BG61934B1 - Приложение на антихелминтни ваксини при лечение на паразитнозаболяване, свързано със загуба на естествения имунитет - Google Patents

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до приложението на хелминтни антигени при приготвянето на ваксини за третиране на заболяване, причинявано от хелминтни паразити, по-специално при домашните животни, и особено при използването на такива антигени при лечението на паразитно заболяване, свързано със супресия/изменение на естествения имунитет, например така нареченото перипартуриентно (околородово) увеличаване или остертагиаза тип II.

Предшестващо състояние на техниката

Хелминтните паразити причиняват голям брой заболявания и инвазии при домашните и при други животни, които водят до загуба на животинска продукция и дори до смърт. Хелминтните инфекции при хора могат да доведат до значително изнемощяване и смърт. Особено внимание при домашните животни трябва да се отдели на Haemonchus, хранещ се с кръв нематод, който инфектира сирището на преживните животни, причинявайки анемия и загуба на тегло, и ако не се лекува многократно причинява смърт, и на Ostertaqia (Teladorsagia) - нематод, който не се храни с кръв, причиняващ същите проблеми по отношение на смъртността и заболеваемостта на домашните животни, особено при говедата и овцете.

Други хелминти, които могат да причинят големи поражения, са Trichostrongylus, Cooperia, Chabertia, Oesophaostomum, Nematodirus, Dictyocaulus и различни метили (например Fasciola).

Техническа същност на изобретението

Естественият имунитет по отношение на хелминти като Haemonchus може да се развие в стада, продължително пребиваващи на пасище, при които контролът на хелминтната инфекция традиционно е бил осъществяван чрез антихелминтни препарати, заедно с третиране на пасището. Прилагането на антихелминтна ваксина има явни предимства пред другите лекарствени препарати, които изискват продължително прилагане и срешу които може да се развие резистентност, като усилията в последните години са насочени към имунологичните методи за лечение.

Най-обещаващи резултати понастоящем са получени с протеини,екстрахирани от червото на Haemonchus, които имат потенциала на защитни антигени, не само срещу него, но и срещу други хелминти. Протеиновият дублет H110D, открит върху луменната повърхност на червото на H.Contortus, е показал качествата си да създава защитен имунитет срещу хемонхоза в овце /вж.например W088/ 00835/.

Така нареченото перипартуриентно увеличаване, също наричано и постпартуриентно увеличаване, представлява особен проблем. Този феномен представлява увеличаване на броя на хелминтните (общо нематоди) яйца, типично за тези от различните видове, включително H.Contortus, които са наблюдавани в екскрементите на животни по време последните стадии от бременността и особено около времето на раждане и ранните фази на лактацията. Въпреки че не е напълно установено, счита се, че това се дължи на временно намаляване на имунитета, свързано с промените в циркулиращите ниви на хормона пролактин, който се среща в животните по време на бременността, или намаляване на имуноглобина, секретиран в мукозната повърхност на червото, дължащо се на преминаване на имуноглобулин в плазмата към епитела на млечната жлеза, последвано от неговата секреция в млякото. Редуцирането на имунитета на гостоприемника завършва с увеличаване на производството на яйца от развитието на наскоро погълнати от гостоприемника ларви или от активиране/ възобновяване на развитието на блокирани ларви до възрастни форми, или и двете, което води до високи нива на яйца (и последващо получаване на инфектирани ларви) върху пасбището. Точно по времето на появата на следващото поколение животни, което следователно представлява нов податлив гостоприемник, който и осигурява преживяването и раз пространението на хелминтните видове. Така цикълът на инфекцията продължава.

За да бъдат податливите животни адекватно защитени и да се предотврати регулярното избухване на глистна инвазия, е желателно да се прекъсне този цикъл на инфекция на околородовия стадий. Тъй като естественият имунитет спада през критичния период, единственият способ за контролиране на перипартуриентния растеж е прилагането на антихелминтни лекарства преди чифтосване. По време на бременността, обаче животните обикновено продължават да приемат заразени ларви и състоянието на паразитизъм може да бъде възстановено. Съществува реална необходимост от усъвършенстван метод за контролиране на околородовото увеличаване и редуциране на последващия инцидент с хелминтна инфекция на податливи млади животни в постродовия период. Загуба на естествен имунитет към гастро-интестинални нематоди в животни които не са бременни, възниква също от сезонни промени в диетата, лагеруване и паразитно въздействие също могат да доведат до заболяване, често с фатален край, например остертагиаза тип II при говедата.

Подробно описание на изобретението

Особеният режим на ваксиниране с използването на скрити антигени, получени от хелминти, при условията, описани както следва, е успешен при редуцирането на продукцията на хелминтни яйца в животните, страдащи от загуба на естествен имунитет, и особено в инфектирани бременни животни, и следователно може да се използва за предотвратяване на околородовото увеличаване и прекъсване на цикъла на инфекция.

Изобретението осигурява приложение на хелминтен скрит антиген или антигенни фрагменти, прекурсори и функционалноеквивалентни производни или варианти от това, имащи имуногенна активност срещу един или повече хелминтни паразити, в производството на състав на ваксина за прилагане на животно, предварително поне един път и/или през период на загуба или намаляване на естествения имунитет към гастро-интестинални хелминтни паразити, за да се стимулира защитният иму нитет срещу споменатите хелминтни паразити през периода на компрометиран природен имунитет.

Нещо повече, изобретението предлага прилагане на хелминтен скрит антиген или антигенни фрагменти, прекурсори и функционалноеквивалентни производни или техни варианти, имащи имуногенна активност срещу един или повече хелминтни паразити, в производството на състав на ваксина за прилагане на женско животно, предварително поне един път през период на чифтосване и/или до започването на третото тримесечие на бременността, през която да стимулира защитен имунитет срещу споменатите хелминтни паразити през перипартуриентния период, и особено да предпази или редуцира перипартуриентното увеличаване.

Изобретението може също да бъде разгледано като предлагащо метод за стимулиране на имунен отговор срещу хелминтни паразити у животно през период на компрометиран естествен имунитет, който метод включва прилагане при вече упоменато животно поне един път преди и/или през периода на загуба или застрашаване от загуба на естествения имунитет към гастро-интестинални хелминтни паразити на ваксина, включваща един или повече хелминтни скрити антигени или антигенни фрагменти, прекурсори, и функционалноеквивалентни производни или варианти от това, имащи имуногенна активност срещу един или повече хелминтни паразити.

Отличителна черта на изобретението е, че предлага метод за стимулиране на имунен отговор срещу хелминтни паразити у женски животни през перипартуриентния период, и особено за предотвратяване или редуциране на перипартуриентния растеж, който метод включва прилагане върху споменатото животно, поне един път през периода преди чифтосване и/или до започването на третото тримесечие на бременността, на ваксинен състав, включващ един или повече хелминтни скрити антигени или антигенни фрагменти, прекурсори и функционалноеквивалентни производни или варианти от това, имащи имуногенна активност срещу един или повече хелминтни паразити.

Така, както тук е прилаган, терминът “компремотиран естествен имунитет включ ва загуба или намаляване на естествения имунитет. което води до неефективна или до неадекватна защита.

Съгласно изобретението ваксината е приложена през период, когато имунната система на животното остава компетентна и служи за осигуряване на адекватен отговор на антигена. В случай на перипартуриентна имунизация, за предпочитане, ваксината може да бъде приложена поне един път през периода преди чифтосване и/или до започването на второто тримесечие на бременността. Както по-нататък ще бъде посочено в детайли, най-общо е за предпочитане да се повтори имунизацията един или повече пъти през време на бременността, в съответствие с ветеринарната медицинска практика.

Намаляване на естествения имунитет към гастро-интестиналните нематоди може да бъде манифестирано посредством:

- възобновена зрялост на блокираните ларви;

- увеличаване на броя на погълнатите заразни ларви;

- редуцирано изхвърляне на съществуващите възрастни глисти;

- увеличаване плодовитостта на съществуващите възрастни популации.

Счита се, че всички четири фактори допринасят за перипартуриентно увеличаване. Дотолкова, доколкото други условия, свързани със загуба или намаляавне на естествения имунитет са засегнати, например остертагиаза тип II, ефектът на възобновена зрялост се счита за особено важен.

Освен това, хипобиотично или имунологично блокирани ларви са тези, подложени на сезонно блокиране на развитието, което е типично за някои видове нематоди, води до зрялост през пролетта около времето на раждане на гостоприемника и така пролетния растеж може също да допринася за перипартуриентния растеж. Естественият имунитет към хелминти, такива като Haemonchus, действа главно на ранния L4 ларвен стадий, при който се случва блокирането в този род. Понякога ларвите успешно са възобновили развитието си и не могат повече да бъдат контролирани посредством естествения имунитет на гостоприемника. Напротив, скритите антигени са ефек тивни при стимулиране на защитен имунитет срещу най-късните ларви и установените зрели стадии фази, които са осуетили механизма на клетъчния имунитет на гостоприемника.

Ефектът от предлаганото изобретение се състои в стимулирането на защитен имунен отговор през периоди, когато естественият имунитет към хелминти е компрометиран, например обикновено през период на понижен имунен отговор към паразити на гостоприемника като бременността, което се изразява в предотвратяване или редуциране на перипартуриентно увеличаване, и е изненадващ и непредсказуем.По-ранните изследвания са показали, че ваксинирането на овца и говедо с помощта на антигени демострирано посредством имуноскрийнинг, за да подпомогне естествения имунен отговор, не е ефективно. Следователно, в случая на околородова имунизация това не е очакван успех, че чрез прилагането на първична имунизация на животните преди или скоро след чифтосването, факултативно последвано от втора имунизация през периода на бременността, в извличането на имунен отговор, способен да предотврати перипартуриентно увеличаване. Подобно, не е предвиждано, че други условия свързани със загуба или намаляване на природния имунитет, такъв като остертагиаза тип II, могат също да бъдат контролирани посредством имунизация през периода на компрометиран естествен имунитет.

Смята се, че ефектът се състои главно в предотвратяването на съзряването до зрели форми на хипобиотичните или имунологично блокирани ларви и посредством това редуциране на нивото на установената инфекция. Намалението на броя на яйца, получени от възрастни паразити, може също да играе значителна роля. Това може да бъде от особена важност за хелминти като Ostertaqia, където съзряването на блокирани ларви в бременни животни или последващите сезонни климатични промени в мъжките и женските говеда често водят до болест с фатален изход, например остертагиаза тип II.

Допълнителен важен фактор при перипартуриентния ефект може да бъде преминаването през коластрата в бозаещото младо животно на майчински защитни антитела, инду цирани посредством имунизация със скритите антигени, които могат също да бъдат от значителна важност при намаляване на случаите на инфекция, например чрез Haemonchus в младите животни, последвано от приемане на ларви, произлезли от яйца в резултат на околородовото увеличаване. Това е в пълен контраст с естествения имунитет, който не е пренесен от майката на потомството.

Терминът “скрит антиген” е прилаган в изобретението за тези антигени, известни също и като “cryptic”, “прикрити” или “латентни” антигени, които по време на обичайния ход на инфекционния процес не влизат в контакт с имунната система на гостоприемника и които следователно не са рекогнисцирани чрез серум на животни, които имат придобит естествен имунитет към въпросния паразит. Такива антигени, така най-общо получени от тези вътрешни части на хелминта, през периода на инфекцията не са влизали в контакт с имунната система на гостоприемника. Така например, установено е, че червото на хелминта е богат източник на скрити антигени.

Прекурсор на въпросния антиген може да бъде голям белтък, който е получен, например чрез протеинолиза, за да даде антигена сам по себе си. Такива прекурсори могат да вземат формата на зимогени (профермент), т.е. инактивни прекурсори на ензими, активирани посредством протеолитично разцепване, например, аналог на системата пепсин/пепсиноген или добре известните зимогени, включени в каскадата на системата на кръвосъсирване.

Откакто скрити антигени упражняват техните ефекти, посредством извличане на продукцията в кръвния поток на гостоприемника от имунните ефекторни молекули, такива като антитела или комплемент, които са взети от паразита, когато се храни с кръвта на гостоприемника, понятието скрити антигени бе отначало използвано ограничено само при хранещи се с кръв паразити. Ние показахме обаче, че скрити антигени могат да бъдат прилагани като база за ваксина за хелминтни паразити, които не се хранят с кръв.

Терминът “имуногенна активност” както е използван в изобретението, дефинира тези антигени и техните фрагменти, прекурсори, производни и варианти, способни да генери рат у гостоприемника защитен имунен отговор, т.е. отговор чрез гостоприемника, който води до производство на имунни ефекторни молекули, антитела или клетки, които стерилизират или редуцират плодовитостта, повреждат, инхибират или убиват паразита и посредством това намаляват броя на отделените от паразита яйца и “защитават” гостоприемника от клинични или субклинични болести и загуби на продуктивността.

Такъв защитен имунен отговор към скрити антигени може най-обикновено да бъде манифестиран посредством получаването на антитела, които са способни да потискат метаболичната функция на паразита, водещо до спиране на растежа, липса на производство на яйца и/или смърт. Тази продукция на защитни, главно IgG антитела, които присъстват в серума на гостоприемника, е един важен фактор, изискващ типа на имунен отговор, извличан посредством скрити антигени от така наблюдавания с естестван имунитет; където скритите антигени са в основата на имунния ефекторен механизъм с първично хуморален тип т.е. основен на антитела естественият имунитет към паразитите се явява като първично клетъчно-медииран, т.е. еозинофилни и мастни клетки, които са взети в действие, за да освободят вещества, които повреждат паразита, хуморалната част на имунния отговор е по-малко важна.

Тези различия в индуцирания от скрити антигени имунитет се смятат за важни съдействащи фактори за приноса на скритите антигени за контролирането на хелминтните заболявания през периода на компрометиран естествен имунитет, т.е. перипартуриентно увеличаване и остертагиаза тип II при говедата.

Както бе споменато по-горе, в обхвата на изобретението са включени функционалноеквивалентни фрагменти, производни и варианти на хелминтни скрити антигени. Терминът “функционален еквивалент” е използван, за да дефинира протеини, включително гликопротеини, свързани или произлезли от природни протеини, където аминокиселинната секвенция е била модифицирана посредством единично или множествено аминокиселинно заместване, добавяне и/или делеция и също секвенции, където аминокиселините са би5 ли по химичен способ модифицирани, включително посредством дегликосилация или гликосилация, но които въпреки това запазват защитна антигенна (имуногенна) активност, например са в състояние да повишават защитните антитела на гостоприемника и/или функционалния имунитет срещу хелминти. Такива функционалноеквивалентни варианти могат да срещнат като естествени биологични вариации или могат да бъдат получени с помощта на известни технологии. Например, функционалноеквивалентни рекомбинантни протеини могат да бъдат приготвени чрез използването на известните технологии чрез насочена към участък мутагенеза, или случайна мутагенеза, или ензимно разграждане и/или лигиране на нуклеинови киселини.

Както бе споменато по-горе, при околородова имунизация ваксинната композиция на основата на скрити антигени се прилага на женски животни поне един път през периода преди чифтосването и/или до началото на третото тримесечие на бременността, по-специално до началото на второто тримесечие на бременността. Най-общо, обаче, ваксината се прилага по-често от един път, например с първата инжекция преди чифтосването и една или повече реваксинации през периода до началото на третото тримесечие, но за предпочитане до началото на второто тримесечие на бременността.

Подходящо е, ваксината да бъде поставена най-напред през периода между 20 и 60 дни преди, или по-специално 10 дни след чифтосване, например през 45-те дни до чифтосването или още по-добре през периода между 40-ия и 5-ия, особено между 40-и и 10-ия ден преди чифтосването. Докато прилагането на първата ваксинна инжекция наскоро преди чифтосването е за предпочитане, различните ветеринарни специалисти или различните ферми могат обаче да твърдят, че имунизацията през други периоди, например 6 месеца преди чифтосването или дори скоро след раждането на младото животно, може да бъде по-приемлива.

Прилагането на реимунизация може да бъде по всяко време след чифтосването до началото на третото тримесечие на бременността. Например, реимунизация може да бъде направена един или няколко пъти в периода до ранното второ или до ранното трето тримесечие на бременността.

Както бе дискутирано по-горе, ваксиниране със същия имуноген може да намери място повече от един път през време на съответния период и могат да бъдат подходящи различни комбинации за различни животни или ваксини. Алтернативно, обаче прилагането на контролирано-изпускаща система, доставяща антигени, ще индуцира дълго продължаващ имунен отговор в сравнение с единичната ваксинация (0 Hagan, et al., 1991, Immunology, 73: 239-242). Ако първата инжекция е направена повече от 6 месеца преди чифтосването, следващата инжекция трябва да се направи през периода на 6-те месеца преди чифтосването. Инжектирането на годишната реваксинация може да задоволява в някои случаи, например през зимния период, когато рискът от инфектиране е нисък. Като пример за подходящ режим за имунизация, поставянето на ваксина, основана на Hl 10D двукратно на 40-ия и 10ия дни преди и около 90 дни след чифтосването, е намерено за ефективно при имунизирането на овце срещу Haemonchus.

Въпреки че имунизация на животни единствено през късната бременност е намерена за неефективна, там където не се използва прилагането на контролирано-изпускаща система, една или повече реуминизации с ваксината е за предпочитане да бъдат направени през време на бременността до началото на третото тримесечие, например при овцете от 50 до 100 дни, например между 45-ия - 90-ия ден през време на бременността.

Животни, за които може да бъде извлечена полза от представяното изобретение, могат да бъдат всички домашни или други животни, особено преживни животни, са за предпочитане. Особено внимание ще бъде отделено на овце, говеда, елени и кози.

Броят на хелминтните видове е свързан с перипартуриентния растеж и така, те са подходящи обекти за прилагане на ваксинния състав. Тук се включват най-известни видово като Haemonchus, Ostertaqia, Trichostrongylus, Chabertia, Oesophaostomum, Hyostrongylus, Nematodirus, Toxocara u Cooperia. Скрити антигени могат да бъдат получени от редица такива хелминти.

Предпочитани са тези антигени, така наречените антигени с “широк спектър”, които са способни да стимулират защитните имунни отговори на гостоприемника срещу, в допълнение към хелминтите, от които те са били изолирани, редица други хелминтни паразити.

Най-подходящо, скритите антигени, използвани съгласно изобретението, могат да бъдат интегрални мембранни протеини, изолирани от червото на хелминта, включвайки за пример ензими, структурни протеини или други функционални протеини, изисквани за съхранение и/или развитие на хелминтните яйчни протеини, включени в хранителния механизъм на хелминта. Такива протеини могат да включват например ензимни протеази или екзо- и ендопептидази, включени в разградения хранителен протеин до свободна аминокиселина.

Подходящи скрити антигени включват H110D, споменат по-горе, приготвянето на рекомбинантни форми, от който е описано във WO93/23542. Упоменат е също и направен от протеинов комплекс Н45, описан във W090 11086, и на антигените, описан във WO/94/02169. В последния случай, такива антигени включват интегрални мембранни протеини, имащи нативна локализация в червото на паразита и характеризирани чрез способността за свързване с пепстатин и с пшеничен зародишен и фъстъчен лектин и други лектини, имащи специфичност за бетасвързан N-ацетилглактозамин. Такива антигени могат да бъдат протеолитични ензими, специално ензими, имащи аспартилова протеаза и/или неутрална ендопептидазна активност. Особено внимание може да бъде обърнато на антигените H-gal-GP и 0gal-GP, които са описани подробно във WO94/ 02169.

Антигените и техните фрагменти, прекурсори и функционалноеквивалентни варианти и деривати могат да бъдат нативни антигени, изолирани директно от хелминти, или могат да бъдат получени чрез рекомбинантна ДНК-технология, използвайки стандартни технологии, такива като описаните например от Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning, a laboratory manual 2nd Edition, Cold Spring Harbour Press), или чрез химически синтез, такъв като добре известната синтетична процедура на Merrifield (твърда фаза).

Ваксинната композиция, приложена на животното, може да бъде поливалентна, съдържайки редица от антигенни компоненти, например, които са активни срещу редица хелминтни видове.

Ваксинна композиция може да бъде получена съгласно изобретението чрез методи, добре известни в производството на ваксини Традиционни ваксинни рецептури могат да включват един или повече антигени или антитела. Съгласно изобретението съвместно, където е подходящо, с един или повече съвместим адювант, например алуминиев хидроокис, поташ, стипца, сапонин или производни от това, мурамилов дипептид, минерални или растителни масла, NAGO, Novasomes или нейонни блокови съполимери, DEAE декстран или контролирани системи, даващи антиген като биоразградими микрочастици, в присъствието на един или повече фармацевтично приемливи носители или разтворители. Подходящи носители включват течна среда, като солеви разтвор, подходящ за използване като вехикул, за да въведе пептидите или полипептидите в организма на животното или пациента. Могат да се включат и допълнителни компоненти като консерванти.

Алтернативна ваксинна структура може да включва вирус или клетка гостоприемник, например микроорганизъм, който може да бъде жив, убит или отслабен, имащ инсертирана вътре молекула на аминокиселина (например ДНК молекула) за стимулация на имунен отговор, насочен срещу полипептиди, кодирани чрез инсертирана молекула на амино-киселина.

Прилагането на ваксинната композиция може да намери своето място при всеки от конвенционалните пътища за въвеждане, например орален или парентерален, посредством интрамускулно, подкожно или вътрекожно инжектиране. Инжектирането най-общо е за предпочитане.

Изобретението по-нататък ще бъде дискутирано в по-големи детайли с особена референция за предотвратяване перипартуриентния ръст на Haemonchus в овце, използвайки скрития антиген Hl 10D. Докато нелимитира7 ното обобщение на изобретението, дефинирано по-горе не бъде разбрано, ще се установи, че използването на антигени от Haemonchus за предпазване на перипартуриентния растеж при отделянето на яйца на Haemonchus в овце, представлява предпочитан аспект на изобретението.

Описание на приложените фигури

В следващите примери, фигурите представят:

Фигура 1 показва средния брой на фекалните яйца (хиляда яйца за грам) през повечето време у ваксинирани и неваксинирани бременни и небременни овце с въведени инфектирани ларви на Haemonchus на 110-ия ден на бременността.

Група D (17 бременни овце, ваксинирани с Hl 10D и клостридиалната ваксина COVEXIN 8).

Група Е (18 бременни овце, ваксинирани с H110D).

Група F (5 небременни овце, ваксинирани с H110D и Covexin 8).

Група G (3 небременни овце, ваксинирани с Hl 10D)

Група С (17 бременни овце ваксинирани с феритин като контролна група).

Стрелката индицира времето на въвеждане; и

Фигура 2 показва защитата на агента срещу H.Contortus, с въвеждане на 5-та седмица от раждането чрез коластрен пренос на антитела към H110D (брой на фекални яйца (хиляда яйца за грам)) за време (дни след средната дата на обагненето) о - агнета от ваксинирани овце, о-агнета от овце от контролната група.

Пример 1. С този пример се цели:

а. Да се оцени ефикасността на H110D ваксина при контролирането на отделянето на глистни яйца, асоциирано с инфекция с H.Contortus в овце през перипартуриентния период;

б. Да се наблюдава имунологичният отговор с антитела и в бременните и в небременните овце, за да се оцени въздействието на бременността върху имуногенността на антиген H110D;

в. Да се оцени ефектът на съвместното приложение на клостридиалната ваксина Covexin 8 на ефикасността на Hl 10D ваксина. Съвместимостта на съществуващите бактериални ензими с нови паразитни ваксини е необходимо условия за тяхната адаптация в практиката.

Въведение

Това изследване оценява ефикасността на Hl 10D ваксина при контролирането на отделянето на глистни яйца от двегодишни овце (гимери), ваксинирани двукратно преди зачеването и поддържани през бременността, и въвеждане на инфектирани ларви на H.Contortus през последното тримесечие на бременността. Тези гимери са сравнени с подходящи по възраст ваксинирани небременни контролни групи.

Разписание (Главни дати)

Дата	Ден No	Дейност
Ранен	-50	Овце, дозирани с левами зол
септември	(NILVERM GOLD) са изведени на пасбище.
	- 40	Производно определена група и първа ваксинация.
	- 10	Втора ваксинация
	- 8	Овни се вкарват за приблизително три седмици
	0	(Средна дата на зачева не)
	80	Всички овце са дозирани с ивермектин (Oramec Drench) и прибрани от пасбището.
	90	Трета ваксинация.
март/	110	Всички овце приемат са. 10000 инфектирани с Н. Contortus ларви След две седмици фекал ните проби започват.
април юли/	147	Обагненето започва
август	267	Отбиване на агнетата.

Методи и експериментални способи овце, дозирани с левамизол (NILVERM

GOLD), за да се отстрани всеки установен глист, са преместени в заграденото място до кошарите в началото на септември 1991 г. Следва минимален период от 7 дни за аклиматизиране и овцете са разпределени в три групи А, В и С, които включват респективно 35. 8 и 17 гимери. Последните в групите А и В са ваксинирани с H110D (денят е -40-ти), докато тези в група С - с феритин, като контролна група. Тридесет дни по-късно (денят е -10) овцете получават втората си ваксинация и веднага след това са разделени в следващите групи: овцете в група А са разделени, формирайки две нови групи - D и Е, докато по подобен начин група В формира групите F и G. Овни се вкарват през последната седмица на октомври при тези животни от групи С, D и Е, за да се определи за група средна дата за оплождане, колкото е възможно по-близка до денят 0 и планираната дата за обагнене през последната седмица на март или първата седмица на април. Овцете в групи F и G не се пускат при овните, така че да се действа като при ваксинираните небременни контроли. След приблизителни шест седмици овните се изолират от заграденото място с овцете и овцете са оставе-¹ ни да пасат заедно като едно стадо. На 80-ия ден всички гимери са дозирани с ивермектин (Oramec Drench), за да бъдат отстранени всички зрели глисти и блокирани ларвите и подслонени. Третата ваксинация с H110D е поставена на всички овце в групите D F, Е и G на 90-ия ден (това е 90 дни бременност дни). Овцете в групи D и F също получават инжекции с Covexin 8 по това време. На 110-ия ден от бременността 10 дни на всички животни са въведени са. 10000 Н. Contortus инфектирани ларви. Броят на нематодите се проследява чрез изследване на фекалиите.

Отсъствието на възможно потискане на 20 имунния отговор към скрития антиген Hl 10D през бременността в потвърдено чрез проследяване на нивата на антителата.

Група	Ваксинация	Бременни/небременни
Група А	Ваксинирани двукратно преди оплождането (H110D)	Бременни
Група D	Hl 10D + Covexin 8 на 90-ия ден бременност	44
Група Е	H110D на 90-ия ден бременност	44
Група В	Ваксинирани (H110D) }	небременни
Група F	H110D + Covexin 8 на }	(4
	90-ия ден бременност	44
Група G	H110D }
Група С	Ваксинирани (феритин) }	Бременни

} = време, подходящо за ваксинация на групи D и Е

Използвани материали за експеримента Ваксина на Н. Contortus (H110D) е приложена и подготвена от Institute of Animal Physiology and Genetics Research, Badraham, Cambridge. Спомагателната система за първата ваксинация е Freund’s complete adjuvant/ aluminium hydroxide (FCA/A1(OH₃)h Freund’s incomplete adjuvant/aluminium hydroxide (FCA/ A1(OH₃) за втората и третата ваксинации.

Конска контролна ваксина с феритин е приложена и приготвена от Institute of Animal

Physiology and Genetics Research, Babraham, Cambridge. Спомагателната система е както посочената.

Въвеждане на паразит

Видове/Щам

Щам на H.Contortus (щам Η/CR), който е резистентен на бензимидазол, е използван в изследването. Щамът е получен като ларви трети стадий от Central Veterinary Laboratory, Weybridge. Резистентността към бензимидазол е потвърдена чрез анализ с инкуби рани яйца и контролен тест (Cawthome RJG and Cheong FH 1984, Veternary Record 114: 562).

Ларвена култура

Достатъчен брой от ларви трети стадий са получени посредством пасаж през неконтаминирано с глисти агне. Фекалии, съдържащи яйца, са събрани и отгледани до инфективен стадий. Инфектирани ларви са възстановени и пречистени с помощта на апарата на Baermann.

Дози с инфектиращо действие

Материал с инокулиране с са. 10000 инфектиращи ларви е приготвен с помощта на стандартна разреждаща технология. Ларвите са въведени през устата чрез чисти пластмасови туби.

Процедура за въвеждане

За да се осъществи контролирано въвеждане в последното тримесечие на бременността всички овце са третирани с ивермецтин и (Oramec Drench) за отделяне на акумулирани обременени глисти, и са подслонени в кошара веднага на 80-ия ден. На всички овце се въвеждат на 110-ия ден от бременността са. 10000 инфектирани ларви на Н. Contortus, които са използвани за наподобяване, в контролния начин за развитието на перипартуриентен растеж.

Експериментални процедури

Контрол на системната грешка.

Всички овце са разпределени по групи на основа на критериите телесно тегло към определеното време.

Процедура на ваксинация

Овцете в групи А и В са ваксинирани с интрамускулна инжекция в задното бедро (1 ml във всяко бедро, всичко 2 ml) със 150 - g от антигена на H.Contortus (H110D) на -40-ия ден и повторни в предните бедра (1 ml във всяко бедро, всичко 2 ml) на -10-ия ден. На 90-ия ден, след формирането на групите D, E,F и G, всички овце в тези четири групи получават трета реваксинация чрез интрамускулна инжекция в задните бедра (процедурата е същата като при първата имунизация). Респективно, овцете в групи D и G са инжектирани подкожно в областта на шията (както е според разписанието (с клостридиална ваксина Covexin 8. Овцете в група С остават като контролна група и получават инжекции с конски феритин (по същия начин и обем, както при ваксината H110D) на -40-ия и -10-ия ден и Covexin 8 подкожно на 90-ия ден.

Оценка на защитните качества

Брой на фекални яйца

Взети са фекални проби от всички овце (от ректума) на седмични интервали започвайки приблизително шест седмици преди обагненето до приключването на експеримента. Броят на фекалните яйца се установява посредством модифициран вариант на метода на Mcmaster, сточност до 10 яйца на грам (epg) фекалии. Фекалните проби са култивирани на всеки две седмици за 7 дни при 27°С за идентифициране на ларви и потвърждаване на чистотата на въвеждането.

Реагиране с производство на антитела, в резултат на ваксинация с СопАНП

Взети са кръвни проби от югуларната вена на всички овце в обикновени кръвни контейнери в двуседмични интервали след първата ваксинация. Кръвни проби са взети на деня на първата ваксинация за референция на серума. Нивата на антителата бяха установени посредством метода ELISA.

Резултати

Резултатите от изследването са показани на фигура 1. Те ясно показват, че неваксинираните бременни овце (група С) продуцират високи нива на нематодни яйца около времето на обагнене, следващо изкуствено въвеждане. Всички ваксинирани овце дават значително редуциран брой на яйца в техните фекалии. Защитните качества не са намалени у овцете, които получават също и клостридиална ваксина.

Таблица 1 показва резултатите от анализите с метода ELISA за определяне на нивата на антитела у животните, участвали в изследването. Може да се види, че всички ваксинирани овце демонстрират по-високи нива на антитела, в сравнение с тези от контролните групи ,които не са ваксинирани. Нивата на антитела у ваксинираните бременни овце са подобни на тези на небременните ваксинирани овце, потвърждавайки отсъствието на супресия на реакцията с производство на антитела срещу скритите антигени. Съвместното прилагане и на клостридиалната ваксина Covexin 8 не повлиява върху нивата на антителата.

Таблица 1.

Анализ на серумни проби, разредени 1:1000 срещу H110D, чрез метода ELISA

Животно №	Група	90 дни бременност	100 дни бременност	Животно №	Група	90 дни бременност	100 дни бременност
223	С	0.459	0.419	180	Е	1.714	2.132
226	и	0.267	0.287	191	44	1.905	2.420
231		0.203	0.148	193	ίί	1.856	2.290
234	ίί	0.096	0.178	199	14	2.123	2.309
235		0.112	0.234	209		1.965	1.998
236	и	0.098	0.294	212	44	1.093	2.104
237		0.150	0.108	214		1.654	2.520
238	а	0.741	0.552	224	44	1.556	2.708
175		0.119	0.108	227		1.486	2.314
195	а	0.229	0.175	228	44	1.278	2.236
202	и	0.495	0.267	233	44	1.202	2.218
204		0.368	0.247	239	44	1.155	2.251
207		0.118	0.153	240		1.673	2.531
210	44	0.339	0.308	241	44	1.391	2.548
215		0.190	0.117	245		1.921	2.484
				248	44	1.268	2.505
217	и	НИ	НИ	253		1.750	2.408
216	и	НИ	НИ	298	44	1.911	2.222
Средно	0.271	0.247		Средно	1.606	2.344
222	D	0.880	2.165	198	F	2.062	2.105
230	D	1.289	2.288	203	F	1.792	НИ
244	D	2.126	2.523	243	F	1.373	2.446
247	D	1.871	2.553	246	F	1.865	2.326
249	D	1.910	2.505	264	F	1.436	2.418
250	D	1.894	НИ		Средно	1.706	2.230
255	D	1.710	2.459
190	D	1.918	2.283
194	D	1.837	2.311
196	D	1.556	2.241
197	D	1.658	1.875	189	G1.565	2.285
200	D	1.864	2.137	205	G	1.271	1.761
208	D	2.066	2.199	272	G	1.637	2.484
211	D	1.869	2.066		Средно	1.409	2.217
213	D	1.418	2.443
274	D	1.612	2.239
300	D	1.301	2.214
Средно	1.692	2.281

Група D = Бременни (H11OD + Covexin 8)

Група Е = бременни (само Hl 1OD)

Група F = небременни (H110D + COVEXIN 8)

Група G = небременни (само H110D)

Група С = бременни (контролни, с фе- $ ритин)

НИ = не изследвани

Пример 1. Пренасяне чрез коластрата на медииран от H110D имунитет у ' ¹⁰

Обосновка на опита

За да се установи че защитните качества могат да бъдат удостоени при млади агнета, са. на 5 седмици, кърмещи от овце, които са имунизирани с Hl 10D, отнасящи се за агнета на неимунизирани овце. Защитните свойства са определени като намаляавне на отделянето на яйца с фекалии и родени глисти, след приемане на пилюла.

Съдържание на опита 20

Съдържанието на опита е обобщено

Таблица 2

Група	Брой на агента, получили П.	Приемана на 5-седмична възраст (L3 ларви)
Агента от овце, ваксинирани през бременността С	6	3000

продължение

H11OD Агента от овце, неваксинирани през бременността С H110D

6

3000

Всички подробности за имунизирането на бременни овце с H11D са описани в пример 1. Десет агнета родени от имунизирани с H11OD овце, заедно с десет от контролните овце, са селектирани на базата на случайността на възраст 2-3 седмици. Антисерум от тях е скрииниран посредством метода ELISA за определяне на нивата на анти-HHOD антитела. Шест агнета с най-високите нива на антитела са подбрани от група овце, имунизирани с H110D. Шест контролни агнета са подбрани да подхождат по възраст. Тези две групи от агнета получават 3000 L 3 ларви от Н. Con tortus (Η/CR щам) на 4 - 5-та седмица. Броят на фекалните яйца се установява от 8 - 11 седмица и родените глисти се изброяват на 11 седмица след аутопсията.

Резултати

Преминаването на антитела чрез коластрата е потвърдено чрез техните високи нива в шестте агнета от овцете, имунизиарни с H11OD (виж Таблица 3). Напритив, не са открити анти-Н110D антитела в агнетата от контролните овце.

Таблица 3.

Възраст на агнета (седмици)	2/3	3/4	7/8	8/9	10/11
		Средна оптична плътност при 405 mm дължина на вълната
Агнета от овце,
имунизирани с H110D Агнета от овце,	1.5	1.6	0.9	0.9	0.9
от контролната група	н.о.	н.о	н.о	н.о	н.о

н.о. = няма открити

Разреждането на серума е 1/1000.

Общият брой на фекални яйца на възраст от 8 до 11 седмици е 50% по-нисък (Р<0.05) у агнета от имунизирани овце, в сравнение при контролната група (вж.фиг.2), в съответствие с по-малкото зрели женски глисти (вж.по-долу).

Средният брой на родените глисти 5 седмици след приема, е:

Таблица 4

Група	Брой на родени глисти	% на защита	Средно съотношение мъжки/женски
Агнета от овце, ваксинирани	625	30.0	0.35
с H11OD Агнета от контролните овце	892		1.15

Намаляването при родените глисти е незначително (Р<0.05). Обаче, има добре маркирано намаление на съотношението мъжки/ женски организми (Р,0<05), характеристичният ефект от имунизацията с Hl 1OD е по-изявен при зрелите агнета.

Обобщение

Агнета, родени и отгледани от овце, които са били имунизиарни с Hl 10D имат значителни нива на антитела срещу H110D, които са получени в резултат на получаването им от майчиния организъм през коластрата.

Тези антитела дават защитни качества срещу отделянето на яйца с фекалиите и срещу раждане на глисти, в резултат на прием на пилюли на възраст от 5 седмици.

Claims (30)

1. Приложение на хелминтен скрит антиген или антигенни фрагменти, прекурсори и функционалноеквивалентни производни или варианти от тях, имащи имуногенна активност срещу един или повече хелминтни паразити в състав на ваксина за прилагане на животно, поне един път предварително и/или през /околородилния/ период, за стимулиране на защитен имунитета срещу споменатите хелминтни паразити през околородилния период.

2. Приложение съгласно претенция 1 в производството на състав на ваксина за прилагане на женско животно поне еднократно през периода преди чифтосването и/или до началото на третото тримесечие на бременността за стимулиране на защитен имунитет срещу споменатите хелминтни паразити през околородилния период.

3. Приложение съгласно претенция 2 за предотвратяване или намаляавне на околородилното увеличаване.

4. Приложение съгласно претенция 2 или претенция 3, в което споменатият ваксинен състав е приложен на женското животно поне еднократно преди чифтосване и поне един път през време на бременността ,до началото на третото тримесечие на бременността.

5. Приложение съгласно претенция 4, в което споменатият ваксинен състав е приложен от женското животно поне еднократно преди чифтосване и поне един път през време на бременността ,до началото на второто тримесечие на бременността.

6. Приложение съгласно претенция 1, за борба с остертагиаза тип II.

7. Приложение съгласно претенции от 1 до 6, в което споменатият хелминтен скрит антиген е неразделна част от чревен мембранен протеин.

8. Приложение съгласно претенция 7, в което споменатият хелминтен антиген е ензим или транспортиращ протеин.

9 .Приложение съгласно претенция 8, в което споменатият хелминтен антиген е протеаза или екздо-или еднопептидаза.

10. Приложение съгласно претенция 9, в което споменатият хелминтен антиген е селектиран от антигени H11OD, Н45, H-gal-GP и O-gal-GP или антигенен фрагмент или прекурсор.

11. Приложение съгласно претенции от 1 до 10, в което споменатото животно е преживно животно.

12. Приложение съгласно претенции от 1 до 10, в което споменатото животно е селектирано от овце, говеда, елени, кози или кучета.

13. Приложение съгласно претенции от 1 до 12, чрез което се стимулира защитен имунитет срещу хелминти, селектирани от Haemonchus, Ostertaqia, Trichostrongylus, Chabertia, Oesophaostomum, Hyostrongylus, Nematodirus, Toxocara и Cooperia.

14. Приложение съгласно претенции от 1 до 13, в което споменатият ваксинен състав е под формата на контролирано освобождаващ съдържанието си препарат.

15. Приложение съгласно претенции от 1 до 5 и претенции от 7 до 14 на антигена H11OD или на антигенен фрагмент за производство на състав на ваксина за лечение на околородилното увеличение на продукцията на яйца от Haemonchus във фекалии на овце.

16. Метод за стимулиране на защитен имунен отговор срещу хелминтни паразити у животни през период на компометиран естествен имунитет, като споменатият метод обхваща прилагането му на посочените животни, поне еднократно преди и/или през период на загуба или намаляване на естествения имунитет по отношение на гастер-интестинални хелминтни паразити, ваксинен състав, включващ един или повече хелминтни скрити антигени или антигенни фрагменти, прекурсори и функционалноеквивалентни производни или варианти, имащи имуногенна активност срещу един или повече хелминтни паразити.

17. Метод съгласно претенция 16, в който споменатият състав на ваксина е приложен на женско животно поне еднократно през периода преди чифтосване и/или до началото на третото тримесечие на бременността, чрез което да стимулира защитен имунен отговор през време на околородилния период.

18. Метод съгласно претенция 17 за предотвратяване или намаляавне на околородил ното нарастване.

19. Метод съгласно претенция 17 и претенция 18, в който споменатият състав на ваксината е приложен на женското животно поне еднократно до чифтосването и поне един път през време на бременността .до началото на третото тримесечие на бременността.

20. Метод съгласно претенция 19, в който споменатият състав на ваксината е приложен на женското животно поне еднократно до чифтовсването и поне един път през време на бременността ,до началото на второто тримесечие на бременността.

21. Метод съгласно претенция 16, за борба с остертагиаза тип II.

22. Метод съгласно претенции от 16 до

21, в който споменатият хелминтен скрит антиген е неразделна част от чревен мембранен протеин.

23. Метод съгласно претенции от 16 до

22, в който споменатият хелминтен антиген е ензим или транспортиращ протеин.

24. Метод съгласно претенции от 16 до

23, в който споменатият хелминтен антиген е протеаза или екзо-или ендопептидаза.

25. Метод съгласно претенции от 16 до

24, в който споменатият хелминтен антиген е селектиран от антигени H11OD, Н45, H-galGP и O-gal-GP, или антигенен фрагмент от това или прекурсор вместо това.

26. Метод съгласно претенции от 16 до

25, в който споменатият ваксинен състав е приложен на преживно животно.

27. Метод съгласно претенции от 16 до 25, в който споменатият ваксинен състав е приложен на животно, селектирано от овце, говеда, елени, кози или кучета.

28. Метод съгласно претенции от 17 до

27, в който се стимулира защитен имунитет срещу хелминти, селектирани от Haemonchus, Ostertaqia, Trichostrongylus, Chabertia, Oesophaostomum, Hyostrongylus, Nematodirus, Toxocara и Cooperia.

29. Метод съгласно претенции от 16 до

28, в който споменатият ваксинен състав е приложен под формата на контролирано освобождаващ съдържанието си препарат.

30. Метод съгласно претенции от 16 до 20 и претенции от 22 до 29. в който ваксинен състав, включващ антигенът H110D или ан14 тигенен фрагмент, е приложен на овце (женските животни) на около 40-те до 10-те дни преди чифтосване, чрез което да лекува околородилното нарастване на продукцията на фекални яйца от Haemonchus.