CZ24177U1

CZ24177U1 - Vakcína pro orální podání hospodářským zvířatům

Info

Publication number: CZ24177U1
Application number: CZ201226153U
Authority: CZ
Inventors: Rychlík@Ivan; Karasová@Daniela; Šebková@Alena; Havlícková@Hana; Matulová@Marta; Šišák@František
Original assignee: Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v.v.i.
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2012-08-14

Description

Vakcína pro orální podání hospodářským zvířatům

Oblast techniky

Řešení se týká vakcíny pro orální podání hospodářským zvířatům, která obsahuje živý oslabený kmen Salmonella enterica CAPM 6474 na ochranu hospodářských zvířat před infekcí salmonelami ve formě atenuované vakcíny s možností serologické diferenciace vakcinovaných a přirozeně infikovaných hejn.

Dosavadní stav techniky

Vakcinace hospodářských zvířat proti infekcí salmonelami lze provádět dvěma typy vakcín inaktivovanými anebo živými oslabenými. Vzhledem k patogenezi onemocnění však oslabené živé vakcíny poskytují výrazně vyšší ochranu před infekcí než vakcíny inaktivované (Papežova aj. 2008, Vet. Med. Czech 53, 315; Robertsson aj. 1983, Infect. Immun. 41, 742; Silva aj., 1981, Avian Dis. 25, 38-52).

První oslabené živé salmonelové vakcíny byly získány dlouhodobým pasážováním v laboratoři nebo náhodnou mutagenezí indukovanou mutageny fyzikální (různé typy záření) nebo chemické povahy (např. působení nitrosoguanidinem). Tyto postupy umožnily selekci kmenů, u kterých byla následně prokázána snížená virulence, avšak se zachovanou imunogenitou. Přestože jsou tyto vakcíny funkční a jsou relativně extenzivně charakterizovány, skutečná příčina jejich oslabení není známa (Guzman aj., 2006, Vaccine 24, 3804-11; Smith 1956, J Hyg. (Lond); 54, 41932). Proto se od poloviny 80. let dvacátého století testují geneticky modifikované vakcíny, tedy s přesně definovaným způsobem oslabení. Při přípravě definovaných mutantních kmenů lze navíc cíleně připravit kmeny, kterým chybí specifické antigeny, které stimulují u infikovaných zvířat produkci protilátek. Absence takového genu a jim kódovaného proteinu pak vede k absenci protilátek v séru vakcinovaných zvířat a vytvoření negativní markerové vakcíny.

Podstata technického řešení

Uvedené nedostatky odstraňuje vakcína pro orální podání hospodářským zvířatům podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že vakcína obsahuje živý oslabený kmen zoopatogenního mikroorganismu Salmonella enterica CAPM 6474, přičemž tento kmen je modifikován třemi nezávislými vyjmutími genetického materiálu, a je uložený ve Sbírce zoopatogenních mikroorganismů v Brně, CZ.

Za účelem zvýšení bezpečnosti živé atenuované vakcíny pro orální užití u hospodářských zvířat původci dále modifikovali atenuovaný kmen, který je předmětem jejich přihlášky vynálezu PV 2011-887. Z kmene Salmonella Enteritidis SPI1 Ion vyjmuli gen kódující hlavní strukturní protein bičíku. Po vakc i nac i tímto kmenem byla zachována aíenuaee i imunogcniía původního kmene Salmonella Enteritidis SPI1 Ion, ale po vakcinaci kmenem SPI1 Ion fliC nedocházelo k tvorbě anti-FliC protilátek, a to ani po intravenózní aplikaci vakcinačního kmene, která vede k masivní produkci protilátek proti LPS.

Vzájemná kombinace mutací SPI-1, Ion a fliC tak vede k ideálnímu novému vakcinačnímu kmeni, který

i) je oslaben dvěma nezávislými mutacemi (zvýšená bezpečnost), ii) je velmi imunogenní (mutace v genu Ion vede k nadprodukci kapsulámích polysacharidů. SPI-1 mutanti neindukují buněčnou smrt u makrofágů), iii) je snadno odlišitelný (nadprodukce kapsulámích polysacharidů vede k tvorbě mukoidních kolonií na běžných agarech a snadnému vizuálnímu odlišení vakcinačního kmene od libovolného terénního kmene Salmonella enterica,

- 1 CZ 24177 Ul iv) umožňuje serologickou diferenciaci vakcinovaných a přirozeně infikovaných hejn Gallus gallus na základě absence anti-FliC protilátek v séru vakcinovaných kuřat.

Podstatou technického řešení je tedy užití kombinace dvou mutací. SPI-1 a Ion, za účelem oslabení Salmonella enterica pro využití jako živé oslabené vakcíny na ochranu chovů hospodář5 ských zvířat a současné vyjmutí genu fliC umožňující serologickou diferenciaci vakcinovaných kuřat od kuřat přirozeně infikovaných Salmonella Enteritidis komerčně dostupnými ELISA soupravami. Připravený konstrukt je vhodný jako orální živá markerová vakcína hospodářských zvířat proti salmonelovým infekcím. Vakcína podle technického řešení byla ověřena původci v praxi ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství v.v.i., Bmo, CZ.

Následující příklady provedení vakcínu podle technického řešení pouze dokládají, ale neomezují. Příklady provedení

Příklad 1

Vakcína pro orální podání hospodářským zvířatům podle technického řešení obsahuje živý oslabený kmen Salmonella enterica CAPM 6474, který byl připraven pomocí lambda red rekombi15 nace. Nejprve byly paralelně připraveny jednotlivé mutace, tedy delece SPI1, delece genu Ion a delece genu fliC. Po náhradě SPI1 za gen kódující rezistenci k chloramfenikolu byla tato modifikace přenesena do nového kmene Salmonella enterica transdukcí P22 fágem. Následně byl gen kódující rezistenci k chloramfenikolu odstraněn pomocí flipázy kódované plazmidem pCP20. Do kmene s úplnou delecí SPI1 byla pomocí transdukce následně vnesena mutace /o«::Cm. Gen kódující rezistenci k chloramfenikolu byl opět odstraněn pomocí flipázy kódované plazmidem pCP20 a do takto vytvořeného kmene (ASPIl ΔΙοη) byla transdukcí vnesena mutace /?/C::Cm. Kmen Salmonella enterica ASPIl A/o« fliC/.Cm byl využit pro testování imunogenity. Pri vakcinačních pokusech byla kmenem Salmonella enterica CAPM 6474 orálně vakcinována jednodenní kuřata linie ISA Brown. Kuřata byla orálně revakcinována o 3 týdny později a čelenžována divokým kmenem Salmonella enterica šero var Enteritidis o další 3 týdny později, tedy ve věku 42 dní. Čelenž byla prováděna jak orálně, tak intravenózně. Kuřata byla utrácena 4 a 14 dní po čelenži a výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1. Vyplývá z ní, že vakcinace chránila kuřata před infekcí divokou Salmonella enterica šero var Enteritidis, protože počty salmonel ve tkáních vakcinovaných kuřat byly 10* až ÍOO* nižší než u nevakcinovaných kontrol. I v případech, kdy byla přítomnost salmonel prokázána pouze kvalitativně, byly ve skupinách vakcinovaných zvířat vždy nižší počty salmonela-pozitivních kuřat než ve skupině nevakcinovaných kuřat. Absence serologické odpovědi na vakcinací Salmonella enterica ASPIl Δίοη fliC.'. Cm tvorbou anti-FliC protilátek je doložena na Grafu 1.

Tabulka 1

Imunizace kuřat Salmonella Enteritidis SVW-Ion-fliC

Vakcinace	den 42	4 DPI	14 DPI
čelenž	játra	slezina	Si. střevo	játra	slezina	sl. střevo
SPI14on-fliC	p.o.	1/6	0/6	0/6*	0/6	1/6	2/6
bez vakcinace	2/6	2/6	6/6	4/6	4/6	6/6
SPI1-lon-fliC	i.v.	2,92±1,37⁴	4,89±0 72*	6/6	5/6	3,29±1,07	2/6
bez vakcinace	4,71±0,39	6,68±0,42	6/6	5/5	4,16±0,38	5/5

^& signifikantně odlišné od skupiny bez vakcinace (t-test, PO.05) * signifikantně odlišné od skupiny bez vakcinace (X² test, P<0.05) p.o. - orální čelenž

i.v. - intravenózní čelenž.

-2 CZ 24177 Ul

V Tabulce 1 jsou shrnuty výsledky detekce saimonei v orgánech vakcinovaných a nevakcinovaných kuřat 4 (den 46) a 14 (den 56) dní po orální nebo intravenózní infekci (DPI). Údaje ukazují buď skutečné počty saimonei na gram tkáně (log CFU/g) anebo počet pozitivních z celkového počtu zvířat.

Tvorba protilátek proti LPS a biČíkovému antigenu F1ÍC po vakcinaci a infekci je znázorněna v Grafu 1.

Panel A, anti-LPS protilátky po orální vakcinaci (den 1 s revakcinací v den 21) a orální infekci v den 42 života kuřat.

Panel B, stejné jako na panelu A, ale pouze s tím rozdílem, že byly detekovány protilátky proti bičíkovému antigenu FliC.

Panel C, anti-LPS protilátky po orální a intravenózní vakcinaci (orální vakcinace v den 1, orální revakcinace v den 21, intravenózní revakcinace v den 42 života) a orální infekci v den 63 života kuřat.

Panel D, stejné jako na panelu C, ale pouze s tím rozdílem, že byly detekovány protilátky proti bičíkovému antigenu FliC. Protože při průkazu anti-FliC protilátek byla použita kompetitivní ELISA, nárůst anti-FliC protilátek je charakterizován poklesem v absorbanci.

Vysvětlivky ke Grafu 1 kosočtverce, SPI1 -Ion vakcinovaná kuřata čtverce, SPIl-Zon-^WC vakcinovaná kuřata kolečka, nevakcinovaná kuřata * - signifikantně odlišné od neinfikovaných kontrol utracených v den 42 (panely A a B) nebo den 46 (panely C a D) ^& - signifikantně odlišné od stejně starých nevakcinovaných, ale infikovaných kontrol, (vše t-test, P<0,05).

Celkové složení vakcíny podle technického řešení a její dávkování

Vakcína podle technického řešení obsahuje pouze živý atenuovaný kmen Salmonella enterica CAPM 6474. Imunizační dávka byla 10⁷ CFU vakcinačního kmene v 0,1 ml inokula na jedno kuře a jednu imunizaci. Při Široké aplikaci se ale předpokládá imunizace orálně podáním v pitné vodě, přičemž dávka 10⁷ CFU na kuře a dávku bude zachována. Kuřata jsou imunizována co nejdříve po vylíhnutí kuřat, ideálně v den 1 života s orální revakcinací 3 týdny po první vakcinaci.

Průmyslová využitelnost

Nová vakcína pro orální podání hospodářským zvířatům obsahuje kmen mikroorganismu Salmonella enterica CAPM 6474, ve kterém byla připravena konkrétní kombinace mutací vedoucí k jeho žádoucímu oslabení se zachováním imunogenity a možností serologické diferenciace po orální aplikaci. Serologická diferenciace umožňuje odlišení vakcinovaných hejn od hejn přirozeně infikovaných divokými kmeny Salmonella enterica. Je proto vhodná jako orální živá markerová vakcína na ochranu hospodářských zvířat před salmonelovými infekcemi.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Vakcína pro orální podání hospodářským zvířatům, vyznačující se tím, že obsahuje živý oslabený kmen zoopatogenního mikroorganismu Salmonella enterica CAPM 6474, přičemž tento kmen je oslabený třemi nezávislými modifikacemi založenými na vyjmutí genetického materiálu, a je uložený ve Sbírce zoopatogenních mikroorganismů v Bmě, CZ.