CZ2006538A3 - Nosice léciv na bázi modifikovaných poly(ethylenglykolu) a jejich pH-senzitivní konjugáty - Google Patents

Abstract

Nosice aminoléciv na bázi modifikovaného poly(ethylenglykolu) s molekulovou hmotností 600 až 40 000obsahují nejméne jednu koncovou spojku -X-Y-CHO, kde X je O, NH, NHCO, OCO a Y je nasycený ci nenasycený, vetvený ci nevetvený uhlíkatý retezec s poctem uhlíku 1 až 20, nebo fenylen. Použití nosice kpríprave konjugátu s pH - sensitivní iminovazbou vzniklou reakcí aminoskupiny léciva s vazebnou koncovou aldehydickou skupinou koncové spojky modifikovaného poly(ethylenglykolového) nosice, jejichž cílem pusobení je poškozená tkán charakteristická sníženou hodnotou pH oproti pH bežnému v krvi a zdravých tkáních. Konjugáty s amfotericinem B a nystatinem a zpusob jejich prípravy.

Description

Nosiče léčiv na bázi modifikovaných poly(ethylenglykolů) ajejich pH-senzitivní konjugáty.

Oblast techniky

Vynález se týká polymerních nosičů léčiv na bázi modifikovaného poly(ethylenglykolu) ajejich pH-senzitivních konjugátů s léčivy.

Dosavadní stav techniky

Využití polymerů jako nosičů léčiv je progresivní trend moderní farmaceutické chemie, který již přinesl řadu významných výsledků např. v oblasti cytostatik [CZ 294996 V. Šubr, K. Ulbrich, B. Říhová]. Vazba léčiva na hydrofilní polymer může řešit závažné nedostatky omezující terapeutické využití mnoha léčiv (např. vysoká toxicita, nevýhodný farmakokinetický profil, nežádoucí lékové interakce, problematické fyzikálně-chemické vlastnosti jako např. obtížná rozpustnost ve vodném prostředí). Polymemí nosiče léčiv musí být netoxické, neimunogenní a schopné eliminace z organismu. Vazba léčivo-polymer musí být degradabilní enzymaticky nebo hydrolyticky. Těmto požadavkům výborně vyhovují poly(ethylenglykoly). [Veronese F. M., Pasut G.: Drug Discov. Today 10, 1451, 2005; Greenwald R. B., Choe Y. H., McGuire J., Conover C. D.: Adv. Drug Delivery Rev. 55, 217, 2003; Hartus J. M., Chess R. B.: Nat. Rev. Drug. Discov. 3, 214,2003; Sedlák M.: Collect. Czech Chem. Commun. 70, 269, 2005],

Polyenové antibiotikum amfotericin Β (AMB) má výsadní postavení v léčbě těžkých, život ohrožujících systémových mykóz, na které často neexistuje jiný vhodný lék. AMB však vykazuje značnou akutní i chronickou toxicitu (zejména nefrotoxicitu) a je téměř nerozpustný ve vodě. Proto jsou využívány různé strategie, např. inkorporace AMB do lipidových formulací nebo speciální lékové formy AMB, které snižují rizika léčby amfotericinem B [Gangneux J. P., Sulahian A., Garin Y. J. F., Derouin F.: Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 90, 574, 1996; Yardley V., Croft S.: Antimicrob. Agents Chemother. 41, 752,1997; Vandermeulen G., Rouxhet L., Arien A., Brewster Μ. E., Preat V.: Int. J. Pharm. 309, 234, 2006. Arthur R. R., Drew R. H., Perfect J. R.: Exp. Opin. Investig. Drugs 13, 903, 2004] Nedávno byla zavedena do praxe i liposomální intravenózní forma dalšího polyenového antibiotika nystatinu (Nys), který byl dosud kvůli vysoké toxicitě používán pouze v lokální aplikaci [Moribe K., Maruyama K.: Curr. Pharm. Design 6, 441,2002 ;Offner F. et al.·. Antimicrob. Agents Chemother., 48, 4808, 2004], Ve všech uvedených t « · ·<«<<<<«<» ‘ « · » · · « t *!«<·<« ««« ··* případech se však jedná o využití pouze fyzikálně-chemických procesů, ne o kovalentní konjugáty.

Nedávno jsme syntetizovali konjugát AMB, ve kterém je 50 mol% AMB vázáno kovalentně karbamátovou vazbou na methoxypoly(ethylenglykol) (mPEG) a zbylých 50 mol% je vázáno nekovalentně [Sedlák M., Buchta V., Kubicová L., Šimůnek P., Holčapek

M., Kašparová P.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 2833, 2001], Konjugát vykazoval in vitro podobné spektrum antimykotické účinnosti jako liposomální a deoxycholátové formy AMB [Sedlák M., Buchta V., Kubicová L., Šimůnek P., Holčapek M., Kašparová P.: Bioorg. Med.

Chem. Lett., 11, 2833, 2001], ale až desetkrát výhodnější poměr antifungální aktivity a akutní toxicity (LD₅₀) na myši ve srovnání s klasickou klinicky používanou deoxycholátovou formou AMB.

Později skupina R. B. Greenwalda [Conover C. D., Zhao H., Longley C. B., Shum K.

L., Greenwald R. B.: Bioconjugate Chem. 14, 661, 2003] připravila konjugáty AMB s poly(ethylenglykolem), kde je AMB na PEG vázán přes spojku prostřednictvím labilní karbamátové vazby. Prvním, rychlost určujícím krokem rozpadu konjugátu je enzymatická reakce, kdy působením krevních hydroláz dochází ke štěpení esterové vazby mezi spojkou a PEGem. Primárně vzniklé proléčivo (spojka-AMB) následně podléhá 1,6-benzylové eliminaci za vzniku chinonmethidu a AMB-karbamátu. Chinonmethid se potom rychle hydratuje a AMB-karbamát se rozpadá na oxid uhličitý a volný AMB [ Conover C. D., Zhao H., Longley C. B., Shum K. L., Greenwald R. B.: Bioconjugate Chem. 14, 661, 2003]. Greenwaldem použitý systém uvolňování účinné látky se sice jeví jako obzvláště vhodný pro cílenou distribuci cytostatik, a to konkrétně v delivery systémech, kdy je na nosiči ještě navázána monoklonální protilátka mající afinitu vůči specifickému glykoproteinovému povrchu nádorově transformovaných buněk [Říhová B., Ulbrich K. et al.·. Adv. Exp. Med.

Biol., 125, 2003], ale nelze jej aplikovat obecně na libovolné skupiny léčiv. Např. v případě konjugátů s AMB vede Greenwaldem použitý systém 1,6-benzylové eliminace k poměrně rychlému odštěpení volného AMB přímo do krevního oběhu a tím k rychlému vzestupu jeho koncentrace v krvi a ledvinách, což je naopak nežádoucí zejména z hlediska toxicity. AMB uvolněný z konjugátu navíc podléhá následné distribuci mezi přítomné lipoproteiny (highdensity-lipoprotein (HDL), low-density-lipoprotein (LDL)), což může místo žádoucího potlačení nefrotoxicity naopak vést k jejímu vzestupu [Wasan K. M., Wong J. C., Corr T., Pritchard S.: Cancer Chemother. Pharmacol. 57,120,2006].

< I * « «

i I » « c * lil * « «

Podstata vynálezu

Uvedné nevýhody odstraňují nosiče aminoléčiv na bázi modifikovaných poly(ethylenglykolů) s molekulovou hmotností 600 až 40 000, které obsahují nejméně jednu koncovou skupinu -X-Y-CHO), kde X je O, NH, NHCO, OCO a Y je nasycený či nenasycený, větvený či nevětvený uhlíkatý řetězec s počtem uhlíků 1 až 20, nebo feny len.

Vhodnými aminoléčivy jsou pentamidin, stilbamidin, trimethoprim, pyrimethamin, sulfonamidy s volnou aminoskupinou v molekule, ampicilin, amoxycilin, cefaloglycin, cefalexin, cefadroxil, bacitracin, polymyxiny, aminoglykosidy, polyenová antibiotika, doxorubicin, daunorubicin, paraaminosalicylová kyselina, amfotericin B a nystatin.

Nosiče jsou použitelné k přípravě konjugátů s pH - sensitivní iminovazbou vzniklou reakcí aminoskupiny léčiva s vazebnou koncovou aldehydickou skupinou koncové spojky modifikovaného poly(ethylenglykolového) nosiče.

Jejich cílem působení je poškozená tkáň charakteristická sníženou hodnotou pH oproti pH běžnému v krvi a zdravých tkáních, tedy zejména tkáň postižená zánětem jakéhokoliv původu.

Způsob přípravy konjugátů spočívá v tom, že se na nosiče s vazebnou koncovou aldehydickou skupinou působí léčivem s primární aminoskupinou za vzniku pH senzitivní iminovazby v přítomnosti dehydratačního činidla vybraného ze skupiny tvořené například aktivovaným molekulovým sítem, silikagelem nebo oxidem hlinitým, a orthoesterů například trimethylorthoformiátu nebo triethylorthoformiátu a rozpouštědla vybraného například ze skupiny tvořené dichlormethanem, chloroformem, tetrahydrofuranem, dioxanem, dimethylformamidem, dimethylsulfoxidem, alkoholy s počtem atomů 1 až 8.

Předmětem vynálezu jsou dále konjugáty amfotericinu B a nystatinu s vpředu uvedenými nosiči, vyjmenované v tabulce 1 a tabulce 2.

t t 4 t » < 4 t í < « ‘ * * 4 1

4 4 4 « · * < « · « < * 4 <

«*«<<<« | « ( l « » « « » i * «44 « « 4 • I t

Tabulka 1

Označení	Molekulová hmotnost nosiče	Vzorec
la	5000 Λ	H3C'0^/0Ý^0]^-°O^N-AMB
lb	'/ 5Ó00 Λ	n _ am b ' n 11 0
lc	ótíoo Λ	ΑΜΒ-Ν^Ο'θΌ^0νθ)Τ-0'ρ;^Ν AMB
ld	ιφοο
le	2$)00 Á
lf	3^)00
ig	7 5fc)00 Λ	H3C'Q-^\^°'^^Qp^N ojCTn-amb ' n 11 0
li	6Ϊ300 n	θ H N-AMB AMBAJÍJ ϋ 0) v π O
U	íqooo
lk	20fc)00 h
11	35Í00 Λ

• · « • · « « « « • < · · · < « c « «««··« « c < « « « <

• < I • t <

( < «

Tabulka 2.

Označení	Molekulová hmotnost nosiče	Vzorec
2a	íSoo Λ	^O^Kot^O^N-Nys
2b	3000 í\	H3C.o^O<^o)^O.cXr^N-Nys 7 η κ 0
2c	6000 A	Nys-N.j7%--0^XC-0C^N~NyS O
2d	ícfooo
2e	20000 n
2f	35000
2g	5000	H3C-o^O^o^N ,cXj N-Nys ΖΠ π O
2i	6000
2j	10000 'Λ
2k	2(j000
21	35$00

Polymerní nosiče na bázi modifikovaného póly (ethylenglykolu) podle vynálezu, jsou vhodné pro navázání léčiv obsahujících aminoskupinu schopnou tvořit iminovazbu. K zavedení koncové spojky s koncovými aldehydickými skupinami schopnými tvořit pHsenzitivní konjugáty s léčivy lze využít a-methoxypoly(ethylenglykoly) (mPEG), poly(ethylenglykoly) (PEG), a-methoxy-úi-aminopoly(ethylenglykoly) (mPEG-NH₂) nebo a,úi-diaminopoly(ethylenglykoly) (PEG-NH₂) o molekulové hmotnosti Mr = 600 až 40 000.

Z výchozích polymerů se modifikací koncových skupin připraví modifikované poly(ethylenglykoly) s nejméně jedním vazebným místem pro léčivo, tvořeným aldehydickou funkční skupinou.

O'n xXj.

Y O

^In Y O kde X a Y mají vpředu uvedený význam

Reakcí aminoskupiny léčiva s aldehydickou funkční skupinou modifikovaných poly(ethylenglykolů) se připraví konjugáty léčiv s modifikovanými poly(ethylenglykoly), obsahující pH-senzitivni iminovazbu, u nichž dojde k rozštěpení této vazby a uvolnění účinné látky specificky v místě snížené hodnoty pH, jaká se vyskytuje například v místě zánětu nebo napadení mikroorganismy.

h₃c_o^o^₀^_Oi[^_n__lc H₃C _ox ^O (/'. _of -.xO._CXX ^N ~^LC 'η π o

N JO^N-LC ^lc-ⁿXL

N-LC ^N_LC o

” H ΛΛ

LCN^Cr^C'N^°'t^0C-^N'C·

N-LC * ( » i i ( « » »

LC = aminoléčivo (například amfotericin B, nystatin) navázané prostřednictvím iminovazby na původní aldehydickou skupinu koncové spojky modifikovaného polyethylenglykolového nosiče.

Tato pH-senzitivní imino vazba mezi léčivem a nosičem je stabilní při pH obvyklém v krvi a tkáních (pH 7,4-7,6), tedy např. v krevní plazmě, a podléhá štěpení při snížené hodnotě pH, která se vyskytuje v organismu např. v místech zasažených infekcí nebo zánětem různého původu, kde probíhají biochemické procesy projevující se lokálním snížením pH až na hodnotu 5,5, zatímco normální pH mezibuněčného prostředí a krve se pohybuje kolem hodnoty 7,4-7,6 [Katzung B.: Basic & Clinical Pharmacology, 8th Edition, Appleton & Lange, Norwalk, CN, 2001; Straubinger R. M.: Methods in Enzymology, 221, 361,1993], Tento princip spojení léčiva s polymerem umožní uvolnění léčiva zkonjugátu cíleně až v místě jeho účinku, kterým je poškozená tkáň charakteristická sníženou hodnotou pH oproti pH běžnému v krvi a zdravých tkáních.

Způsob přípravy modifikovaných polyethylen glykolů) spočívá v tom, že na výchozí polymer se pomocí skupiny X naváže skupina Y s reaktivní aldehydickou funkční skupinu. Je-li spojovací skupinou X etherová vazba -O- (Schéma 1), syntéza vychází z PEGu nebo mPEGu, na který se nejprve zavede vhodná odstupující skupina jako například tosylát, « « I « ί « ί · *

* * « * » 4 * · « · « < a ’«·«·» · « a « g ··«««·· « « · mesylát, bromid nebo chlorid. Aldehydická skupina navázaná na skupinu Y je ochráněna vhodným způsobem, např. jako acetal. Spojení se provede nukleofilní substitucí v přítomnosti bazického katalyzátoru, kterým může být například uhličitan draselný. Odchránění aldehydické funkční skupiny se provede kyselou hydrolýzou, například pomocí kyseliny chlorovodíkové, fosforečné nebo trifluoroctové. Po extrakci organickým rozpouštědlem, například dichlormethanem se surový produkt přečistí krystalizaci z vhodného rozpouštědla, např. propan-2-olu.

HO-Y-HQ j cH

D K₂CO₃ ²) ^H3^C'Q''^/OÝ/^x'Q-j^^OSO₂CH₃

P

-Y-HC_X hci/h₂o

H

, kde X je -O- a Y má vpředu uvedený význam.

Schéma 1

Jestliže skupinou X je esterová nebo amidová vazba, modifikovaný poly(ethylenglykol) se připraví reakcí PEG, mPEG, PEG-NH₂ nebo mPEG-NH₂ s příslušnou formylkyselinou, která se aktivuje vhodným činidlem ze skupiny karbodiimidů, např. dicyklohexylkarbodiimidem (DCC), diisopropylkarbodimidem (DIC).

t · « «

, kde Y má vpředu uvedený význam.

Schéma 2

Stejným postupem se připraví nosič, kde X = NHCO a Y má vpředu uvedený význam.

Konjugáty se připraví reakcí koncové vazebné aldehydické funkční skupiny modifikovaných poly(ethylenglykolů) s primární aminoskupinou léčiva za vzniku iminovazby. Reakce se s výhodou provádí v přítomnosti aktivovaného molekulového síta a trimethylorthoformiátu nebo triethylortoformiátu a rozpouštědla, například dichlormethanem, chloroformem, tetrahydrofuranem, dioxanem, dimethylformamidem, dimethylsulfoxidem, nebo alkoholem s počtem atomů uhlíku 1 až 8.

Řízené uvolňování léčiva z konjugátů in vitro změnou pH je demonstrováno v této přihlášce na konjugátech amfotericinu B a nystatinu (viz příklady 10 a 11), určených k systémovému podání, u kterých jsme stanovili, že v roztocích fosfátového pufru (pH = 5,5, 37 °C) dochází ke štěpení iminovazby za vzniku volného AMB s poločasy 2 až 5 min, a to v závislosti na použité koncové spojce XYCHO v molekule poly(ethylenglykolového) nosiče. Ve fosfátovém pufru při hodnotě pH = 7_;4 (37 °C) byly všechny hodnocené konjugáty stabilní. Konjugáty mající esterovou vazbu (X=COO) v lidské krevní plazmě resp.v krevním séru (pH = 7,4, 37 °C) podléhají enzymatickému štěpení, a to s poločasy 2 až 6 h, v závislosti na molekulových hmotnostech použitého poly(ethylenglykolu) (poločasy rostou se stoupající molekulovou hmotností). Při štěpení esterové vazby nejprve vzniká relativně stabilní (při pH = 7,4 a 37 °C) proléčivo tj. 4-karboxybenzylideniminoamfotericin B, který se rozpadá na AMB a 4-formylbenzoovou kyselinu cíleně až při snížených hodnotách pH (fosfátový pufr o pH = 5,5, 37 °C) (Schéma 3), jak je doloženo v příkladech číslo 10 a 11.

' « < < t · « « · « t · « · • * · « • » <

• « * « « • · t • « « ( • » <

• i « liti

Schéma 3.

Na rozdíl od dřívějších kovalentně-nekovalentních konjugátů [Sedlák M., Buchta V., Kubicová L., Šimůnek P., Holčapek M., Kašparová P.: Bioorg. Med. Chem. Lett., 11, 2833, 2001.] majících relativně stabilní karbamátové vazby či konjugátů založených na 1,6benzylové eliminaci, kdy dochází k uvolnění volného AMB již v krevním řečišti [Conover C. D., Zhao H., Longley C. B., Shum K. L., Greenwald R. B.: Bioconjugate Chem. 14, 661, 2003] dochází tedy u konjugátů podle tohoto vynálezu k postupnému, selektivnímu uvolnění léčiva kysele katalyzovanou hydrolýzou iminovazby, a to bud^v přímo z polymerního konjugátu nebo z uvolněného proléčiva.

Nosiče a jejich konjugáty s léčivy podle vynálezu, založené na principu pHsenzitivních konjugátů modifikovaného poly(ethylenglykolu) s léčivy, vázanými prostřednictvím pH-senzitivní iminovazby, vzniklé reakcí mezi aldehydickými skupinami koncové spojky modifikovaného poly(ethylenglykolu) s aminoskupinou přítomnou v léčivu, překonávají nevýhody předchozích vyjmenovaných metod v případě polyenových antibiotik. Jsou však obecně použitelné pro cílenou distribuci všech léčiv, která obsahují aminoskupinu, schopnou tvořit iminovazbu, a cílem jejich působení je poškozená tkáň vyznačující se sníženou hodnotou pH oproti pH běžnému v krvi a zdravých tkáních, tedy zejména tkáň postižená zánětem jakéhokoliv původu (infekce, nádor, následek mechanického poškození aj.). Jedná se zejména o antiinfekční a antiinvazní léčiva, léčiva ovlivňující imunitní odpověď, protinádorová léčiva a protizánětlivé látky. Příklady takových léčiv jsou: pentamidin, stilbamidin, trimethoprim, pyrimethamin, sulfonamidy s volnou aminoskupinou v molekule, ampicilin, amoxycilin, cefaloglycin, cefalexin, cefadroxil, bacitracin, polymyxiny, aminoglykosidy (například streptomycin), polyenová antibiotika (například li)» t I t · < t ' f t « · < * < < • « * « t « · « » <

• « · • l t « • « <

« < <

« · i » ) » « * « « Ϊ * « » < « • » « » 4 t amfotericin B, nystatin, natamycin), doxorubicin, daunorubicin, paraaminosalicylová kyselina.

Následující příklady ilustrují tento vynález takovým způsobem, jakým ho lze prakticky provádět. Rozsah tohoto vynálezu však není omezen pouze na uvedené příklady.

Příklad 1

Syntéza a-methoxy-ct>-(4-formylfenyloxy)poly(ethylenglykolu) (M_R = 5Í000)

Tavenina 5g (lmmol) a-methoxy-o-methansufonylpoly(ethylenglykolu) (M = 5000), 2,5g (15mmol) 4-(l,3-dioxolan-2-yl)f^en°l^{u a} 2 g (15mmol) uhličitanu draselného byla za míchání zahřívána pod argonovou atmosférou na teplotu 65 °C po dobu 48 h. Po ochlazení byla reakční směs rozpuštěna ve 200 ml dichlormethanu, zfiltrována s křemelinou a na vodní lázni odpařena k suchu. Odparek byl rozpuštěn ve 150 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové a refluxován 4 hodiny. Po ochlazení byl roztok nasycen chloridem sodným a extrahován 5krát 60 ml dichlormethanu. Spojené extrakty byly odpařeny a dvakrát krystalovány z propan-2-olu. Bylo získáno 3,4 g produktu (68 %). ^!H NMR (CDCb, ppm) δ: 3,36 (s; 3H, CH3-O);

3,52 - 4,27 ( m; 460 H, (CH₂-CH₂-O)₁₁₅); 7,17 (d; J Ί,Ί Hz, 2H-arom); 7,97 (d; J Ί,Ί Hz, 2H-arom); 9,94 (s; 1H, CH=O). IR (KBr) v: 3439,2945, 2887, 2741, 1701, 1467, 1360, 1343, 1280,1201, 1149, 1110, 1061, 963, 843, 531 cm’¹.

Příklad 2

Syntéza a,ro-bis(4-formylfenylkarboxamino)poly(ethylenglykolu) (Mr = 6000) y ^Λ

6g (lmmol) a,ro-diaminopoly(ethylenglykol)u (M = é^OOO), l,2g (8 mmol) 4-formylbenzoové kyseliny a 0,lg (0.8 mmol) 4-dimethylaminopyridinu byly rozpuštěny v 50 ml suchého dichlormethanu . Vzniklý roztok byl ochlazen na 0 °C. Během 10 minut byl do reakční směsi přikapán vychlazený roztok lg (8 mmol) diisopropylkarbodiimidu v 10 ml dichlomethanu. Reakční směs byla míchána ještě 4 h při 0 °C a následně byla vyhřátá na teplotu místnosti. Po 24 h byla odfiltrována diisopropylmočovina, filtrát byl odpařen a krystalován z propan-2-olu. Bylo získáno 4,3 g produktu (86 %) ^!H NMR (CDCI3, ppm) δ: 3,36 (s; 3H, CH₃-O);

3,52 - 4,27 ( m; 460 H, (CH₂-CH₂-O)₁₁₅); 4,51; 6,48 (m; H, NH-CO); 7,96 (d; J7,8 Hz, 2H-arom); 8,22 (d; J 7,8 Hz, 2H-arom); 10,11 (s; 1H, CH=O). IR (KBr) v: 3439, 3225, 2945, 2887, 2741, 1701, 1693, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061, 963, 843, 531 cm^-1.

< t » » t t ι » • t » » í « < » t t • < · f I * * I « • ·* « » i « < t

Příklad 3

V

Syntéza a,o-bis(4-formylfenylkarbonyloxy)poly(ethyleneglykolu) (Mr = 1 OjOOO) lOg (1 mmol) poly(ethylenglykolu) (M = 10000), l,2g (8 mmol) 4-formylbenzoová kyseliny •'X a 0,lg (0.8 mmol) 4-dimethylaminopyridinu byly rozpuštěny v 50 ml suchého dichlormethanu a vzniklý roztok byl ochlazen na 0 °C. Během 10 minut byl do reakční směsi přikapán vychlazený roztok lg (8 mmol) diisopropylkarbodiimidu v 10 ml dichlomethanu. Reakční směs byla míchána ještě 4 h při 0 °C a následně byla pozvolna vyhřátá na teplotu místnosti. Po 24 h byla odfiltrována diisopropylmočovina, filtrát byl odpařen a krystalován z propan-2-olu. Bylo získáno 8,2 g produktu (80 %) *H NMR (CDC1₃, ppm) 3,52 - 4,27 ( m; 908 H, (CH₂-CH₂-O)₂27); 4,50 (m; 2H, CH₂-O-CO); 7,96 (d; J7,8 Hz, 2H-arom); 8,22 (d; J 7,8 Hz, 2H-arom); 10,11 (s; 1H, CHO). IR (KBr) v: 3439, 3225, 2945, 2887, 2741, 1701, 1693, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061, 963, 843, 531 cm’¹.

Příklad 4 ý

Syntéza a-methoxypoly(ethylenglykol yl)-4-oxobutanoátu (Mr = 5000)

A

5g (1 mmol) poly(ethylenglykolu) (Μ = 5Ό00), 0,4 g (4 mmol) 4-oxobutanové kyseliny a 0,5g (0.4 mmol) 4-dimethylaminopyridinu byly rozpuštěny v 25 ml suchého dichlormethanu a vzniklý roztok byl ochlazen na 0 °C. Během 10 minut byl do reakční směsi přikapán vychlazený roztok 0,5g (4 mmol) diisopropylkarbodiimidu v 50 ml dichlomethanu. Reakční směs byla míchána ještě 4 h při 0 °C a následně byla pozvolna ohřátá na teplotu místnosti. Po 24 h byla odfiltrována diisopropylmočovina, filtrát byl odpařen a krystalován z propan-2olu. Byly získány 4 g produktu (80 %) ^lH NMR (CDC1₃, ppm) δ: 3,36 (s; 3H, CH₃-O); 3,52 - 4,27 ( m; 460 H, (CH₂-CH₂-O)_n5); 2,79 (m; 4 H, OOC-CH₂-CH₂-CO); 9,72 (s; 1H, CH=O). IR (KBr) v: 3439,2945, 2887, 2741, 1701, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061,963, 843, 531 cm¹.

Příklad 5

Syntéza konjugátu (la)

0,1 mmol a-methoxy-co-(4-formylfenyloxy)poly(ethylenglykol)u (Mr = 5 000) byl rozpuštěn v 5 ml trimethylorthoformiátu, k vzniklému roztoku bylo přidáno ekvivalentní množství (0,1 mmol) amfotericinu B ve formě roztoku v dimethylformamidu s přídavkem 0,2 g aktivovaného molekulového síta 4A. Reakční směs byla míchána několik dnů při teplotě

111» « < < « » ( * « « < «

*.. * místnosti v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs zfíltrována a z filtrátu byl při 25 °C vakuově oddestilován trimethylorthoformiát. Destilační zbytek byl nalit do 250 ml suchého diethyletheru a vyloučený produkt byl odfiltrován. Připravené konjugáty byly rozpuštěny dichlormethanu a přesráženy diethyletherem. Bylo získáno 450 mg produktu (74 %). IR (KBr ) v: 3428, 2945, 2885, 2741, 2695, 1719, 1637, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061,963, 843 cm’¹.

Příklad 6

Syntéza konjugátu (ld)

0,1 mmol a,ro-bis(4-formylfenylkarbonyloxy)poly(ethylenglykolu) (Mr = 10 000) byl rozpuštěn v 10 ml trimethylorthoformiátu, k vzniklému roztoku bylo přidáno ekvivalentní množství (0.2 mmol) amfotericinu B ve formě roztoku v dimethylformamidu s přídavkem 0,2 g aktivovaného molekulového síta 4A. Reakční směs byla míchána několik dnů při teplotě místnosti v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs zfíltrována a z filtrátu byl při 25 °C vakuově oddestilován trimethylorthoformiát. Destilační zbytek byl nalit do 250 ml suchého diethyletheru a vyloučený produkt byl odfiltrován. Připravené konjugáty byly rozpuštěny dichlormethanu a přesráženy diethyletherem. Bylo získáno 980 mg produktu (83%). IR (KBr) v: 3439, 2945, 2887, 2741, 1735, 1719, 1693, 1638, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201,1149,1110, 1061, 963, 843, 531 cm^-1.

Příklad 7

Syntéza konjugátu (lg)

0,1 mmol a-methoxy-ío-(4-formylfenylkarboxamino)poly(ethylenglykolu) (Mr = 5 000) byl rozpuštěn v 5 ml trimethylorthoformiátu, k vzniklému roztoku bylo přidáno ekvivalentní množství (0.1 mmol) amfotericinu B ve formě roztoku v dimethylformamidu s přídavkem 0,2 g aktivovaného molekulového síta 4A. Reakční směs byla míchána několik dnů při teplotě místnoti v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs zfíltrována a z filtrátu byl při 25 °C vakuově oddestilován trimethylorthoformiát. Destilační zbytek byl nalit do 250 ml suchého diethyletheru a vyloučený produkt byl odfiltrován. Připravené konjugáty byly rozpuštěny dichlormethanu a přesráženy diethyletherem. Bylo získáno 320 mg produktu (54%). IR

(KBr) v: 3439, 3225, 2945, 2887, 2741, 1719, 1693, 1638,1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061,963, 843, 531 cm’¹

Příklad 8

Syntéza konjugátu (2e)

0,1 mmol a,o-bis(4-formylfenylkarboxamino)poly(ethylenglykolu) (M_R = 35 000) byl rozpuštěn v 15 ml trimethylorthoformiátu, k vzniklému roztoku bylo přidáno ekvivalentní množství (0.2 mmol) nystatinu ve formě roztoku v dimethylformamidu s přídavkem 0,2 g aktivovaného molekulového síta 4A. Reakční směs byla míchána několik dnů při teplotě místnosti v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs zfiltrována a z filtrátu byl při 25 °C vakuově oddestilován trimethylorthoformiát. Destilační zbytek byl nalit do 250 ml suchého diethyletheru a vyloučený produkt byl odfiltrován. Připravené konjugáty byly rozpuštěny dichlormethanu a přesráženy diethyletherem. Bylo získáno 840 mg produktu (70%). IR (KBr) v: 3439, 2945, 2887, 2741, 1735, 1719, 1693, 1638, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061,963,843,531 cm’¹.

Příklad 9

Syntéza konjugátu (21)

0,1 mmol a,ro-bis(4-formylfenylkarbonyloxy)poly(ethylenglykolu) (M_R = 10 000) byl rozpuštěn v 10 ml trimethylorthoformiátu, k vzniklému roztoku bylo přidáno ekvivalentní množství (0,2 mmol) nystatinu ve formě roztoku v dimethylformamidu s přídavkem ,2 g aktivovaného molekulového síta 4A. Reakční směs byla míchána několik dnů při teplotě místnosti v argonové atmosféře s vyloučením světelného záření. Ukončení reakce bylo monitorováno pomocí GPC. Závěrem byla reakční směs zfiltrována a z filtrátu byl při 25 °C vakuově oddestilován trimethylorthoformiát. Destilační zbytek byl nalit do 250 ml suchého diethyletheru a vyloučený produkt byl odfiltrován. Připravené konjugáty byly rozpuštěny dichlormethanu a přesráženy diethyletherem. Bylo získáno 2,78 g produktu (75%). IR (KBr) v: 3439, 2945, 2887, 2741, 1735, 1719, 1693, 1638, 1467, 1360, 1343, 1280, 1201, 1149, 1110, 1061,963, 843, 531 cm’¹.

Příklad 10

Spektrofotometrická detekce - Stabilita konjugátu (lb) ve fosfátovém pufru o pH 5,5 γ

Stabilita konjugátu amfotericinu B v 0,07M fosfátovém pufru o pH 5,5 při teplotě 37rC byla ověřována pomocí spektrometrie s UV/VIS detekcí (spektrofotometr Hewlett-Packard model 8453 diodě array). Do 1 cm křemenné kyvety bylo předloženo 2 ml 0,07M fosfátového pufru o pH 5,5. Kyveta byla vložena do temperovaného bloku přístroje a po ustálení teploty (37i°C;

A min) bylo do kyvety nastříknuto 20 μΐ vodného roztoku konjugátu lb (5 x 10^_3M). Na spektrálním přístroji byly sledovány časové změny UV/VIS spekter. Pomocí těchto změn byla vyhodnocena rychlost hydrolýzy iminové vazby konjugátu lb. Ze spektrálních záznamů je patrné, že při hydrolýze dochází k poklesu absorbance při 346 nm, což odpovídá úbytku konjugátu a vzrůstu absorbance při 367 nm, 386 nm a 409 nm což je charakteristické pro vznik volného AMB. Z této časové závislosti spektrálních změn při uvedených vlnových délkách byl vypočten pomocí optimalizačního programu poločas vzniku volného AMB (ř_1/2= (120 ± 9) s). Pokud byl testován a-methoxy-co-(4-formylfenyloxykarbonyl)poly•(ethylenglykol) (5000) bez navázaného amfotericinu B, nedocházelo za stejných podmínek k žádné spektrální změně. Samotný AMB je za těchto podmínek také stabilní po dobu několika hodin.

Příklad 11

Spektrofotometrická detekce - Stabilita konjugátu (lb) ve fosfátovém pufru o pH 7,4 Stabilita konjugátu amfotericinu B v 0,07M fosfátovém pufru o pH 7,4 při teplotě 3t[⁰C byla r-A ověřována pomocí spektrometrie s UV/VIS detekcí stejným způsobem jako v příkladě 10. V tomto případě však nedocházelo během 24 h k žádným spektrálním změnám.

Příklad 12

Studie hydrolýzy esterové vazby konjugátu lb vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií

Stabilita konjugátu (lb) v lidské krevní plazmě a v lidském krevním séru byla sledována po dobu 24 hodin (Obr. 1). Do mikrozkumavky bylo napipetováno 500 μΐ vzorku (plazmy, séra), 500 μΐ konjugátu lb, výsledná koncentrace konjugátu byla 1 x 10 'M B 50 mg/ml. Směs byla inkubována při 37 °C. Postupně byly odebírány vzorky v čase 0 hod (okamžitě), 1, 2 hod až 10 hod a po 24 hod. Vzorky byly stabilizovány 100 μΐ 4% ZnSO4.7H2O. Směs byla 1 min třepána a poté stáčena 3 min při 14000 rpm. Supernatant (20 μΐ) byl dávkován na kolonu HPLC. Pro separaci byla použita kolona LiChroCART® 125 x 4 mm s náplní LiChrospher® 100 RP-18e 5 pm (MERCK, Darmstadt) a mobilní fáze acetonitril, 20 mM « t « ·

I « chelaton ΠΙ. Výsledky kinetických měření v krevní plazmě a v krevním séru byly v rámci experimentálních chyb navzájem srovnatelné. Stanovení koncentrací konjugátů v krevní plazmě však bylo zatíženo větší chybou a horší reprodukovatelností. Z kinetické závislosti (Obr. 1) bylo vypočteno, že ke štěpení esterové vazby konjugátu lb dochází s poločasem 2 hodiny, což je srovnatelné s literaturou[Conover C. D., Zhao H., Longley C. B., Shum K. L., Greenwald R. B.: Bioconjugate Chem. 14, 661, 2003], kdy bylo v potkaním séru pozorováno štěpení esterových vazeb v poly(ethylenglykolu) s poločasy 1 až 3 h.

Průmyslová využitelnost

Nosiče podle tohoto vynálezu lze využít ve farmaceutickém průmyslu k přípravě konjugátů s léčivy obsahujícími volnou aminoskupinu, sloužících k cílenému transportu léčiv na místo účinku, jímž je místo se sníženým pH, zejména tkáň postižená zánětem jakéhokoliv původu (infekce, nádor, následek mechanického poškození aj.). Z konjugátů podle tohoto vynálezu je léčivo uvolňováno až v místě se sníženým pH, jak je demonstrováno na příkladu konjugátů s amfotericinem B.

Claims (8)

1. Patentové nároky

   1. Nosiče aminoléčiv jsou modifikované poly(ethylenglykoly) s molekulovou hmotností 600 i

   až 40 000, které obsahují nejméně jednu koncovou skupinu -X-Y-CHO), kde X je O, NH,

   NHCO, OCO a Y je nasycený či nenasycený, větvený či nevětvený uhlíkatý řetězec s počtem uhlíků 1 až 20, nebo fenylen.
2. 2. Použití nosičů podle nároku 1 k přípravě konjugátů spH - sensitivní iminovazbou vzniklou reakcí aminoskupiny léčiva s vazebnou koncovou aldehydickou skupinou koncové spojky modifikovaného poly(ethylenglykolového) nosiče.
3. 3. Použití podle nároku 2 pro léčiva, jejichž cílem působení je poškozená tkáň charakteristická sníženou hodnotou pH oproti pH běžnému v krvi a zdravých tkáních, tedy zejména tkáň postižená zánětem jakéhokoliv původu.
4. 4. Konjugáty amfotericinu B s nosiči podle nároku 1, vyjmenované v tabulce 1; Tabulka 1

   Označení Molekulová hmotnost nosiče Vzorec la $)00 A lb 5000 A H₃C._o^.^O₍^_op^O._cXX^í:>N-AMB ' n ii 0 lc óboo •-K ^x 0 ld 1ÓÓ00 n le 20000 u lf 35Í5OO A lg 5000 A H₃C-_o^O^_oj^N „ΧΧ 'ν-ΑΜΒ II 0 li 6000

   « I t « t I t » « · ( · «II» * * « * « ( « t • ( ( * • 1 1 « i ♦

   10000 ΑΜθ'Όύ ΰ °^r ? \ Π Q lk 20^)00 11 3S000
5. 5. Konjugáty nystatinu s nosiči podle nároku 1, vyjmenované v tabulce 2; Tabulka 2.

   Označení Molekulová hmotnost nosiče Vzorec 2a 5000 A / H₃C_O^O^_o^O^_N__Nys 2b jooo *0 _ H₃c._o^o^_o^o-_CJO^^N-^Ny^s 0 2c 6000 / Nys-N^'°^°^°^°'c^X)^^{N NyS} 0 2d 10000 -s 2e 2Óf)00 A 2f 35000 £ 2g 5000 —2. H₃C N N -Nys ' η h 0 2i φοο Nys-N^a^C'N^^oV-o^^N-9^^N-^Nys 2j ltíĎOO ZN 2k 20^00 „K 21 35000
6. 6. Způsob přípravy konjugátů podle nároku 4 a 5 vyznačující se tím, že se na nosiče s koncovou aldehydickou skupinou podle nároku 1 působí léčivem s primární aminoskupinou za vzniku pH senzitivní iminovazby v přítomnosti dehydratačního činidla, « « • · « I

   4 « • t < « « C · I « < « • « « » « <

   « · orthoesterů a rozpouštědla vybraného ze skupiny tvořené dichlormethanem, chloroformem, tetrahydrofuranem, dioxanem, dimethylformamidem, dimethylsulfoxidem, alkoholy s počtem atomů 1 až 8.
7. 7. Způsob přípravy konjugátů podle nároku 6 vyznačující se tím, že dehydratační činidlo se vybírá ze skupiny tvořené aktivovaným molekulovým sítem, silikagelem nebo oxidem hlinitým.
8. 8. Způsob přípravy konjugátů podle nároku 6 a 7 vyznačující se tím, že orthoestery se vybírají ze skupiny tvořené trimethylorthoformiátem a triethylorthoformiátem.