CZ202458A3 - Kvartérní amoniová sůl s širokým antimikrobním spektrem, způsob její přípravy, dezinfekční kompozice a jejich použití - Google Patents

Abstract

Kvarterní amoniová sůl, kterou je 1,1‘-(2-oxapropan-1,3-diyl)bis[4-(decylamino)pyridin-1-ium] 2X- obecného vzorce I, kde X- je anion vybraný ze skupiny obsahující halogenid, sulfát, fosfát, mesylát, malonát, vínan, acetát, salicylát, tosylát, s výhodou Cl-, Br- nebo I-. Dále se týká způsobu její přípravy, dezinfekční kompozice a jejího použití.

Description

Kvartérní amoniová sůl s širokým antimikrobním spektrem, způsob její přípravy, dezinfekční kompozice a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká kvartérní amoniové soli s širokým antimikrobním spektrem, konkrétně 1,1‘-(2oxapropan-l,3-diyl)-bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_, způsobu jeho přípravy, dezinfekční kompozice a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Jedním z největších problémů současnosti v oblasti běžně užívaných antimikrobních látek je zvýšená nebo úplná odolnost stále většího počtu mikroorganismů. Nejedná se jen o rezistenci vůči antibiotikům, ale také obecně o zvýšení odolnosti vůči běžně používaným dezinfekčním přípravkům. Mluví se o tzv. multirezistentních kmenech, které jsou odolné vůči oběma skupinám antimikrobiálních činidel. Tento trend je výsledkem dlouhodobého používání antibiotik a dezinfekčních přípravků, zvláště ve zdravotnických zařízeních, ve kterých jsou mikroorganismy neustále vystaveny selekčnímu tlaku antibiotik a jsou schopné se stát odolnými i vůči běžně používaným dezinfekčním přípravkům.

Odolnost vůči antimikrobiálním sloučeninám je buď primární, vyjádřená absencí (nebo nedostupností) cílové struktury pro dezinfekční přípravek, nebo sekundární, která se postupně vytvoří v původně citlivém kmeni. Příčinou závažných infekcí je celá řada bakterií, virů nebo hub přítomných ve vnějším prostředí. Specifikem je pak výskyt vysoce odolných tzv. nozokomiálních kmenů ve zdravotnických zařízeních. Pravděpodobnost propuknutí těchto nozokomiálních infekcí se zvyšuje zvláště u osob s oslabeným imunitním systémem. Minimalizace rizika infekce může být dosaženo uplatňováním racionální metodiky pro podávání antibiotik a v případě dezinfekčních přípravků přísným dodržováním komplexních dezinfekčních programů. Klíčovým aspektem je používání vysokoúčinných látek a pravidelné obměňování antibiotik a dezinfekčních přípravků tak, aby se zamezilo vystavování kmenů jednomu produktu déle, než je kritická doba, po níž se riziko vzniku odolnosti zvyšuje.

Dalším problémem je převažující existence mikroorganismů v tzv. biofilmové formě. Biofilm je vysoce odolné společenství mikroorganismů přisedlých k určitému povrchu. Buňky uvnitř biofilmu jsou schopné mezi sebou komunikovat a specializovat se na různé funkce. Povrch biofilmu je chráněn extracelulámí matrix poskytující ochranu vůči vnějším vlivům. Tímto se biofilmy stávají rezistentními a pro jejich eradikaci je nutné použít nové antimikrobní látky v dostatečné (biofilm eradikující) koncentraci.

Díky nedávno proběhlé pandemii nemoci Covid-19 je stále více kladen důraz na zabránění šíření virových částic jak mezi obyvatelstvem, tak především i ve zdravotnických zařízeních, kde jsou ve zvýšené míře pacienti s těžšími průběhy nemoci. Z tohoto důvodu se doporučuje aktualizovat dezinfekční programy ve zdravotnických zařízeních i obecně zvýšit hygienické návyky populace z důvodu zastavení každé budoucí pandemic a z toho plynoucích negativních ekonomických dopadů.

Kvartérní amoniové sloučeniny mají širokou škálu použití. Používají se jako dezinfekční látky, tenzidy, změkčovače textilu nebo antistatická činidla. První zmínka o monomemích kvartémích amoniových sloučeninách (KAS) pochází z roku 1935, kdy Gerhard Domagk učinil průlom s dimethyl -benzyl-dodecylamonium chloridem, později známým jako Zephirol. Tyto benzalkoniové soli (A-alkyl, A-benzyl, A'.A'-dimcthylamin. Bac) s délkou alkylového řetězce C10-C18 se mj. běžně používají v potravinářském průmyslu, protože chrání před kontaminací potravin, léků a jiných produktů různými mikroorganismy, včetně plísní. Prodlužují dobu

- 1 CZ 2024 - 58 A3 trvanlivosti a zvyšují bezpečnost. Ve čtyřicátých letech se objevily stovky nových látek, z nichž některé dodnes zůstávají předními antiseptiky. Komplexní potenciál těchto látek byl zkoumán v průběhu desetiletí a odhalil jejich antibakteriální, fůngicidní, sporistatickou a virucidní aktivitu a rovněž jejich povrchové vlastnosti. KAS tak získaly masivní podporu díky těmto vlastnostem spolu s nízkou výrobní cenou, vysokou účinností a pouze mírnou toxicitou pro eukaryotické buňky (Soukup, O., Benkova, M., Doležal, R., Šleha, R., Malinak, D., Salajkova, S., Markova, A., Hympanova, M., Prchal, L., Ryškova, L., Hobzova, L., Sepčic, K., Gunde-Cimerman, N., Korabecny, J., Jun, D., Bostikova, V., Bostik, P., & Marek, J. (2020). The wide-spectrum antimicrobial effect of novel A-alkyl monoquatemary ammonium salts and their mixtures; the QSAR study against bacteria. European Journal of Medicinal Chemistry, 206, 112584. https://doi.Org/10.1016/j.ejmech.2020.112584).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je nová širokospektrá antimikrobní látka typu kvartémí amoniové soli s výrazným baktericidním, fůngicidním a virucidním účinkem.

Jedná se o kvartémí amoniovou sůl, kterou je l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)bis[4(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ obecného vzorce I

kde X^- je anion vybraný ze skupiny obsahující halogenid, sulfát, fosfát, mesylát, malonát, vínan, acetát, salicylát, tosylát, s výhodou Ck, Br nebo Γ.

Navíc disponuje velmi dobrou rozpustností ve vodě nebo vodných mediích jako fyziologický roztok, pufrovací systémy na bázi vody, média pro kultivaci buněk a nízkou toxicitou.

Kvartémí amoniová sůl podle vynálezu prokázala lepší účinnost ve velmi malých koncentracích v porovnání s běžně používanými standardy benzalkonia (Bac C12-16) či didecyldimethylamonium chloridu (DDAC).

Kvartémí amoniová sůl obecného vzorce I podle vynálezu je účinné dezinfekčními činidlo proti celé řadě mikroorganismů.

Kvartémí amoniová sůl podle vynálezu je účinná proti širokému spektru mikroorganismů, tedy Gram-negativním, Gram-pozitivním bakteriím, kvasinkám, vláknitým houbám či obaleným virům. S výhodou hubí kmeny bakterií, výhodněji Staphylococcus aureus (Cl947), Meticilinrezistentní Staphylococcus aureus (C1923), Staphylococcus epídermídís (C1936), Vankomycinrezistentní Enterococcus, Escherichia coli (A1235), neprodukující rozšířené spektmm betalaktamáz (ESBLs) Klebsiella pneumoniae (C1950), produkující rozšířené spektmm betalaktamáz (ESBLs) Klebsiella pneumoniae (C1914) a multi-rezistentní Pseudomonas aeruginosa (A1245), dále s výhodou kmeny hub, výhodněji Aspergillus fumigatus (CCM F 373) a Absidia corymbifera (CCM F 8077) a dále s výhodou pro kmeny obalených virů, výhodněji Herpes Simplex virus 1 (VR 260).

-2CZ 2024 - 58 A3

Byla prokázána výrazná virucidní aktivita, úplná eradikace viru přesahující 4 logaritmy za 5minutovou časovou expozici při koncentraci 0,01 %.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu je uveden způsob přípravy kvartémí amoniové soli podle obecného vzorce I, jehož podstatou je, že 4-chlorpyridin vzorce II a

(Π), nebo jeho hydrochloridová nebo hydrobromidová sůl reaguje s decylaminem vzorce III

NH_rC._wH₂₁ (III), za refluxu v polárním aprotickém rozpouštědle za vzniku 4-(decylamino)pyridinu vzorce IV

HN

O

N (IV), který dále reaguje s bis(Xmethyl)etherem vzorce V

X ' 'O ' 'X (V), za refluxu v polárním aprotickém rozpouštědle za vzniku l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)bis[4(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ obecného vzorce I, jak je uveden výše.

Podle ještě dalšího provedení způsobu podle vynálezu je polární aprotické rozpouštědlo vybráno ze skupiny obsahující aceton, dichlormethan, ethylacetát, acetonitril.

Reflux je teplota varu příslušného rozpouštědla. Rozsah teplot refluxu je od 56 °C do 83 °C podle výběru polárního aprotického rozpouštědla.

Podle ještě dalšího provedení způsobu podle vynálezu reakce, při které vzniká 4(decylamino)pyridin vzorce IV probíhá 2 až 10 hodin, s výhodou 2 až 6 hodin, a reakce, při které vzniká l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_, probíhá 20 až 30 hodin.

- 3 CZ 2024 - 58 A3

Schéma 1: Příprava l,r-(2-oxapropan-l,3-diyl)bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X

Cl

NH₂-C₁₀H₂-,

2-6 hodin.

aywík&ě rQZpytištfjdfc

CwH,)

HN λ

< BXME <. -<> 2040 hodin.

Η 2X

N .

,,0-.

BXME=Bis(Xmethyl)ether

Prvním krokem je příprava meziproduktu 4-(decylamino)pyridinu zahrnující reakci decylaminu s 4-chloropyridinem podle schématu 1 nebo jeho hydrochloridové nebo hydrobromidové soli. Reakční směs látek se míchá v polárním aprotickém rozpouštědle (například aceton, dichlormethan, acetonitril, ethylacetát) po dobu 2 až 6 hodin. Struktura a čistota výsledného meziproduktu se potvrdí pomocí HRMS a NMR analýzy.

Druhý krok zahrnuje reakci meziproduktu 4-(decylamino)pyridinu společně s bis(Xmethyl)etherem podle schématu 1. Reakce látek probíhá v polárním aprotickém rozpouštědle po dobu 20 až 30 hodin. Výsledný produkt (sloučenina obecného vzorce I) se získá řízenou krystalizací z nepolárního rozpouštědla (například chloroform, diethylether apod.). Struktura a čistota získané sloučeniny obecného vzorce I se potvrdí pomocí HRMS a NMR analýzy. Produkt je bílá krystalická látka.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu je popsána dezinfekční kompozice, která obsahuje Ι,Γ(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ obecného vzorce I.

Koncentrace l,r-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ obecného vzorce I v dezinfekční kompozici podle vynálezu je v rozsahu 0,001 % hmota, až 1 % hmota., s výhodou 0,01 % hmota, až 0,1 % hmota.

Podle ještě dalšího provedení dezinfekční kompozice podle vynálezu dále zahrnuje alespoň jednu pomocnou látku vybranou ze skupiny obsahující parfémy, gelotvomá činidla, adhezivní činidla, barviva, plniva, rozpouštědla nebo pevné nosiče.

Podle ještě dalšího provedení dezinfekční kompozice podle vynálezu dále zahrnuje alespoň jednu pomocnou látku vybranou ze skupiny obsahující parfémy pro zlepšení senzorických vlastností (např. esenciální oleje a silice z rostlin čeledi hluchavkovité, citrusů, jehličnanů apod.), gelotvomá činidla (např. karbomer, karboxymethylcelulóza, methylcelulóza, kys. alginová a další), adhezivní činidla (např. polyakryláty, hydroxymethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, chitosan apod.) pro zvýšení ulpívání na nehorizontálních površích modifikací Teologických vlastností, barviva jako například oxid titaničitý, oxid zinečnatý, ultramarín nebo brilantní modř, plniva (např. škrob), rozpouštědla pro potenciaci dezinfekční účinnosti (např. čištěná voda, ethanol, isopropanol, bílá vazelína apod.) prodloužení nebo zkrácení doby zasychání, možnost zvýšení koncentrace účinných složek nebo pevné nosiče (např. gáza nebo tampon).

Koncentrace parfému nebo jejich směsi v kompozici podle vynálezu je s výhodou v rozsahu 0,05 až 0,1 % hmota.

Koncentrace gelotvomého činidla v kompozici nebo jejich směsi podle vynálezu je s výhodou v rozsahu 0,1 až 10 % hmota.

-4CZ 2024 - 58 A3

Koncentrace adhezivního činidla nebo jejich směsi v kompozici podle vynálezu je s výhodou v rozsahu 0.1 až 5 % hmota.

Koncentrace plniva nebo rozpouštědla nebo jejich směsi v kompozici podle vynálezu je s výhodou v rozsahu 50 až 99 % hmota.

Jako rozpouštědlo je možné použít vodu, vodná média (například fýziologický roztok, pufrovací systémy, média pro kultivaci buněk apod.), alkoholy nebo jiná rozpouštědla, ve kterých jsou předmětné kvartemí amoniové soli lépe rozpustné než ve vodě. Takovéto kompozice je možné použít k dezinfekci skla, kovů nebo odolných plastů, jako je PVC apod.

Podle ještě dalšího provedení dezinfekční kompozice podle vynálezu je ve formě roztoku, pěny nebo gelu. Dezinfekční kompozice podle vynálezu aplikovatelná na živé či neživé povrchy jako například pokožka osob, pomůcky, materiál, terén.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu je popsáno použití kvartemí amoniové soli obecného vzorce I nebo dezinfekční kompozice jako dezinfekční činidlo.

Dezinfekční činidlo je účinné proti širokému spektru mikroorganismů vybraných ze skupiny obsahující malé obalené viry, s výhodou na HSV-1, dále Gram-negativní bakterie nebo Grampozitivní bakterie s výhodou Methicilin rezistentní Staphylococcus aureus. Enterococcus spp., s výhodou Vankomycin rezistentní Enterococcus, Escherichia coli, Klebsiella spp. s výhodou Klebsiella Ext. Spectrum B-lactamase negativní, Klebsiella Ext. Spectrum B-lactamase pozitivní, Pseudomonas aeruginosa, s výhodou Pseudomonas aeruginosa multirezistentní, dále vláknité huby s výhodou na Aspergillus fumigatus nebo Absidia corymbifera.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava kvartémí amoniové soli

Výchozí sloučeniny byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (CZ) v nejvyšší dostupné čistotě. Rozpouštědla byla koupena od Penta chemicals Co. Na tenkovrstvou chromatografii (TLC) byly použity hliníkové destičky potažené silikagelem Merck silica gel 60 F254 analytical plates (mobilní fáze: Eythylacetát:Methanol:Amoniak=6:2:0,2). Jednotlivé sloučeniny byly na TLC detekovány Dragendorffovou detekcí. Teplota tání produktu nebyla měřena.

Konkrétní kroky přípravy:

1. krok: Do varné baňky bylo přidáno 20,0 mmol decylaminu, 5 mmol NaF a 40 ml AcCN. Do směsi bylo poté přidáno 5 mmol 4-chlorpyridinu a necháno za refluxu 4 hodiny. Reakční směs byla zfiltrována a extrahována do ethylacetátu. Organická vrstva byla oddělena a sušena bezvodým Na2SO4 a odpařena za vakua. Látka byla následně čištěna sloupcovou chromatografii s výtěžkem 27 %. Struktura a čistota výsledného meziproduktu byla potvrzena pomocí HRMS a NMR analýzy.

2. krok: 4-(decylmino)pyridin 0,8 mmol byl rozpuštěn v 10 ml AcCN. Ke směsi byl přidán bis(chlormethyl)ether (0,4 mmol) a ponechán reagovat za refluxu 24 h. Reakční směs byla odpařena za vakua a vzniklý surový produkt krystalizován z diethyletheru za vzniku bílých krystalů. Výtěžnost reakce byla 63 %.

- 5 CZ 2024 - 58 A3

Příklady složení dezinfekční kompozice

1) Dezinfekční kompozice pro vnější použití obsahující: látka I (l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-dichlorid) 0,1 % hmota., levandulová silice 0,05 % hmota., izopropylalkohol 70 % obj., voda čištěná 29,85 % obj.

2) Dezinfekční kompozice pro vnější použití obsahující: látka I (l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-mesylát) 0,1 % hmota., fenoxyethanol 2 % hmota., polysorbat 20 0,1 % hmota., fosforečnan sodný 0,25 % hmota., voda čištěná 97,55 % obj.

3) Dezinfekční kompozice pro vnější použití obsahující: látka I (l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-dibromid) 1 % hmota., citrónová silice 0,05 % hmota., ethylalkohol 70 % obj., voda čištěná 28,95 % obj.

4) Dezinfekční kompozice pro vnější použití obsahující: látka I (l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-acetát) 0,1% hmota., ethylalkohol 35 % obj., hydroxypropylmethylcelulóza 0,7 % hmota., chitosan 2 % hmota., polysorbat 20 0,5 % hmota., glycerin 0,2 % hmota., polyethylenglykol 400 0,5 % hmota., borovicová silice 0,05 % hmota., propylenglykol 0,4 % hmota., voda čištěná 60,55 % obj.

5) Dezinfekční kompozice pro vnější použití obsahující: látka 1 (l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-tosylát) 1 % hmota., lidokain 4 % hmota., polysorbat 80 5 % hmota., bílá vazelína 90 % hmota.

Hmotnostní nebo objemová % jsou vztažena na celkovou hmotnost či objem kompozice.

Příklad 2

Hodnocení rozpustnosti

Tabulka číslo 1 zahrnuje hodnota rozpustnosti v mg/ml u látky vzorce I konkrétně 1,1‘-(2oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-dichlorid ve vodě, která byla stanovena dle protokolu (Singh et al., 2017). Výsledkem je porovnání hodnot rozpustnosti látky I a komerčně používaných standardů Bac a DDAC. Z tabulky 1 vyplývá, že látka vzorce I má výrazně lepší rozpustnost, což velmi zjednodušuje praktické použití.

Tabulka 1 - hodnocení rozpustnosti ve vodě

Látka	Rozpustnost ve v(
______________m________________________	>366
BAC Br C12	52,00
BAC Br C14	20,21
BAC Br C16	5,00
DDAC	0,39

ě(mg/ml)

Příklad 3

Hodnocení antibakteriální účinnosti

Tabulky č. 2a a 2b zobrazují in-vitro stanovení antibakteriální účinnosti látky vzorce I konkrétně 1,1 ‘ -(2-oxapropan-1,3 -diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-1 -ium] -dichlorid pomocí buj onové mikrodiluční metody podle standardní metodiky M07-A10 pro čtyři Gram-pozitivní a čtyři Gram-negativní kmeny bakterií. Výsledkem je stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) po 24 a 48 hodinách, a stanovení minimální baktericidní koncentrace (MBC) po 48 hodinách. Tabulky jsou rozděleny podle typu bakterií (Grammova barvení) a součástí jsou pro porovnání i

-6CZ 2024 - 58 A3 výsledky komerčně používaných látek typu benzalkonií (Bac) a didecyldimethylamonium chloridu (DDAC). Z tabulek 2a a 2b je zřejmé, že na většinu bakterií jsou nové látky obvykle stejně účinné nebo účinnější v porovnání se standardními látkami. Komerční látky se obvykle používají v koncentraci od 0,1 % do 1 %, což mnohonásobně převyšuje stanovované hodnoty 5 MIC nebo MBC.

Tabulka 2a - hodnocení antibakteriální účinnosti na Gram-pozitivních kmenech

MIC (pmol/l); 24h inkubace MIC (pmol/l); 48h inkubace MBC (pmol/l); 48h inkubace
Methicilin rezist. Staphylococcus aureus) +	Staphylococcus epidermidis +	Vankomycin rezist. Enterococcus +
Látka	1,47	0,98	0,25
ST\	1,47	0,98	0,25
w	4,88	1,47	1,47
	15,63	15,63	31,25
DUU ΓΓ)	15,63	15,63	31,25
V-x J. £	15,63	15,63	62,5
	5,86	2,93	15,63
DUU C11	5,86	2,93	15,63
Γ14	5,86	3,91	23,44
	7,81	2,93	15,63
DUU CIL	7,81	3,91	15,63
Γ1 o	11,72	7,81	23,44
	1,95	2,93	2,93
DDAC	1,95	2,93	5,86
	1,95	2,93	11,72
Tabulka 2b	- hodnocení antibakteriální účinnosti na Gram-negativních kmenech
	MIC (pmol/l); 24h inkubace
	MIC (pmol/l); 48h inkubace
	MBC (pmol/l); 48h inkubace
		Klebsiella Klebsiella	Pseudomonas
	Escherichia
	.. pneumoniae - pneumoniae	aeruginosa -
		ESBL - ESBL +	Multirezistent.
	1,95	2,93 2,93	9,77
Látka (I)	1,95	2,93 2,93	9,77
—	.................	8,79	..................--------
	31,25	46,88 31,25	156,25
Bac C12	31,25	46,88 31,25	156,25
	31,25	46,88 31,25	156,25
	31,25	31,25 23,44	156,25
Bac C14	31,25	31,25 23,44	156,25
	31,25	31,25 23,44	156,25
	62,5	93,75 93,75	187,50
Bac Cl 6	62,5	93,75 93,75	187,50
	62,5	93,75 93,75	187,50

-7 CZ 2024 - 58 A3

	4,88	11,72	15,63	156,25
DDAC	4,88	11,72	15,63	156,25
	4,88	11,72	15,63	156,25

Bac = benzalkonium chloridy; DDAC = Didecyldimethylamonium chlorid;

Příklad 4

Hodnocení fungicidní účinnosti

Tabulka č. 3 zobrazuje in-vitro stanovení antifungální účinnosti látky vzorce I, konkrétně 1,1‘-(2oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-dichlorid pomocí bujónové mikrodiluční metody podle metodiky EUCAST E.DEF 9.3.2 pro dva kmeny vláknitých hub. Výsledkem je stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) po 24 hodinách, a stanovení minimální fungicidní koncentrace (MFC) po 48 hodinách. Tabulka 3 shrnuje výsledky fungicidního testování nové látky a součástí jsou pro porovnání i výsledky komerčně používaných látek typu benzalkonií (Bac) a didecyldimethylamonium chloridu (DDAC). Z tabulky 3 je zřejmé, že na testované kmeny vláknitých hub je nová látka účinnější v porovnání se standardními látkami. Komerční látky se obvykle používají v koncentraci od 0,1 % do 1 %, což mnohonásobně převyšuje stanovované hodnoty MIC nebo MFC.

Tabulka 3 - hodnocení antimikrobní účinnosti na dvou kmenech vláknitých hub (fungicidní)

MIC (pmol/l); 24h inkubace MBC (p.mol/1); 48h inkubace

	Aspergillus fumigatus	Absidia corymbifera
Látka (I)	7 81	31 25
15,63	125,00
Bac C12	500,00	500,00
500,00	NFC
Bac C14	500,00	500,00
500,00	500,00
Bac Cl 6	>500,00	500,00
> 500,00	500,00
DDAC	500,00	500,00
500,00	NFC

Bac = benzalkonium chloridy; DDAC = Didecyldimethylamonium chlorid; NFC = není fungicidní efekt

Příklad 5

Hodnocení virucidní účinnosti

Pro stanovení antivirové aktivity byl zvolen Herpes simplex virus typu 1 (HSV-1, VR-260 získaný z americké národní sbírky) pomocí infikovaných Věro buněk CCL81 (z ledvin africké zelené opice). Stanovení antivirové aktivity bylo provedeno pomocí kvantitativního suspenzního testu. Titr viru byl vyhodnocen pomocí Spearman-Karber metody a vyjádřen jako logio TClD50/ml. V souladu s EN 14476 pro virucidní aktivitu dezinfekcí by měla látka prokázat snížení titru viru alespoň o 4 řády, což odpovídá 99,99% inaktivaci. Pro rozlišení virem vyvolaných cytopatických změn a toxického efektu způsobeného testovanými látkami, byly až do konce virucidního testování monitorovány morfblogické změny buněk. Výsledky měření jsou uvedeny v tabulce č. 4. Z výsledků je zřejmé, že látky obecně mají výrazný virucidní efekt na

-8CZ 2024 - 58 A3 obalené viry. Z tabulky je zřejmé, že látka I si drží výrazný virucidní efekt i po naředění na koncentraci 0,01%.

Tabulka č. 4 - Stanovení účinnosti látky vzorce I konkrétně l,T-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4(decylamino)pyridin-l-ium]-dichlorid a dalších standardů proti obalenému viru Herpes simplex virus. AlogTCID50 značí pokles řádu virového titru po 5 minutách ve dvou koncentracích testovaných látek (0,1% a 0,01%).

Látky	AlogTCID50 (HSV-1)
0,1%	0,01%
Látka (I)	6	4,5
Bac C12	7	5,17
Bac C14	7	6,17
Bac C16	6	4,84
DDAC	6	6,5

Bac-benzalkonium chloridy, DDAC - didecyldimethymamonium chlorid.

Příklad 6

Posouzení cytotoxicity

Pro stanovení cytotoxicity vůči eukaryotním buňkám byl použit MTT test podle protokolu dodavatele s využitím buněk CHO-K1 (ovariální buňky křečíka čínského). Buněčná viabilita byla stanovena spektrofotometricky při vlnové délce 570 a 650 nm (referenční vlnová délka). Hodnota IC50, definovaná jako koncentrace způsobující 50% viabilitu buněk byla vypočítána pomocí nelineární regrese. IC50 a standardní chyby průměru (SEM) byly získány zprůměrováním tří nezávislých měření. Hodnoty byly porovnány s několika běžně používanými látkami typu KAS (tabulka 5) a z výsledků je zřejmé, že novou látku lze v porovnání s komerčními považovat za bezpečnou, kdy vidíme, že oproti všem standardním látkám se jeví pozitivně.

Tabulka č. 5 - Stanovení cytotoxického efektu látky vzorce I konkrétně l,l‘-(2-oxapropan-l,3diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium]-dichlorid a standardů

Látka	IC50 ± SEM (μΜ)
Látka (I)	23,51 ± 1,4
Bac C12	19,50 ± 1,2
Bac C14	15,14±0,l
Bac Ci6	12,18 ± 1,4
DDAC	7,83 ± 0,4

Bac-benzalkonium chloridy, DDAC - didecyldimethymamonium chlorid.

Claims (11)

1. Kvartemí amoniová sůl, kterou je l,r-(2-oxapropan-l,3-diyl)bis[4-(decylamino)pyridin-lium] 2X' obecného vzorce I

kde X^- je anion vybraný ze skupiny obsahující halogenid, sulfát, fosfát, mesylát, malonát, vínan, acetát, salicylát, tosylát, s výhodou Ck, Br nebo Γ.

2. Způsob přípravy kvartémí amoniové soli podle nároku 1, vyznačující se tím, že 4-chlorpyridin vzorce II

Cl ··' ^ν X N 'N (Π), nebo jeho hydrochloridová nebo hydrobromidová sůl reaguje s decylaminem vzorce III

NH2-C10H21 (III) za refluxu v polárním aprotickém rozpouštědle za vzniku 4-(decylamino)pyridinu vzorce IV ,C

HN 'Ν' (IV), který dále reaguje s bis(Xmethyl)etherem vzorce V

X' 'Ό ' X (V)

- 10CZ 2024 - 58 A3 za refluxu v polárním aprotickém rozpouštědle za vzniku l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)bis[4(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ obecného vzorce I.

3. Způsob přípravy kvartemí amoniové soli podle nároku 2, vyznačující se tím, že polární aprotické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny obsahující aceton, dichlormethan, ethylacetát, acetonitril.

4. Způsob přípravy kvartemí amoniové soli podle nároku 2 nebo nároku 3, vyznačující se tím, že reakce za vzniku 4-(decylamino)pyridin vzorce IV probíhá 2 až 10 hodin, s výhodou 2 až 6 hodin, a reakce za vzniku l,r-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ obecného vzorce I probíhá 20 až 30 hodin.

5. Dezinfekční kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje l,l‘-(2-oxapropan-l,3-diyl)-bis-[4(decylamino)pyridin-l-ium]-2X· vzorce I podle nároku 1.

6. Dezinfekční kompozice podle nároku 5, vyznačující se tím, že koncentrace 1,1 ‘-(2-oxapropanl,3-diyl)-bis-[4-(decylamino)pyridin-l-ium] 2X^_ je v rozsahu 0,001 % hmota, až 1 % hmota., s výhodou 0,01 % hmota, až 0,1 % hmota.

7. Dezinfekční kompozice podle kteréhokoliv z nároků 5 až 6, vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jednu pomocnou látku vybranou ze skupiny obsahující parfémy, gelotvomá činidla, adheživní činidla, barviva, plniva, rozpouštědla nebo pevné nosiče.

8. Dezinfekční kompozice podle nároku 5 až 7, vyznačující se tím, že je ve formě roztoku, pěny nebo gelu.

9. Použití kvartemí amoniové soli podle nároku 1 jako dezinfekční činidlo.

10. Použití dezinfekční kompozice podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8 jako dezinfekční činidlo.

11. Použití podle nároku 9 nebo nároku 10, kde dezinfekční činidlo je účinné proti širokému spektru mikroorganismů vybraných ze skupiny obsahující obalené viry, s výhodou Herpes Simplex vims 1, dále Gram-negativní bakterie nebo Gram-pozitivní bakterie s výhodou Staphylococcus aureus, s výhodou Methicilin rezistentní Staphylococcus aureus. Enterococcus spp., s výhodou Vankomycin rezistentní Enterococcus, Escherichia coli, Klebsiella spp. s výhodou Klebsiella Ext. Spectrum Blactamase negativní, Klebsiella Ext. Spectrum B-lactamase pozitivní, Pseudomonas aeruginosa, s výhodou multirezistentní Pseudomonas aeruginosa, dále vláknité huby s výhodou na Aspergillus fumigatus, nebo Absidia corymbifera.