CZ2020277A3

CZ2020277A3 - Mesylátová sůl para-topolinu, přípravky ji obsahující, a její použití

Info

Publication number: CZ2020277A3
Application number: CZ2020277A
Authority: CZ
Inventors: Lucie Plíhalová; Plíhalová Lucie doc. Mgr., Ph.D.; Marek Zatloukal; Zatloukal Marek RNDr., Ph.D.; Karel DoleĹľal; Dr. Doležal Karel Mgr.; Miroslav Strnad; Miroslav prof. Ing. Strnad; Jan Walla; Jan Mgr. Walla; Jiří Voller; Jiří Mgr. Voller
Original assignee: Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2020-05-17
Filing date: 2020-05-17
Publication date: 2021-07-21
Also published as: CZ308865B6; US20230055908A1; WO2021233486A1

Abstract

Předmět vynálezu se týká mesylátové soli para-topolinu a její krystalické formy. Dále se týká použití této látky v kosmetických a léčebných aplikacích, a přípravků obsahujících tuto látku. Mesylátová sůl para-topolinu mesylátu má širokou škálu biologických aktivit, včetně antioxidačních, protizánětlivých, anti-senescentních a protistárnoucích, přitom má nízkou toxicitu a výbornou rozpustnost ve vodě.

Description

Cytokininy jsou rostlinné signální látky (fýtohormony), které hrají ústřední roli v regulaci buněčného dělení rostlinných buněk a v četných vývojových procesech rostlin. Cytokininy objevili F. Skoog, C. Miller a spolupracovníci v 50. letech 20. století jako faktory, které podporují buněčné dělení (cytokinezi). Prvním objeveným cytokininem byl derivát adeninu s názvem kinetin (6fůrfurylaminopurin), který byl izolován jako produkt degradace DNA. První běžný identifikovaný přírodní cytokinin byl izolován z nezralých kukuřičných zrn a pojmenován zeatin (chemický název: 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purin). V současnosti je známo několik dalších cytokininů s podobnými heterocyklickými strukturami. Cytokininy mají široké spektrum biologických účinků.

6-(4-Hydroxybenzylamino)purin (para-topolin, pT) je cytokinin, jehož kosmetické a léčebné vlastnosti jsou známy, např. z US 8552013. Bohužel je však para-topolin prakticky nerozpustný ve vodě, ale má vysokou permeabilitu buněčnou membránou. Nízká rozpustnost ve vodě a pomalá rychlost rozpouštění jsou často omezujícími faktory odpovědnými za nízkou biologickou dostupnost farmaceutických/kosmetických sloučenin, což omezuje jejich použití. Přes dlouhodobě známou skutečnost, že para-topolin má určité vlastnosti sloučeniny proti stárnutí, nebyly při ošetření kůže vyvinuty žádné úspěšné režimy s použitím para-topolinu. Jedním přijatelným vysvětlením je pravděpodobně špatná rozpustnost a špatná biologická dostupnost, jakož i rychlý metabolismus para-topolinu ve fázi II v jeho známé formě.

Předkládaný vynález si klade za cíl vyvinout vodorozpustnou formu para-topolinu, vhodnou zejména pro kosmetické a léčebné použití.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je 6-(4-hydroxybenzylamino)purin (para-topolin) mesylát (methylsulfonát). Jedná se o sůl, která jako kationt obsahuje protonovaný 6-(4hydroxybenzylaminojpurin, tedy 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium, a jako aniont obsahuje methylsulfonát, běžně nazývaný mesylát. Uátku lze znázornit strukturním vzorcem I,

(I)

CZ 2020 - 277 A3

V jednom provedení vynálezu se jedná o krystalickou formu para-topolin mesylátu. Tato sloučenina krystalizuje v triklinické krystalové soustavě s prostorovou grupou P-l.

S výhodou je předmětem vynálezu krystalická forma para-topolin mesylátu mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 9,0; 9,2; 17,0; 17,9; 18,1; 22,3; 22,4; 24,1; 26,4 ± 0,2° 2-theta. Výhodněji může mít další charakteristické reflexe: 13,6; 15,6; 16,3; 16,7; 19,8; 25,7; 27,2 ± 0,2° 2-theta.

V rámci předkládaného vynálezu bylo na základě zkoumání monokrystalové struktury zjištěno, že krystalická forma mesylátové soli para-topolinu má obecný sumární vzorec C13H15N5O4S s protonizováným purinovým p-topolinovým kationtem amesylátovým aniontem. Centrosymetrické dimery asymetrické jednotky jsou propojeny řadou intermolekulámích vodíkových vazeb, které jsou realizovány hlavně mezi protonizovaným kationtem amesylátovým aniontem, což ovlivňuje torzní úhly a spolu s vlastní sítí vodíkových vazeb přispívá k vynikající rozpustnosti sloučeniny ve vodě.

Para-topolin mesylát podle předkládaného vynálezu má širokou škálu biologických aktivit, včetně antioxidačních, protizánětlivých, antisenescentních, protistámoucích a pro-diferenciačních aktivit, které jsou zvláště užitečné ve farmaceutických a kosmetických aplikacích, například při léčbě kožních chorob nebo při zlepšení stavu pleti. Sloučenina podle předkládaného vynálezu má rovněž minimální nebo nulovou toxicitu.

Konkrétněji je předmětem předkládaného vynálezu je para-topolin mesylát pro použití in vivo při ochraně buněk, organel, orgánů nebo celých organismů proti oxidačnímu nebo elektrofílnímu stresu, pro použití při detoxikaci a eliminaci reaktivních oxidantů a elektrofílů, pro použití jako antioxidantu při inhibici peroxidace lipidů, proteinů a DNA u zvířat a rostlin.

Dále je předmětem předkládaného vynálezu konkrétněji para-topolin mesylát pro použití in vitro při ochraně buněk, organel nebo orgánů proti oxidačnímu nebo elektrofílnímu stresu, pro použití při detoxikaci a eliminaci reaktivních oxidantů a elektrofílů, pro použití jako antioxidantu při inhibici peroxidace lipidů, proteinů a DNA u buněk, organel nebo orgánů zvířat a rostlin.

Předmětem předkládaného vynálezu je také para-topolin mesylát pro použití jako léčivo. Může být použit k léčbě zvířat (ve veterinární medicíně) i k léčbě lidí (v humánní medicíně).

S výhodou je předmětem vynálezupara-topolin mesylát pro použití pro léčbu nebo zlepšení chorob či stavů kůže, jako je akné, erytém a zarudnutí.

S výhodou je předmětem vynálezu para-topolin mesylát pro použití jako antineurodegenerativní léčivo nebo pro potlačení imunostimulace či zánětu, například při léčení artritidy nebo potlačení rejekce transplantátu nebo poskytnutí úlevy od bolesti.

S výhodou je předmětem vynálezu para-topolin mesylát pro použití při prevenci a léčbě chorob spojených s oxidačním stresem v kůži, zejména chorob vybraných z rakoviny kůže, psoriázy, fíbrózních poruch, jako je sklerodermie, onemocnění štěpu proti hostiteli (GVHD), hypertrofíckých jizev, nefrogenní systémové fíbrózy (NSF), alergického ekzému, toxického ekzému, atopické dermatitidy, lichen planus, hyperpigmentace a lézí herpes simplex, ichtyózy, papilomu, Bowenovy choroby, seboroické keratózy, aktinické keratózy, bazálních a skvamózních buněčných karcinomů.

Předmětem předkládaného vynálezu je také použití para-topolin mesylátu jako kosmeticky účinné látky. Kosmetické použití této sloučeniny zahrnuje omlazení buněk a tkání, stimulaci buněčné proliferace a/nebo diferenciace, inhibici, oddálení nebo snížení nepříznivých účinků stárnutí buněk a tkání, zejména epidermálních buněk, j ako j sou keratinocyty nebo fíbroblasty. Kosmetická použití

-2 CZ 2020 - 277 A3 také zahrnují zlepšení celkového vzhledu a stavu savčí kůže, zejména pak lidské kůže. Mohou tak být zlepšovány kosmetické stavy kůže, jako je například akné, erytém, zarudnutí a podobně.

Předmětem předkládaného vynálezu je také použití para-topolin mesylátu in vitro pro omlazení buněk a tkání, stimulaci buněčné proliferace, morfogeneze a/nebo diferenciace, inhibici buněčného stárnutí a stárnutí tkání, například v kulturách keratinocytů nebo fibroblastů.

Inhibice, oddálení nebo snížení nepříznivého účinku stárnutí buněk znamená, že vývoj morfologických změn, které se normálně vyskytují se stárnutím v normálních buňkách in vitro nebo in vivo, je zpomalen, zvrácen a/nebo zastaven. Mezi nepříznivé účinky stárnutí patří také změny genové exprese a biosyntézy proteinů související s věkem. Ameliorativní účinek je takový, který vykazuje zvýšení rychlosti růstu nebo celkové proliferativní kapacity buněk. Inhibice, oddálení nebo snížení nepříznivých účinků stárnutí na buňky může být detekováno jako zpoždění nebo zvrácení nástupu morfologických a fenotypových změn souvisejících s věkem, které se běžně vyskytují se stárnutím buněk. Změny související s věkem in vivo zahrnují změny v tkáních, jako je vývoj nebo zvýšení počtu nebo hloubky vrásek, linek, ochablá kůže, změna barvy, výskyt stařeckých skvrn, kožovité a/nebo zažloutlé oblasti pokožky, nežádoucí kosmetický vzhled pokožky a související změny strukturální a funkční integrity tkáně.

Předkládaný vynález dále poskytuje kosmetické a farmaceutické kompozice obsahující paratopolin mesylát a alespoň jeden kosmeticky a/nebo farmaceuticky přijatelný nosič.

Para-topolin mesylát nebo přípravky jej obsahující je při léčebném nebo kosmetickém použití aplikován systemicky nebo lokálně. Častým typem aplikace je aplikace topická, ale možná je i aplikace injekční, perorální, nebo jiná vhodná forma aplikace podle uvážení lékaře. Při použití v buněčných nebo tkáňových kulturách se para-topolin mesylát nebo přípravky jej obsahující aplikují na ošetřované buňky nebo tkáně.

Farmaceutické a kosmetické kompozice

Vhodné cesty pro systémovou aplikaci jsou orální, inhalační, injekční (intravazální, intramuskulámí, subkutanní), bukální, sublingualní a nasální. Lokální podání je například možné ve formě krémů, mastí, mlék, roztoků, očních a ušních kapek, ve formě vaginálních přípravků a rektálních čípků. Pro terapii onemocnění skalpu a kůže jsou výhodou lékovou formou roztoky, krémy a masti.

Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta a místě onemocnění, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.

Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.

Kosmetické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.

Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Kosmetické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným

-3 CZ 2020 - 277 A3 rozpouštěním nebo lyofilizaci. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, beta-karotenu nebo 3,5-di-terc-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyloleát, isopropylmyristát, isopropylpalmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylenglyceroltrioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C8 až C12 od Hůls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.

Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidlajako cukry, např. laktóza, sacharóza, mannitol nebo sorbitol, celulózové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylenglykol nebo jeho deriváty. Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě, roztoky vhodných celulózových preparátů jako acetylcelulózaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulózaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Další formy podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10 % nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafíny, které přednostně obsahují vhodné hydroxy sloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofílní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylenglykol, sorbitol a/nebo polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonicí látky.

-4 CZ 2020 - 277 A3

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejně, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např. lauryl, cetyl nebo stearylalkoholy, mastné kyseliny, například palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropylmyristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolátum) nebo parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofílními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween), dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetylstearylalkoholu nebo stearylalkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonicí látky.

Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodné-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování, jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylenglykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.

Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě kosmetických přípravků, přednostně v množství, které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického nebo kosmetického přípravku.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje porovnání XRPD práškových difraktogramů krystalické soli para-topolin mesylátu (p-topolin mes) apara-topolinu (p-topolin base).

Obr. 2 znázorňuje výsledky stability krystalické soli /?ara-topolin mesylátu formou XRPD práškového difraktogramů změřeného po 30 dnech uložení látky při teplotě 25 °C - nebyly zaznamenány žádné strukturní změny.

- 5 CZ 2020 - 277 A3

Obr. 3 znázorňuje molekulární strukturu centrosymetrického dimeru krystalické soli para-topolin mesylátu včetně sítě intermolekulámích vodíkových vazeb

Obr. 4 znázorňuje krystalovou strukturu (crystal packing) krystalické soli para-topolin mesylátu včetně sítě intermolekulámích vodíkových vazeb.

Příklady uskutečnění vynálezu

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu bez omezení jeho rozsahu. Pokud není zmíněno jinak, všechna procentuální množství jsou založena na hmotnosti sloučenin.

Příklad 1: Příprava krystalického para-topolin mesylátu (methansulfonátu) p-Topolin, volná báze (241 mg; 1 mmol) byl rozptýlen v metanolu (10 ml), míchán při teplotě místnosti a byla přidána methansulfonová kyselina (100 mg; 1,03 mmol). Po krátké době se suspense změnila v homogenní průsvitně žlutý roztok. Výsledná směs byla ponechána míchat při teplotě místnosti po dobu 10 minut a pak byla odpařena na rotační vakuové odparce za vzniku žlutého pevného residua, které bylo promyto acetonem (10 ml) a byl získán nažloutlý krystalický prášek. Produkt byl zfiltrován, promyt acetonem (3x 5 ml) a vysušen při 60 °C do konstantní hmotnosti.

Výtěžek: 300 mg (88 %); čistota (HPLC-UV/VIS): 99 %+; ESI-MS: [M + H]⁺= 242,2

Nažloutlé průsvitné krystaly byly připraveny rozpuštěním získané pevné látky v methanolu a ponecháním k volné krystalizaci odpařením rozpouštědla po 7 dní.

Příklad 2: Stanovení teploty tání krystalického para-topolin mesylátu a porovnání s paratopolinem

Teplota tání krystalické soli para-topolin mesylátu byla stanovena na přístroji Bůchi Melting point B-540 apparatus a porovnána s para-topolinem volnou bází. Zatímco interval teploty tání krystalické soli para-topolin mesylátu byl stanoven 186 až 188 °C, interval teploty tání výchozí volné báze para-topolinu byl určen mezi 281 a 283 °C. To znamená, že interval teplot tání těchto dvou látek se zásadně liší, rozdíl činí cca 95 °C. Oba materiály použité k měření byly krystalické pevné látky.

Příklad 3: XRPD prášková rtg difrakce krystalického para-topolin mesylátu

Prášková rentgenová difrakční studie byla provedena na difraktometru Bruker D8 Advance ECO s Cu K-alfa zářením a SSD160 detektorem. Přibližně 5 mg vzorku bylo jemně vmáčknuto do XRPD držáku vzorku přístroje. Vzorek byl následně vložen do přístroje v transmisním módu a analyzován za použití tabelovaných experimentálních podmínek viz níže.

XRPD podmínky měření

Osa scanu gonio
výchozí pozice [°2th.]	4,0000
konečná pozice [°2th.]	40,00
Step size [°2th.]	0,0100
doba scanu [s]	0,3 (48) s
typ scanu	kontinuální
Offset [°2th.]	0,0000
typ divergenční štěrbiny	fixní
velikost divergenční štěrbiny [°]	0,3000

-6CZ 2020 - 277 A3

	délka vzorku [mm]	10,00
	teplota měření [° c.] materiál anody K-alphal [á]	25,00 Cu 1,54060
5	K-alpha2 [á] K-beta [á] K-a2/k-al poměr nastavení generátoru goniometrický poloměr [mm]	1,54443 1,39225 0,50000 40 ma, 25 kv 250,00
10	Dist. Focus-diverg. Slit [mm] Ni Kbeta filtr monochromátor dopadajícího paprsku Spinning	110,00 ano ne ne

Práškový XRPD difraktogram krystalické soli para-topolin mesylátu a práškový XRPD difraktogram para-topolinu byly získány za podmínek popsaných výše. Na obrázku 1 je srovnání difraktogramů krystalické soli para-topolin mesylátu apara-topolinu formou překryvu. Z překrytí je patrné, že se difraktogramy výrazně liší. To dokladuje také tabulka 1 pro krystalickou sůl paratopolinu mesylátu a tabulka 2 pro para-topolin. V obou tabulkách jsou uvedeny relativní intenzita záření, d-spacing (mezirovinná vzdálenost) a odpovídající úhly 2Θ.

Tabulka 1: Měřené XRPD úhly, d-spacing a intenzita záření pro krystalickou sůl para-topolin mesylát

úhel (°2θ)	d-spacing	Rel. Intenzita
9,049	9,76473	34,00 %
9,146	9,66095	61,00 %
10,924	8,09291	3,90 %
11,189	7,90175	7,10%
12,047	7,3409	15,60 %
12,67	6,98133	1,40 %
13,569	6,52029	28,00 %
13,858	6,38532	8,10%
14,188	6,23735	7,10%
14,538	6,08798	7,20 %
15,629	5,66533	28,00 %
16,329	5,42417	24,40 %
16,572	5,34504	13,00 %
16,698	5,30489	21,20 %
17,021	5,2052	51,50 %
17,318	5,11653	4,30 %
17,424	5,08561	3,00 %
17,904	4,95037	59,40 %
18,11	4,89436	39,90 %
18,361	4,82823	19,00 %
18,706	4,73993	10,80 %
19,583	4,52944	10,70 %
19,779	4,485	26,50 %
20,201	4,39237	0,90 %
21,518	4,12628	17,40 %
21,698	4,09245	15,40 %

CZ 2020 - 277 A3

21,87	4,0608	18,10 %
22,262	3,99002	37,00 %
22,409	3,96422	100,00 %
23,21	3,82922	13,70 %
24,06	3,69581	32,80 %
24,112	3,688	27,60 %
24,227	3,6707	32,60 %
24,881	3,57573	5,30 %
25,712	3,46203	30,60 %
25,973	3,42784	11,10 %
26,391	3,37442	34,80 %
26,56	3,35339	7,70 %
27,19	3,27711	20,10 %
27,045	3,29436	7,40 %
27,311	3,26288	12,60 %
27,686	3,21953	11,30 %
27,832	3,20289	16,50 %
28,04	3,17958	18,50 %
28,433	3,13661	6,70 %
28,851	3,09205	11,20 %
29,104	3,06582	5,00 %
30,593	2,91981	15,00 %
31,017	2,88087	1,30 %
31,292	2,85623	4,80 %
31,543	2,83409	2,60 %
32,06	2,78953	0,50 %
32,441	2,75766	0,90 %
32,861	2,72331	1,80 %
33,261	2,69152	0,70 %
34,146	2,62369	1,70 %
34,639	2,58749	1,30 %
35,023	2,55998	4,50 %
35,773	2,50803	1,00 %
36,182	2,48062	1,10%
36,692	2,44732	4,20 %
37,299	2,40884	3,90 %
37,802	2,37797	1,00 %
38,391	2,34284	1,50 %
38,897	2,31351	0,70 %
39,514	2,27878	1,80 %

Tabulka 2: Měřené XRPD úhly, d-spacing a intenzita záření pro para-topolin

úhel (°2θ)	d spacing	Rel. Intenzita
6,749	13,08594	55,80 %
8,858	9,97457	1,00 %
10,631	8,31467	1,00 %
11,76	7,51896	3,00 %

CZ 2020 - 277 A3

13,148	6,72814	43,30 %
13,567	6,52143	3,30 %
13,954	6,34164	5,70 %
14,361	6,16281	6,00 %
15,199	5,82456	2,10 %
15,533	5,70029	20,60 %
15,887	5,57406	18,60%
16,476	5,37596	2,90 %
16,821	5,2665	7,10 %
17,307	5,11956	14,40 %
17,723	5,00039	38,20 %
17,852	4,9646	42,30 %
18,907	4,68984	30,40 %
19,531	4,54138	41,10%
20,014	4,43284	1,60 %
20,442	4,34101	64,70 %
21,171	4,19322	3,50 %
21,424	4,14415	8,80 %
22,074	4,02358	12,10%
22,516	3,94557	8,20 %
22,929	3,87556	5,80 %
23,509	3,78124	1,30 %
23,766	3,74081	36,20 %
24,201	3,67456	25,70 %
24,397	3,64555	100,00 %
24,86	3,57867	13,70 %
25,106	3,54423	11,00%
25,271	3,52137	3,30 %
26,371	3,37702	60,60 %
26,902	3,31153	0,60 %
27,388	3,2538	8,20 %
27,824	3,20383	4,30 %
28,407	3,13936	12,80 %
28,607	3,11784	6,90 %
29,19	3,05695	39,80 %
29,708	3,00484	3,00 %
30,035	2,97278	3,20 %
30,88	2,89333	7,50 %
31,412	2,84558	3,30 %
31,918	2,8016	4,50 %
32,143	2,78253	11,80%
32,396	2,76136	1,60 %
33,1	2,7042	2,20 %
34,177	2,62143	4,20 %
35,093	2,55506	2,20 %
35,474	2,52849	4,90 %
36,368	2,46834	0,60 %
36,889	2,43471	3,20 %
37,273	2,41045	1,90 %

-9CZ 2020 - 277 A3

38,063	2,36222	0,70 %
38,42	2,34111	0,70 %
39,532	2,2778	0,50 %
39,686	2,26928	0,60 %

Příklad 4: Ή nukleární magnetická rezonance (NMR) para-topolin mesylátu a porovnání se spektrem para-topolinu

Ή NMR byla měřena na přístroji JEOL 500 SS při teplotě 300 K a frekvenci 500.13 MHz. Vzorky byly připravovány rozpuštěním sloučenin DMSO-d6. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard. Kalibrace chemického posunu je vztažena ke zbytkovému píku rozpouštědla v Ή DMSO-de, a to 2,50 ppm. Každý vzorek byl připraven v ca. 5mg koncentraci. Chemické posuny identifikované ve spektru 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylátu (para-topolin mesylátu) odpovídají popisované chemické sloučenině a jsou následující: 'HNMR (500 MHz, DMSO-ď,) δ 9,48 (s, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,22 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 6,75 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 4,70 (d, J = 4,6 Hz, 2H), 2,34 (s, 3H), chemické posuny identifikované ve spektru 6-(4hydroxybenzylamino)purin (para-topolinu) jsou následující: Ή NMR (500 MHz, DMSO-o/) δ 12,89 (s, 1H), 9,23 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 8,09 (s, 2H), 7,15 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,66 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 4,57 (s, 2H). Při porovnání obou spekter jsou patrné signifikantní rozdíly, zejména u těch chemických posunů, které jsou v sousedství protonizovaných vodíků v 6-(4hydroxybenzylamino)purinium kationtu v porovnání s 6-(4-hydroxybenzylamino)purinem (paratopolinem bází).

Příklad 5: Rozpustnostpara-topolinu mesylátu ve vodě

Rozpustnost látky ve vodě byla stanovována podle následujícího protokolu. Byl připraven supemasycený roztok krystalické soli para-topolin mesylátu ve vodě. Byl zfiltrován od viditelně nerozpuštěných částic a byl obdržen nasycený roztok para-topolin mesylátu ve vodě. Nasycený roztok byl zředěn 1:10 000 a změřen na přístroji HPLC Alliance Waters 2690 s chromatografickou kolonou o průměru 2,1 mm a délce 150 mm se sorbentem C18 Symmetry o porozitě 5 pm. Vzorek byl rozpuštěn v mobilní fázi (MeOH: HCOONH4 - 1: 9).Vzorek byl eluován v metanolovém gradientu (10 až 90 %, po dobu 35 min) při pH 4 a průtokové rychlosti 0,3 ml/min. Absorbance sloučenin byla detekována v UV oblasti záření 210 až 400 nm. Plocha píku byla stanovena 2 729 231 a porovnána s plochami píku u dříve změřených konkrétních koncentrací krystalické solipara-topolin mesylátu ve vodě viz tabulka 3 níže.

Získaná plocha píku byla porovnána s plochami píku u určitých konkrétních koncentrací látky ve vodě a tak byla určena výsledná koncentrace nasyceného roztoku para-topolin mesylátu.

Tabulka 3.: Změřené plochy píku pro konkrétní koncentrace krystalické solipara-topolin mesylátu ve vodě

c (μΜ)	plocha píku
50	1 101 534
100	2 091 000
250	5 578 605

To znamená, že koncentrace krystalické soli para-topolin mesylátu ve vodě je přibližně 1,208 M, tj. 407 mg/ml, což je o několik řádů vyšší rozpustnost než upara-topolinu báze. Upara-topolinu báze byla popsána rozpustnost ve vodě < 0,04 mg/ml.

Příklad 6: Rozpustnost para-topolin mesylátu a para-topolinu v různých organických rozpouštědlech

- 10CZ 2020 - 277 A3

Rozpustnost v různých organických rozpouštědlech byla měřena za použití následujícího protokolu. Přibližně lOmg vzorek para-topolinu a para-topolin mesylátu byl umístěn do vialek. Pět objemových alikvot každého rozpouštědla bylo přidáno do jednotlivých vialek. Před každým následujícím přidáním byla směs ověřena na rozpustnost, a pokud nebyl vzorek rozpuštěn, bylo pokračováno s přídavkem dalšího alikvotu rozpouštědla. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4.: Rozpustnost p-topolinu a p-topolin mesylátu v různých organických rozpouštědlech

rozpouštědlo	p-topolin	p-topolin mesylát
methanol	0,25 mg/ml	5 mg/ml
ethanol	0,25 mg/ml	0,4 mg/ml
DMF	5 mg/ml	14 mg/ml
DMSO	6,66 mg/ml	10 mg/ml
aceton	0,2 mg/ml	0,33 mg/ml
Heptan	<0,1 mg/ml	<0,1 mg/ml
acetonitril	<0,25 mg/ml	<0,25 mg/ml

Příklad 7: Stabilitní studie krystalického para-topolin mesylátu pomocí práškové rtg difrakce

Stabilita vzorku byla testována při uložení látky při 25 °C. Nebyla pozorována žádná změna struktury ani barvy po 30 dnech uložení pevné látkypara-topolin mesylátu. Po těchto 30 dnech byl změřen práškový difraktogram a nebyla zaznamenána žádná změna struktury (změna difraktogramu). Obrázek 2 ukazuje porovnání originálního XRPD práškového difraktogramu látky a přeměření tohoto difraktogramu po 30 dnech při 25 °C. Nebyly detekovány žádné změny tohoto difraktogramu.

Příklad 8: Disproporcionační studie krystalického para-topolin mesylátu

50mg vzorek krystalickéhopara-topolin mesylátu byl rozpuštěn v 1 ml destilované vody, ponechán 48 h v roztoku a pak zkrystalován a byl změřen XRPD difraktogram, aby byly zjištěny případné disproporcionační změny. Z difraktogramu nebyla žádná disproporcionace pozorována, látka svou strukturu nezměnila.

Příklad 9: Monokrystalová rentgenostruktumí analýza krystalickéhopara-topolin mesylátu a popis jeho molekulové a krystalové struktury

Příprava monokrystalů: Krystaly pro monokrystalovou rtg analýzu byly vypěstovány z roztoků para-topolin mesylátu (asi 100 mg) v methanolu (30 cm³). Roztok byl ponechán k volnému odpařování rozpouštědla po dobu 7 dnů a po této době vznikly průsvitné krystaly, ze kterých byly vybrány vhodní zástupci pro rtg monokrystalovou analýzu.

Monokrystalová rtg difrakce: Pro analýzu byly vybrány podlouhlé průsvitné krystalky. Difrakční data byla měřena za použití čtyřkruhového mikrofokusního difraktometru Supernova s Cu/Ka zářením kolimovaným pomocí tenkovrstvých zrcadel, s použitím uzavřené mikro-fokusované rtg trubice, který je vybaven CCD detektorem Atlas S2, pracujícím při teplotě 105 K.

Při analýze krystalové struktury bylo zjištěno, že para-topolin mesylát je centrosymetrický dimer spojený níže diskutovanými vodíkovými vazbami. Krystalová soustava byla určena jako triklinická s prostorovou grupou P-l s následujícími parametry základní buňky: a=7,5356 Á, b=10,5681 Á, c=19,7793 Á, α=101,1060°, β=95,940°, γ=105,3230°, a objemem základní buňky V=1470,75 Á³. Strukturní model byl nalezen za použití software Superflip nebo SHELXT a vypřesněn metodou nejmenších čtverců softwarem JANA2006. Sběr dat, redukční a absorpční korekce pro danou

- 11 CZ 2020 - 277 A3 sloučeninu byly uskutečněny s použitím software CrysAlisPro (Rigaku, Oxford Diffraction, 2018, CrysAlis version 1.171.40.35a). Asymetrická jednotka zkoumané sloučeniny je složena z 6-(4hydroxybenzylamino)puriniového kationtu (para-topolinový kationt) a mesylátového (methylsufonátového) aniontu. Kationt je protonizován na jednom z dusíkových atomů a sloučenina krystalizuje v triklinické krystalové soustavě s prostorovou grupou P-l. Některé vodíkové atomy napojené na kyslíky byly lokalizovány v diferenční mapě. Síť intermolekulámích vodíkových vazeb mezi N...H atomy v purinu a kyslíkovými atomy mesylátu spojují vždy dvě molekuly sloučeniny v centrosymetrické dimery. Tyto vodíkové vazby stabilizují celý system a konkrétně propojují N6...H6a atom purinové struktury s Ola atomem mesylátu, dále N7a...H7a purinu s O2a atomem mesylátu, O4b...H 104b hydroxylu připojeného na benzenový kruhparatopolinu s Ola kyslíkem mesylátu a vice versa O4b...H4b vodíkový atom para-topolinu s Olb kyslíkovým atomem mesylátu viz obrázek 3. Mimo tyto interakce je purinový kationt spojen dvěma vodíkovými vazbami mezi N3a.. H3a vodíkem a N9a dusíkem dalšího para-topol i nového kationtu v krystalové struktuře, která je uvedena na obrázku 4. Výsledný “konvenční” R-faktor (založený na F a 6049 reflexích s [F²> 2σ (F²)] byl 0,0271.

Monokrystalová struktura krystalické soli para-topolin mesylátu odhalila, že se jedná o sloučeninu obecného sumárního vzorce C13H15N5O4S s p-topolinovým kationtem kompenzovaným mesylátovým aniontem. Centrosymetrické dimery asymetrické jednotky jsou spolu propojené sítí intermolekulámích vodíkových vazeb, které jsou zejména realizovány mezi kationtem a aniontem, což přispívá k výborné rozpustnosti dané látky ve vodě oproti jeho volné bázi para-topolinu nebo jiným popsaným solím, například para-topolin hydrochloridu. Jsou výrazně ovlivněny tzv. torzní úhly v molekule. Tyto úhly mají často dopad na fyzikální vlastnosti a rozpustnost zkoumaných molekul a jsou silně ovlivněny právě formací husté sítě intermolekulámích vodíkových vazeb.

Příklad 10: Schopnost vychytávat volné radikály metodou ORAC

Schopnost látek vychytávat volné radikály in vitro byla stanovena pomocí metody ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Ve stručnosti, 100 μΐ fluoresceinu (500 mM) a 25 μΐ roztoku zkoumané látky byly napipetovány do každé jamky 96jamkové mikrotitrační desky předehřáté na 37 °C. Samotná reakce byla spuštěna přídavkem 25 μΐ 250mM AAPH. Po 5s třepání byla odečítána fluorescence (Ex. 485 nm, Em. 510 nm) každé 3 min po dobu 90 min pomocí přístroje Infinite 200 (TECAN, Švýcarsko). Plocha pod křivkou byla použitá k vyjádření antioxidační kapacity relativní vůči troloxu, který je používán jako standard. Látky s ORAC aktivitou vyšší než 1 jsou efektivnější než trolox, který je hydrofilním ekvivalentem vitaminu E. Trolox, ve vodě rozpustný analog vitaminu E, je známý svou antioxidační aktivitou, u které se také ukázalo, že je odpovědná za jeho ochrannou aktivitu v lidských buňkách. Test ORAC, který se obecně používá pro stanovení antioxidační aktivity, ukázal, že několik cytokininů, jako je ortúo-topolin (oT), meto-topolin (mT) a para-topolin (pT), bylo spojeno s vysokou celkovou antioxidační aktivitou vyjádřenou v ekvivalentech Trolox (TE). Takové aktivity jsou pravděpodobně úzce spojeny s elektronově bohatým systémem C6-hydroxybenzylamino substituentu. Ukázalo se, že mesylátová sůl paratopolinu je nejúčinnější látkou.

Tabulka 5. Údaje o kyslíkové radikálové absorpční kapacitě (ORAC) vyjádřené v ekvivalentech Troloxu (TE) na ekvimolámím základě.

	Průměr (TE)	SD (n=3)
6-(3-hydroxybenzylamino)purin (mT)	4,509	0,687
6-(2-hydroxybenzylamino)purin (oT)	7,026	1,179
6-(4-hydroxybenzylamino)purin (pT)	16,799	0,829
6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylát (pT mesylát)	21,436	1,306

- 12CZ 2020 - 277 A3

Příklad 11: Protizánětlivá aktivitapara-topolinu a jeho mesylátu

Byla stanovena protizánětlivá aktivita para-topolinu a para-topolin mesylátu podle tohoto vynálezu; cytokinin kinetin byl také hodnocen jako kontrola. Krysí gliomové C6 buňky (ATCC č. CCL107) byly kultivovány v monovrstvě v chemicky definovaném besérovém médiu obsahujícím Ham's FlO/minimální esenciální médium (1:1 obj./obj.), 2 mM L-glutaminu, 1% (obj./obj.). Minimální vitamíny esenciálního média (lOOx), 1% (obj ./obj.) minimální esenciální aminokyseliny neesenciální (lOOx), 100 U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu a 30 nM seleničitanu sodného. Inkubace byla prováděna při 37 °C ve 100% zvlhčené atmosféře. Testy byly prováděny v logaritmické růstové fázi při hustotě 2,5 x 10⁵ buněk/cm². Intracelulámí syntéza cAMP byla indukována přidáním 5mM (-)-isoproterenolu; současně byly přidány různé koncentrace testovaných sloučenin ve stejné době jako (-)-isoproterenol. Po 30 minutách inkubace bylo buněčné množství cAMP stanoveno pomocí ELISA testu (cAMP-enzymová imunoanalýza od Amersham). Hodnoty IC50 byly stanoveny z křivky závislosti odpovědi na dávce ve dvojím provedení. Byly získány následující výsledky:

	Protizánětlivá aktivita
IC₅₀ (μΜ)
kinetin (6-furfurylaminopurin)	0
6-(4-hydroxybenzylamino)purin (para-topolin, pT)	7
6-(4-hydroxybenzylamino)purin mesylát (para-topolin mesylát, pTmes)	13

Para-topolin a para-topolin mesylát vykázaly protizánětlivou aktivitu, přičemž sůl byla téměř dvakrát účinněj ší než výchozí volná báze. Kinetin byl v testovacím protokolu neaktivní a byl použit jako cytokininová kontrola.

Příklad 12: Účinek nové sloučeniny na senescentní lidské diploidní fibroblasty

Senescentní lidské diploidní fibroblasty (buňky různých úrovní pasáže: pasáž 20 - P20; pasáž 40 označená P40; pasáž 80 - označená P80) byly naočkovány do 24-jamkové destičky (10 000 buněk/jamku). Kultivační médium (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 μg/ml streptomycinu a 10% fetální telecí sérum) bylo odstraněno a nahrazeno kultivačním médiem obsahujícím testovanou sloučeninu v koncentračním rozmezí 0 až 12,5 μΜ. Každá koncentrace byla testována trojmo. Buňky byly následně inkubovány při 37 °C (bez CO2) po dobu 16 hodin ve 2 až 3 ml roztoku obsahujícího ferrikyanid draselný (5 mM), ferokyanid draselný (5 mM), MgCb (2 mM), X-gal (5-brom)-4-chlor-3-indolyl-P-D-galaktopyranosid) (1 mg/ml), v citrát/fosfátovém pufiru, pH 6,0) Po této inkubační době byly vzorky buněk pozorovány, aby se zjistila přítomnost modrých buněk, což naznačuje, že X-gal byl rozštěpen (pozitivně senescentní buňky). V tomto experimentu byly senescentní buňky, ale ne jiné buňky, obarveny modře v důsledku působení β-galaktózidázy na substrát. Jak je ukázáno v tab. 6, se zvyšujícím se počtem pasáží zbarvení ztmavlo. U nej starších buněk existovaly pouze modré buňky od jasně modré až po téměř neprůhlednou barvu. Obapara-topoliny (báze i mesylátová sůl) byly účinné při udržení mnohem nižší hladiny senescentních buněk po 80 pasážích. V případě dlouhodobé kultivace byly ošetřené buňky schopny žít o 30 % déle než kontrolní buňky.

- 13 CZ 2020 - 277 A3

Tabulka 6. Účinek nové sloučeniny na počet senescentních buněk v kultuře lidských fibroblastů

Sloučenina	Senescentní buňky (%)
pasáže buněk	P20	P40	P80
KONTROLA	3	14	38
6-(4-hydroxybenzylamino)purin (para-topolin)	4	14	25
6-(4-hydroxybenzylamino)purin mesylát (paratopolin mesylát)	3	12	21

Příklad 13:7« vitro cytotoxická aktivita (metabolizace kalceinu AM).

Protože toxické sloučeniny negativně ovlivňují metabolické procesy buněk, je mnoho standardních testů cytotoxicity založeno na měření rychlosti metabolizace různých umělých substrátů. Výsledný produkt je pak kvantifikován například pomocí spektrometrie. Testy lze snadno modifikovat pro použití v 96-jamkových destičkách. Pro vyhodnocení cytotoxicity para-topolinu a jeho soli podle vynálezu byl použit mikrotitrační test založený na kvantifikaci metabolizace Calceinu AM. Test je široce používán v programech screeningu léků a při testování chemosenzitivity. V živých buňkách je Calcein AM enzymaticky hydrolyzován a kumulace výsledného kalceinu se projevuje zelenou fluorescencí.

Následující buněčné linie - RPMI 8226 (mnohočetný myelom), CEM (T-lymfoblastická leukémie), K562 (chronická myeloidní leukémie), HL-60 (promyelocytámí leukémie), MCF-7 (adenokarcinom prsu), HeLa (karcinom děložního čípku), G361 (maligní melanom), HOS (lidský osteosarkom) a BJ (lidské předkožkové fíbroblasty) - byly získány ze sbírky American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Tyto buňky byly udržovány ve standardním médiu DMEM nebo RPMI (Sigma, MO, USA) doplněném tepelně inaktivovaným fetálním hovězím sérem (10 %) 2 mM L-glutaminem a penicilin-streptomycínem (1 %) za standardních podmínek buněčné kultury (37 °C) C, 5 % CO² ve vlhkém prostředí) a subkultivovány dvakrát nebo třikrát týdně pomocí standardního trypsinizačního postupu.

Přibližně 10 000 buněk v 80 pl média bylo naočkováno do 96-jamkové mikrotitrační destičky. Po 12 hodinách inkubace byly sloučeniny, které se měly testovat, přidány ve 20μ1 podílech. Kontrolní kultury byly ošetřeny samotným DMSO. Konečná koncentrace DMSO v médiu nepřesáhla 0,5 %. Byla testována sériová, trojnásobná ředění (celkem šest, nejvyšší koncentrace v inkubacích 166 μΜ) každé sloučeniny. Po 72 hodinách inkubace byl přidán roztok Calcein AM (Molecular Probes) do konečné koncentrace 1 pg/ml a buňky byly inkubovány další hodinu. Fluorescence volného kalceinu byla poté kvantifikována s použitím fluorometru Fluoroscan Ascent (Microsystems) a procento přežívajících buněk v každé jamce bylo vypočteno dělením OD získané z každé buňky exponovanými buňkami střední OD získanou z kontrolních jamek x 100 %. Nakonec byly vypočteny hodnoty IC50 (koncentrace způsobující 50 % pokles aktivity buněčné esterázy) pro každou sloučeninu generovaných z křivek závislosti odpovědi na dávce (Kryštof et al., 2005, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 3283-3286). Zde uvedené hodnoty IC50 jsou průměry získané z alespoň tří nezávislých experimentů, kde jednotlivé hodnoty replikace spadaly do 20% průměru. Inhibice růstu byla vypočtena pomocí následující rovnice: IC50 = (průměr FDj_amka exponovaná k léčivu průměr FDbiank) / (průměr FDkontroinijamky- průměr FDbiank) x 100%. Hodnota IC50, koncentrace léčiva způsobující 50% snížení konverze Calceinu AM, byla vypočtena z získaných křivek závislosti odpovědi na dávce.

Cytoxicita sloučenin byla testována na panelu buněčných linií různého histogenetického a druhového původu. Jak je uvedeno v tab. 7, IC50 para-topol i nových derivátů překročila obvykle maximální testovanou koncentraci, což znamená, že sloučeniny by mohly být aplikovány v koncentracích vyvolávajících požadovaný účinek bez negativních vedlejších účinků. 7’ara-topolin mesylát nebyl vůbec cytotoxický, kdežto para-topolin byl toxický pro buňky chronické myeloidní leukémie K562.

- 14CZ 2020 - 277 A3

Tabulka 7. Cytotoxická aktivita para-topolinů vyjádřená jako hodnoty IC50 ve 3-denním testu Calcein-AM. Prezentované hodnoty jsou průměry alespoň 3 nezávislých experimentů, kde jednotlivé replikáty spadají do intervalu 20 % kolem průměru.

	CEM	HL60	K562	RPMI 8226	HOS	MCF7	G361	HELA
para-topolin	>167	>167	140	>167	>167	>167	>167	>167
para-topolin mesylát	>167	>167	>167	>167	>167	>167	>167	>167

Příklad 14: Cytotoxická aktivita in vitro na normálních fibroblastech (metabolizace MTT)

Test MTT (metabolická tetrazoliová toxicita) je standardní kolorimetrický test pro hodnocení cytotoxicity. Mitochondriální dehydrogenázová aktivita převádí žlutou MTT na fialový formazan, který se měří pomocí spektrometrie. Lidské diploidní fibroblasty BJ (pasáž 18 až 22) byly naočkovány na 96-jamkovou destičku (5 000 buněk na jamku). Po 6 hodinách, kultivační médium (DMEM s 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitanu sodného) bylo nahrazeno kultivačním médiem obsahujícím testované sloučeniny v koncentračním rozmezí 0 až 200 μΜ. Nejvyšší koncentrace byla upravena, pokud rozpustnost sloučeniny byla omezující. Každá koncentrace byla testována pentaplikátem. MTT byl přidán k buňkám po 72 hodinách inkubace (konečná koncentrace 0,5 mg/ml) a inkubace pokračovala další 3 hodiny. MTT byl solubilizován pomocí DMSO a byla měřena absorbance při 570 nm. Inhibice růstu (GI) byla vypočtena pomocí následující rovnice: GI = (průměr jamek ošetřených léčivem - průměr jamek Abi_ank/ průměr Akontroinich jamek - průměr Abiank) x 100 %. Hodnota GI20, koncentrace léčiva způsobující 20% pokles aktivity mitochondriální dehydrogenázy, byla vypočtena ze získaných křivek závislosti odpovědi na dávce. Jak je uvedeno v tab. 8, GI20para-topolinů překročilo většinou maximální testovanou koncentraci, což naznačuje, že sloučeniny by mohly být aplikovány v koncentracích vyvolávajících požadovaný účinek bez negativních vedlejších účinků. Na druhé straně mnoho dalších přírodních isoprenoidních cytokininových bází a ribosidů vykazovalo vysokou cytotoxicitu

Tabulka 8. Cytotoxicita pro lidské diploidní fibroblasty (GI20, μΜ)

Sloučenina	BJ
6-(4-hydroxybenzylamino)purin (para-topolin)	138
6-(4-hydroxybenzylamino)purin mesylát paratopolin mesylát	>167
6-(benzylamino)purin ribosid	1,7
6-furfurylaminopurin (kinetin)	>167
6-furfurylaminopurin ribosid (Kinetin ribosid)	2,1

Příklad 15: Amesůvtest

Para-topolm apara-topolin mesylát byly testovány na mutagenitu bakteriálním testem reverzních mutací. Provedení testu bylo založeno na metodě EU B. 13/14 Mutagenicity - Reverse mutation test using bacteria, která je analogem metodiky OECD Test Guideline No. 471. Byly použity čtyři indikátory kmene Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 a také byl použit jeden kmen Escherichia coli WP2 uvrA. Zkoušené látky byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a byly testovány v dávkách lOaž 1000 pg najednu desku, která byla aplikována na plotny v objemu 0,1 ml. Experimenty byly prováděny s metabolickou aktivací se supematantem z krysích jater a směsi kofaktorů stejně jako bez metabolické aktivace. Pracovní postup byl proveden podle dokumentů Metody B. 13 / 14, Mutagenicity - Reverse mutation test using bacteria, Council Regulation (EC) No.440/2008. Published in O. J. L 142, 2008 a podle metodiky OECD Test Guideline 471, Bacterial Reverse Mutation Test. Adopted July 21, 1997. Při testování v uspořádání

- 15 CZ 2020 - 277 A3 uvedeném výše se testované látky projevily jako nemutagenní pro všechny použité testovací kmeny s metabolickou aktivací stejně jako bez metabolické aktivace.

Příklad 16: Biologická dostupnost para-topolinu a para-topolin mesylátu po intraduodenálním a intravenózním podání samcům potkanů

Příprava dávkovačích roztoků pro studii in-vivo: Para-topolin a para-topolin mesylát byly skladovány při pokojové teplotě v sušárně a chráněny před světlem. Dávkovači roztoky byly připraveny čerstvé z prášků v den dávkování. Dávkovači roztok pro intravenózní podávání (IV) byl připraven v koncentraci 1 mg/ml v 50:50 DMSO : solný roztok (slaninka). Dávkovači roztoky pro intraduodenální podávání (ID) byly připraveny v koncentraci 2 mg/ml v 0,2% roztoku karboxymethylcelulózy sodné (NaCMC) ve vodě.

Dávkování zvířatům: Farmakokinetika para-topolinů byla hodnocena u samců krys SpragueDawley na lačno. Každé zvíře bylo opatřeno kanylou jugulámí žíly (JVC) pro odběr krve. Zvířata určená pro intravenózní dávkování byla vybavena dalším JVC pro podávání dávky. Zvířata určená pro intraduodenální dávkování byla pro podávání dávky vybavena intraduodenální kanylou (IDC).

Chirurgicky modifikovaná zvířata byla umístěna po jedné do klece. Všechna zvířata byla před zahájením studie zásobena komerčním krmivém pro hlodavce (LabDiet, Certified Rodent Diet # 5002) ad libitum. Krmivo bylo potom zvířatům zadrženo po dobu nejméně dvanácti hodin před studií a během studie, až do osmi hodin po dávce, když bylo jídlo vráceno. Voda byla přiváděna ad libitum. Intraduodenální dávkovači roztoky byly podávány jako jedna bolusová dávka v čase nula v den podání. Intravenózní dávky byly podávány jako pomalá injekce IV po dobu přibližně 1 minuty. Časy odběru krve začaly na konci infůze. Byly odebrány vzorky krve. Návrh studie je uveden v tab. 9.

Tabulka 9. Srovnávací farmakokinetická studie para-topolinu a para-topolin mesylátu u potkanů

Ošetřená skupina	Testovaná sloučenina	Způsob podání	Dávka (ml/kg)	Dávk. konc. roztoku (ml/kg)	Dávk. objem (ml/kg)	Vehiculum	Odběry krve časové body
1.	paratopolin	ID	20	10	2	0,2% NaCMC v h₂o	0, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 h
2.	paratopolin mesylát	ID	20	10	2	0,2% NaCMC v h₂o	0, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 h
3.	paratopolin	IV	1	1	1	50% DMSO ve slanince	0, 5, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 h
4.	paratopolin mesylát	IV	1	1	1	50% DMSO ve slanince	0, 5, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 h

Každý vzorek krve byl odebrán z krys pomocí kanyly jugulámí žíly a umístěn do chlazených polypropylenových zkumavek obsahujících heparin sodný jako antikoagulační činidlo. Vzorky byly odstředěny při teplotě 4 °C a při rychlosti 13 000 ot/min po dobu 5 minut. Vzorky byly během zpracování udržovány chlazené. Každý vzorek plazmy byl rozdělen do dvou alikvotů. První alikvot obsahoval 50 μΐ plazmy. Veškerý zbývající objem plazmy byl použit pro druhý alikvot. Vzorky pak byly umístěny na suchý led a uloženy v mrazničce nastavené pro udržování -60 °C až -80 °C. Celková koncentrace para-topolinu ve vzorcích plazmy byla analyzována pomocí LC-MS/MS po inkubaci přes noc se směsí enzymů glukuronidáza/arylsulfatáza. Farmakokinetické parametry byly vypočteny pomocí softwaru WinNonlin.

- 16CZ 2020 - 277 A3

Analýza vzorků plazmy: Byla vyvinuta analytická metoda LC-MS/MS pro stanovení para-topolinu v plazmě potkanů (metoda publikována Novákem et al., Phytochemistry, 69, 2008: 2214-2224). Před analýzou vzorku byla analyzována standardní křivka pro stanovení specificity, rozsahu a linearity metody. Celkový para-topolin ve vzorcích plazmy byl stanoven předběžným ošetřením všech vzorků enzymy β-glukuronidázy/arylsulfatázy a inkubací před analýzou. Inkubace s enzymatickou směsí dekonjugovala jakýkoli glukuronidový nebo sulfátový metabolit paratopolinu zpět do původní formy.

Kritéria přijatelnosti pro analýzu LC-MS/MS'. Jedna standardní křivka byla vložena do každého analytického pokusu. Aby běh proběhl adekvátně, musí být přesnost minimálně 5 z 8 standardů s přesností ± 20 %, s výjimkou LLOQ, kde je přijatelná ± 25 %.

Farmakokinetická analýza: Jednotlivé plazmatické koncentrace v závislosti na čase pro paratopolin byly podrobeny nekompartmentální analýze s použitím farmakokinetického programu WinNonlinv. 4.1. Plazmatickým koncentracím pod limitem kvantifikace (lOng/ml) byla přiřazena hodnota nula pouze pro PK analýzu.

Výsledky: Průměrná plazmatická koncentrace a profily PK para-topolinu ve srovnání s paratopolin mesylátem se po dávkování ID výrazně lišily. Průměrná maximální plazmatická koncentrace (Cma_X) z para-topolin mesylátu byla 4,2-krát vyšší ve srovnání s maximální plazmatickou koncentrací para-topolinu, 6526 ± 897 ng/ml a 1312 ± 765 ng/ml. Již do 15 minut po ID dávce para-topolin mesylátu byla pozorována maximální plazmatická koncentrace (Cmax) para-topolinu, zatímco Cmax para-topolinu byla pozorována 2 hodiny po dávce para-topolinu podávaného ve formě volné báze (tab. 9). Biologická dostupnost /?ara-topolinu z mesylátové soli para-topolími byla 53 ± 12 % ve srovnání s 13 ± 4,1 % pro para-topolin (tab. 10).

Tabulka 10. Farmakokinetické parametery po intraduodenální aplikaci 20 mg/kg odpovídající formy (průměr ± SD, n = 3).

PK parametr	para-topolin	para-topolin mesylát
Cmax(ng/ml)	1312 ±765	6526± 897
tmax (h)	2,1 ±0	0,82 ± 0,9
AUCiast (h · kg · ng/ml/mg)	408±111	1157 ±342
Biodostupnost (%)	13 ±4,1	53 ± 12

Příklad 17: Přípravky

Kosmetické přípravky obvykle obsahují 0,1 až 99 % z hmotnosti, obzvláště 0,1 až 95 % hmota., směsi účinných látek obsahující para-topolin mesylát podle tohoto vynálezu, 1 až 99,9 % hmota, pevné nebo kapalné přípravky, a od 0 do 25 % hmota., obzvláště 0,1 až 25 % hmota., povrchově aktivního činidla. Zatímco komerční produkty jsou obvykle formulovány jako koncentráty, konečný uživatel bude normálně používat zředěné formulace. Tyto prostředky mohou také obsahovat další přísady, jako jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný kokosový, řepkový olej nebo sójový olej), činidla proti pěnění, například silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojidla, látky způsobující lepivost a také hnojivá nebo jiné aktivní složky. Výhodné formulace mají zejména následující složení: (% = hmotnostní procenta):

Emulgované koncentráty aktivní složka

a) dodecylbenzensulfonan vápenatý 6 % polyoxyethylovaný ricinový olej (polyglykolether 4 % ricinového oleje) oktylfenolpolyglykolether (7 až 8 mol ethylenoxid)

c) % 6% 4%

d) % 8 % 4%

2%

- 17CZ 2020 - 277 A3 cyklohexanon směs aromatických uhlovodíků C9-C12

10% 20%

83% 82% 53% 18%

Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou.

Roztoky	a)	b)	c)	d)
aktivní složka	5 %	10 %	50 %	90 %
1 -methoxy-3 -(3 -methoxy-propoxy)propan	-	20 %	20 %	-
polyethylenglykol MW 400	20 %	10 %	-	-
oktylfenolpolyglykolether (7 až 8 mol ethylenoxid)	-	-	30%	10%
směs aromatických uhlovodíků	75 %	60%	-	-
Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.
Smáčivé prášky	a)	b)	c)	d)
aktivní složka	5 %	25 %	50 %	80 %
ligninsulfonan sodný	4%	-	3 %	-
laurylsulfát sodný	Ω 0/ Z /o	3 %	-	4%
diisobutylnaftalensulfonát sodný	-	6%	c 0/ J /0	6%
oktylfenolpolyglykolether (7 až 8 mol ethylenoxid)	-	1 0/ 1 /0	9 o/ Z /o	-
vysoce disperzní kyselina křemičitá	1 %	3 %	5 %	10 %
kaolin	87 %	61 %	37 %	-

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.

Suspenzní koncentrát	a)	b)	c)	d)
aktivní složka	o 0/ 3 /o	10 %	25 %	50 %
ethylenglykol	C 0/ J /0	5 %	5 %	5 %
nonylfenolpolyglykolether (15 mol etylenoxid)	-	1 0/ 1 /o	2%	-
lignosulfonát sodný	o o/ 3 /o	Ώ 0/ 3 /o	4%	c 0/ J /0
karboxymethylcelulóza	1 %	1 %	1 %	1 %
37% vodný roztok formaldehydu	0,2 %	0,2 %	0,2 %	0,2 %
emulze silikonového oleje	0,8 %	0,8 %	0,8 %	0,8 %
voda	85 %	78 %	64 %	38 %

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.

Suché kapsle

5000 Tobolek, z nichž každá obsahuje 0,25 g para-topolin mesylátu, se připraví následujícím způsobem:

Složení: léčivá látka: 1250 g; talek 180 g; pšeničný škrob: 120 g; stearát hořečnatý: 80 g; laktóza 20 g.

Postup přípravy: Rozetřené látky jsou tlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí stroje na plnění tobolek.

Měkké tobolky

- 18 CZ 2020 - 277 A3

5000 měkkých želatinových tobolek, z nichž každá obsahuje 0,05 g para-topolin mesylátu jako účinnou látku, se připraví následujícím způsobem:

Složení: 250 g Účinná látka + 21 g Lauroglycol

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v Lauroglykol® (propylenglykollaurát, Gattefossé SA, Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Měkké tobolky

Složení: 250 g účinné složky v 1 1 PEG 400, 1 litr Tween 80.

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o mh mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween 80 (polyoxyethylensorbitanmonolaurát, Atlas Chem lne., Inc., USA., dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 18. Gelový přípravek

Formulace mastí byla testována během pilotní klinické studie se 4 dobrovolníky růží, což je onemocnění kůže. Složky jsou uvedeny v gramech na 100 g.

Látka	Obsah
para-topolin mesylát	1,0 g
butylhydroxytoluenum	0,2 g
butylparaben	0,2 g
diethylenglykolmonoethylether	10,0 g
silica colloidalis anhydrica	5,0 g
propylenglykollaurát	83,6 g

Gel této konzistence může být navíc modifikován přidáním oxidu křemičitého, silica colloidalis anhydrica. Také se opět předpokládá, že transdermální systém Transcutol P/Lauroglycol FCC zvýší účinnost mesylátové soli para-topolinu. Oxid křemičitý colloidalis anhydrica pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky.

Příklad 19: Postup přípravy kožní masti

Složky masti jsou uvedeny v gramech na 200 g:

Látka	Obsah
para-topolin mesylát	2,0 g
butylhydroxytoluenum	0,4 g
butylparaben	0,4 g
diethylenglykolmonoethylether	20,0 g
glyceroldibehenát	44,0 g
propylenglycollaurát	132,2 g

Doporučený postup

- 19CZ 2020 - 277 A3

Fáze A: 2 g mesylátová soli para-topolinu se rozpustí ve 20 g Transcutol P za stálého míchání při teplotě místnosti v oddělené skleněné nebo nerezové nádobě. Proces rozpouštění může být urychlen zahříváním roztoku na maximální teplotu 40 °C.

Fáze B: 0.4 g Nipanox BHT a 0,4 g Nipabutyl se rozpustí za stálého míchání ve 133,2 g Lauroglykolu FCC při teplotě přibližně 70 °C, v další samostatné skleněné nebo nerezové nádobě. Čirý olejovitý roztok se zahřívá na teplotu přibližně 80 °C a 44 g Compritol 888 ATO se taví v něm, za stálého míchání. Čirý olejovitý roztok se ochladí na cca 60 °C za stálého míchání a ochlazení a smísí se s fází A. Vzniklá bělavá mast je rozdělena na přibližně 15 g porce a plní se do předem připravených plastových nádob.

Příklad 20: Formulace přípravku pro lokální aplikaci na kůži

Prostředek pro místní aplikaci na kůži obsahuje následující složky podle hmota. %:

Aktivní složka:	para-topolin mesylát	0,1 %
Olejová fáze:	Cetylalkohol	5,0 %
	Glycerylmonostearát	15,0 %
	Sorbitanmonooleát	0,3 %
	Polysorbát 80 USP	0,3 %
Vodná fáze:	Methylcelulózová 100 cps	1,0 %
	Methylparaben	0,25 %
	Propylparaben	0,15 %
	Vyčištěná voda q.s. na	77,9 %

Methylparaben a propylparaben se rozpustí v horké vodě a následně se v ní disperguje i methylcelulóza. Směs se pak ochladí na 60 °C, dokud se metaylcelulóza nerozpustí. Směs se potom zahřívá na 72 °C a přidá se do olejové fáze, která se zahřívá na teplotu 70 °C za stálého míchání. Mesylátová sůl para-topolinu se přidá při teplotě 35 °C a výsledná směs se míchá až do okamžiku rozptýlení. Tento prostředek se aplikuje na kůži přinejmenším každý den, dokud se nedosáhne požadovaného zmírnění stárnutí kůže (proti stárnutí).

Claims

1. 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylát.

2. Krystalická forma 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylátu, vyznačená tím, že má charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 9,0; 9,2; 17,0; 17,9; 18,1; 22,3; 22,4; 24,1; 26,4 ± 0,2° 2-theta.

3. Krystalická forma podle nároku 2, vyznačená tím, že má další charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 13,6; 15,6; 16,3; 16,7; 19,8; 25,7; 27,2 ± 0,2° 2-theta.

4. 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako léčivo.

5. 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití při léčbě nebo zlepšení chorob či stavů kůže, neurodegenerativních chorob, nebo pro potlačení imunostimulace nebo zánětu.

6. 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití při prevenci a léčbě chorob a stavů vybraných z rakoviny kůže, psoriázy, fíbrózních poruch, jako je sklerodermie, onemocnění štěpu proti hostiteli tzn. GVHD, hypertrofíckých jizev, nefrogenní systémové fíbrózy tzn. NSF, alergického ekzému, toxického ekzému, atopické dermatitidy, lichen planus, hyperpigmentace a lézí herpes simplex, ichtyózy, papilomu, Bowenovy choroby, seboroické keratózy, aktinické keratózy, bazálních a skvamózních buněčných karcinomů, artritidy, rejekce transplantátu, bolesti, akné, erytému a zarudnutí.

7. Použití 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 jako kosmeticky účinné látky.

8. Použití podle nároku 7, které zahrnuje omlazení buněk a tkání; zlepšení celkového vzhledu a stavu kůže; zlepšení stavu akné a/nebo erytému; snížení zarudnutí; snížení počtu a/nebo hloubky vrásek, linek; zlepšení stavu vybraného z ochablé kůže, změny barvy, výskytu stařeckých skvrn, kožovitých a/nebo zažloutlých oblastí pokožky; zlepšení kosmetického vzhledu pokožky.

9. Použití 6-(4-hydroxybenzylamino)purinium mesylátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 in vitro pro omlazení buněk a tkání, stimulaci buněčné proliferace, morfogeneze a/nebo diferenciace, inhibici buněčného stárnutí a stárnutí tkání.

10. Kosmetická a/nebo farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje 6-(4hydroxybenzylaminojpurinium mesylát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a alespoň jeden kosmeticky a/nebo farmaceuticky přijatelný nosič.