CZ213895A3 - The use of a hidden antigen of intestinal worms for preparing a vaccine and stimulation method of immunity response - Google Patents

Description

Použití skrytého antigenu hlístů pro výrobu vakcinačního prostředku a způsob stimulace imunitní odpovědi

Oblast techniky

Vynález se týká použití antigenů hlístů v přípravě vakcín pro kontrolu onemocnění způsobeného hlístovými parazity, zvláště u domácích zvířat, a zvláště použití takových antigenů ke kontrole parazitárního onemocnění, spojeného s potlačením nebo změnami přirozené imunity, např. tak zvaným nárůstem v době kolem porodu (periparturientním nárůstem) či ostertagiázou typu li .

Dosavadní stav techniky

Hlístoví paraziti jsou zodpovědní za širokou škálu onemocnění a zamoření škůdci u domácích a jiných zvířat, které mají, vzhledem k vyvolávání ztrát v produkci a dokonce i úmrtnosti zvířat, značnou ekonomickou důležitost. V případě člověka mohou vést hlístové infekce k silnému vysílení a smrti. Pokud jde o domácí zvířata, měla by být zvláštní pozornost věnována krví se živícímu hlístů Haemonchus, který infikuje abomasum přežvýkavců, působí anémii a hmotnostní úbytek a pokud není léčen, často působí smrtelně, a hlístů, který se neživí krví, Ostertagia (Teladorsagia), vyvolávajícímu stejné obtíže, pokud jde o úmrtnost zvířat a rozvoj nemoci, zvláště u skotu a ovcí.

K dalším hiístúm, majícím ekonomickou důležitost, patří Trichostrongylus. Cooperia, Chabertia, Oesophagostomum, Nematodirus, Dictyocaulus a různé motolice (např. Fasciola).

Přirozená imunita vůči hlístům jako je Haemonchus se může vyvinout u stád, nepřetržitě vystavených hlísty infikované pastvě, avšak kontrola hlístových infekcí byla tradičně prováděna za použití protihlístových léčiv spolu s řízením pastvy.

Protihlístová vakcína by měla zřetelné výhody před léčivy, která vyžadují časté podávání a vůči nimž se může vyvinout odolnost, a v posledních letech bylo velké

-2úsilí zaměřeno na imunologické prostředky kontroly.

Nejslibnější výsledky byly až do nynějška získány s bílkovinami, extrahovanými ze střev Haemonchus, které mají schopnost působit jako ochraně antigeny nejen proti Haemonchus, ale i vůči řadě dalších hlístů. Zejména u bílkovinného dubletu H110D, nalézajícího se na luminálním povrchu střeva H.contortus, byla prokázána schopnost vyvolávat ochrannou imunitu vůči haemonchóze u ovcí (viz např. W088/00835).

Tak zvaný nárůst v době kolem porodu, nazývaný také poporodní (postparturientní) nárůst, však představuje zvláštní problém. Tento jev odpovídá zvýšení počtu vajíček červů (obecně hlístů), typicky vajíček mnoha různých druhů, včetně H.contortus, které je pozorováno ve výkalech zvířat během pozdních období březosti a zvláště v době kolem porodu a v časných stádiích laktace. Existuje domněnka, i když plné vysvětlení chybí, že důvodem je přechodné zeslabení imunity, spojené se změnami v oběhových hladinách hormonu proiaktin, ke kterým u zvířat dochází během březosti, nebo snížení sekrece imunoglobulinu na povrchu střevní sliznice, způsobené přenosem imunoglobulinu v plazmě do prsního epitelu a jeho následným vylučováním do mléka. Snížení hostitelovy imunity má za následek zvýšenou produkci vajíček buď vývojem z nedávno polknutých infekčních larev, nebo aktivací či obnovením vývoje zastavených (zbrzděných) larev do dospělého stádia, případně oběma způsoby, vedoucí obratem k vysokým hladinám vajíček (a následné tvorbě infekčních larev) na pastvině právě v době, kdy se rodí další generace zvířat, a tedy nových vnímavých hostitelů, a tím k zajištění přežití a rozmnožení druhů hlístů. Infekční cyklus je tedy nepřetržitý.

K zajištění příslušné ochrany vnímavých zvířat a k prevenci propuknutí pravidelných hlístových zamoření je proto žádoucí přerušit tento infekční cyklus ve stádiu kolem doby porodu. Jak bylo dříve zmíněno, v kritickém období přirozená imunita klesá a jediným prostředkem kontroly nárůstu v době kolem porodu bylo podávání protihlístových léčiv, obecně před připouštěním. Ovšem během březosti

-3zvířata obvykle pokračují v zachycování infekčních larev a parazitismus může být obnoven. Existuje tedy jasná potřeba zlepšené metody kontroly nárůstu v době kolem porodu a sníženi následného výskytu hlístových infekcí u vnímavých mladých zvířat v poporodním období. Nadto i ztráta přirozené imunity vůči gastrointestinálním hlístům u nebřezích zvířat, vznikající ze sezóních změn stravy, ustájení a vystavení parazitům, může vyvolávat onemocnění, často fatální, například ostertagiázu typu II u skotu.

Podstata vynálezu

Autoři nyní překvapivě zjistili, že zvláštní režim vakcinace za použití skrytých antigenů, získaných z hlístů a prováděný za dále popsaných podmínek, je úspěšný ve snížení produkce vajíček hlístů u zvířat, která trpí ztrátou přirozené imunity a zejména u infikovaných březích zvířat, a tím v prevenci nárůstu v době kolem porodu a přerušení infekčního cyklu.

V jednom aspektu vynález poskytuje použití skrytého hlístového antigenu, nebo antigenních fragmentů, prekursorů a funkčně rovnocených derivátů nebo variant těchto látek, které vykazují imunogenní aktivitu vůči jednomu nebo více hlístovým parazitům, k výrobě očkovacího prostředku pro podávání zvířatům nejméně jednou před obdobím anebo během období ztráty nebo úbytku přirozené imunity vůči gastrointestinálním hlístovým parazitům pro podporu obranné imunity vůči uvedeným hlístovým parazitům během období ohrožení přirozené imunity.

Konkrétněji vynález předkládá použití hlístového skrytého antigenu, nebo antigenních fragmentů, prekursorů a funkčně rovnocených derivátů nebo variant těchto látek, které vykazují imunogenní aktivitu vůči jednomu nebo více hlístovým parazitům, k výrobě vakcinačního prostředku pro podávání samicím zvířat nejméně jednou během období před připuštěním a/nebo do začátku třetího trimestru březosti, ke stimulaci ochranné imunity vůči uvedeným hlístovým parazitům během doby kolem porodu a zvláště k prevenci nebo snížení nárůstu v době kolem porodu.

-4Z jiného pohledu může vynález poskytovat způsob stimulace imunitní odpovědi vůči hlístovým parazitům u zvířete během období ohrožení přirozené imunity a tato metoda zahrnuje podání uvedenému zvířeti, nejméně jednou před obdobím nebo během období ztráty či úbytku přirozené imunity vůči gastrointestinálním hlístovým parazitům, vakcinačního prostředku, obsahujícího jeden nebo více skrytých hlístových antigenu nebo anigenních fragmentů, prekursorů a funkčně rovnocených derivátů či variant takových látek, které jsou imunogenní vůči jednomu druhu či více druhům hlístových parazitů.

Konkrétněji vynález poskytuje způsob stimulace imunitní odpovědi vůči hlístovým parazitům u samic zvířat během období kolem porodu a zvláště způsob prevence nebo snížení nárůstu v době kolem porodu, přičemž tento způsob zahrnuje podání uvedenému zvířeti, nejméně jednou během období připouštění a/nebo do začátku třetího trimestru březosti, vakcinačního prostředku, obsahujícího jeden nebo více skrytých hlístových antigenů nebo anigenních fragmentů, prekursorů a funkčně rovnocených derivátů či variant takových látek, které jsou imunogenní vůči jednomu druhu či více druhům hlístových parazitů.

Výraz ohrožení přirozené omunity, jak je zde užíván, zahrnuje ztrátu nebo úbytek přirozené imunity, vedoucí k neúčinné nebo nedostatečné ochraně.

Podle vynálezu se tedy vakcina podává během období, kdy imunitní systém zvířete zůstává funkční a slouží k vytvoření odpovědi na základě paměti vůči antigenu, o nějž se jedná. V případě imunisace v období kolem porodu může být vakcina s výhodou podávána nejméně jednou během období před připouštěním a/nebo do začátku druhého trimestru březosti. Jak bude podrobněji popsáno dále, obecně se dává přednost opakování imunisace jednou nebo víckrát během březosti, v souladu s praxí chovu zvířat.

Úbytek přirozené imunity vůči gastrointestinálním hlístům se může projevovat následovně:

-51. obnovením dospívání pozastavených (zbrzděných) stádií larev;

2. zvýšením rychlosti zdomácnění polknutých infikovaných larev;

3. snížením vylučování existujících dospělých cizopasníků;

4. zvýšením plodnosti zdomácnělé dospělé populace.

Předpokládá se, že všechny čtyři faktory přispívají k nárůstu v období kolem porodu. Pokud jsou uvažovány jiné podmínky, spojené se ztrátou nebo úbytkem přirozené imunity, například ostertagiáza typu II, primární důležitost je přisuzována účinku obnoveného zrání.

Nadto hypobiotické nebo imunologicky zbrzděná stádia larev, tj. larvy procházející sezóním zbrzděním, pozastavením vývoje, což je typické pro některé druhy hlístů, mají sklon dospívat na jaře přibližně v době, kdy u hostitele dochází k porodu a tento jarní vzestup může rovněž přispívat k nárůstu v době kolem porodu. Přirozená imunita vůči hlístům, jako ie Haemonchus působí zejména na časné larvální stádium L4, což je stádium vývoje larev, v němž u tohoto rodu dochází k pozastavení vývoje. Pokud u larev dojde k úspěšnému obnovení vývoje, nemohou již být přirozenou imunitou hostitele omezovány. Oproti tomu skryté antigeny jsou účinné při stimulaci obranné imunity vůči pozdním stádiím larev a vůči zdomácnělým jedincům v dospělém stádiu, uniklým přirozenému obrannému mechanismu hostitele.

Účinek předkládaného vynálezu, kterým je stimulace obranné imunitní odpovědi během období, kdy je přirozená imunita vůči hlístům ohrožena (například během obvyklého snížení imunitní odpovědi vůči parazitům v době březosti), vyvolávající prevenci nebo snížení nárůstu v době kolem porodu, je překvapivý a neočekávaný; dřívější studie ukázaly, že vakcinace ovcí a skotu za pomoci antigenů, přispívající podle imunologických testů k růstu přirozené imunitní odpovědi, není účinná. V případě imunisace v době kolem porodu tedy nebylo možné očekávat, že by po poskytnutí prvotní imunisace zvířatům před nebo krátce po připuštění a následné druhotné imunisace během březosti mohla imunisace úspěšně vyvolat imunitní odpověď, schopnou předejít nárůstu v době kolem porodu.

-6Podobně nemohlo být očekáváno, že by další podmínky, spojené se ztrátou nebo úbytkem přirozené imunity, jako je ostertagiáza typu II, mohly být rovněž kontrolovány pomocí imunisace v období ohrožené přirozené imunity.

Aniž by bylo žádoucí vázat se teorií, předpokládá se, že účinku je prvotně dosaženo prevencí dozrávání hypobioticky nebo imunologicky zbrzděných larev do dospělého stádia a tím snížením úrovně zdomácnělé infekce. Významnou roli může mít také snížení počtu vajíček, produkovaných dospělými parazity. To může být zvláště významné u hlístů jako jsou Ostertagia, kde dozrávání zbrzděných larválních stádií u březích zvířat nebo následné klimatické změny u obou pohlaví skotu často vedou ke smrtelnému onemocnění, například ostertagiáze typu II.

Dalším důležitým faktorem periparturientního účinku (v době kolem porodu) může být přenos, přes mlezivo a krmené mládě, ochranných mateřských protilátek, indukovaných imunisací se skrytými antigeny, který může být rovněž významný při snižování výskytu infekce, například způsobené kmenem Haemonchus, u mladých zvířat po polknutí larvev vzniklých z vajíček, která jsou výsledkem nárůstu v době kolem porodu. To je naprosto odlišné od přirozené imunity, která není přenášena z matky na potomka.

Výraz skrytý antigen, jak je zde používán, definuje takové antigeny, známé také jako latentní (cryptic), nepřímé (covert) či utajené (concelaed) antigeny, které nemohou během obvyklého průběhu nemoci přijít do styku s imunitním systémem hostitele a které proto nemohou být stanoveny v séru zvířat, která dříve získala přirozenou imunitu vůči uvedeným parazitům. Takové antigeny tedy obecně pocházejí z vnitřních částí hlísta, které nejsou během infekce vystaveny imunitnímu systému hostitele. Zvlášť bohatým zdrojem skrytých antigenů se ukázalo být například střevo hlísta.

Prekursorem antigenu, o nějž se jedná, může být rozsáhlejší bílkovina, která se upravuje, např. proteolytický, k získání antigenu samotného. Takové prekursory

-7mohou mít formu zymogenů, tj. neaktivních prekursoru enzymů, které jsou aktivovány proteolytickým štěpením, analogickým například jako u systému pepsin/pepsinogen, nebo u dobře známých zymogenů, zapojených v kaskádě srážlivosti krve.

Vzhledem k tomu, že skryté antigeny uplatňují své účinky tím způsobem, že v krevním oběhu hostitele vyvolají tvorbu imunitních efektorových molekul, jako jsou protilátky nebo systém komplementu, které jsou parazitem vstřebávány při polknutí hostitelovy krve, předpokládalo se nejprve, že koncepce skrytých antigenů bude omezena na parazity, živící se krví. Avšak autoři vynálezu prokázali, že lze skryté antigeny použít i jako základ vakcín vůči hlístovým parazitům, kteří krev nesají.

Výraz imunologenní aktivita, jak je zde užíván, označuje takové antigeny a jejich fragmenty, prekurzory, deriváty a varianty, schopné vyvolávat imunitní odpověď chránící hostitele, tj. odpověď hostitele, která vede k vytvoření efektorových imunitních molekul, protilátek nebo buněk, které sterilizují nebo snižují plodnost parazitů, poškozují je, inhibují nebo zabíjejí a tím snižují produkci vajíček a zároveň chrání hostitele proti klinickému nebo subklinickému onemocnění a ztrátě produktivity.

Taková ochranná imunitní odpověď vůči skrytým antigenúm se může nejčastěji projevovat tvorbou protilátek, které jsou schopné inhibovat metabolické funkce parazita, což vede k jeho ochromení, nedostečné produkci vajíček a/nebo smrti. Tato tvorba ochranných protilátek, zejména IgG, které jsou přítomné v séru hostitele, je důležitým faktorem, odlišujícím typ imunitní odpovědi vyvolané skrytými antigeny od odpovědi, pozorované u přirozené imunity. Zatímco imunitní efektorový mechanismus, založený na skrytých antigenech, je prvotně humorální, tj. zprostředkovaný protilátkami, přirozená imunita vůči parazitům se zdá být primárně zprostředkovaná buněčně, tj. eosinofily a žírnými buňkami, které jsou zapojovány do akce k uvolnění sloučenin, poškozujících parazita a humorální část imunitní odpovědi je méně důležitá.

-8 Tyto rozdíly, pozorované u imunity indukované skrytými antigeny, jsou považovány za důležitý faktor, přispívající k úspěšnosti skrytých antigenů v kontrole hlístových onemocnění během období ohrožení přirozené imunity, například při nárůstu v době kolem porodu a u ostertagiázy typu II u skotu.

Jak bylo dříve uvedeno, do rozsahu tohoto vynálezu jsou zahrnuty funkčně rovnocenné fragmenty, deriváty a varianty skrytých antigenů hlístů. Výraz funkčně rovnocenné je zde použit k označení bílkovin, včetně glykoproteinú, příbuzných s přírodními bílkovinami nebo od nich odvozených, u nichž bylo pořadí aminokyselin pozměněno jednoduchou nebo násobnou aminokyselinovou substitucí, adicí a/nebo deleci, a rovněž k označení sekvencí, v nichž byly aminokyseliny chemicky modifikovány, včetně použití deglykosilace a glykosiiace, které si však přesto uchovávají ochranou antigenní (imunogenní) aktivitu; jsou například schopné zvyšovat ochraně protilátky hostitele a/nebo funkční imunitu vůči hlístům. Takové funkčně rovnocenné varianty mohou vzniknout jako přirozené biologické odchylky, nebo mohou být připraveny za použití známých technik. Například funkčně rovnocenné rekombinantní bílkoviny mohou být připraveny za použití známých technik stranově řízené mutageneze, náhodné mutageneze, Či enzymového štěpení a/nebo spojování nukleových kyselin.

Jak bylo výše uvedeno, při periparturientní imunizaci (v době kolem porodu) je vakcinační prostředek na bázi skrytých antigenů podáván samicím zvířat nejméně jednou během období před připuštěním a/nebo do začátku třetího trimestru březosti a s výhodou do začátku druhého trimestru. Obecně se však vakcína podává více než jednou, například formou primární injikace před připuštěním a jedné či více zesilovacích aplikací během období do začátku třetího trimestru a s výhodou do začátku druhého trimestru březosti.

Vakcína může být s výhodou podávána nejprve v období od 60 dnů před připuštěním do 20, či lépe do 10 dnů po připuštění, například během 45 dnů do připuštění anebo lépe během období od 40 do 5, zvláště pak od 40 do 10 dnů

-9před připuštěním. Ačkoli se dává přednost podávání první vakcinační injekce krátce před připuštěním, různé chovné postupy na odlišných farmách však mohou určovat, že imunizace v různých časových obdobích, například 6 měsíců před připuštěním, nebo i krátce po narození mladých zvířat, může být výhodnější.

Podání zesilovací dávky může být provedeno kdykoli po připuštění až do počátku třetího trimestru březosti. Zesilovací dávka může být podávána například jednou nebo vícenásobně v době až do počátku druhého trimestru či počátku třetího trimestru březosti.

Jak bylo dříve uvedeno, vakcinace stejným imunogenem se může provádět během odpovídajícího období více než jedenkrát a pro různá zvířata či vakcíny mohou být vhodné různé kombinace.

Jinou možností je však použití systému, uvolňujícího antigen řízeným způsobem, který může indukovat dlouhodobou imunitní odpověď po jedné vakcinaci (O'Hagan se spoluautory, Immunology 73, 239-242, 1991). Pokud je prvotní injekce podána více než 6 měsíců před připuštěním, obecně je vyžadována další injikace během 6 měsíců před připuštěním. V některých případech může stačit roční zesilovací injekce, například v zimním období, pokud je malé riziko infekce. Dvojnásobné podání vakcíny na bázi H110D asi 40 dnů a 10 dnů před a asi 90 dní po připouštění bylo shledáno jako příklad vhodného imunizačního režimu k účinné imunizaci ovcí vůči Haemonchus.

Ačkoli imunizace zvířat pouze během pozdní březosti byla shledána neúčinou, pokud není použit vakcinační prostředek pro řízené uvolňování, jedno nebo více zesilovcích podání vakcíny by mělo být s výhodou aplikováno během doby březosti až do počátku třetího trimestru; například u ovcí mezi dnem 50 a 100, např. mezi 45 a 90 dny březosti.

Živočichy, pro které může být využit předkládaný vynález, mohou být lidé či

- 10jakákoli zvířata, ale přednost se dává zvířatům, chovaným jako společníci, zvláště psům a kočkám a domácím zvířatům, zejména přežvýkavcům. Zvláště lze zmínit ovce, skot, vysokou zvěř a kozy.

Množství hlístů je spojeno s nárůstem v době kolem porodu a jsou proto vhodným cílem pro vakcinační prostředek. Patří mezi ně zvláště druhy Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Chabertia, Oesophagostomum, Hyostrongylus, Nematodirus, Toxocara a Cooperia. Skryté antigeny lze získat od řady takových hlístů.

Přednost se dává těm antigenům, nazývaným také širokospektré antigeny, které kromě toho, že stimulují ochranou imunitní odpověď hostitele vůči hlístům, z nichž byly isolovány, jsou schopné tuto odpověď stimulovat i vůči řadě jiných hlístových parazitů.

Skryté antigeny používané podle tohoto vynálezu mohou být s výhodou jakoukoli integrální membránovou bílkovinou, isolovanou ze střeva hlísta, včetně například enzymů, strukturálních bílkovin nebo jakékoli jiné funkční bílkoviny, nutné pro existenci a/nebo vývoj hlísta, např. bílkovin zapojených v výživově zásobním mechanismu hlísta. Takové bílkoviny mohou zahrnovat například enzymy jako jsou proteázy či exo- a endopeptidázy, zapojené v odbourávání požité bílkoviny na volné aminokyseliny.

Ke vhodným skrytým antigenům patří dříve zmíněný H110D, jehož příprava v rekombinantních formách je popsána ve WO93/23542. Zmínit lze rovněž bílkovinný komplex H45, popsaný ve WO90/11086 a antigeny popsané ve WO94/02169. Antigeny v posledním z uvedených příkladů zahrnují integrální membránové bílkoviny, přirozeně se vyskytující ve střevech parazita a charakteristické tím, že jsou schopné vázat se na pepstatin a na lektin z pšeničných klíčků, na arašídový lektin a jiné lektiny, vykazující specifitu pro β-vázaný N-acetylgalaktosamin. Takovými antigeny mohou být proteolytické enzymy, zejména enzymy, mající

-11 aktivitu aspartylproteázy a/nebo neutrální endopeptidázy. Zvláště je nutno zmínit antigeny H-gal-GP a O-gal-GP, popsané podrobně ve WO94/02169.

Antigeny a jejich fragmenty, prekursory a funkčně rovnocenné varianty a deriváty mohou být přirozenými antigeny, isolovanými přímo z hlístů, nebo mohou být připraveny technikou rekombinantní DNA za použití standardních postupů jako jsou ty, popsané například Sambrookem a spoluautory (Molecular Cloning, laboratorní příručka, 2. vydání, Cold Spring Harbour Press), nebo chemickou syntézou, jako dobře známým Merrifieldovým postupem syntézy v pevné fázi.

Vakcinační prostředek, podávaný zvířeti, může být polyvalentní, s obsahem řady antigenních složek, které jsou aktivní například vůči celé škále druhů hlístů.

Vakcinační prostředek může být podle vynálezu připraven metodami, které jsou dobře známé v oboru výroby vakcín. Tradiční vakcinační prostředky mohou obsahovat jeden nebo více antigenů nebo protilátek podle vynálezu dohromady, pokud je to vhodné, s jednou nebo více adjuvantními látkami, například hydroxidem hlinitým, síranem hlinito-draselným, saponinem nebo jejich deriváty, muramyldipeptidem, minerálními nebo rostlinnými oleji, NAGO, Novasomes či neiontovými blokovými kopolymery, DEAE dextranem anebo se systémy k řízenému uvolňování antigenů, jako jsou biologicky degradovatelné mikročástice, v přítomnosti jednoho nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů nebo ředících látek. K vhodným nosičům patří kapalná média jako je solný roztok, který lze použít jako vehikulum k zavedení peptidů nebo polypeptidů do zvířete nebo pacientovi. Zahrnuta mohou být i přídavná činidla, jako jsou konzervační látky.

Alternativní vakcinační prostředek může obsahovat virus nebo buňku hostitele, například mikroorganismus, který může být živoucí, mrtvý nebo oslabený, s vloženou molekulu nukleové kyseliny (např DNA) ke stimulování imunitní odpovědi, zacílené vůči polypeptidům, kódovaným touto vloženou molekulou nukleové kyseliny.

- 12Podávání vakcinačního prostředku lze provádět jakýmikoli běžnými cestami, například orálně nebo parenterálně jako injikací do svalu, podkožně nebo do kůže. Obecně se dává přednost injikaci.

Vynález bude nyní podrobněji diskutován se zvláštním zřetelem k prevenci periparturientního nárůstu (v době kolem porodu) hlísta Haemonchus u ovcí za použití skrytého antigenu H110D. Aby nebyla omezena dříve definovaná všeobecnost vynálezu, bude předpokládáno, že použití antigenu Haemonchus k prevenci periparturientního nárůstu tvorby vajíček Haemonchus u ovcí představuje upřednostňovaný aspekt vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

V následujících Příkladech obrázky znázorňují:

Obrázek 1 znázorňuje střední množství vajíček ve fekáiiích (v tisících vajíček na gram) v závislosti na času u očkovaných a neočkovaných březích a nebřezích bahnic, provokovaných infekčními larvami Haemonchus ve 110 dni březosti.

O skupina D • skupina E

V skupina F

V skupina G □ skupina C (17 březích bahnic, očkovaných H110D a klostridiální vakcínou COVEXIN 8) (18 březích bahnic, očkovaných H110D) (5 nebřezích bahnic, očkovaných H110D a COVEXIN 8) (3 nebřezí bahnice, očkované H110D) (17 březích bahnic, očkovaných ferritinem jako kontrola)

Šipka označuje dobu provokace; a

Obrázek 2 znázorňuje ochranu jehňat ve stáří 5 týdnů vůči provokaci HL contortus pomocí přenosu protilátek vůči H110D mlezivem (množství vajíček ve fekáiiích, v tisících na gram) v závislosti na času (dny po středním datu narození).

-13° jehňata očkovaných ovcí • jehňata kontrolních ovcí

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad je zaměřen (i) na stanovení účinnosti vakciny H110D při kontrole produkce vajíček cizopasníků, spojených s infekcí H. contortus, u bahnic během doby kolem porodu.

(ii) ke sledování protilátkové odpovědi jak u březích, tak u nebřezích bahnic ke stanovení účinku březosti na imunogenitu antigenu H110D.

(iii) ke stanovení účinkuspolečně podávané klostridiální vakciny COVEXIN 8 na účinnost vakciny H110D. Slučitelnost existujících bakteriálních vakcín s novými parazitárními vakcínami je nezbytným předpokladem pro jejich zavedení do praxe.

Úvod

Tato studie stanovuje účinnost vakciny H110D při kontrole produkce vajíček cizopasníků u jehnic (chovné ovce do druhého roku), očkovaných dvakrát předběžně a poté k zesílení během doby březosti, které podstoupily umělou provokaci infekčními larvami H. contortus během posledního trimestru březosti. Tyto jehnice byly porovnávány s očkovanými nebřezími kontrolami, které byly ve stejném stáří.

- 14 Časová tabulka (hlavní data) datum_číslo dne_činnost začátek září - 50

-40 - 10 - 8

110 březen/duben 147 červenec/srpen 267 jehnice, které dostaly dávku levamisolu (NILVERM GOLD) vypuštěny na pastvu rozdělení do náhodných skupin a první vakcinace druhotná vakcinace spojení s berany přibližně na 3 týdny (střední skupinové datum početí) všechny jehnice obdržely ivermectin(ORAMEC DRENCH) a byly ustájeny třetí vakcinace všechny jehnice obdržely asi 10 000 infekčních larev H. contortus. Začalo dvoutýdenní odebírání vzorků z fekálií.

začátek porodů odstavení jehňat

Metoda a pokusné uspořádání

Šedesáti jehnicím, které obdržely levamisoi (NILVER GOLD) k odstranění zátěže jakýchkoli zdomácnělých cizopasníkú, byl ponechán přístup do výběhu od počátku září 1991. Po minimálním období sedmidenní aklimatisace byly jehnice náhodně rozděleny do tří skupin A, B a C, zahrnujících 35, 8 a 17 jehnic. Jehnice ve skupinách A a B byly očkovány H110D (v den - 40), zatímco jehnice skupiny C byly očkovány ferritinem jako kontroly. Po 30 dnech (v den - 10) obdržely jehnice druhé očkování a poté byly ihned rozděleny do následujících skupin: jehnice ze skupiny A byly rozděleny tak, aby vznikly dvě nové skupiny, D a E, zatímco zvířata ze skupiny B podobně vytvořila skupiny F a G. Berani byli přidáni během posledního týdne v říjnu k bahnicím ze skupin C, D a Ε , aby bylo střední skupinové datum oplodnění co možná nejblíže ke dnu 0 a plánované datum porodu byl poslední týden března a

- 15první týden dubna. Jehnice ve skupinách F aG nebyly připuštěny beranem, aby mohly působit jako očkované nezabřezlé kontroly. Po asi 6 týdnech byli berani z výběhů odstraněni a všechny jehnice byly ponechány pást se v jednom stádu. V den 80 obdržely všechny jehnice ivermectin (ORAMEC DRENCH) k odstranění všech dospělých cizopasníků a zbrzděných larev a byly ustájeny. Třetí vakcinace byla provedena pomocí H110D, podávaným všem jehnicím ve skupinách D, F, E a G v den 90 (což je 90 dní březosti ± 10 dní). Jehnice ve skupinách D a F rovněž obdržely ve stejné době injekci COVEXIN 8. Ve 110. den březosti ± 10 dní všechna zvířata podstoupila provokaci přibližně 10 000 infekčními larvami H.contortus. Počty hlístú byly sledovány odebíráním vzorků z fekálií. Nepřítomnost možného snížení imunitní odpovědi vůči skrytému antigenu H110D během doby březosti byla potvrzena sledováním hladiny protilátek.

Souhrn skupin zvířat:

označení skupiny	stav vakcinace		březí/nebřezí
skupina A	dvakrát předběžná vakcinace (H110D)	březí
skupina D	H110D + COVEXIN 8 v 90. dnu březosti	březí
skupina E	H110D v 90. dnu březosti	březí
skupina B	vakcinace (H110D)	}	nebřezí
skupina F	H110D + COVEXIN 8	}	nebřezí
skupina G	H110D	}	nebřezí
skupina C	vakcinace (ferritin)	}	březí

} = doba vakcinace odpovídající skupinám D a E

TESTOVANÉ MATERIÁLY

Popis:

Vakcina Haemonchus contortus (H110D) byla dodána a připravena Ústavem i

í

- 16 studií živočišné fysiologie a genetiky (Institute of Animal Physiology and Genetic

Research) v Babraham, Cambridge. Adjuvantním systémem pro prvotní vakcinaci bylo Freudovo kompletní adjuvans s hydroxidem hlinitým (FCA/AI(OH)₃ ) a pro druhou i třetí vakcinaci bylo použito Freudova nekompletního adjuvans s hydroxidem hlinitým (FIA/AI(OH)₃).

Kontrolní vakcina koňského ferritinu byla poskytnuta a připravena rovněž Ústavem studií živočišné fysiologie a genetiky v Babraham, Cambridge. Použitý adjuvantní systém byl stejný jako výše popsaný.

PARAZITÁRNÍ PROVOKACE

Druhy/kmeny:

Ve studii byl použit kmen H.contortus odolný vůči benzimidazolu (kmen H/CR). Kmen byl získán jako třetí larvální stádium z Centrální veterinární laboratoře, Weybridge. Odolnost vůči benzimidazolu byla potvrzena testem líhnutí z vajíček a kontrolním testem (R.J.G. Cawthorne a F.H. Cheong, Veterinary Record 114, 562, 1984).

Larvální kultura:

Dostatečné množství larev ve třetím vývojovém stádiu bylo získáno pasážováním přes jehně, které nebylo napadeno hlísty. Fekálie obsahující vajíčka byly sbírány a kultivovány do infekčního stádia. Infekční larvy pak byly shromážděny a pročištěny za použití přístroje Baermann.

Infekční dávky:

Inokula o přibližně 10 000 infekčních larvách byla připravena standardními postupy ředění. Larvy byly podávány tlamou za použití plastových trubic.

Způsob provokace

K umožnění kontrolované provokace v posledním trimestru březosti byly

-17 všechny jehnice ošetřeny ivermectinem (ORAMEC DRENCH) k odstranění jakýchkoli nahromaděných obtíží působených cizopasníky a neprodleně ustájeny v

80. den. Všechny jehnice pak obdržely ve 110. dni březosti provokační dávku přibližně 10 000 infekčních larev H. contortus, která byla použita k napodobení rozvoje periparturientního nárůstu (kolem doby porodu) kontrolovaným způsobem.

POKUSNÉ POSTUPY

Kontrola sklonů:

Všechny jehnice byly rozděleny do skupin na základě tělesné hmotnosti a stanovené doby.

Postup vakcinace:

Jehnice ve skupinách A a B byly očkovány intramuskulární injekcí do zadních končetin (1 ml do každé nohy, celkově 2 ml) obsahující 150 antigenu H. contortus (H110D) v den -40 a opět do předních končetin (1 ml do každé nohy, celkově 2 ml) v den -10. V den 90, po vytvoření skupin D, E, F a G, obdržely všechny jehnice v těchto čtyřech skupinách třetí dávku vakcíny pomocí intramuskulární injekce do zadních končetin (postupem jako byl dříve popsaný). Současně byla jehnicím ve skupinách D a F podkožně do krku (podle pokynů výrobce) injikována klostridiální vakcína COVEXIN 8. Jehnice ve skupině C zůstaly jako kontroly a obdržely injekce koňského ferritinu (stejnou cestou a ve stejném objemu jako byla podávána vakcína H110D) v den -40, -10 a 90 a podkožně COVEXIN 8 v den 90.

STANOVENÍ OCHRANY

Množství vajíček ve fekáliích:

Vzorky fekálií byly odebírány z konečníku (rektálně) od všech jehnic v týdenních intervalech počínaje přibližně šestým týdnem před porodem až do ukončení studie. Počty vajíček ve fekáliích byly určovány pozměněnou

-18McMasterovou metodou s přesností na 10 vajíček na gram (epg, eggs per gram) fekáiií. Vzorky fekálií byly kultivovány ve čtrnáctidenním intervalu po 7 dní při 27°C k identifikaci larev a potvrzení čistoty provokace.

Protilátková odpověď po vakcinaci pomocí ConAH11:

Krevní vzorky byly odebírány z krční žíly všech jehnic do zásobníků běžné krve ve čtrnáctidenním intervalu po prvotní vakcinaci. Předběžné odběry byly shromážděny v den prvotní imunizace pro získání referenčních sér. Hladiny protilátek byly stanovovány metodou ELISA.

VÝSLEDKY

Výsledky studie jsou znázorněny na obrázku 1. Ten jasně ukazuje, že neočkované březí bahnice (skupina C) produkují následně po umělé provokaci v době kolem porodu vysoké hladiny vajíček hlístů. Všechny očkované bahnice však ve fekáliích produkují podstatně snížené počty vajíček. Ochrana nebyla snížena u bahnic, které obdržely společně podávanou klostridiální vakcínu.

Tabulka 1 ukazuje výsledky testů ELISA, stanovujících hladiny protilátek u testovaných zvířat. Je z ní zřejmé, že všechny očkované bahnice vykázaly vyšší hladiny protilátek než neočkovaná kontrolní zvířata.

Hladiny protilátek u očkovaných březích bahnic byly podobné jako hladiny u nebřezích očkovaných zvířat, což potvrzuje nepřítomnost suprese (potlačení) protilátkové odpovědi na skryté antigeny. Současné podání klostridiální vakcíny COVEXIN 8 neovlivnilo hladiny protilátek.

-19Tabulka 1

Hodnoty absorbance vzorků séra, zředěných 1:1 000, vůči H110D v testu ELISA

zvíře č	skupina	90 dni břez.	100 dní břez.	zvíře č.	skupina	90 dní břez.	100 dní břez.
223	C	0.459	0.419	180	E	1.714	2.132
226	•	0.267	0.287	191	•	1.905	2.420
231	4	0.203	0.148	193	«	1.856	2.290
234	4	0.096	0.178	199	a	2.123	2.309
235	•	0.112	0.234	209	a	1.965	1.998
236	«	0.098	0.294	212	a	1.093	2.104
237	•	0.150	0.108	214	a	1.654	2.S20
23B	•	0.741	0.552	224	•	1.556	2.708
175		0.119	0.108	227		1.486	2.314
195		0.229	0.175	228	a	1.278	2.236
202		0.495	0.267	233	a	1.202	2.218
204		0.358	0.247	239		1.155	2.251
207		0.118	0.153	240	«	1.673	2.531
210	*	0.339	0.308	241	•	1.391	2.548
215	•	0.190	0.117	245	a	1.921	2.484
				248	•	1.268	2.505
217		NS	NS	253	•	1.750	2.408
216		NS	NS	298	a	1.911	2.222
	PRŮMĚR	0,271	0,247		PRŮMĚR	1,606	2,344
222	D	0.880	2.165	198	F	2.062	2.105
230		1.289	2.288	203	a	1.792	NS
244		2.126	2.523	243	a	1.373	2.446
247		1.871	2.553	246	a	1.865	2.326
249		1.910	2.505	264	a	1.436	2.418
250		1.894	NS		PRŮMĚR	1.706	2.23
255		1.710	2.459
190		1.918	2.283
194		1.837	2.311
196		1.556	2.241
197		1.658	1.875	189	G	1.565	2.285
200		1.864	2.137	205		1.271	1.761
208		2.066	2.199	272	•	1.637	2.484
211		1.869	2.066		PRŮMĚR	1.409	2.217
213		1.418	2.443
274		1.612	2.239
300		1.301	2.214
	PRŮMĚR	1,692	2,281

skupina G = nebřezí (jen H110D) skupina D = březí (H110D + COVEXIN 8) skupina E = březí Gen H110D) skupina F = nebřezí (H110D + COVEXIN 8) skupina C = březí kontroly s ferritinem NS = nebyly odebrány vzorky

-20Příkiad 2

Přenos imunity, zprostředkované H110D, mlezivem

Účel pokusu:

Ke stanovení, že ochrana může být mladým jehňatům udělena přenosem mleziva. Ochrana byla měřena u jehňat ve stáří přibližně 5 týdnů, sajících u bahnic, které byly imunisovány pomocí H110D, ve srovnání s jehňaty neimunisovaných bahnic. Ochrana byla stanovována jako snížení produkce vajíček ve fekáliích a obtíží způsobených cizopasníky po provokaci.

Uspořádání pokusu:

Uspořádání je shrnuto v Tabulce 2:

Tabulka 2

skupina	počet jehňat k provokaci	provokace ve stáří 5 týdnů (larvy L3)
očkovaných H110D během březostí	6	3 000
jehňata bahnic, neočkovaných H110D během březosti	6	3 000

Všechny podrobnosti o imunisaci březích bahnic pomocí H110D jsou popsány v Příkladu 1. Deset jehňat, narozených bahnicím imunisovaným H110D, spolu s deseti jehňaty kontrolních bahnic, bylo vybráno při prvním odchytu ve stáří 2-3 týdny. Jejich antiséra byla testována metodou ELISA ke stanovení hladiny protilátek vůči H110D. Šest jehňat s nejvyššími hladinami protilátek bylo vybráno od skupiny bahnic, imunisovaných H110D a šest kontrolních bylo zvoleno tak, aby

-21 odpovídala věkem. Tyto dvě skupiny jehňat byly ve věku 4-5 týdnů provokovány pomocí 3 000 larev L, H. contortus (kmene H/CR). Množství vajíček ve fekáliích byla stanovována od 8-11 týdnů a obtíže vyvolané cizopasníky byly vyčísleny po nekropsii v 11 týdnech.

Výsledky:

Přenos protilátek vůči H110 prostřednictvím mleziva byl potvrzen jejich vysokými hladinami u šesti jehňat bahnic, imunizovaných H110D, viz Tabulka 3. Oproti tomu u jehňat kontrolních bahnic nebyly protilátky vůči H110D nalezeny.

Tabulka 3

věk jehňat (týdny)	2/3	3/4	7/8	8/9	10/11
	střední optická densita při 405 nm
jehňata bahnic imunis. H1110D	1,5	1,6	0,9	0,9	0,6
jehňata kontrolních bahnic	n.d.	; n.d.	n.d.	n.d.	n.d.

n.d. = nenaměřeny zředění séra činilo 1/1 000

Celkový počet vajíček ve fekáliích byl ve věku 8 až 11 týdnů přibližně o 50 % nižší (P<0,05) u jehňat od imunisovaných bahnic oproti jehňatům kontrolních bahnic (viz obr. 2), v souladu s menším množstvím dospělých samičích cizopasníků (viz dole). Hlavními obtížemi byly 5 týdnů po provokaci:

-22Tabulka 4

skupina	střední cizopasné zatížení	% ochrany	střední poměr samic/samců
jehňata bahnic imunisovaných H110D	625	30,0	0,35
jehňata kontrolních bahnic	892		1,15

Snížení obtíží, působených cizopasníky nebylo významné (P>0,05). Došlo však ke značnému snížení poměru samic a samců (P<0,05), charakteristickému účinku imunisace H110D u dospělejších jehňat.

Souhrn:

Jehňata, narozená bahnicím imunisovaným pomocí H110D a u nich vyrůstající, vykazovala podstatné hladiny protilátek vůči H110D, získané přenosem mleziva.

Tyto protilátky jim udělují ochranu vůči produkci vajíček do fekálií a obtížím způsobeným cizopasníky, vzniklým provokací ve stáří pěti týdnů.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití skrytého antigenu hlístů, fragmentů, prekursorů a funkčně rovnocenných derivátů či j variant těchto látek, s imunogenní aktivitou vůči jednomu nebo více druhům hlístových parazitů, k výrobě vakcinačního prostředku pro podávání zvířeti nejméně jednou před a/nebo během doby kolem porodu, ke stimulaci ochranné imunity vůči uvedenému hlístovému parazitu během doby kolem porodu. 1
2. 2. Použití podle nároku 1 pro výrobu vakcinačního prostředku pro podávání samicím zvířat nejméně jednou během období před připuštěním a/nebo do začátku třetího trimestru březosti, ke stimulaci obranné imunity vůči uvedeným hlístovým parazitům během doby kolem porodu.
3. 3. Použití podle nároku 2 pro výrobu vakcinačního prostředku pro předcházení nebo snížení nárůstů v době kolem porodu (periparturientního nárůstu).
4. 4. Použití podle nároku 2 nebo 3 pro výrobu vakcinačního prostředku pro podání samici zvířete nejméně jednou před připuštěním a nejméně jednou během březosti až do počátku třetího trimestru březosti.
5. 5. Použití podle nároku 4 pro výrobu vakcinačního prostředku pro podání samici nejméně jednou před připuštěním a nejméně jednou během březosti až do počátku druhého trimestru březosti.
6. 6. Použití podle nároku 1 pro výrobu vakcinačního prostředku pro boj s ostertagiázou typu II.
7. 7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že uvedený skrytý antigen hlístů je integrální bílkovinou střevní membrány.
8. 8. Použití podle nároku 7, vyznačuj íc í se tím , že uvedený antigen hlístů je enzymem nebo transportní bílkovinou.
9. 9. Použití podle nároku 8, vyznačuj íc í se t í m , že uvedený antigen hlístů je proteázou nebo exo- či endopeptidázou.
10. 10. Použití podle nároku 9, vyznačuj íc i se t í m , že uvedený antigen hlístů je zvolen z antigenů H110D, H45 , H-gal-GP a 0-gal-GP, nebo z antigenního fragmentu těchto látek nebo z prekursorů těchto látek.
11. 11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se t í m , že uvedeným zvířetem je přežvýkavec.
12. 12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že uvedené zvíře je zvoleno z ovcí, Skotu, vysoké zvěře, koz a psů.
13. 13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 ke stimulaci obranné imunity vůči hlístům, zvoleným z Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Chabertia, Oesophagostonum, Hyostrongylus, Nematodirus, Toxocara a Cooperia.
14. 14.Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že uvedený vakcinační prostředek je ve formě prostředku pro řízené uvolňování.
15. 15. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a 7 až 14 antigenů H110D nebo jeho antigenního fragmentu pro výrobu vakcinačního prostředku ke kontrole nárůstu v době kolem porodu fekální produkce vajíček Haemonchus u ovcí.