CZ260593A3

CZ260593A3 - Vaccine for preventing infectious bursitis of poultry and process for preparing thereof

Info

Publication number: CZ260593A3
Application number: CZ932605A
Authority: CZ
Inventors: Bezalel Gutter
Original assignee: Abic Ltd
Priority date: 1992-12-01
Filing date: 1993-12-01
Publication date: 1994-06-15
Also published as: CZ282443B6; EP0600723A3; HU9303369D0; PL177386B1; ES2147557T3; KR0127116B1; RU2126268C1; KR940013536A; BR9304911A; US5804195A; HU214737B; EP0600723A2; EP0600723B1; DE69328341D1; HUT67324A; ZA938952B; IL103939A0; IL103939A; DE69328341T2; CN1072962C

Description

Očkovací látka pro prevenci infekční bursitidy u drůbeže^v způsob její výroby ^sjg^eíi^SSažs&fcSr

Oblast technikv

Vynález se týká očkovací látky pro prevenci infekční bursitidy (zánětu kloubového mazového váčku) u drůbeže, způsobu její výroby a jejího použití. Dále se vynález týká atenuovaných kmenů virů infekční bursitidy.

Dosavadní stav technikv

Infekční bursitida drůbeže je způsobena virem, který náleží do skupiny virů BIRNA. Tyto viry jsou poměrně stálé při nízké hodnotě pH v etheru a chloroformu. Obsahují dva fragmenty dvouřetězcové RNA, které kódují jejich virové proteiny.

Jsou známy dva serotypy, totiž serotyp I, který způsobuje infekční bursitidu (IBD) u kuřat a serotyp II, který byl izolován z krocana a který není patogenní vůči kuřatům. Mateřské protilátky proti jednomu serotypu nechrání proti druhému serotypu. Homologické protilátky však proti této chorobě kuřata chrání.

Infekční bursitida je velmi rozšířena a způsobuje velké ekonomické ztráty. Napadená kuřata jsou postižena diarrheou, svalovým krvácením, nekrosou Fabriciovy bursy a těžkým poškozením imunitního systému. Úmrtnost je vysoká a kuřata, která přežijí, jsou retardována v růstu a jsou vysoce citlivá vůči jiným chorobám.

V průběhu let bylo vyvinuto několik živých oslabených (atenuovaných) očkovacích látek. Tak například v US patentu č. 3 584 055 je popsána očkovací látka, která je účinná proti IBD a která obsahuje oslabený virus IBD získaný několikanásobným pasážováním. V US patentu č 3 769 400 je popsána očkovací látka, která je účinná prot IBD a která obsahuje oslabený virus IBD, získaný pasážováním v myšatech. V US patentu č. 4 530 831 je popsána živá a inaktivovaná očkovací látka proti IBD u drůbeže, určená pro jednorázové podávání ptákům v obvyklém stáří, kdy se očkování provádí. Tato očkovací látka obsahuje virus IBD, uložený ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem VR-2041. Tato očkovací látka není patogenní a může proniknout přes obvyklou úroveň mateřských protilátek, aniž by došlo k poškození bursy mateřsky imunních ptáků. Této očkovací látky se proto používá pro ochranu drůbeže. Očkovací látká se získá čtyřstupňovou plakovou purifikací, po níž následuje dvojí pasážování vejcem. V US patentu č. 4 824 668 je popsána očkovací látka, která je účinná proti IBD u drůbeže a která obsahuje oslabený nebo inaktivovaný kmen viru IBD VR-2161 a nosič nebo ředidlo. Tato očkovací látka se může drůbeži podávat bez toho, že by u očkovaných ptáků vyvolávala symptomy IBD. Takové očkovací látky byly obvykle podávány prostřednictvím pitné vody a až do roku 1988 udělovaly dobrou imunitu. V přihlášce PCT pod označením WO 9001336 je popsána očkovací látka pro prevenci IBD u drůbeže, která je způsobena kmeny neresponsivními vůči soudobým očkovacím látkám (zjevně se jedná o neklasické kmeny). Tato očkovací látka obsahuje usmrcený nebo oslabený nový purifikovaný virus IBD, který je v této přihlášcé popsán.

Roku 1988 se poprvé v Anglii a Holandsku a později i v jiných částech světa, objevil nový kmen, který je velmi patogenní a způsobuje mnohem vyšší stupeň mortality, ve srovnání s tzv. starými kmeny. Existující živé oslabené očkovací látky již proti novému kmenu neposkytovaly žádou ochranu. Nebylo zjištěno, že by nový kmen izolovaný v Evropě byl antigenicky odlišný od starého, tzv. klasického kmene. Na druhé straně však v USA byly izolovány variantní kmeny, které se odlišují od klasických kmenů při zkoušení pomocí zkušebních systémů s monoklonálními protilátkami. Izraelské izoláty, kterých se používá při tomto vynálezu, byly rovněž zkoušeny a zjistilo se, že se podobají evropských kmenům.

Neúčinnost starých očkovacích látek při ochraně proti novým kmenům je mj. způsobena vyšší patogenicitou nových kmenů, které jsou schopny proniknout přes mateřské protilátky přenesené z očkování nově vylíhlých zavedení inaktivovány Koncentrace mateřských chovných slepic na kuřata. Při kuřat jsou viry starých kmenů po těmito mateřskými protilátkami. protilátek po vylíhnutí klesá, přičemž její poločas životnosti je asi 5 dnů. Je-li očkování odloženo na stáří, kdy již nejsou mateřské protilátky detegovatelné, jsou kuřata velmi ohrožena, poněvadž mohou být infikována patogenním polním kmenem před imunizací kmenem, obsaženým v očkovací látce. Z toho důvodu se proto usuzuje, že kmen, obsažený v očkovací látce, by měl být do jisté míry patogenní, aby se dostal přes mateřské protilátky dříve, než tak učiní polní kmeny. Jeho virulence by měla mít střední úroveň.

Nedávno H. J. Tsai a Y. M. Saif [Avian Diseases 36:415-422 (1992)] popsali dva variantní kmeny viru IBD (IN a E), které byly adaptovány a pasážovány v zavedené buněčné linii ledvinových buněk opice (Cercopithecus aethiops sabaeus) (BGM-70). Pasážováním v buněčné kultuře se dosáhlo ztráty patogenicity, zatím co antigenicita a imunogenicita byla zachována. Nedosáhlo se však žádné ochrany proti této chorobě, když byly pasážované viry podány ve formě živých očkovacích látek kuřatům bez specifických patogenů [specific-pathogen-free (SPF)].

Předložený vynález se naproti tomu týká virů, které při pasážování sice ztratily část své patogenicity, ale zachovaly si antigenicitu a drůbeži skutečně udělují imunitu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je očkovací látka pro prevenc infekční bursitidy u drůbeže, jejíž podstata spočívá v tom že obsahuje imunizačně účinné množství živého oslabeného středně patogenního viru IBD, který náleží ke kmeni, který byl uložen ve sbírce ECACC, pod přírůstkovým číslem V92052301 (MB).

Předmětem vynálezu je také očkovací látka pr prevenci infekční bursitidy u drůbeže, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje imunizačně účinné množství živéh oslabeného, středně patogenního viru IBD, který náleží k kmeni, který byl uložen ve sbírce ECACC, pod přírůstkovým číslem V92100106 (MB-2).

Předmětem vynálezu je také očkovací látka pro prevenci infekční bursitidy u drůbeže, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje imunizačně účinné množství živého oslabeného, středně patogenního viru IBD, který náleží kě kmeni, který byl uložen ve sbírce ECACC, pod přírůstkovým číslem V92102209 (MB-1).

Kromě toho je předmětem vynálezu způsob prevence infekční bursitidy u drůbeže, jehož podstata spočívá v tom,, že se ptákům podá imunizačně účinné množství očkovací látky,, obsahující virus IBD, který náleží ke kmenům, které byly uloženy ve sbírce ECACC, pod přírůstkovými čísly V92052301 (MB) a/nebo V92100106 (MB-2) a/nebo V92102209 (MB-1).

Předmětem vynálezu jsou dále tři nové kmeny virů, které byly uloženy ve sbírce ECACC, pod přírůstkovými čísly V92052301 (MB), V92100106 (MB-2) a V92102209 (MB-1).

Dále se vynález týká způsobu výroby živých očkovacích látek, které poskytují drůbeži ochranu proti infekční bursitidě, kteréžto očkovací látky obsahují imunizačně účinné množství kmene viru uloženého ve sbírce ECACC, pod přírůstkovým číslem V92052301 (MB) a/nebo V92100106 (MB-2) a/nebo V92102209 (MB-1).

Vynález se tedy týká tří nových kmenů virů, které byly uloženy ve sbírce ECACC, pod přírůstkovým číslem V92052301 (MB), V92100106 (MB-2) a V92102209 (MB-1).

Jak již bylo uvedeno výše, očkování drůbeže by se mělo provádět velmi brzo, před tím než zmizí mateřské protilátky, poněvadž tím je možno se vyhnout tomu, aby byla kuřata vystavena vysokému riziku infekce patogenními polními kmeny. Proto se předpokládá, že účinný očkovací kmen by si měl zachovat určitou patogenicitu, aby mohl proniknout přes hradbu mateřských protilátek. Tři nové kmeny podle tohoto vynálezu, MB, MB-2 a MB-1, vykazují tyto žádoucí vlastnosti, poněvadž jsou středně patogenní. To jim umožňuje proniknout přes mateřskou imunitu. Zároveň však tyto kmeny nejsou tak virulentní, aby způsobily chorobu. Při zkoušení na kuřatech SPF, která neobsahují protilátky proti IBD, byl kmen MB-1 poněkud méně patogenní než kmen MB a kmen MB-2 byl ještě méně patogenní než MB-1. Všechny tři kmeny udělují dobrou imunitu při podání prostřednictvím pitné vody i v časném stádiu (stáří 1 až 2 týdny) a nejsou patogenní pro mateřsky imunní brojlery a pro chovná kuřata, sloužící pro obnovu hejna. Po očkování však dochází k určitému stupni bursální atrofie.

Původní kmeny byly izolovány z Fabriciovy bursy brojlerových kuřat, která pošla na IBD na dvou farmách v centrální části Izraele v průběhu roku 1989. Virus můž být pěstován ve slepičích vejcích s embryem a v buněčných liniích, jako jsou kultury fibroblastové tkáně kuřecího embrya (CEF), kultury buněčných linií vero a jiné vhodné kultury. Buňky se pěstují až do 80% konfluence v rotujícíč lahvích, baňkách, na mikronosičích nebo jinými metodami které slouží pro pěstování tkáňových kultur. Tři až čtyř dny po infekci vznikne cytopathický efekt (CPE) a virus se sklidí pomocí několika opakovaných cyklů zmrazování a tání po nichž následuje nízkootáčková centrifugace. Pro lyofilizaci supernatantu se přidají stabilizátory. Atenuace (oslabování) a propagace viru budou podrobně popsány v následujících příkladech.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadá také způsob výroby očkovacích látek a jejich podávání. Při způsobu výroby těchto očkovacích látek se postupuje tak, že se vejce s embryi inokulují, embrya a membrány se sklidí a živá očkovací látka, pocházející z homogenátu, který z nich byl získán, se vyrobí za použití přídavku stabilizátoru, kterého se normálně používá u živých ptačích očkovacích látek, jako je pepton, laktóza, sušené práškovité mléko atd.

Může se používat dávky živé očkovací látky v rozmezí od 10^ do 10⁴násobku hodnoty EID_5Q (kde EID_5Qpředstavuje dávku, která je infekční pro 50 % vajec). Živá očkovací látka podle vynálezu může obsahovat jeden z výš0 uvedených kmenů virů nebo směs kterýchkoliv dvou z těchto kmenů nebo dále směs všech výše uvedených kmenů virů.

Jakákoliv z živých také obsahovat j iné může očkovacích látek podle vynálezu viry, například virus New

Ί

Castle-ské choroby nebo virus Markovy choroby nebo virus infekční bronchitidy.

Očkovací látka se kuřatům podává metodami, které jsou v současné době dostupné, jako například prostřednictvím pitné vody, okulárním podáváním ve formě očních kapek, aerosolů nebo jiných postřiků, nasálním podáváním ve formě nosních kapek a jakýmikoliv jinými vhodnými očkovacími cestami.

Kuřata očkovaná živou očkovací látkou, obsahující viry MB a/nebo MB-2 a/nebo MB-1 vykazují odpověd v tom, že se u nich vyvinou precipitační a typově specificky neutralizující protilátky a jsou imunní proti následující infekci izraelským virulentním kmenem viru IBD, jakož i infekci evropským kmenem. Očkovací látky podle vynálezu tedy zřejmě udělují universální imunitu proti IBD.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradě ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Atenuace kmenů

Původní kmeny virů byly izolovány s Fabriciovy bursy brojlerových kuřat, která pošla na IBD na dvou farmách v centrální části Izraele v průběhu roku 1989. Bursy byly rozemlety, odstředěny a přefiltrovány přes filtr Millipore s otvory o velikosti 0,2 μπι. Filtrát byl vstříknut do allantoické dutiny vajec s 11 denním kuřecím embryem SPF. Po inkubaci v délce 72 až 96 hodin byly embrya a membrány vyjmuty, homogenizovány a sériově reinjektovány do vajec s kuřecími embryi SPF, za účelem atenuace.

Kmen MB (ECACC č. V92052301) byl pasážován 43x kmen MB-1 (ECACC č. V92102209) byl pasážován 94x a kmen MB-2 (ECACC č. V92100106), izolovaný z jiné farmy, byl pasážován 71x. Tyto pasážované kmeny byly lyofilizovány á bylo jich použito pro očkování.

Příklad 2

Očkování mateřsky imunních (Μ. I.) brojlerů očkovací látkou

MB

Kuřata typu brojlerů (15 zvířat ve skupině) byla očkována v různém stáří : Jedno očkování v den 2, 7 nebo 14 nebo dvě očkování v den 2 a 14 (viz tabulka 1). V průběhů celého pokusu byla kuřata umístěna v izolovaných jednotkách. Očkování bylo provedeno prostřednictvím pitné vody za použití 10³·³⁵násobku dávky EID₅₀ viru MB na dávku. Koncentrace mateřských protilátek v den 2, 7 a 14 po vylíhnutí činila 1/11, 6/10 a 2/10 (počet AGP pozitivních/ počet zkoušených sér; AGP = precipitin v agarovém gelu)[. Účinnost byla vyhodnocována v den 28 dvěma metodami:

a) serologická odpověď: precipitující protilátky (AGP) nebo systém ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Mezi oběma systémy byla zjištěna velmi dobrá kolerace.

b) ochrana proti infekci: ptáci byli ve stáří 28 dnů provokováni infekcí do oka izraelským virulentním kmenem viru IBD v množství 10⁵násobku EID₅₀, vztaženo na kuře. Také byla provedena infikace kmenem Weybridge 52/70. Po třech dnech byli ptáci usmrceni a jejich Fabriciovy bursy byly zkoušeny pomocí AGP na přítomnosti viru IBD. Očkovaní ptáci byli negativní, zatímco susceptibilní byli pozitivní. Jak u kuřat infikovaných virulentním izraelským kmenem viru IBD, tak u kuřat infikovaných kmenem Weybridge 52/70 byly zjištěny stejné výsledky. To znamená, že očkovací látky podle vynálezu udělují imunitu jak proti izraelskému, tak proti evropskému kmeni.

Byl vypočten hmotnostní poměr bursy k celkové tělesné hmotnosti a bursy byly podrobeny zkoušení na histopatologické leze. Všechny skupiny byly také očkovány živou obchodně dostupnou lentogenní očkovací látkou proti New

Castle-ské chorobě (NDV) ve stáří 14 dnů.
	T a	bulka	1
Stáří při	Serologické	Ptáci	Protilátky	Tělesná
očkování	odpověd	chránění	proti NDV	hmotnost
	na IBD	před pro- vokační
(dny)	AGP Elisa	infekcí	(HI)	(g)

2 0/14*	1/14	2/12**	3,6±0,9	1077± 92
2+14 13/14	13/14	14/14	3,l±0,5	10771148
7 6/14	7/14	14/14	3,5±0,9	958+119
14 15/15	15/15	14/14	3,8±0,8	1114± 83
kontrolní 0/8	0/8	0/8	3,8±0,9	995± 88

* Počet pozitivních/počet zkoušených zvířat ** Počet chráněných/počet zkoušených zvířat zřejmé, že očkovací

Z výsledků uvedených v tabulce 1 je kuřata jsou chráněna, pokud proběhlo očkování látkou s kmenem MB ve stáří 7 dnů nebo později.

Ve stáří 7 dnů přibližně polovina ptáků vykazovala serologickou odpověď a všichni byli chráněni proti infekci Ve stáří 14 dnů byli všichni ptáci imunní, jak je zřejmé ze serologických zkoušek a z odolnosti proti infekci. Žádná ochrana nebyla pozorována, pokud k očkování došlo ve stáří dnů. Hmotnostní poměr bursy k tělu 3 dny po expozici virulentnímu viru činil přibližně 0,25 % u nechráněných skupin (kontrolních skupin a skupin očkovaných ve stáří 2 dnů) a 0,07 % u chráněných skupin (2. + 14., 7. a 14. den). Tento výsledek ukazuje, že se virus dostal přes hradbu mateřských protilátek a způsobil atrofii bursy. Histopatologické zkoumání potvrdilo mírné vyčerpání lymfocytů. Odpověď na očkování NDV u skupin očkovaných IBD byla podobná jako odpověď u kontrolní skupiny. Tělesná hmotnost ptáků očkovaných IBD na konci pokusu nebyla statisticky odlišná od tělesné hmotnosti kontrolní skupiny.

Příklad 3

Orální nebo aerosolové očkování kuřat typu brojlerů Μ. I. pomocí očkovací látky na bázi kmene MB a MB-1

Kuřata typu brojlerů umístěná v isolátorech od 1. dne stáří byla očkována bud ve stáří 12 dnů (skupiny 1 a 2, očkovací látky MB a MB-1) nebo ve stáří 1 a 12 dnů (skupiny 3 a 5, očkovací látka MB) dávkou odpovídající 1O³'⁶⁵násobku hodnoty EID_5Q. Ptáci byli očkováni živou očkovací látkou NDV (kmen VH) 1. + 18. den věku okulární cestou (skupiny 1 až 4) nebo 1. + 12. den věku aerosolovou cestou (skupiny 5 až 6), Ve skupině 5 bylo provedeno kombinované aerosolové očkování

IBDV (MB) a NDV (VH) . Kuřatům byla odebrána krev a byla vystavena infekci 29. den a po třech dnech byla usmrcena. V den 1 mělo 10 kuřat z 10 zděděné mateřské protilátky IBD.

Očkovací látky na bázi kmene MB a MB-1 poskytly vynikající ochranu proti provokační infekci a střední serologickou odpověď při podání pitnou vodou nebo aerosolem. Z tohoto a předcházejícího příkladu se zdá vyplývat, že jedno očkování 12. až 14. den věku má za následek stejnou imunizaci, jako dvě očkování v den 1 a v den 12 až 14.

Nebyl pozorován žádný negativní účinek na tělesnou hmotnost nebo titr NDV, přestože došlo v určitém rozsahu k atrofii bursy.

Dále je možno učinit závěr, že simultánní očkování pomocí kmene MB z Gumboro a očkovací látkou proti New Castle-ské chorobě je možné a vede k podobným výsledkům jako separátní očkování. Toto kombinované očkování bylo provedeno za použití aerosolové techniky prostřednictvím respiračního systému. Tento způsob je doporučován pro očkování NDV. Dále je zřejmé, že aerosolové očkování je dobrý způsob pro očkování očkovací látkou na bázi kmene MB, prováděné ve velkém měřítku.

Protilátky proti NDV

Tělesná hmotnost

Tabulka 2

Očkování proti IBD

Serologická odpověď

Ptáci chránění

Sku-					před prov.	(Hl)		(g)
pina Den	Metoda	Kmen	AGP	Elisa	infekcí
1 12	Λ PV	MB-1	7/8	7/8	8/8	4,0±0,	8	1304±10
2 12	PV	MB	7/8	8/8	0/8	4,6±1,	0	1348+13
3 1+12	PV	MB	10/16	9/16	16/16	4,3±0,	7	1209Í11
4 kontrolní	—	0/8	0/8	0/8	4,2±0,	9	1256±16
5 1/12	aerosol	MB	10/16	10/16	16/16	4,0±0,	9	1031± 9
6 kontrolní	—	0/14	0/14	0/14	4,7±0,	7	1154+10
pv* = pitná voda
Ve skupině	5 bylo prováděno kombinované očkování	proti	IBDV	+ NDV
		P ř	í k 1	a d	4

Porovnání kmene MB s atenuovaným Winterfieldovým kmenem

Kuřata (brojleři) ve stáří 14 dnů byla okulární cestou očkována očkovací látkou na bázi kmene MB (10³'⁷5ná£Obek hodnoty EID50 na jednoho ptáka) nebo očkovací látkou na bázi Winterfieldova kmene (10⁴·²⁸násobek hodnoty EID50 na jednoho ptáka). Winterfieldův kmen je atenuovaný kmen, který nechrání hejna proti současným patogennějším virům. Dvě kontrolní skupiny nebyly očkovány pomocí IBDV. Tři skupiny byly očkovány očkovací látkou NDV v den 1 a v den 17. Ve stáří 31 dnů byla všem ptákům odebrána krev a podrobena zkoušení. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

Očkování	Protilátky	Ochrana proti
proti	proti	provokační
IBDV NDV	IBDV NDV	infekci

MB	VH	10/10	5,2	10/10
Winterf.	VH	0/10	5,1	0/10
—	VH	0/18	4/7	0/18
— —	— —	0/20	2,3	0/20
	Jak je	zřejmé z tabulky 3,	a) Winterfieldův kmen
nechrání	proti	provokační	infekci,	ani nevede ke	tvorbě
protilátek proti	IBD; b)	kmen MB	uděluje vysoký	stupeň

ochrany a vysokou koncentraci protilátek; c) kmen MB nemá žádný nepříznivý účinek na titr protilátek proti NDV.

Příklad 5

Očkování kuřat očkovacími látkami MB nebo MB-2 za použití různých dávek

Očkování bylo prováděno v izolačních jednotkách (jedna jednotka pro každou experimentální skupinu) pomocí očních kapek ve stáří 7 nebo 12 dnů. Byly zkoušeny různé dávky v rozmezí od 10^1,0 do 10³·³⁵násobku hodnoty ΕΙϋ^θ. V tomto příkladě byla očkována obchodně dostupná kuřata (brojleři Μ. I.) a kuřata SPF. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4 a v tabulce 5. Ve stáří 21 dnů (9 nebo 14 dnů po očkování) byla zvířatům odebrána krev, která byla podrobena zkoušení. Po dalších 4 dnech byla zvířata usmrcena a jejich bursy zkoušeny na antigen IBV. Také byl vypočten poměr hmotnosti bursy k celkové tělesné hmotnosti.

Tabulka 4 Kuřata (brojleři Μ. I.)

Očko- Stáří při vací očkování látka (dny)

Dávka Šero- Ochrana Hm. poměr Tělesná násobek logická před prov. bursa/tělo hmotnost EIDjjq odpověd infekcí (%) (g)

MB	7	l₀3,35	14/17
MB	12	10 2,3 5	9/10
MB	12	l₀l,35	9/11
	kontrolní	-	0/11
MB-2	12	10³	5/10
MB-2	12	10²'⁰	5/10
MB-2	12	10¹'⁰	4/10

17/17	0,07±0,03	900±69
10/10	0,07±0,02	921±95
11/11	0,07±0,01	918±86
0/11	0,29±0,06	915+72
10/10	0,07+0,03	988±88
10/10	0,07±0,02	974Ž94
10/10	0,10±0,03	988±93

Očko- Stáří	Dávka náso- bek eid₅₀	Tabulka Kuřata SPI	5	Tělesná hmotnost (g)
Morta- lita po očkování	Sero- logická odpověd	Ochrana před prov. infekcí	Hm. poměr bursa/tělo (%)
vací látka	při očkování (dny)
MB	7	103,35	5/18	7/7	7/7	0,12±0,03	277+40
MB	12	1q2,35	4/15	5/6	6/6	0,ll±0,03	199±20-
MB	12	10¹'³⁵	4/15	5/6	6/6	0,14±0,02	212±33
kontrolní	-	0/15	0/3*	0/8*	0,43±0,17	205+13
MB-2	12	10³'⁰	0/15	5/8	8/8	0,ll±0,02	264±27
MB-2	12	10²'⁰	0/15	7/8	8/8	0,13±0,03	224±44
MB-2	12	10¹'⁰	0/15	6/8	8/8	0,12±0,02	233±17

* 5 kuřat z 8 zahynulo v důsledku provokační infekce. Antigen byl zjištěn u třech přeživších zvířat. V žádné z očkovaných skupin nedošlo k žádnému úhynu.

Z tabulek 4 a 5 je zřejmé, že očkovací látky MB a

MB-2 udělují výbornou ochranu proti provokační infekci již od devíti dnů po očkování a dobrou serologickou odpověď, již při tak nízké dávce, jako je lO-^násobek hodnoty EID_5Q.

Očkovací látka MB-2 je méně patogenní než očkovací látka MB (viz výsledky mortality po očkování u kuřat SPF, které jsou uvedeny v tabulce 5) a vyvolává poněkud slabší serologickou odpověď.

Příklad 6

Očkování jeden den starých kuřat SPF očkovací látkou na bázi kmene MB, MB-1 a MB-2

Kuřata SPF ve stáří 1 dne byla očkována v izolačních jednotkách pomocí očních kapek dávkou, odpovídající 10³·³^násobku hodnoty EIDg_Q. Sedm dní po očkování byla část zvířat z každé skupiny usmrcena a byl vypočten poměr hmotnosti bursy k celkové tělesné hmotnosti. Ve stáří 21 dnů byla zbývající kuřata exponována provokační infekci za použití podobného postupu, jaký byl popsán v příkladu 5.

		- 16 -
	T a	bulka 6
Očkovací 7 dpi*	Mortalita	Serologická	Ochrana
látka	hm.poměr	po očko-	odpověď	proti
	bursa/tělo vání	IBD	infekci
MB	0,12+0,03	8/18	2/6	6/6
MB-1	0,15±0,04	3/18	0/7	7/7
MB-2	0,12±0,03	0/18	2/9	9/9
	0,29±0,05	0/15	0/8	0/8
*dpi =	dny po očkování
	Jak je zřejmé z	tabulky 6 stupeň patogenicity vůč
jednodenním kuřatům SPF	(měření podle	stupně mortality) j
vyšší	u očkovací látky	MB, nižší u	očkovací látky MB-1
nulový	u očkovací látky MB-2. Ochrana proti p	rovokačn
infekci	je velmi dobrá u	všech kmenů.
	P ř	i k 1 a d 7

Identifikace virových proteinů kmene MB a MB-2

A. Příprava virových proteinů pro analýzu

Kuřata byla pěstována v izolaci až do 4 týdnů věku, rozdělena do skupin a infikována takto:

skupina 1 byla infikována divokým typem patogenního viru, izolovaného v Izraeli;

skupina 2 byla infikována jiným izolátem IBDV, z něhož byl kmen MB podle vynálezu vyvinut pasážováním ve vejcích;

skupina 3 skupina 4 skupina 5 byla infikována kmenem MB;

byla infikována dalším izolátem IBDV, z něhož byl kmen MB 2 získán pasážováním ve vejcích;

byla infikována kmenem MB-2.

Tři dny po infikaci byla kuřata usmrcena a jejich Fabriciovy bursy byly homogenizovány a podrobeny opakovaným cyklům zmrazování a tání. Virové částice z každé skupiny byly v ultracentrifuze rozděleny do pásů mezi 40% až 60% sacharozu.

B. Analýza Western Blot

Po zpracování SDS byly proteiny rozděleny na SDS-PAGE (polyakrylamidový gel pro elektroforézu s dodecylsulfátem sodným) v průběhu 4 dnů při výkonu 9 W. Polovina každého gelu byla obarvena modří coomasie a druhá polovina byla převedena na filtry hybond - C pro reakci s SPF negativním šerem (gel A) nebo s konvalescentním kuřecím šerem (gel B). Gely byly zreagovány s králičím protikuřecím šerem a peroxidasou. Obr. 1 představuje reprezentativní příklad takového pokusu. Dráhy 1 až 5 v každém gelu odpovídají skupinám 1 až 5, které byly charakterizovány výše (VP = virový protein).

Jak je zřejmé z obr. 1 konvalescentní sérum (gel B) zreagovalo s VP2 a VP3 viru IBD, zatímco SPF negativní sérum s těmito virovými proteiny nezreagovalo (gel A).

Dále je zřejmé že:

a) VP2 pocházející z MB a z původního kmene, z něhož kmen MB pochází (dráha 2 a 3) se liší velikostí od VP2 z kmene divokého typu (dráha 1).

b) VP2 pocházející z atenuovaného kmene MB-2 (dráha 5) zreagoval s konvalescentním šerem méně intenzivně než VP2 z původního kmene, z něhož kmen MB-2 pochází (dráha 4). Jeho poloha na gelu je podobná jako poloha VP2 všech ostatních virů s výjimkou kmene MB a původního kmene, z něhož kmen MB pochází.

Důležité je zjištění, že kmen MB-2 se jasně liší od původního kmene, z něhož pochází a že kmen MB se liší od většiny jiných kmenů virů IBD, které byly izolovány γ Izraeli.

Příklade

Nepřítomnost virulence reverze

Úkolem tohoto příkladu bylo ukázat, že se stupeň reziduální patogenicity kmene MB nemění v průběhu pasážování viru z ptáka na ptáka. 15 kuřat SPF bylo očkováno ve stáří 1 dne virem MB (množství 10³'⁶⁵násobku hodnoty EID₅₀, vztaženo na jedno kuře). Po třech dnech bylo 5 kuřat usmrceno a jejich bursy posloužily pro infikaci druhé skupiny jednodenních kuřat. 7 dní po každé infekci byla měřena, virulence viru těmito způsoby:

a) vypočtením poměru hmotnosti bursy k celkové tělesné hmotnosti a

b) histopatologickým vyšetřením bursy.

Bylo provedeno 5 takových po sobě následujících pasáží z ptáka na ptáka. Při každé pasáži byla kontrolní skupina infikována kmenem MB a bylo provedeno srovnání mezi patogenicitou viru pasážovaného v ptáku a pategenicitou viru MB, kterého bylo použito pro inokulaci infekce. Patogenicita při první infikaci MB byla vyjádřena dvěma indexy, tj. hmotnostním poměrem bursa/tělo a histopatologickým číslem, které bylo definováno jako 1,00. Tyto indexy jsou označeny v tabulce 1 souhrnným názvem index patogenicity.

Tabulka 7

Index patogenicity³

	titr IBDV	Hm. poměr	Histopato
	EID₅₀/dávka	bursa/tělo*⁵	logie^c
infekce MB	jq3,65	1,00	1,00
pasáž ptákem	>10⁶'³	0,93	0,88
pasáž ptákem	10⁵»	0,92	0,96
pasáž ptákem	10⁴'⁹²	1,00	0,96
pasáž ptákem	1θ4,93	1,07	1,04
pasáž ptákem	10⁴,65	0,93	1,04

Poznámky:

^aIndex patogenicity: patogenicita viru pasážovaného v ptáku vzhledem k patogenicitě MB viru použitého pro první infikaci (která je definována jako 1,00).

^Hmotnostní poměr bursa/tělo u kuřat infikovaných při první infekci MB činil 0,12 až 0,15 %, zatímco hmotnostní poměr bursa/tělo neinfikovaných kuřat o stáří 7 dnů činil 0,30 %.

^cHistopatologické skóre: 0 - normální, bez vyčerpání lymfoidů; 4 - podstatné vyčerpání lymfoidů. Histopatologické zatímco histoskupiny bylo skóre při první infekci MB bylo 2,5 až 2,9, patologické skóre u neinfikované kontrolní

0,23.

Z výsledků uvedených v tabulce 7 lze učinit závěr, že patogenicita kmene MB se v průběhu pětinásobnéhó pasážování z ptáka na ptáka nezvýší.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Očkovací látka pro prevenci infekční bursitidy , i—- ' u drůbeže, vyznačující se tím, že obsahuje imunizačně účinné množství živého atenuovaného středně?, virulentního viru infekční bursitidy, který náleží ke kmeni uloženému ve sbírce ECACC pod přírůstkovým číslem V92052301 (MB).
2. Očkovací látka pro prevenci infekční bursitidy u drůbeže, vyznačující se tím, že obsahuje imunizačně účinné množství živého atenuovaného středně virulentního viru infekční bursitidy, který náleží ke kmeni uloženému ve sbírce ECACC pod přírůstkovým číslem V92100106 (MB-2).
3. Očkovací látka pro prevenci infekční bursitidy u drůbeže, vyznačující se tím, že obsahuje imunizačně účinné množství živého atenuovaného středně virulentního viru infekční bursitidy, který náleží ke kmeni uloženému ve sbírce ECACC pod přírůstkovým číslem V92102209 (MB-1).
4. Očkovací látka podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že je účinná při jediném podání kuřatům v libovolném věku od stáří jednoho dne.
5. Očkovací látka podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že je vhodná pro podávání kuřatům v libovolném věku, kdy je mateřská imunita snížena.
6. Očkovací látka podle nároku 5, vyznačující se tím, že je vhodná pro podávání kuřatům o stáří 10 až 17 dnů.
7. Lyofilizovaná virová hmota, obsahující virus infekční bursitidy, který je uložen ve sbírce ECACC pod přírůstkovým číslem V92052301 (MB).
8. Lyofilizovaná virová hmota, obsahující virus infekční bursitidy, který je uložen ve sbírce ECACC pod přírůstkovým číslem V92100106 (MB-2).
9. Lyofilizovaná virová hmota, obsahující virus infekční bursitidy, který je uložen ve sbírce ECACC pod přírůstkovým číslem V92102209 (MB-1).
10. Očkovací látka pro prevenci infekční bursitidy u drůbeže, vyznačující se tím, že obsahuje imunizačně účinné množství alespoň jednoho živého atenuovaného viru infekční bursitidy, zvoleného ze souboru kmenů, které jsou uloženy ve sbírce ECACC pod přírůstkovými čísly V92052301, (MB), V92100106 (MB-2) aV92102209 (MB-1).
11. Očkovací látka pro drůbež podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje imunizačně účinné množství alespoň jednoho dalšího virů choroby drůbeže.
12. Očkovací látka pro drůbež podle nároku 11, vyznačující se tím, že dalším virem choroby drůbeže je virus lentogenní New Castle-ské choroby nebo Markovy choroby nebo virus infekční bronchitidy.
13. Způsob výroby živé očkovací látky, která chrání drůbež proti infekční bursitidě, vyznačuj ící tím ze se

a) virus infekční bursitidy pěstuje ve vejcích s embryi kuřat SPF, fibroblastech kuřecího embrya (CEF) nebo buněčné linii vero;

b) virový materiál získaný ve stupni a) se sklidí;

c) látka získaná ve stupni b) se stabilizuje; a

d) látka získaná ve stupni c) se lyofilizuje;

přičemž virem infekční bursitidy, pěstovaným ve stupni a), je virus jednoho z kmenů MB (přírůstkové číslo sbírky EGACC V92052301), MB-1 (přírůstkové číslo sbírky ECACC V92102209) nebo MB-2 (přírůstkové číslo sbírky ECACC V92100106).