů v maximálně možné kvalitě a případně i množství. V nedávné době k těmto dvěma přístupům přibyl ještě další, jehož snahou je získat všechny možné kombinace aminokyselinových řetězců o zvolené délce a z předem zvolených aminokyselin a tento způsob je popsán v Lam K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hrubý V.J., Kazmierski W. M. and Knapp R.J., A new type of synthetic peptide library for identifiing ligandbinding activity, 1991, Nátuře vol. 354, str. 82-84; Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E., Appel J.R. , Dooley c.T. and Cuervo J.H., Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery, 1991, Nátuře vol. 354 str. 34-86. Touto takzvanou randomizaci se získá banka, neboli knihovna peptidů, jejíchž nejrůznější aktivity jsou předmětem dalšího imunologického testováni. Automatická verze zařízení pro syntézu s randomizaci však dosud není známá.The prior art synthesizer designs have focused on the simultaneous synthesis of the maximum amount of a given peptide, or on the synthesis of only one or a limited number of peptides of the highest possible quality and possibly amount. More recently, these two approaches have been supplemented by an effort to obtain all possible combinations of amino acid chains of a chosen length and from pre-selected amino acids, and is described in Lam KS, Salmon SE, Hersh EM, Gross VJ, Kazmierski WM and Knapp RJ , A new type of synthetic peptide library for identifying ligandbinding activity, 1991, Nature vol. 354, pp. 82-84; Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E., Appel J.R. , Dooley c.T. and Cuervo J. H., Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research and Drug Discovery, 1991, Nature vol. 354 pp. 34-86. This so-called randomization yields a bank, or library of peptides, whose various activities are subject to further immunological testing. However, the automatic version of the randomization synthesis device is not yet known.

V krátkosti lze syntézu peptidů popsat, jako postupné stavění řetězce z aminokyselin, propojených peptidovou vazbou (-CO-NH-), kdy k připojení každé následující aminokyseliny dojde po odchránění aminokyseliny předchozí, za účasti aktivačního činidla. Na pevné fázi tento proces probíhá tak, že první amino-1CZ 278787 B6 kyselina je navázána vhodným způsobem na pevný nosič a celý peptid tak v závěru syntézy zůstává zachycen na nosiči a k jeho získání je nutné konečné štěpení z nosiče. Obvyklými rozpouštědly, užívanými k syntéze, jsou dimethylformamid, vhodný spíše pro Fmoc strategii, nebo dichlormethan, vhodný pro Boc strategii. Pro postupné odchraňování koncových aminokyselin se užívá v případě Fmoc syntézy asi 20% piperidin v dimethylformamidu, a v případě Boc syntézy asi 50% trifluoroctová kyselina v dichlormethanu. Pro finální štěpení z nosiče se používá v případě Fmoc syntézy trifluoroctová kyselina s 5 až 10% specifických látek v různých poměrech, a v případě Boc syntézy obvykle fluorovodík, někdy též s přísadami. Agresivita téměř všech uvedených látek je značná a proto dosud nebylo realizováno spojení jak syntézy, tak závěrečného štěpení peptidu v jedné reakční nádobě se současným vícenásobným provedením pro daný počet peptidu. Všechny doposud uvedené syntetizátory se omezují pouze na syntézu, a to v případě vícenásobné syntézy přináší problém závěrečného štěpení značného množství peptidu z nosiče, který je nutno provádět manuálně, nebo s pomocí přídavných zařízení.Briefly, peptide synthesis can be described as sequential chain building from amino acids linked by a peptide bond (-CO-NH-), where each subsequent amino acid is attached after deprotection of the previous amino acid, with the participation of an activating agent. On the solid phase, this process proceeds such that the first amino-1C 278787 B6 acid is appropriately coupled to a solid support so that the entire peptide remains captured on the support at the end of the synthesis and ultimately cleavage from the support is required to obtain the peptide. The usual solvents used for the synthesis are dimethylformamide, more suitable for the Fmoc strategy, or dichloromethane suitable for the Boc strategy. About 20% piperidine in dimethylformamide is used for the sequential deprotection of terminal amino acids, and about 50% trifluoroacetic acid in dichloromethane for the Bm synthesis. For the final cleavage from the carrier, trifluoroacetic acid with 5 to 10% specific substances in different proportions is used in the case of Fmoc synthesis, and in the case of Boc synthesis usually hydrogen fluoride, sometimes also with additives. The aggressiveness of almost all of these substances is considerable, and therefore, both the synthesis and the final cleavage of the peptide in a single reaction vessel have not been combined with the simultaneous multiple performance for a given number of peptides. All of the above synthesizers are limited to synthesis, and in the case of multiple synthesis, the problem of the final cleavage of a considerable amount of peptide from the carrier, which has to be performed manually or with the aid of additional devices, is a problem.

Podstata* vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Výše uvedené nedostatky odstraňuje reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů a oligonukleotidů, jehož podstata spočívá v tom, že na tělese reaktoru se středovým kuželem je uložena trubice, shora uzavřená hlavou reaktoru, přičemž mezi středovým kuželem a stěnami trubice jsou po obvodu reaktoru vytvořeny komůrky, zdola uzavřené fritou. Pod každou komůrkou je veden výpustný kanálek, který ústí přes výpustný blok do bloku přepínacích ventilů, který ke každému kanálku připojuje přívod inertního plynu a odpad. Hlava reaktoru je nad každou komůrkou opatřena přívodem roztoků aminokyselin a nukleotidů a dále přívodem rozpouštědel a činidel. V případě běžné syntézy peptidů a oligonukleotidů je blok přepínacích ventilů připojen rovněž ke kolektoru .The above-mentioned drawbacks are overcome by a multisventional peptide and oligonucleotide synthesis reactor, which consists in placing a tube, closed from above by the head of the reactor, on top of the reactor core, with chambers formed from below fritou. Under each chamber there is an outlet passage that extends through the outlet block to a switch valve block that connects to an inert gas inlet and waste to each passage. The reactor head is provided above each chamber with a supply of amino acid and nucleotide solutions, and a solvent and reagent supply. In the case of conventional synthesis of peptides and oligonucleotides, the switch valve block is also connected to the collector.

Výhodou reaktoru podle vynálezu .je možnost jeho použití pro syntézu peptidů oběma hlavními postupy Fmoc a Boc. Konstrukce zůstává stejná, mění se pouze počet á druh rozpouštědel a činidel, použitých při jednotlivých postupech. Kromě uvedeného, reaktor umožňuje odštěpení navázaných peptidů z nosiče a jejich jímání do zkumavek kolektoru. Reaktor dále slouží k syntetizaci peptidů s randomizací při využití principu flotace a sedimentace ke statistickému rozdělení kuliček nosiče. Vzhledem k tomu, že v tomto reaktoru je možno provádět běžnou syntézu peptidu spolu s randomizační syntézou, lze automatizovat i přípravu peptidů, které mají randomizovanou pouze část své sekvence.An advantage of the reactor according to the invention is that it can be used for peptide synthesis by both the main Fmoc and Boc procedures. The design remains the same, with only the number and type of solvents and reagents used in each process changing. In addition, the reactor allows cleavage of the bound peptides from the support and collection into the collector tubes. The reactor also serves to synthesize peptides with randomization using the principle of flotation and sedimentation for statistical distribution of carrier beads. Since conventional peptide synthesis along with randomization synthesis can be performed in this reactor, it is also possible to automate the preparation of peptides having only a randomized portion of their sequence.

Analogické možnosti syntézy platí v plném rozsahu také pro syntézu oligonukleotidů.Analogous synthesis possibilities also apply in full to oligonucleotide synthesis.

Přehled obrázků na výkreseOverview of the drawings

Na přiložených výkresech je na obr. 1 znázorněn reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů metodou Fmoc i Boc s možností randomizace a dále pro odštěpování připravených peptidů z pevného nosiče pro strategii Fmoc, na obr. 2 reaktor pro syntézu s randomizací bez možnosti odštěpování a na obr. 3 reaktor, upravený proIn the accompanying drawings, FIG. 1 shows a randomized randomized Fmoc and Boc peptide synthesis reactor and cleaves the prepared peptides from a solid support for an Fmoc strategy; FIG. 2 shows a randomized non-cleavage synthesis reactor; 3 is a reactor adapted for

-2CZ 278787 B6 odštěpování peptidů pro strategii Boc. Na obr. 4 a 5 jsou znázorněny dvě z možných variant komůrek pro syntézu peptidů a oligonukleotidů.B6 cleavage of peptides for the Boc strategy. Figures 4 and 5 show two of the possible variants of the peptide and oligonucleotide synthesis chambers.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů a oligonukleotidů podle obr. 1 je tvořený trubicí 1, uloženou na tělese 34 se středovým kuželem 32. Mezi kuželem 32 a stěnami trubice 1 jsou v tělese 34 po obvodu reaktoru vytvořeny komůrky 2 s pevným nosičem. z nichž každá je ze spodní strany uzavřena fritou 3., pod niž je vytvořen výpustný kanálek 8, který je přes výpustný blok 28. veden do bloku 15 přepínacích ventilů. V tomto případě je výpustný blok 38 tvořen uzavíracími ventily, kde vždy jeden ventil přísluší jedné komůrce 2. Přepínací ^: ventily bloku 15 připojují každý výpustný kanálek 2 jednak kolektoru 14., jednak k zásobníku 24 inertního plynu přes přívody 12 a redukční ventily 16 a 17 pro vyšší suspendační a nižší míchací tlak Pl, P2, a jednak k odpaduThe multisquence peptide and oligonucleotide synthesis reactor of FIG. 1 is comprised of a tube 1 disposed on a central cone body 32. A chamber 2 with a solid support is formed between the cone 32 and the walls of the tube 1 in the body 34 around the reactor perimeter. each of which is closed from the underside by a frit 3, under which a discharge channel 8 is formed, which is led through the discharge block 28 to the block 15 of the changeover valves. In this case, the discharge unit 38 formed by closing valves, wherein in each case one valve for the one compartment, the second ^switch: block valves 15 connect each discharge channel 2, second collector 14 th, first, the inert gas reservoir 24 through lines 12 and reducing valves 16 and 17 for higher suspension and lower mixing pressures P1, P2, and for waste

11. Trubice 1 je uzavřena hlavou 5 reaktoru, která je opatřena pohonem 22 pro otáčení hlavy 5. kolem osy reaktoru. V hlavě 5 jsou nad jednotlivými komůrkami 2 vytvořeny otvory pro přívod 6 roztoků aminokyselin a nukleotidů ze zásobníku 10 a nejméně jeden otvor pro přívod 2 rozpouštědel a činidel ze zásobníku 9, přičemž přívod 2 je ^ve vnitřním prostoru reaktoru ukončený rozprašovačemThe tube 1 is closed by the reactor head 5, which is provided with a drive 22 for rotating the head 5 about the axis of the reactor. In the head 5 are openings above the individual chambers 2 for the supply of 6 amino acid and nucleotide solutions from the container 10 and at least one opening for the supply of 2 solvents and reagents from the container 9, the supply 2 being terminated by a sprayer ^{in the} interior of the reactor.

4. K hlavě 5 reaktoru je dále upevněno míchadlo 36 a jeho pohon 21. Do vnitřního prostoru reaktoru dále prochází hlavou 5 přívod 18 pro přetlak inertního plynu a zavedení ochranné atmosféry v reaktoru, spojený přes redukční ventil 37 se zásobníkem 24. inertního plynu. Plyny jsou z nádoby reaktoru odváděny odvodem 19. V tělese 34 a ve středovém kuželu 32 jsou vytvořeny temperovací kanálky 20,. Příslušenství reaktoru rovněž tvoří zdroj 25 vakua, který je přes uzavírací ventily 23 přiveden do bloku kolektoru 14 a do nádoby odpadu 11.4. The stirrer 36 and its drive 21 are further fastened to the reactor head 5. Further, an inlet 18 for inert gas overpressure and the introduction of a protective atmosphere in the reactor connected to the inert gas reservoir 24 via the pressure reducer 37 passes into the reactor interior. The gases are discharged from the reactor vessel through a discharge duct 19. In the body 34 and in the central cone 32, tempering channels 20 are formed. The reactor accessories also form a vacuum source 25, which is fed through the shut-off valves 23 to the collector block 14 and to the waste vessel 11.

Reaktor podle obr. 2 má výpustné kanálky 2 vedeny do společného sifonu 35, jehož výstup je spojen s blokem 15 přepínacích ventilů, který připojuje výstup sifonu 35, stejně jako v reaktoru podle obr. 1, k zásobníku 24 inertního plynu a k odpadu 11.The reactor of FIG. 2 has discharge channels 2 directed to a common siphon 35, the outlet of which is connected to a changeover valve block 15, which connects the outlet of the siphon 35, as in the reactor of FIG.

Reaktor, znázorněný na obr. 3, se od výše popsaných variant liší konstrukčním provedením vstupů a výstupů do vnitřního prostoru reaktoru. V hlavě 5 je nad každou komůrkou 2. vytvořen elektricky nebo hydraulicky ovládaný válec 26, pohybující se ve směru osy reaktoru, ukončený uzavírací zátkou 27. Každá zátka 27 je opatřena přívodem 13 flourovodíku, spojeným přes uzavírací ventil se zásobníkem 28 flourovodíku, přívodem 6 roztoků aminokyselin a nukleotidů a přívodem 2 rozpouštědel a činidel. Ve středovém kuželu 32 tělesa 34 je uložen zdroj 29 světla pro kontrolu hladiny fluorovodíku v jednotlivých komůrkách 2 a pro stejný účel jsou po obvodu tělesa 34 vytvořeny výřezy 30.The reactor shown in FIG. 3 differs from the above-described variants in the design of the inlets and outlets into the interior of the reactor. An electrically or hydraulically actuated cylinder 26, moving in the direction of the reactor axis, terminates in each of the chambers 2, terminating in the direction of the reactor axis, terminated with a stopper 27. Each stopper 27 is provided with a hydrogen fluoride inlet 13 connected via a shut-off valve. amino acids and nucleotides and supply of 2 solvents and reagents. In the central cone 32 of the body 34 there is a light source 29 for controlling the level of hydrogen fluoride in the individual chambers 2, and for this purpose cut-outs 30 are formed around the circumference of the body 34.

Komůrky 2 s pevným nosičem jsou odděleny radiálními přepážkami 31, mezi něž jsou vloženy izolované frity 2· Podobného efektu se dosáhne vytvořením po obvodu tělesa 34 rozmístěných, například kuželových zahloubení 3 3, opět ze spodní strany opatřených fritou 2.The solid support chambers 2 are separated by radial baffles 31 between which the insulated frits 2 are inserted. A similar effect is achieved by providing circumferentially spaced recesses 33 disposed around the body 34, again provided with a frit 2 from the underside.

-3CZ 278787 B6 ' V případě běžné syntézy je počet komůrek 2 dán počtem peptidů, které mají být současně syntetizovány, v případě syntézy s randomizací, počtem aminokyselin, které mají být variovány. Počet komůrek 2 lze měnit vložením jinak dělených bloků. Také pro různá množství pevného nosiče lze vložený blok konstruovat tak, aby vyhovoval požadovanému účelu, například větší výška radiálních přepážek 31 pro běžnou syntézu, menší výška při randomizací a podobně.In the case of conventional synthesis, the number of chambers 2 is determined by the number of peptides to be synthesized simultaneously, in the case of randomized synthesis, by the number of amino acids to be varied. The number of chambers 2 can be varied by inserting otherwise divided blocks. Also, for varying amounts of solid support, the intermediate block can be constructed to suit the desired purpose, for example, a larger height of the radial baffles 31 for conventional synthesis, a smaller height at randomization, and the like.

Reaktor má tři základní funkce. Za prvé umožňuje současnou vícenásobnou syntézu peptidů oběma nejvýznamnějšími metodami Fmoc a Boč. Za druhé umožňuje syntézu všech peptidů, tvořených kombinací daného počtu různých aminokyselin o dané délce řetězce, to jest randomizací, opět oběma metodami, a za třetí je vhodný pro současné štěpení takto připravených peptidů s vyloučením vzájemné kontaminace. V případě oligonukleotidu jsou výše uvedené možnosti syntézy stejné, to znamená, že reaktor umožňuje syntézu, randomizaci i jejich kombinaci všemi standardně používanými metodami a odštěpení připravených řetězců. Pro’ vícenásobnou syntézu peptidů a oligonukleotidu při Fmoc o Boc strategii je reaktor vybaven dávkovacím zařízením roztoků aminokyselin, které jsou pak dodávány prostřednictvím přívodů £, průchozích hlavou 5 reaktoru, přímo do jednotlivých komůrek 2 podle požadovaných sekvencí. Reaktor je dále vybaven otočnou hlavou 5, řízenou krokovým motorem 22. Přívod Z promývacích rozpouštědel a činidel je ukončen rozprašovačem £, umístěným pod hlavou 5 v ose reaktoru. Rozpouštědla a činidla jsou buď odsávána vakuem, nebo vytlačována přetlakem inertního plynu, přiváděného do reaktoru přívodem 18. Během reakce, odchránění, promývání a dalších operací lze obsah jednotlivých komůrek 2 promíchávat nižším tlakem P2 inertního plynu, přiváděného do spodní části reaktoru přes blok 15 přepínacích ventilů a přes uzavírací ventily výpustného bloku 38 pod frity 3. Plyn obsah komůrek 2 rozvíří, ale nezpůsobí smísení obsahu sousedních komůrek 2.The reactor has three basic functions. First, it allows simultaneous multiple peptide synthesis by both the most important Fmoc and Boč methods. Secondly, it allows the synthesis of all peptides consisting of a combination of a given number of different amino acids of a given chain length, i.e., randomization, again by both methods, and thirdly, it is suitable for simultaneous cleavage of the peptides thus prepared, avoiding cross-contamination. In the case of oligonucleotides, the aforementioned synthesis possibilities are the same, i.e. the reactor allows synthesis, randomization and a combination thereof by all standard methods and cleavage of the prepared strands. For the multiple synthesis of peptides and oligonucleotides in the Fmoc o Boc strategy, the reactor is equipped with an amino acid solution dosing device, which is then supplied via leads, through the reactor head 5 directly to the individual chambers 2 according to the desired sequences. The reactor is further equipped with a rotating head 5, controlled by a stepper motor 22. The supply of washing solvents and reagents is terminated by a sprayer 6 located under the head 5 in the reactor axis. Solvents and reagents are either aspirated by vacuum or extruded by the inert gas supplied to the reactor via inlet 18. During the reaction, deprotection, scrubbing and other operations, the contents of the individual chambers 2 can be agitated by lowering the inert gas pressure P2 introduced into the reactor. The gas swirls the contents of the chambers 2 but does not mix the contents of the adjacent chambers 2.

V tomto reaktoru je možno použít všech typů pevných nosičů, jako je pryskyřice, bavlna, bavlněná tkanina a podobně. Podle typu nosiče a podmínek syntézy se upraví dávkovači a promývací proces.All types of solid supports such as resin, cotton, cotton fabric and the like can be used in this reactor. The dosing and washing process is adapted to the type of carrier and the synthesis conditions.

Při odštěpování je třeba zabránit možnému smíchání roztoků odštěpených peptidů. Každá komůrka 2 reaktoru proto musí být ze spoda uzavřena fritou 3. a každé komůrce 2 v tělese 34 reaktoru odpovídá jeden výpustný kanálek 8, vyvedený do výpustného bloku 38.During cleavage, possible mixing of the cleaved peptide solutions should be avoided. Therefore, each chamber 2 of the reactor must be closed from below by a frit 3, and each chamber 2 in the reactor body 34 corresponds to one discharge channel 8 led to the discharge block 38.

Po ukončení vícenásobné syntézy peptidů jsou jednotlivé Komůrky 2. reaktoru s pevným nosičem a navázaným peptidem i dělené těleso 34 reaktoru promyty vhodným rozpouštědlem, například dichlormethanem, a vysušeny. Pak se přidá štěpící činidlo a výsledný roztok peptidů je přívodem 18 pro přetlak inertního plynu, popřípadě připojením zdroje 25 vakua ke kolektoru 14 odsát do zkumavek kolektoru 14,. V případě použití Fmoc strategie je možno použít reaktorovou hlavu 5 ve výše popsaném provedení. Při Boc v jejichž ose plnění komůrek 2 použít reaktorovou hlavu 5 ve výše popsaném provedení, strategii syntézy peptidů je třeba použít válce 26, jsou umístěny všechny potřebné přívody pro _ a obvody plynů. Protože štěpení připravených peptidů probíhá v tomto případě pomocí kapalného fluorovodíku, reaktor musí býtUpon completion of the multiple peptide synthesis, the individual chambers of the solid-support reactor 2 and the bound peptide as well as the reactor partition 34 are washed with a suitable solvent, for example dichloromethane, and dried. Then, the cleavage agent is added and the resulting peptide solution is sucked into the collector tubes 14, via an inert gas overpressure 18, optionally by connecting a vacuum source 25 to the collector 14. When using the Fmoc strategy, the reactor head 5 may be used in the embodiment described above. With the Boc in whose axis of filling the chambers 2 to use the reactor head 5 in the embodiment described above, the peptide synthesis strategy requires the use of cylinders 26, all the necessary inlets for and the gas circuits are located. Since the digestion of the prepared peptides in this case is effected with liquid hydrogen fluoride, the reactor must be

-4CZ 278787 B6 vyroben z inertního materiálu. Před přidáním fluorovodíku přívodem 13 se jednotlivé komůrky 2., ve kterých dojde ke štěpení, uzavřou uzavírací zátkou 27. Reaktor se vychladí na potřebnou teplotu cca -10 ’C cirkulací chladicího média temperovacími kanálky 20., a otevřením ventilů se fluorovodík napustí do jednotlivých komůrek 2. Kontrola množství kapalného fluorovodíku v jednotlivých komůrkách 2 se provádí pomocí světelného zdroje 29 a výřezů 30 v tělese 34 reaktoru. Po ukončení štěpícího procesu se do komůrek 2 zavede ze spoda inertní plyn a fluorovodík se odpaří odvodem 19 plynu, mimo vnitřní prostor nádoby reaktoru. Po přidání rozpouštědla se roztok odštěpených peptidú výše popsaným způsobem odsaje nebo protlačí fritami. 3 do zkumavek kolektoru 14.-478 278787 B6 made of inert material. Before addition of the HF through the inlet 13, the individual chambers 2 in which the cleavage takes place are closed with a stopper 27. The reactor is cooled to the required temperature of about -10 ° C by circulating the cooling medium through the temperature channels 20, and 2. Control of the amount of liquid hydrogen fluoride in the individual chambers 2 is performed by means of a light source 29 and slots 30 in the reactor body 34. Upon completion of the cleavage process, inert gas is introduced into the chambers 2 from below and the hydrogen fluoride is evaporated off via a gas outlet 19 outside the interior of the reactor vessel. After addition of the solvent, the solution of the cleaved peptides is aspirated or sintered as described above. 3 into the collector tubes 14.

Při syntéze peptidú s randomizací může bát hlava 5 reaktoru pevně fixována na trubici 1, neboť do stejných komůrek 2 se dávkují stále stejné aminokyseliny. Analogicky, prostor pod fritami £ může být společný pro všechny komůrky 2. Pokud budou použity především aktivované aminokyseliny, lze aktivační činidlo přidávat pomocí rozprašovače 4, umístěného ve středu reaktoru, a promíchat je následně pomocí proudu dusíku s nadávkovanými roztoky, aminokyselin. Do reaktoru je vloženo potřebné množství kuliček, například syntetické pryskyřice, přičemž počet komůrek 2 je stejný jako počet aminokyselin, které budou variovány. Ve vhodném rozpouštědle jsou kuličky suspendovány a zároveň promíchány proudem inertního plynu, který je do reaktoru přiváděn ze zásobníku 24 inertního plynu přívodem 12 pod tlakem Pl pod jednotlivé frity £ komůrek £. Množství rozpouštědla a tlak inertního plynu musí být takový, aby došlo k dokonalému vzájemnému promísení obsahu jednotlivých komůrek 2. Po rozptýlení kuliček v kapalině, to jest po jejich randomizací, je uzavřen přívod 12 inertního plynu a kuličky sedimentuji zpět do komůrek 2. Kuličky, které případně ulpí na stěně reaktoru, nebo na horních hranách přepážek 31, jsou smyty proudem rozpouštědla z rozprašovače 4. Po přidání roztoků jednotlivých aminokyselin přívody 6, v tomto případě se do stejné komůrky 2 přidává vždy stejná aminokyselina, proběhnou reakce prvního cyklu. Promývání, odchránění i aktivace probíhá společné stejnými činidly pro všechny aminokyseliny ve všech komůrkách 2 současně. Dávkování činidel a rozpouštědel, promíchávání a odsávání je shodné s běžnou výše popsanou multisekvenční syntézou. Po ukončení prvního cyklu jsou kuličky pevného nosiče opět suspendovány do kapaliny pomocí proudu inertního plynu pod tlakem Pl a celý cyklus se opakuje.In the synthesis of randomized peptides, the reactor head 5 can be fixedly fixed to the tube 1, since the same amino acids are still fed into the same chambers 2. Analogously, the space below the frits 6 may be common to all chambers 2. If mainly activated amino acids are used, the activating agent may be added by means of a nebulizer 4 located in the center of the reactor and mixed subsequently using a stream of nitrogen with dosed amino acid solutions. The required number of beads, for example synthetic resin, is placed in the reactor, the number of chambers 2 being the same as the number of amino acids to be varied. In a suitable solvent, the beads are suspended and mixed simultaneously with a stream of inert gas which is fed to the reactor from the inert gas reservoir 24 via an inlet 12 under pressure P1 under individual frits 6 of the wells. The amount of solvent and the pressure of the inert gas must be such that the contents of the individual chambers 2 are mixed perfectly together. After dispersing the beads in the liquid, i.e. after randomizing them, the inert gas inlet 12 is closed and the beads sediment back into the chambers. optionally adhering to the reactor wall, or to the upper edges of the baffles 31, they are washed off by the solvent stream from the nebulizer 4. After the addition of the individual amino acid solutions through the inlet 6, in this case the same amino acid is added to the same chamber 2. Washing, deprotection, and activation proceed in common with the same reagents for all amino acids in all chambers 2 simultaneously. The dosing of reagents and solvents, mixing and aspiration is consistent with conventional multi-sequential synthesis described above. After completion of the first cycle, the solid support beads are again suspended in the liquid by means of an inert gas stream under a pressure of P1 and the whole cycle is repeated.

Reaktor lze použít bez zásadních úprav k syntéze oligonukleotidů všemi běžně používanými postupy. Požadavek bezvodého prostředí lze zajistit utěsněním otočné dávkovači hlavy £ reaktoru, mírným přetlakem suchého inertního plynu, který zabrání vstur·.*,·» *J7-Ý>’ťr\ó a S+·-í vn V < /-.V» ó i »-, 4 · ·— >-* v. V- M *-> -i- ... » j Í u, 1. πι a krfl 4U » U J i Λ KsCÍAlCXiil syntézy i k suspendaci. K dávkování činidel a rozpouštědel lze použít stejný .dávkovači systém, jako v případě syntézy peptidú. Druh a počet činidel a rozpouštědel a řídící program je nutno upravit podle použité metody syntézy. Případné požadavky na chlazení nebo ohřívání reaktoru lze řešit pomocí termostatu a temperovacích kanálků 20 v tělese 34 reaktoru. Syntézou oligonukleotidů se v současnosti připravují o dva až tři řady nižší molová množství materiálu, avšak snížením substituce použitých pevnýchThe reactor can be used without major modifications to synthesize oligonucleotides by any of the commonly used methods. The desirability of the anhydrous environment can be ensured by sealing the rotatable dosing head 6 of the reactor with a slight overpressure of dry inert gas to prevent the ingress of the inert gas. -, -, -, -, -, -, -, -, -, -, -, and - by synthesis and suspension. The same dosing system as for peptide synthesis can be used to dispense reagents and solvents. The type and number of reagents and solvents and the control program should be adjusted according to the synthesis method used. Possible requirements for cooling or heating the reactor can be addressed by means of a thermostat and temperature channels 20 in the reactor body 34. Oligonucleotide synthesis currently produces two to three rows lower molar amounts of material, but reducing the substitution of solids used

-5BAD ORIGINÁL nosičů a úpravou koncentrace použitých činidel vat se stejnými objemy nosiče, činidel a u syntézy peptidú.-5BAD ORIGINAL OF CARRIERS AND ADJUSTING THE CONCENTRATION OF THE WATER AGENTS USED WITH EQUAL VOLUMES OF CARRIER, AGENTS AND FOR Peptide Synthesis.

je umožněno pracorozpouštědel, jakoworking solvents such as

Claims

A reactor for multis sequential synthesis of peptides and oligonucleotides, characterized in that it consists of a tube (I) with a closed head (5) with a stirrer (36) and a body (34) with a central cone (32) underneath. ) between which and the walls of the tube (1) are formed in the body (34) on the periphery of the reactor are chambers (2) with a solid support, closed from below by a frit (3) under which a drain channel (8) is formed block (38) with a switch valve block (15) for connection to the inert gas inlets (12) and the waste (II), the reactor head (5) being provided with a solvent and reagent inlet (7) terminated in the reactor interior by a sprayer (4) and above each chamber (2) a supply (6) of amino acid and nucleotide solutions.

A multis sequential peptide and oligonucleotide synthesis reactor according to claim 1, characterized in that the switch valve block (15) is connected to a collector (14).

3. A reactor for multis sequential synthesis of peptides and oligonucleotides according to claims 1 and 2, characterized in that the reactor is provided with a drive (22) for rotating the head (5) about the vertical axis of the reactor.

A multis sequential peptide and oligonucleotide synthesis reactor according to claims 1 to 3, characterized in that a gas outlet (19) and a protective atmosphere inlet (18) connected through a pressure reducing valve (18) are formed in the reactor head (5). 37) to an inert gas container (24).

A multis sequential peptide and oligonucleotide synthesis reactor according to claims 1 to 4, characterized in that the body (34) and its central cone (32) are provided with temperature channels (20).

6. The multisquence peptide and oligonucleotide synthesis reactor according to claims 2 to 5, characterized in that a vacuum source (25) is connected to the collector (14) and the waste (11) via shut-off valves.

7. A reactor for multis sequential synthesis of peptides and oligonucleotides according to claims 1 and 4 to 6, characterized in that the discharge block (38) is formed by a siphon (35).

A reactor for multis sequential synthesis of peptides and oligonucleotides according to claims 1 to 6, characterized in that the discharge block (38) is formed by shut-off valves (16).

CZ 278787 Ě6

9. A multisquence peptide and oligonucleotide synthesis reactor according to claims 1 to 8, characterized in that in the head (5) a cylinder (26) is displaceably mounted above each chamber (2) in the direction of the axis of the reactor, terminated with a stopper (27). (13) hydrogen fluoride, (19) gas evacuation and (6) amino acid supply.

10. A reactor for multis sequential oligonucleotide peptide synthesis according to claims 1 to 6 and 8 to 9, characterized in that a light source (29) is located in the central cone (32) and cut-outs (30) are formed around the periphery of the body (34). liquid levels in cells (2).

11. Reactor for. multi-sequence synthesis of peptides and oligonucleotides according to claims 1 to 10, characterized in that the chambers (2) are separated by radial baffles (31).

12. A reactor for multis sequential synthesis of peptides and oligonucleotides according to claims 1 to 10, characterized in that each chamber (2) is formed by a conical recess in the reactor body (34).