CZ2017162A3 - Sady pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu - Google Patents

Sady pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu Download PDF

Info

Publication number
CZ2017162A3
CZ2017162A3 CZ2017-162A CZ2017162A CZ2017162A3 CZ 2017162 A3 CZ2017162 A3 CZ 2017162A3 CZ 2017162 A CZ2017162 A CZ 2017162A CZ 2017162 A3 CZ2017162 A3 CZ 2017162A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lchv
seq
pcr
detection
probe
Prior art date
Application number
CZ2017-162A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308827B6 (cs
Inventor
Radek ÄŚmejla
Lucie Valentová
Markéta Bohunická
Jana Suchá
Original Assignee
Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s. r. o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s. r. o. filed Critical Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s. r. o.
Priority to CZ2017162A priority Critical patent/CZ308827B6/cs
Publication of CZ2017162A3 publication Critical patent/CZ2017162A3/cs
Publication of CZ308827B6 publication Critical patent/CZ308827B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Sady primerů a hybridizačních sond pro PCR detekci virů Little cherry virus 1 (LChV-1) a Little cherry virus 2 (LChV-2) v biologickém materiálu. Jsou charakterizovány tím, že obsahují primery a hybridizační sondy, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení: Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1), Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5), Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2), Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3), Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6), Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 7), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G a hybridizační sondy jsou označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce. Sady primerů a sond umožňují současnou velmi specifickou detekci obou virů v jedné PCR reakci. Viry LChV-1 a LChV-2 jsou původci onemocnění maloplodost třešní a řešení tak zpřesňuje, zrychluje a zlevňuje diagnostiku tohoto onemocnění.

Description

Sady pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu
Oblast techniky
Řešení se týká sad primerů a sond pro PCR detekci virů Little cherry virus 1 (LChV-1) a Little cherry virus 2 (LChV-2) v biologickém materiálu.
Dosavadní stav techniky
Viry Little cherry virus 1 (LChV-1) a Little cherry virus 2 (LChV-2) patří mezi (+)ssRNA viry z čeledi Closteroviridae a jako takové jsou velmi polymorfní s vysokou rozmanitostí nalezených izolátů. Oba viry lze detekovat ve floému a parenchymatických buňkách napadených rostlin.
Viry LChV-1 a LChV-2 jsou původci onemocnění maloplodost třešní, které postihuje produkční výsadby třešní na celém světě. Kromě třešní může LChV-1 napadat i jiné ovocné druhy, např. višně, slivoně, mandloně a broskvoně. Mezi symptomy patří výrazně zmenšená velikost plodů, špatná vybarvenost plodů a nevýrazná chuť, takže plody nemají tržní hodnotu a pěstitelé zaznamenávají výrazné ekonomické ztráty. Pro omezení tohoto onemocnění je tedy nezbytná včasná a přesná diagnostika.
V současnosti se k detekci příslušných virů používají metody PCR, a to jak v klasickém uspořádání s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy (Eastwell, K.C., 1996; Vitushkina, M., 1997; Rott, M.E., 2001; Bajet, N.B., 2008; Rao, W.-L., 2011; Candresse, T., 2013; Zong, X., 2014; Katsiani, A. T., 2015; Glasa, M., 2015; Osman, F., 2015; Ruiz-García, A.B., 2016), tak i realtime PCR založená na použití interkalačního barviva (Jelkmann, W., 2008; Zong, X., 2015). Nevýhodou obou přístupů je obecně nízká specificita, neboť publikované metody nejsou dle výsledků srovnávací analýzy sekvencí z dostupných databází schopny zachytit všechny izoláty příslušných virů. Další nevýhodou je nutnost separátní PCR reakce pro každý virus zvlášť, což analýzu prodlužuje a prodražuje.
n *» · » ···· · · · · · ···· · · · ·· ·
2« · v * · · · • · » » · · · · • · · · · · ·· ·«·»·«·· «· ·· «· · ·
Podstata vynálezu
Nevýhodu nízké specificity a nutnosti provádět individuální PCR reakce pro detekci viru LChV-1 a LChV-2 odstraňuje sada primerů a sond pro PCR detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje primery a hybridizační sondy, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení: Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3) Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)
Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4)
Sonda 2: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G a hybridizační sondy jsou označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce.
Nevýhodu nízké specificity PCR reakce pro detekci viru LChV-1 odstraňuje sada primerů a sondy pro PCR detekci viru LChV-1 v biologickém materiálu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery a hybridizační sondu, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení:
Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)
Sonda: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G a hybridizační sonda je označena pro její detekci v průběhu PCR reakce.
Nevýhodu nízké specificity PCR reakce pro detekci viru LChV-2 odstraňuje sada primerů a sondy pro PCR detekci viru LChV-2 v biologickém materiálu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery ·* « · · * • · · » » > t 9 • · · * ««·«*·« ·· ·*· a hybridizační sondu, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení:
Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)
Sonda: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G a hybridizační sonda je vhodně označena pro její detekci v průběhu PCR reakce.
Výše uvedené sady primerů a sond jsou vhodné pro současnou nebo individuální kvalitativní nebo kvantitativní detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu s vysokou specificitou metodou založenou na metodě PCR. Metodou PCR se rozumí klasické uspořádaní PCR reakce s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy nebo digitální PCR nebo real-time PCR využívající k detekci interkalační barviva nebo různě značené hybridizační sondy podle vynálezu a další varianty metody PCR známé odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení vynálezu je PCR produkt detekován v reálném čase pomocí real-time PCR, a ještě výhodněji pomocí značených hybridizačních sond. V jedné PCR reakci je tak možné stanovit konkrétní virus, který je zodpovědný za vznik onemocnění.
Hybridizační sondy mohou být pro účely jejich detekce značeny fluorescenčně, radioaktivně, neradioaktivně nebo dalšími způsoby známými odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení vynálezu jsou hybridizační sondy pro detekci jednotlivých virů značeny fluorescenčně, a ještě výhodněji pomocí odlišných fluoroforů pro jejich současnou detekci v jedné PCR reakci.
Sekvence alespoň s 80% identitou k uvedeným sekvencím jsou zejména sekvence lišící se zkrácením nebo prodloužením na 3‘ a/nebo 5‘ konci nebo záměnou nukleotidů nebo kombinací těchto modifikací.
Návrh sad primerů a hybridizačních sond podle vynálezu pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 byl proveden v několika krocích: 1) Analýza sekvencí dostupných izolátů těchto virů; 2) Porovnání specificity detekce těchto izolátů s primery z dosavadního stavu techniky; 3) Návrh sad primerů a hybridizačních sond pro detekci virů LChV-1 a LChV-2.
* ·« • «· · • · « · ··«· «··· <i · «I • » * « • · »»· ·
Detekce virů LChV-1 a LChV-2 může být dle provedení vynálezu provedena v jakémkoliv rostlinném materiálu, s výhodou je rostlinný materiál floém a parenchymatické buňky.
Prvním krokem detekce virů LChV-1 a LChV-2 způsobujících maloplodost třešní v rostlinném materiálu je izolace celkové RNA a její přepis na cDNA pomocí RNA-dependentní DNA polymerázy a sady náhodných primerů metodami známými v oboru.
Vytvořená cDNA je následně analyzována na přítomnost nukleové kyseliny virů LChV-1 a LChV-2 metodou PCR sadami primerů a hybridizačních sond podle vynálezu.
Příklady provedení vynálezu jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace uvedených primerů, hybridizačních sond a použitého způsobu PCR detekce, které budou spadat do rozsahu této přihlášky. Ta je vymezena připojenými patentovými nároky a podrobně popsána v popisu vynálezu.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Návrh sekvencí primerů a sond
Sekvence různých izolátů virů LChV-1 a LChV-2 byly získány z databáze sekvencí GenBank. Pro analýzu variability sekvencí byla použita metoda multiple alignment v programu ClustaIW. Specificita primerů dle dosavadního stavu techniky byla stanovena jejich namapováním na uspořádané sekvence a zhodnocením konzervovanosti cílových úseků. Pro navržení sad primerů a hybridizačních sond byly použity konzervované oblasti genomu virů vykazující nejvyšší sekvenční homologii napříč všemi izoláty. Primery a hybridizační sondy byly navrženy pomocí programu Vector NTI Advance.
·:· ·
Příklad 2: Simplexová kvalitativní detekce viru LChV-1 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádání
Pro detekci viru LChV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:
Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.
Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru LChV-1 byl identifikován proužek o velikosti 84 bp.
Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-1.
Příklad 3: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru LChV1 v biologickém materiálu metodou real-time PCR
Pro detekci viru LChV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.
• ·
Ve výhodném provedení vynálezu je pro real-time PCR detekci viru LChV-1 použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 pM dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 1x EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:
Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.
Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-1.
V ještě výhodnějším provedení vynálezu je pro real-time PCR detekci viru LChV-1 použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio): 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 400 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:
Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)
Sonda: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.
• · · · • «I · ·
II
II
Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-1.
Ve výhodném provedení vynálezu byla přítomnost viru LChV-1 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy LChV-1 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru LChV-1 ve vzorku.
Příklad 4: Simplexová kvalitativní detekce viru LChV-2 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádání
Pro detekci viru LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:
Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.
Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru LChV-2 byl identifikován proužek o velikosti 149 bp.
Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-2.
• · · ·
Příklad 5: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru LChV2 v biologickém materiálu metodou reai-time PCR
Pro detekci viru LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.
Ve výhodném provedení vynálezu je pro real-time PCR detekci viru LChV-2 použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 1x EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:
Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.
Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-2.
V ještě výhodnějším provedení vynálezu je pro real-time PCR detekci viru LChV-2 použito tluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΙ cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 400 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:
Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)
Sonda: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), • · · · > · · « ·· ·· kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.
Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-2.
Ve výhodném provedení vynálezu byla přítomnost viru LChV-2 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy LChV-2 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru LChV-2 ve vzorku.
Příklad 6: Multiplexová kvalitativní detekce virů LChV-1 a/nebo LChV-2 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádání
Pro detekci viru LChV-1 a/nebo LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:
Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3) Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
• · · · ···· · ···
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.
Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U vzorků pozitivních na přítomnost viru LChV-1 byl identifikován proužek o velikosti 84 bp; u vzorků pozitivních na přítomnost viru LChV-2 byl identifikován proužek o velikosti 149 bp; u dvojitě pozitivních vzorků na přítomnost virů LChV-1 a LChV-2 byly identifikovány oba příslušné proužky.
Pozitivní nálezy získané pomocí PCR v tomto uspořádání byly porovnány s výsledky ze simplexových detekcí viru LChV-1 a LChV-2, které již byly sekvenačně ověřeny. Ve všech případech nálezy ze současné detekce obou virů v jedné PCR reakci souhlasily s výsledky ze simplexových reakcí.
Příklad 7: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru LChV1 a/nebo LChV-2 v biologickém materiálu metodou real-time PCR
Pro detekci virů LChV-1 a/nebo LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných prímerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.
Ve výhodném provedení vynálezu je pro real-time PCR detekci virů LChV-1 a/nebo LChV-2 použito odlišně fluorescenčně značených hybridizačních sond specifických pro příslušný virus s následujícími reakčními podmínkami: 2 pl cDNA; 1x PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCI2; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 400 nM každá sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:
Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3) Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)
Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4)
Sonda 2: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G.
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.
Pozitivní nálezy získané pomocí PCR v tomto uspořádání byly porovnány s výsledky ze simplexových detekcí viru LChV-1 a LChV-2, které již byly sekvenačně ověřeny. Ve všech případech nálezy ze současné detekce obou virů v jedné PCR reakci souhlasily s výsledky ze simplexových reakcí.
Ve výhodném provedení vynálezu byla přítomnost virů LChV-1 a/nebo LChV-2 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy LChV-1 a LChV-2 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Koncentrace virů LChV-1 a LChV-2 u pozitivních vzorků byla stanovena podle příslušné kalibrační křivky.
Průmyslová využitelnost
Nové sady primerů a hybridizačních sond pro detekcí viru LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu metodou PCR oproti dosavadnímu stavu techniky odstraňují problém falešně negativních vzorků, kdy primery dle dosavadního stavu techniky nemusí umožňovat detekci všech známých izolátů těchto virů. Dále byly navržené primery a hybridizační sondy optimalizovány pro použití v sadě pro současnou detekci obou virů v jedné PCR reakci. Nové sady primerů a hybridizačních sond tedy zrychlují, zpřesňují a zlevňují diagnostiku onemocnění maloplodost třešní, které je způsobeno viry LChV-1 a LChV-2.
II ·· ··
Seznam použité literatury
Bajet, N.B., Unruh, T.R., Druffel, K.L. et al., Occurrence of Two Little Cherry Viruses in Sweet Cherry in Washington State. Plant Dis. (2008) 92:234-238.
Candresse, T., Marais, A., Faure, C. et al. Association of Little cherry virus 1 (LChV1) with the Shirofugen Stunt Disease and characterization of the genome of a divergent LChV1 isolate. Phytopathology (2013) 103(3):293-298.
Eastwell, K.C., Bernardy, M.G. Association of high molecular weight double-stranded RNA with little cherry disease. Canadían Journal of Plant Pathology (1996) 18(3):203-208.
Glasa, M., Benediková, D., Predajňa, L. First report of Little cherry virus1 in Slovakia. Journal of Plant Pathology (2015) 97(3):542.
Jelkmann, W., Leible, S. and Rott, M. Little cherry closteroviruses-1 and -2, their genetic variability and detection by real-time-PCR. Acta Hort. (ISHS) (2008) 781:321-330.
Katsiani, A. T., Maliogka, V. I., Amoutzias, G. D. et al. Insights into the genetic diversity and evolution of Little cherry virus 1. Plant Pathology (2015) 64(4):817-824.
Osman, F., Al Rwahnih, M., Golino, D. et al. Evaluation of the phytosanitary status of the prunus species in the national clonal germplasm repository in California: survey of viruses and viroids. Journal of Plant Pathology (2015) 94(1):249-253.
Rao, W.-L., Li, F., Zuo, R.-J. First report of Little cherry virus 2 in flowering and aweet cherry trees in China. Plant Disease (2011) 95(11):1484.
Rott, M.E., Jelkmann W. Detection and partial characterization of a second closterovirus associated with Little Cherry Disease, Little cherry virus2. Phytopathology (2001) 91(3):261-267.
Ruiz-García, A.B., Martínez, C., Santiago, R. et al. First report of Little cherry virus 1 (LChV-1) in sweet cherry in Spain. Plant Disease (2016) 100(11):2340.
Vitushkina, M., Fechtner, B., Agranovsky, A. et al. Development of an RT-PCR for the detection of little cherry virus and characterization of some isolates occurring in Europe. European Journal of Plant Pathology (1997) 103(9): 803-808.
Zong, X., Wang, W., Wei, H. et al. A multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of four viruses from sweet cherry. Scientia Horticulturae (2014) 187:118-122.
Zong, X., Wang, W., Wei, H. et al. Incidence of sweet cherry viruses in shandong province, china and a čase study on multiple infection with five viruses. Journal of Plant Pathology (2015) 97(1):61-68.

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sada primerů a sond pro PCR detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu, vyznačující se tím, že obsahuje primery a hybridizační sondy, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení:
    Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
    Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3) Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)
    Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4)
    Sonda 2: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z G nebo G a hybridizační sondy jsou označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce.
  2. 2. Sada primerů a sondy podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro PCR detekci virů LChV-1 obsahuje primery a hybridizační sondu, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení:
    Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1) Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)
    Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)
    Sonda: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4), kde Y je vybráno ze skupiny sestávající z C nebo G a hybridizační sonda je vhodně označena pro její detekci v průběhu PCR reakce.
  3. 3. Sada primerů a sondy podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro PCR detekci virů LChV-2 obsahuje primery a sondu, jejichž sekvence je alespoň z 80 % identická s nukleotidovými sekvencemi o složení:
    Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5) Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)
CZ2017162A 2017-03-22 2017-03-22 Sada pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu CZ308827B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017162A CZ308827B6 (cs) 2017-03-22 2017-03-22 Sada pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017162A CZ308827B6 (cs) 2017-03-22 2017-03-22 Sada pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2017162A3 true CZ2017162A3 (cs) 2018-10-03
CZ308827B6 CZ308827B6 (cs) 2021-06-23

Family

ID=63668688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2017162A CZ308827B6 (cs) 2017-03-22 2017-03-22 Sada pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ308827B6 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CZ308827B6 (cs) 2021-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hasiów-Jaroszewska et al. Detection of Pepino mosaic virus isolates from tomato by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
Guček et al. One-step multiplex RT-PCR for simultaneous detection of four viroids from hop (Humulus lupulus L.)
Guček et al. Optimization and validation of singleplex and multiplex rt-qpcr for detection of citrus bark cracking viroid (CBCVd), hop latent viroid (HLVd), and hop stunt viroid (HSVd) in hops (Humulus lupulus)
CN107177700A (zh) 一种检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法
JP6407292B2 (ja) シークエンシングアッセイに対するユニバーサルコントロール
CN113005224A (zh) 一种用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对及其应用
KR101771964B1 (ko) 배추 감염성 4종 바이러스 복합진단 pcr 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법
KR20240045385A (ko) 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 진단방법
JP7633643B2 (ja) サツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット及びサツマイモ病原ウイルスの検出方法
CN113637804A (zh) 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法
CN104032036A (zh) 草莓皱缩病毒的快速检测试剂盒及方法
Shaffer et al. First report of amazon lily mild mottle virus in peony in the United States
CN108754010B (zh) 一种快速检测总rna样本中基因组dna残留的方法
CN105112530A (zh) 转基因玉米bt176双重数字pcr荧光定量检测方法
CN105112538A (zh) 转基因玉米mir162双重数字pcr荧光定量检测方法
CZ2017162A3 (cs) Sady pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu
KR20200054750A (ko) 일천궁 및 토천궁의 바이러스 동시 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 일천궁 및 토천궁 바이러스의 진단방법 및 키트
KR102213231B1 (ko) 고추 감염 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
CN104263854A (zh) 南芥菜花叶病毒SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法
CZ32045U1 (cs) Sada pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu
JP2023128819A (ja) サツマイモ病原体検出用プライマーセット及びサツマイモ病原体の検出方法
KR101953125B1 (ko) 가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
CN118957157B (zh) 一种多重pcr检测四种烟粉虱传瓜类病毒的方法与试剂盒
CN105112539A (zh) 转基因玉米mon810双重数字pcr荧光定量检测方法
Lee et al. Development of in-field-diagnosis of Aspergillus flavus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Honeybee

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20250322