CZ2004162A3 - Nové inhibitory HIV proteasy - Google Patents

Description

Vynález se týká nových inhibitorů HIV proteasy a jejich využití, a to jak in vitro tak in vivo.

Dosavadní stav techniky

Virus lidské imunodeficience (HIV) byl identifikován jako etiologické agens AIDS nezávisle v Paříži a Washingtonu (Barre Sinoussi, F., Chermann, J., Rey, J., Nugerye, R., Chamaret, M., Gruest, S., Danget, J., Axler-Blin, C., Rouzioux, F., Rosenbaum, C., Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871; Popovic, M., Sarngadharan, M.G., Read, E., Gallo, R.C. (1984) Science 224, 497-500). Úsilí posledních 18 let vyvinout účinná virostatika proti AIDS vedlo k objevení řady léků, které výrazně napomohly v léčení této nemoci. Přesto se stále nedaří dostat nemoc pod kontrolu a zastavit její šíření. AIDS tak zůstává vážným celosvětovým problémem. Zvláště v rozvojových zemích a zejména v centrální Africe dosahuje epidemie katastrofických rozměrů ohrožujících samu podstatu existence národů a společnosti.

Virus lidské imunodeficience (HIV) patří do rodu Lentivirus z čeledi Retroviridae. Do této čeledi patří viry, které obsahují diploidní RNA genom a replikují se pomocí reversní transkriptasy. Retroviry se dále dělí do tří rodů: onkoviry, lentiviry á spumaviry (Gelderblom, H.R., Marx, P.A., ózel, M., Gheysen, D., Munn, R.J., Joy, K.I., Pauli, G. (1991) AIDS 5, 159-180). Rod Lentivirus zahrnuje viry, které způsobují pomalá chronická onemocnění. Nejvýznamnějšími zástupci jsou HIV-1, HIV-2 (dále uváděné pod shrnující zkratkou HIV) a opičí lentivirus SIV.

Zralý virion HIV je sférická částice o průměru přibližně 100 až 110 nm. Virové jádro obalené kapsidovým proteinem sestává ze dvou kopií genomové jednovláknové RNA, nukleokapsidových proteinů (NC) a virových enzymů reverzní transkriptasy (RT), integrasy (IN) a proteasy (PR). Povrchový obal je tvořen fosfolipidovou membránou pocházející z hostitelské buňky. Z obalu vyčnívají knoflíčkovité útvary složené ze tří molekul glykosylovaného povrchového proteinu SU, které jsou volně zakotveny do transmembránového proteinu TM (Gelderblom, H.R., Marx, P.A., ózel, M., Gheysen, D., Munn, R.J., Joy, K.I., Pauli, G. (1991) AIDS 5, 159-180).

HIV genom tvoří dvě identické molekuly RNA o velikosti přibližně 9,2 kb, které kódují 9 různých genů. Základní struktura genomu, která je typická pro všechny retroviry, je tvořena třemi strukturními geny gag, pol a env. Vedle strukturních genů bylo v genomu HIV rozpoznáno 6 genů kódujících proteiny s regulační funkcí, které se podílejí na replikaci viru.

Replikační cyklus HIV uvnitř hostitelské buňky můžeme rozdělit do několika etap (Kráusslich, H-G. (1993) Regulation of Gene Expression in Animal Viruses, ed. by L. Carrasco, et al., Plenům Press, New York): povrchový glykoprotein virového obalu SU rozpoznává a s vysokou afinitou se váže k proteinovému receptoru CD4+, který je exprimován na povrchu T-lymfocytů. K účinné vazbě je navíc zapotřebí ještě koreceptoru, specifického podle typu hostitelské buňky. Virus vstupuje do buňky endocytosou nebo fúzí virového obalu s povrchem buňky a obsah kapsidy se dostává do cytoplazmy buňky. Reversní transkriptasa (RT) přepisuje virovou RNA do dvouřetězcové DNA, která je integrasou (IN) začleněna do chromosomu hostitelské buňky. Takto přetrvává v klidovém stavu (latentní infekce) až do okamžiku, kdy je aktivována a dochází k transkripci virových genů hostitelskou RNA polymerasou II. Podle provirové mRNA se na ribosomech hostitelské buňky z

syntetizují virové polyproteinové prekursory Gag a Gag-Pol. Posttranslačně modifikované polyproteiny a genomová RNA se soustřeďují u povrchu buňky a procesem nazývaným pučením se uvolňují ve virionu z buňky. Polyproteinové prekursory Gag a Gag-Pol jsou v nezralé částici štěpeny virem kódovanou proteasou (PR) za vzniku funkčních proteinů, čímž vytvářejí zralou, infekční částici. Je-li HIV PR poškozena nebo její aktivita inhibována, virion zůstává nezralý.

Nejvíce prostudovanou je HIV-1 PR. Je to dimerní aspartátová proteasa, která se skládá ze dvou stejných nekovalentně vázaných podjednotek. Primární strukturu monomerní jednotky tvoří 99 aminokyselin. K poznání sekundární struktury HIV-1 PR nejvíce přispěly krystalografické strukturní analysy (Wlodawer, A., Miller, M., Jaskóíski, M., Sathyanarayana, B.K., Baldwin, E., Weber, I.T., Selk, L.M., Clawson, L., Schneider, J., Kent, S.B.H. (1989) Science 245, 616-621), které odhalily přesnou dvojnásobnou rotační C₂ symetrii a vysoký obsah β-struktur. Čtyři z řetězců v jádře molekuly vytvářejí list tvaru „písmena ψ charakteristický pro všechny aspartátové proteasy. Triplet aktivního místa (Asp25-Thr26-Gly27) je umístěn v ohybu proteinového řetězce a jeho struktura je stabilizována sítí vodíkových vazeb.

HIV PR se musí nejprve autokatalyticky vyštěpit z prekursoru a následně v něm rozštěpit devět přesně definovaných míst. HIV PR specificky štěpí virový polyprotein i přesto, že se štěpená místa od sebe navzájem dosti liší v aminokyselinové sekvenci. Na rozdíl od jiných endopeptidas (pepsin, trypsin, renin) hydroiyzujících peptidové vazby v sousedství určitých aminokyselin, se u HIV PR obdobná závislost na primární sekvenci nedá snadno stanovit. Zde se spíše předpokládá specifita plynoucí z kumulativního účinku na sobě nezávislých převážně slabých interakcí mezi jednotlivými vedlejšími řetězci v substrátu a odpovídajícím podmístem v enzymu. Podstatný vliv má hydrofobní interakce, plocha povrchu, polarita, potenciál sekundární struktury a další vlivy (Poorman, R.A., Tomasselli, A.G., Heinrikson, R.L., Kézdy, F.J. (1991) J. Biol. Chem. 266,14554-14561).

Inhibitory HIV proteasy

Několik kroků životního cyklu HIV bylo vybráno jako bod možného terapeutického zásahu. Jedná se především o reversní transkriptasu (dideoxynukleosidy, jejich analoga a nenukleosidové inhibitory), navázání a vstup virionu do hostitelské buňky (rozpustné CD4 receptory a jejich deriváty, polyaniontové sloučeniny, inhibitory fúze), integrace proviru integrasou do hostitelského chromosomu, regulace transkripce proteinovými produkty genů tat a rev aj. (pro souhrn De Clerq, E. (1998) Collect. Czech. Chem. Commun. 63, 449-479). Zrání retroviru a především jeho nejdůležitější enzym HIV proteasa, která je předmětem této patentové přihlášky, se stal také předmětem rozsáhlého výzkumu a racionálního navrhování léčiv. Pro klinické používání byly nebo v nejbližší době bude v ČR schváleno sedm inhibitorů: saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir a atazanavir. Všechny tyto inhibitory kompetitivně inhibují vazbu přirozených substrátů na HIV PR a snižují infektivitu viru blokováním maturace virionu.

Vznik resistence vůči inhibitorům HIV PR

Uvedení proteasových inhibitorů na trh na přelomu roků 1995 a 1996 a zavedení vysoce aktivní antiretrovirové terapie (HAART - highly active antiretroviral therapy) vedlo ke zpomalení nástupu oportunních infekcí a poklesu mortality, což zvýšilo naději pacientů i lékařů na nalezení uspokojivé terapie AIDS. Bohužel, brzy po zavedení nových léčiv se objevily i jejich limity.

-4Při aplikaci PR inhibitoru dojde k potlačení replikace viru. Je-li replikace potlačena neúplně, může pod selekčním tlakem přežít malá populace viru resistentního vůči příslušnému inhibitoru. Tento jev vede k resistenci viru (Larder, B., Richman, D._t Vella, S. (1998) HIV resistance and implications fortherapy, MediCom lne., Atlanta, USA). Do dnešní doby byly pozorovány mutace na nejméně 49 pozicích v 99 aminokyselinovém monomeru (Gulnik, S., Erickson, J.W., Xie, D. (2000) Vitamins and Hormones 58, 213-256).

Hlavními faktory, které jsou zodpovědné za rychlý vývoj resistentních variant, jsou přirozená variabilita HIV genomu (polymorfismus) a dynamická virová replikace za latentní fáze a během ustáleného stavu (Erickson, J.W., Buřt, S.K. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36, 545-571). Genetická variabilita HIV vzniká pravděpodobně kombinací vlivu vysoké chybovosti reversní transkriptasy, genomové rekombinace a selekční síly lidského imunitního systému.

Existuje několik možných strategií, kterými si virus může vyvinout resistenci k proteasovým inhibitorům. Mezi hlavní patří mutace ve vazebném místě enzymu, které přímo ovlivňují vazbu; mutace mimo vazebné místo enzymu, které ovlivňují vazbu inhibitoru nepřímo; mutace štěpených míst HIV PR v polyproteinových substrátech. Svůj příspěvek k resistenci mohou mít mutace, které snižují stabilitu dimeru HIV PR a tím afinitu k inhibitoru, a konečně i mutace mimo vlastní oblast proteasy, které mohou mít za následek například účinnější posun čtecího rámce (Erickson, J.W., Buřt, S.K. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36, 545-571; Boden, D., Markowitz, M. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42, 2775-2783).

Známé inhibitory HIV proteasy můžeme rozdělit do tří základních skupin: (i) sloučeniny navržené jako izostery tranzitního stavu substrátu (statinový, hydroxyethylaminový, hydroxymethylenový, hydroxyethylenový, «.oZ-difluoroketony apod.) (ii) látky navržené pomocí racionálního designu na základě geometrické podobnosti se substrátem (např. inhibitory řady DMP) (iii) sloučeniny s náhodnou strukturní podobností k substrátu, získané sereeningem přírodních látek izolovaných např. z biologického materiálu (Lebon F., Ledecq M. (2000) Curr. Med. Chem. 7, 455-477).

Design inhibitorů virálních proteas je netriviální problém. Na rozdíl od řady jiných enzymů, jejichž substrátem je jednoduchá organická molekula (např. synthasa oxidu dusnatého má jako přirozený substrát L-arginin, a tak jednoduché modifikace jako

N“-OH-Arg či N®-Me-Arg jsou velmi úspěšnými inhibitory), je v případě návrhu inhibitoru pro tento enzym situace podstatně složitější. Přirozeným substrátem je totiž polypeptid, který je na specifickém místě rozpoznán a rozštěpen za vzniku funkčních enzymů a strukturních proteinů virionu. Teoreticky, jak metodami molekulového modelování na semiempirické úrovni a ab initio výpočty, i prakticky představuje design specifického HIV VP inhibitoru složitý problém, kdy nízkomolekulární substrát musí mít vyšší afinitu k enzymu než přirozený polypeptid.

Všechny inhibitory HIV proteasy používané v lékařské praxi (saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir a atazanavir) lze zařadit do skupiny (i). Mají peptidomimetický charakter a jsou kompetitivními inhibitory aktivního centra enzymu. Takové látky však obvykle mají nepříznivé farmakodynamické vlastnosti (pro dosažení účinné koncentrace v infikovaných buňkách je potřeba podávat orálně značné dávky léčiv) a po čase vůči nim vzniká rezistence. Pro překonání rezistence je tedy obecnou snahou objevit inhibitory nepeptidové povahy, které je možné vyvíjet racionálním návrhem léčiv na základě strukturních informací, získaných rentgenostrukturní analysou komplexů HIV PR a dosud známých inhibitorů, případě testováním kombinatoriálních nebo jiných knihoven chemických sloučenin.

Podstata vynálezu:

Uvedené nevýhody odstraňují inhibitory HIV proteasy podle vynálezu, které obsahují klastry vybrané ze skupiny tvořené borany a/nebo karborany a/nebo metallakarborany, s počtem atomů boru v každém individuálním klastru 6 až 12, kde náboj každého individuálního boranového, karboranového, nebo metallakarboranového klastru je 0, -1 nebo -2, boranové, karboranové, nebo metallakarboranové klastry jsou periferně substituovány skupinami zvýšujícími interakční energii mezi HIV proteasou a inhibitorem, přičemž počet boranových, karboranových, nebo metallakarboranových klastrů v molekule inhibitoru je 1 až 9, přičemž karboranové klastry v metallakarboranových inhibitorech jsou koordinovány na atom přechodného kovu, vybraného ze skupiny tvořené Co, Fe, Ni a Ru.

V klastrech mohou být přítomné další heteroatomy, které jsou vybrány ze skupiny tvořené N, P, Si, Ge, Sn, S.

Inhibitory HIV proteasy podle vynálezu se vyznačují obecným vzorcem (1>,

a) /

(R')„A(-X-Y-2)_m kde A je klastrový anion B₁₀Hi₀ ^(2-), Bi2Hi2^(2-), CB6H₇ ^h, CB7H8^w,CB7H₈ ^h, CB9Hi0^h, CBioH1o^(_), CBhHi2^(-), SíBhHi2^(-), SíB1iHh^(2_), SnBiiHn^(2-), GeBnHn^(2_), 7,8C2B9H12^h, 7,9-C2B₉H₁₂ ⁽-⁾,Sí2B1oHi2⁽-⁾, [(I.Ž-CsBgHii^-S-Coílll)]^ [(1,7-C2B₉Hn)₂-3Co(lll)]^H, [(CzBsHnJCoílllXCzBeHioJjCoílllXCzBsHn)]^, [(U-CzBgH^-S-FeOlOp, [(1 ,7-C2B9Hn)2-3-Fe(lll)]^(-), [(1,2-C2B9Hi)₂-3-Ni(lll)]⁽~>, [1-(C5H5)Fe(HI)(CB10H11)]⁽-⁾, [(CsHsjCoOlIXU-CBioHn)]^, [(C5H5)Ni(IIIX1,2-CB10Hii)]^w, [(C2B10H12)2M(lll)]^w nebo neutrální klastr 1,2-C2B₈H₁₀,1,6-C₂B₈H_10l 1,10-C₂B₈H₁₀, 1,2-C₂B₁₀H₁₂,1,7-C₂BioHi₂, 1,12-C₂B₁₀Hi2, P₂BioH-io, SBnHn, NBnHn, PBnHn, [[(CsHsXI.Ž- C₂B₉Hii)-Co(lll)], [(C₅H5X1,7-C2B₉Hii)-3-Co(III)], [(CsHsXU-CzBgH^-FeOII)], [(CsHsjíU-CzBgHnXFeílllX.KCsHsXI.Ž-CsBgHuJNKIII)], [(CsHsJFeíllXCsBeHu)], [(CsHsWIIXCaBeH^)], [(CaBeHufc-Feíll)], [(C₅H₅)Fe(ll)(C3B₇H₁₀)], [1(C₅H₅)Fe(ll)(PC₂B₈H₁₀)], [(CzBgHnXCoílllXCgBeHn)], [(C₂B₁₀H₁₂)-M(IIIXC₅H₅)] kde substituenty obecného vzorce —X—Y—Z a R¹ jsou navázány na atomech boru, uhlíku nebo heteroatomech klastru A, kde j je 1 až 3,

M značí Fe, Co, Ni, Ru a kde R¹ je stejné nebo různé a je vybráno ze skupiny obsahující vodík, halogen, methyl, hydroxy, fenyl, fenylen, thiol, methoxy a trifluoromethoxy skupinu, m je 0,1 a 2, n je O až 12,

X je různé nebo stejné a značí skupinu —O—, —C(=0)—, —CH₂—, —N(R³)—, —P(R³)—, —S —, Ci až C10 alkandiyl, —O(CH₂CH₂O)_q—, fenylen substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, v případě metallakarboranů typu [(1,2-Ο₂Β₉Ηιι)₂-3-Μ(ΙΙΙ)]^(-) je dále X můstkově vázaná skupina >S, >N, >P, >0₂P, >0₂P(=0), fenylen substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, ethandiyl substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, na níž je připojen substituent Y , kde M má vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde q nabývá hodnot O až 12, kde R³ je stejné nebo různé a značí vodík, Ci až C8 alkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, C2 až C_B alkenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, C2 až C8 alkynyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, a C3 až C₁₄ karbocyklický systém substituovaný 0 až 5 R¹° nebo 0 až 5 R¹¹, nebo 5až 1 (^členný heterocyklus obsahující bbsahujícj 1 až 4 heteroatomy vybrané ze skupiny tvořené z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 2 R¹¹, kde R¹⁰ je stejné nebo různé a značí ketoskupinu, halogen, kyanoskupinu, -CH2N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), -C(=O)O(R⁷), —C(=O)(R⁵), —OC(=O) (R⁷), -O(R⁷), C2 až C₆ alkoxyalkyl, —S(=O)_k(R⁷), — NHC(=NH)NH(R⁷), —C(=NH)NH(R⁷), —C(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)C(=O)(R⁷), =N—O(R⁸), —N(R⁸)C(=O)O(R⁸), —OC(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)C(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)S(=O)₂N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)S(=O)2(R⁷), —S(=O)2N(R⁷)(R⁸), Cl až C₄ alkyl, C₂ až C₄ alkenyl, C₃ až C₁₀ cykloalkyl, C₃ až Οθ cykloalkylmethyl, fenylmethyl, fenethyl, fenoxy, fenylmethoxy, nitro, C₇ažC₁₀ arylalkyl, —C(=O)—NH(OH), — C(=O)—NH(NH₂), —B(OH)₂, sulfonamid, formyl, C₃ až C₆ cykloalkoxy, Ci až C₄ alkyl substituovaný—N(R⁷)(R⁸), Ci až C4 hydroxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, Ci až C4 haloalkyl, C1 až C4 haloalkoxy, Ci až C4 alkoxykarbonyl, až C4 alkylkarbonyloxy, Ci až C4 alkylkarbonyl, Cg až C4 alkylkarbonylamino, —OCH2C(=O)O(R⁷), 2-(1morfolino)ethoxy, azido, —C(R⁸)=N—O(R⁸), C5 až Cu karbocyklický zbytek substituovaný 0 až 5 R¹¹, nebo 5- až 10}členný heterocyklus obsahující ěbsatrajíčf 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 2 R¹¹, kde k nabývá hodnot 0,1 a 2 kde R⁷ je stejné nebo různé a značí vodík, fenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, fenylmethyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, Ci až C6 alkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C2 až C₄ alkenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, Ci až C6 alkylkarbonyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, Ci až Οθ alkoxykarbonyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, Ci až C6 alkylaminokarbonyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C₃ až C₆ alkoxyalkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, libovolnou chránící skupinu na aminoskupině, pokud je R⁷ vázán na atom dusíku, nebo libovolnou chránící skupinu na hydroxyskupině, pokud je R⁷ vázán na atom kyslíku, kde R¹⁴ je různé nebo stejné a značí

H, keto, halogen, kyano, —CH₂NH₂, —NH₂, —C(=O)OH, —OC(=O)(Ci až C₃ alkyl), —OH, C₂ až C₆ alkoxyalkyl, —C(=O)NH₂, —OC(=O)NH₂, —NHC(=O)NH₂, —S(=O)₂NH₂, Ci až C₄ alkyl, C₂ až C₄ alkenyl, C₃ až Cm cykloalkyl, C₃ až C₆ cykloalkylmethyl, benzyl, fenethyl, fenoxy, benzyloxy, nitro, C₇ až Cm arylalkyl, —C(=0)—NH(OH), —C(=0)—NH(NH₂), —B(OH)₂, C₃ až C6 cykloalkoxy,

Ci až C₄ alkyl substituovaný —NH₂, Ci až C₄ hydroxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, Ci až C₄ haloalkyl, Ci až C₄ haloalkoxy, Ci až C₄ alkoxykarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonyloxy, Ci až C₄ alkylkarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonylamino, —OCH₂C(=O)OH, 2-(1-morfolino)ethoxy, azido, aryl(Ci až C₃ alkyl), C5 až Ci₄ karbocyklický zbytek, 5- až 10rčlenný heterocyklus obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný O až 3 R⁶, kde R⁸, pokud je substituentem na uhlíku, je různé nebo stejné a značí fenyl, fenylmethyl, fenethyl, fenoxy, fenylmethoxy, halogen, hydroxy, nitro, kyano, Ci až C₄ alkyl, C₃ až C₆ cykloalkyl, C₃ až C₆ cykloalkylmethyl, C₇ až Cm arylalkyl, C1 až C₄ alkoxy, —C(=O)OH, , —C(=0)—NH(OH), —C(=0)—NH(NH₂), —B(OH)_2> sulfonamid, formyl, C₃ až C₆ cykloalkoxy, —0(R⁷), C1 až C4 alkyl substituovaný —N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), C2 až Cg alkoxyalkyl, C1 až C₄ hydroxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, C1 až C₄ haloalkyl, C1 až C₄ haloalkoxy, C1 až C₄ alkoxykarbonyl, C1 až C₄ alkylkarbonyloxy, C1 až C₄ alkylkarbonyl, C1 až C₄ alkylkarbonylamino, — S(=O)_k(R⁷), — S(=O)2N(R⁷)(R⁸), —NHS(=O)2(R⁸), —OCH₂C(=O)OH, 2-( 1 -morfolino)ethoxy, —C(R⁸)=N—0(R⁸),

5- až 10}členný heterocyklus obsahujíc! ^sáhujíc) 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný O až 3 R⁹, C₃ až C₄ uhlíkatý řetězec jehož druhý konec je připojený k vedlejšímu atomu uhlíku na kruhu a vytváří 5- nebo 6|členný kruh, tento 5- nebo 6^členný kruh může být substituovaný na některém z alifatických uhlíků skupinami halogen, Ci až C₄ alkyl, Ci až C₄ alkoxy, hydroxy, —N(R⁷)(R⁸), nebo pokud je R⁶ připojen k nasycenému atomu uhlíku, R⁶ může být =0 nebo =S, kde k a R⁷ má vpředu jý-tomto-nárokt| uvedený význam, kde R⁸je stejné nebo různé a značí vodík, hydroxy, trifluoromethyl, Ci až C₆ alkoxy, C₂ až C₆ alkenyl, fenylmethyl, amino, Ci až Ce alkyl substituovaný 0 až 3 skupinami vybranými nezávisle z hydroxy, Ci až C₄ alkoxy, halogen, amino, libovolnou chránící skupinu na aminoskupině, pokud je R⁸ vázán na atom dusíku, nebo libovolnou chránící skupinu na hydroxyskupině, pokud je R⁸ vázán na atom kyslíku, kde R⁹ je různé nebo stejné a značí vodík nebo methyl, kde R⁶, pokud je substituentem na dusíku, je různé nebo stejné a značí fenyl, fenylmethyl, fenethyl, hydroxy, C1 až C4 hydroxyalkyl, C1 až C4 alkoxy, C1 až C4 alkyl, C3 až C6 cykloalkyl, C3 až C6 cykloalkylmethyl, —CH2N(R⁷)(R⁸), — N(R⁷)(R⁸), C2 až C₆ alkoxyalkyl, C1 až C₄ haloalkyl, C1 až C₄ alkoxykarbonyl, — C(=O)OH, až C₄ alkylkarbonyloxy, C1 až C₄ alkylkarbonyl C(R⁸)=N—O(R⁸), kde R⁷ a R⁸ mají vpředu ^v4omto-nárokt| uvedený význam,

R⁷ a R⁸ mohou být alternativně připojeny tak, aby tvořily — (CH₂)₄—, —(CH₂)₅—, —CH₂CH₂N(R⁹)CH₂CH2— nebo — CH₂CH₂OCH₂CH₂—, kde R⁵ je různé nebo stejné a značí vodík, halogen, fenylmethyl, fenethyl,, —C(=O)—NH(OH), — C(=O)—NH(NH₂), —B(OH)₂, sulfonamid, azido, formyl, fenoxy, fenylmethoxy, nitro, kyano, —CH₂N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), —OCH₂C(=O)OH, —C(=O)O(R⁷), —OC(=O)(R⁷), —O(R⁷), C2 až C6 alkoxyalkyl, —S(=O)k(R⁷), — NHC(=NH)NH(R⁷), —C(=NH)NH(R⁷), —C(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)C(=O)(R⁷), =N—O(R⁸), —N(R⁸)C(=O)O(R⁸), OC(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)C(—O)N(R⁷)(R⁸), —C(R⁸)=N—O(R⁸), -N(R⁸)S(=O)2N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)S(=O)2(R⁷), —S(=O)2N(R⁷)(R⁸), Cl až C4 alkyl, C2 až C4 alkenyl, C3 až C10 cykloalkyl, C3 až Ce cykloalkylmethyl, C7 až C10 arylalkyl, C3 až Οδ cykloalkoxy, C1 až C4 alkyl substituovaný—N(R⁷)(R⁸), C1 až C4 hydroxyalkyl, C1 až C₄ haloalkyl, C1 až C₄ haloalkoxy, C1 až C₄ alkoxykarbonyl, C1 až C₄ alkylkarbonyloxy, C1 až C₄ alkylkarbonyl, C1 až C₄ alkylkarbonylamino, 2-(1morfolino)ethoxy, —(C1 až C₃ alkyl)aryl substituovaný 0 až 2 R⁶, C5 až C₁₄

R karbocyklický zbytek substituovaný 0 až 3 R , 5- až 10[-členný heterocyklus obsahující ^bsahujtcj 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 3 R⁶, kde k, R⁶, R⁷ a R⁸ mají vpředu ý-tomtonárokufuvedený význam, kde R¹¹, pokud je substituentem na uhlíku, je různé nebo stejné a značí fenethyl, fenoxy, C3 až Cw cykloalkyl, C3 až C6 cykloalkylmethyl, C7 až C10 arylalkyl, —C(=O)—NH(OH), — C(=O)—NH(NH2), —B(OH)2, C2 až C6 alkoxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, C1 až C4 alkylkarbonyloxy, —NHS(=O)2(R⁸), fenylmethoxy, halogen, 2-(1-morfolino)ethoxy, —C(=O)O(R⁷), -C(=O)N(R⁷)N(R⁷)(R⁸), kyano, sulfonamid, formyl, C3—C₆ cykloalkoxy, C1 ažC₄ haloalkyl, C1 až C₄ haloalkoxy, C₂ až C₄ haloalkenyl, C₂ až C₄ haloalkynyl, —N(R⁷)(R⁸), —C(R⁸)=N— O(R⁸), —NO2>—O(R⁷), —N(R¹²)(R¹³), _ S(=O)k(R⁷), -S(=O)_kN(R⁷)(R⁸), -C(=O)N(R⁷)(R⁸), —OC(=O)N(R⁷)(R⁸), -C(=O)(R⁵), —OC(=O)(R⁵), —OC(=O)O(R⁷), fenyl, —C(=O)N(R⁷)-(Ci až C₄ alkyl), N(R⁷)(R⁸), —C(=O)N(R¹²)(R¹³), — C(=O)—(C1 až C₄ alkyl)—N(R⁷)C(=O)O(R⁷),

C1 až C₄ alkoxy substituovaný 0 až 4 skupinami nezávisle vybranými ze skupin :

—R⁵, C₃ až C₆ cykloalkyl, — C(=O)O(R⁷), — C(=O)N(R⁷)(R⁸), — N(R⁷)(R⁸) nebo hydroxyl,

Ch až C₄ alkyl substituovaný 0 až 4 skupinami nezávisle vybranými ze skupin:

—R⁵, =N(R⁸), =NN(R⁷)C(=O)N(R⁷)(R⁸) nebo — N(R⁷)(R⁸),

C₂ až C₄ alkenyl substituovaný 0 až 4 R⁵, C2 až C4 alkynyl substituovaný 0 až 4 R⁵, 5- až 6-členný heterocyklus obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, C3 až C₄ uhlíkatý řetězec jehož druhý konec je připojený k z\ vedlejšímu atomu uhlíku na kruhu a vytváří 5- nebo 6[členný kruh, tento 5- nebo 6členný kruh může být substituovaný na některém z alifatických uhlíků skupinami halogen, až C₄ alkyl, C1 až C₄ alkoxy, hydroxy, — N(R⁷)(R⁸), nebo pokud je R¹¹ připojen k nasycenému atomu uhlíku, R¹¹ může být =0 nebo =S, kde k, R⁵, R⁷ a R⁸ mají vpředu (v4omto-nárokQ uvedený význam, kde R¹² je různé nebo stejné a značí vodík nebo C1 až C₃ alkyl, kde R¹³ je různé nebo stejné a značí — C(=O)N(R⁷)(R⁸), — C(=O)N(R⁷)NH(R⁸), —C(=O)C(R⁵)2N(R⁷)(R⁸), — C(=O)C(R⁵)2N(R⁷)NH(R⁸),

- 11 -C(=O)C(R⁵)2N(R⁷)C(=O)O(R⁷), —C(=O)H, —C(=O)(R⁵), -C(=O)-(C1 až C₄ alkyl)—N(R⁷)(R⁸), -0(=0)-((^ až C₄ alkyl)—, N(R⁷)C(=O)O(R⁷) nebo 1 až 3 aminokyseliny spojené amidovými vazbami k atomu dusíku pomocí karboxylových skupin, kde R⁵, R⁷ a R⁸ mají vpředu |vHx>mtoTrárokd uvedený význam, kde R¹¹, pokud je substituentem na dusíku, je různé nebo stejné a značí fenyl, fenylmethyl, fenethyl, hydroxyl, Ci až C₄ hydroxyalkyl, Ci až C₄ alkoxy, Ci až

C₄ alkyl, C₃ až C₆ cykloalkyl, C₃ až C₆ cykloalkylmethyl, — CH₂N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), C₂ až Οβ alkoxyalkyl, Ci až C₄ haloalkyl, Ci až C₄ alkoxykarbonyl, —C(=O)OH, Ci až C₄ alkylkarbonyloxy, Ci až C₄ alkylkarbonyl nebo —C(R⁸)=N— 0(R⁸), kde R⁷ a R⁸ mají vpředu ý-tomto-nárokó uvedený význam, kde Y je různé nebo stejné a značí Ci až C10 alkandiyl substituovaný O až 4 skupinami R²; oligoethylenglykol, nebo substituovaný oligoethylenglykol substituovaný skupinou R² ; nebo Ci až C10 cykloalkandiyl substituovaný O až 4 skupinami R²; —C(=0)—;

—S(=O)k—; —P(=O)(OR³)—X—; —P(=O)(N(R³)(R⁴))—X—;

—P(=O)(N(R³)(R⁴))—X—; —C(=0)—X—; —(CF₂)_q—; fenylen substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, kde k, q a R³ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R² je různé nebo stejné a značí vodík, —A, —X—A, —0(R⁷), —S(R⁷), —N(R⁷), —C(=O)O(R⁷), keto, Ci až C8 alkyl substituovaný O až 3 R⁵, C2 až C₈ alkenyl substituovaný O až 3 R⁵, fenyl, fenyl substituovaný nezávisle O až 5 substituenty R¹⁴, fenylen substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, alkynyl substituovaný O až 3 R⁵, Ci až C₈ perfluoroalkyl, C₃ až C-μ karbocyklus substituovaný O až 3 R nebo O až 3 R , nebo 5 až 10 členný heterocyklus obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný O až 2, oligoethylenglykol, R⁶, kde A, X, R⁵, R⁶, a R⁷ mají vpředu ýTomte-nárokuf uvedený význam,

- 12 kde R⁴ je různé nebo stejné a značí vodík, Ci až Ca alkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰,

C₂ až Ca alkenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, C2 až C8 alkynyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, a C3 až Cu karbocyklický zbytek substituovaný 0 až 5 R¹⁰ nebo 0 až 5 R¹¹, nebo 5až 10-jčlenný heterocyklus obsahující obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 2 R¹¹, kde R¹⁰ a R¹¹ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde Z je různé nebo stejné a značí vodík, A, —X—A, —C(=O)—X—A, —CH(OH)_X—A, —CH(NH₂)—X—A, NH-A, NH-CH(OH)CH-NH-A —S(=O)_k—X—A, —O—P(=O)(OR³)—X—A, — O—P(=O)(N(R³)(R⁴))—X—A, R³ a Ci až Cio alkyl substituovaný 0 až 4 skupinami R², kde k, A, X, R², R³ a R⁴ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, a jejich farmaceuticky využitelné sole.

Inhibitory HIV proteasy a jejich farmaceuticky využitelné sole mohou mít též obecný vzorec^íl) (R¹)_nA(—X—Z)_m kde A, X ,Z a R¹ a m.n mají vpředu uvedený význam.

Inhibitory HIV proteasy jsou zejména sloučeniny [(8-HO-(CH₂-CH20)₂-1,2-C₂B9H₁o)(1^,,2^,-C₂B₉H₁₁)-3,3^,-Co]Na [8-(OH-1 ,2-C₂B₉Hio)(1 ’,2^,-C₂B₉H₁₁)-3,3’-Co]Na.nH₂O [8,8’-p-0-(C₂B₉Hio)₂-3-Co]Na [(8-(HO)₂-P(O)O-1 ,2-C₂B₉Hi₀) -(ť^-C^Hwj-S-Co] Na₂.nH₂O [(C₂B₉Hio)₂-3-Fe]Na.4H₂0 [(1₎2-C₂B9H₁o)-3,3’-Co(1’,2’-C2B₉H₁₁)-8-(OCH2CH2)20CH(C₆H₅)CH2(C₆H5)(OH)]Na [(1,2-C₂B₉H₁₀)-3,3’-Co(1 ’,2’-C₂B₉Hh)-8-(OCH2CH2)20CH(C6H₅)CH(C6H5)(OCH2CH2)2-8”-0-(1”,2”-C2B₉H₁o)-3”,3”’-Co(1^,”,2”’- C₂B₉Hn)]Na₂ [(1,2-C₂B₉H₁₀)-3_I3^,-Co(1 ^Χ^Η^Αβ’ψ-ΝΗ^Ηζ-ΟΗίΟΗΚΗζ-δ,δ VNH-(1 ”,2”-O2B₉Hio)-3,3”’-Co(1’”,2”’-C₂B₉Hi₀)] a [3,3’-Οο-(Γ,2^0269^-i)(8-1,2-0269^0-(0-01-12-01-12)40-8-1,2-02891-1-10)(1^2C₂B₉Hi-))-3,3'-Co]Na₂.

Způsob přípravy nových sloučenin [(1,2-C₂B₉Hio)-3,3’-Co(1’,2’-C₂B₉Hii)-8_ (ΟΟΗ₂ΟΗ2)2ΟΟΗ(Ο6Η5)ΟΗ2(Ο₆Η₅)(ΟΗ)]Ν3 a [(1,2-C₂B₉H₁o)-3,3’-Co(1’,2^,-C₂B₉H₁i)-8- (OCH₂CH₂)₂OCH(C₆H₅)CH(C₆H₅)(OCH₂CH₂)₂-8”-O-(1 ”,2”-C₂B₉H₁₀)-3”,3’”-Co(1 ”’,2”’- C₂B₉Hii)]Na₂ spočívá podle vynálezu v tom, že se na meso-hydrobenzoin deprotonizovaný jedním nebo dvěma ekvivalenty NaH působí za laboratorní teploty roztokem obsahujícím jeden nebo dva ekvivalenty 8-dioxan-kobalt bis(dikarbollidu) v toluenu.

Způsob přípravy nové sloučeniny [(1 ,2-C₂B9Hio)-3,3’-Co(1 ’,2’-C₂B₉Hio)-8,8’-p-NH- CH2-CH(OH)-CH₂-8,8’-p-NH-(1”,2”-C2B₉Hio)-3”,3'^,,-Co(r’^,,2'-C₂B₉H₁₀)] spočívá v tom, že se na látku [(1,2-0₂Β9Ηιο)-3,3’-Οο(1\2’-θ2Β9Ηι₀)-8,8’-μ-ΝΗ] deprotonizovanou NaH a rozpuštěnou v diethylenglykol dimethyletheru (DME) působí za laboratorní teploty epichlorhydrinem a produkt se získá purifikací reakční směsi na silikagelové koloně.

Způsob přípravy nové sloučeniny [δ,δ’-Οο-ίΙ',ζ'-ΟζΒθΗι^ίδ-Ι,ζ-ΟζΒ^^-ζΟ-ΟΗζCH₂)4O-8-1,2-C₂B₉Hio)(1',2'-C2B₉Hii)-3,3-Co]Na₂ spočívá v tom, že se na látku [(8HO-(CH2-CH₂O)2-1 ^-ΟζΒθΗ-ιοΧΙ',2^0269^1)-3,3'-Co]Me₃NH deprotonizovanou NaH a rozpuštěnou v diethylenglykol dimethyletheru (DME) působí za laboratorní teploty 8-dioxan-kobalt bis(dikarbollidem) a produkt se získá purifikací reakční směsi na silikagelové koloně.

·» *

- 14 Předmětem vynálezu je též léčivo určené k léčbě AIDS vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden inhibitor HIV proteázy obecného vzorce (l)^; a/nebo obecného vzorce (Il) s výhodou vpředu uvedené nové sloučeniny.

Zavedení derivátů klastrových sloučenin boru jako nového strukturního prvku přináší velice pozoruhodné inhibiční vlastnosti pro HIV proteasu a její mutanty, které jsou rezistentní vůči jiným inhibitorům. Nízká toxicita, stabilita a biokompatibilita, spolu s vysokou účinností představuje prioritu nad známými a dosud používanými inhibitory HIV proteasy, které mají řadu vedlejších účinků.

Přehled obrázků

Obrázek 1 znázorňuje strukturu sloučenin popsaných v příkladech. Každá ze sloučenin je označena zkratkou.

Obrázek 2 znázorňuje model interakce sloučeniny GB-16 s HIV-1 proteasou. Obrázek 3 znázorňuje model sloučeniny GB-24 vložený do aktivního místa HIV-1 proteasy.

Obrázek 4 znázorňuje grafickou závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu.

Obrázek 5 znázorňuje inhibiční účinek inhibitorů GB-8, GB-12 a GB-16 ve tkáňových kulturách transfekovaných provirovým klonem NL4-3.

Příklady provedení:

Předloženy'patentuje dále demonstrování na následujících příkladech, které jej však žádným způsobem neomezují.

1. Molekulové modelování

2. Syntéza známých látek

3. Syntéza nových látek

4. Testování účinnosti známých i nových látek in v/íro

5. Testování inhibice infektivity viru HIV ve tkáňových kulturách

Struktury a zkratky všech sloučenin popsaných v příkladech jsou uvedeny na Obrázku 1. Atomy boru nesoucí vodík nebo substituenty jsou označeny šedými kuličkami, atomy uhlíku nesoucí vodík nebo substituenty černými kuličkami, kobalt a

-15 železo jsou označeny příslušnou značkou prvku. Atomy na klastrech jsou číslovány standardním způsobem.

1. Molekulové modelování

Základní filosofickou koncepci našeho návrhu představují inhibitory HIV proteasy obsahující boranové, karboranové nebo metallakarboranové klastry. Tyto klastry, v medicíně dosud výhradně navrhované a používané pro neutronovou záchytovou boronovou terapii NCBT (Larson B. et al. (1997) Advances in Boron Neutron Capture Therapy. Vol. 1, Elsevier Science B.V.; Soloway A.H. (1998) Chem. Rev. 98, 15151562; Hawthorne M.F., Maderna A. (1999) Chem. Rev. 99, 3421-3434; Hawthorne M.F. (1993) Angew. Chem. Intl. Ed., 32, 950-984; Valliant J.F. (2002) Coord. Chem. Rev. 232, 173-230; Sivaev I.B. (2002) Russ. Chem. Bull., Intl. Ed., 51, 1362-1374; Hawthorne M.F., Lee M.W. (2003) J. Neuro-Oncology, 62, 33-45)) představují novou, potenciálně významnou strukturní jednotku pro selektivní interakce s proteiny a tak vytvoření vysoce účinných a stabilních, netoxických inhibitorů s velkým léčebným potenciálem.

Pro analýzu předpokládaného způsobu vazby inhibitorů založených na karboranových klecích k HIV protease pomocí molekulového modelování byly vybrány dvě sloučeniny: GB-16 a GB-24. Jako výchozí krystalová struktura byla použita příbuzná sloučenina [8,8'-p-propargylthio-(1,2-0269^0)2-3-00]^- (kód v Cambridgeské strukturní databázi: TENQAE) (Vohlidal et al. (1996) Collect. Czech. Chem. Commun., 61, 877). Pomocí molekulového modelování byly přidány vodíkové atomy a atom síry nahrazen fosfátovou skupinou, resp. spojovacím řetězcem. Přidané atomy či skupiny byly optimalizovány semiempirickou metodou MNDO. Modely sloučenin byly vloženy do aktivního místa divokého typu HIV-1 proteasy podle templátu inhibitoru QF34 (kód v Protein Data Bank 11ZI). (Weber J., Mesters J.R., Lepsik M., Prejdova J., Švec M., Sponarova J., Mlčochova P., Skalická K., Strisovsky K., Uhlíková T., Souček M., Machala L., Staňkova M., Vondrasek J., Klimkait T., Kraeusslich H.G., Hilgenfeld R., Konvalinka J. (2002) J. Mol. Biol., 324(4), 739-754).

Výsledky molekulového modelování ukazují, že látky založené na metallakarboranových klastrech splňují prostorové a velikostní požadavky pro vazbu inhibitoru do aktivního místa HIV proteasy. Dále struktury komplexů mezi HIV proteasou a inhibitory ukazují dvě podstatné přednosti patentovaných látek. Za prvé, ze změřených vzdáleností mezi kyslíkovými atomy inhibitoru a proteasy je zjevné, že funkční skupiny metallakarboranových inhibitorů mohou zaujímat takové postavení, které umožňuje vytváření vodíkových můstků s katalytickými aspartáty (Obr. 2). Za druhé, výrazná komplementarita povrchů mezi aktivním místem HIV proteasy a metallakarboranového inhibitoru umožňuje silné hydrofobní interakce s dutinou

O enzymu (Obr. 3), které zajišťují silnou vazbu.

Obrázek 2. znázorňuje model interakce sloučeniny GB-16 (1) s katalytickými aspartáty Asp25 a Asp25’ (2), které jsou součástí aktivního místa HIV-1 proteasy. Atomy inhibitoru GB-16 jsou znázorněny kuličkami, tyčky představují vazby mezi nimi. Barevné označení inhibitoru GB-16 je následovně: černé kuličky znázorňují atomy uhlíku, šedé kuličky atomy boru, bíle kuličky atomy kyslíku a atom fosforu (P) a kobaltu (Co) je popsán. Menší bílé kuličky a bílé čárky mezi nimi označují atomy a chemické vazby, které tvoří katalytické aspartáty Asp25 a Asp25’. Čárky s čísly označují vzdálenosti (v Ángstrómech, 1Ángstróm=0,1nm ) mezi kyslíkovými atomy katalytických aspartátů a inhibitoru GB-16. Fakt, že vzdálenosti nepřesahují 2,5 Á, potvrzuje, že vzájemné postavení funkční skupiny inhibitoru GB-16 a katalytických aspartátů je optimální pro vytvoření vodíkových můstků. Aktivní místo HIV proteasy (kromě katalytických aspartátů) je představováno tyčkovým modelem a vybarveno šedě.

Obrázek 3. znázorňuje model sloučeniny GB-24 vložený do aktivního místa HIV-1 proteasy. Je patrné, že povrch inhibitoru je vysoce komplementární k dutině proteasy. Toto blízké přiblížení převážně hydrofobních povrchů způsobuje silnou vazbu mezi inhibitorem GB-24 a HIV-1 proteasou. Van der Waalsův povrch inhibitoru (1) je znázorněn kalotovým modelem (černě), zatímco dutina HIV proteasy je představena jako Connolyho povrch (šedé tečky). Katalytické aspartáty HIV-1 proteasy Asp25 a Asp25’(2) jsou vybarveny černě, zatímco zbytek aktivního místa je šedě.

2. Syntéza známých látek

GB-1 [(8-HO-(CH₂-CH₂0)2-1,2-C₂B9Hio)(T, 2·-Ο₂Β9Ηιι)-3,3'-Co]Na

Látka byla připravena reakcí známé neutrální sloučeniny, derivátu 8-dioxan-kobalt bis(dicarbollidu) (Plešek J, Heřmánek S, Franken A, Císařová I, Nachtigal C. (1997) Collection Czechoslovak. Chem. Commun. 62, 47-56) s NaOH ve vodném dioxanu podle následující procedury: 1 ,Ojg 8-dioxan-kobalt bis(dikarbollidu) bylo rozpuštěno v 50 ml směsi dioxan-voda 4:6 a bylo přidáno 10 ml 10% roztoku NaOH. Reakční směs byla zahřívána při 80⁶C dvě hodiny. Po ochlazení bylo přidáno 100 ml vody,

A dioxan byl odpařen za chladu a pak přidáno 50 ml 3M HCI. Vodná fáze byla extrahována diethyletherem (3x 30 ml). Spojené organické extrakty byly protřepány s vodou (2x 20 ml), odděleny a bylo k nim přidáno dalších 50 ml H2O a ether byl odpařen. Byl přidán ethanol do rozpuštění produktu a produkt byl vysrážen nadbytkem (ΟΗ₃)3Ν.ΗΟΙ ve vodě, zfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek (8-HO(CH₂-CH₂O)₂-1 ,2-C₂B₉H₁o)(1^,,2^,-C₂B₉H₁₁)-3,3'-Co](CH3)3NH: 0,99g, 86%.

¹H NMR: aceton-de, 4,27 (2H, CH_karboran,), 4,11m (2H, CH₂-O), 3,97s (2H, CH₂), 3,81 (2H, CH₂-O), 3,64-3,59 m (4H, 2CH₂-O), 3,10s (2H, 2CH_karboran.), [2,95] (H10’), [2,79] (H4’,7’), [2,72] (H10), 2,90 (9H, (CH₃)₃NH, [2,48] (H8’), [2,06] (H9’,12’), [2,06, 1,81] (H4, 7, 9, 12), [1,73] (H6’), [1,68] (H5’, 11'), [1,59] (H5, 11), [1,49] (H6).

¹¹B NMR: acetori-d₆: 23.8s (B8), 5,2 (B8*) (131), 0_;5 (B10’) (135), -2,5 (B10) (139), 4,6 (B4’,7’) (142), -7,Od, -7,5d (B9, 12, 9’,12’) (překryv=overlap), -8,7 (B4, 7) (176), 17,2 (B5’, 11’) (150), -20,3 (B5, 11) (150), -22,1 d (B6’) (overlap), -28,5 (B6) (135). M.S. m/z= 415,3.

Analýza: %B vypočteno: 41,22, nalezeno: 40,84, %Co vypočteno: 12,49, nalezeno: 12,33.

y

Trimethylamonná sůl byla převedena na sodnou následujícím postupem: 1jg soli bylo třepáno mezi 3M HCI (50 ml) a diethyletherem (30 ml), organická vrstva byla oddělena a dvakrát protřepána s 3M HCI (50 ml). Organický extrakt byl protřepán postupně třikrát s50Íml 10% vodného roztoku Na₂CO₃, 50ml vody, etherová fáze byla oddělena a odpařena dosucha a vysušen ve vakuu.

V literatuře existuje popis přípravy této látky jinou, složitější metodou (Sivaev IB, Staříkova ZA, Sjoberg S, Bregadze VI. (2002) J. Organomet. Chem. 649,1-8).

GB-8 [8-(OH-1,2-C₂B₉H₁₀)(1 ’,2’-C₂B₉Hn)-3,3’-Co]Na.nH₂O η Látka byla připravena přímou hydroxylací kobalt bis(dikarbollidového aniontu) pomocí zředěné H₂SO₄ za vyšších teplot, postupem popsaným v literatuře (Plešek J, Gruner B, Báča J, Fušek J, Císařová I. (2002) J. Organometal. Chem. 649,181-190).

GB-12 [8,8’-p-0-(C₂B₉Hio)₂-3-Co]Na

Můstkový derivát kobalt bis(dikarbollidu) byl připraven na základě popsaných postupů reakcí nesubstituovaného iontu s paraformaldehydem (Plešek J, Heřmánek S, Baše K, Todd LJ, F. WW. (1976) Collection Czechoslovak. Chem. Commun. 41, 3509-3515).

GB-16 [(8-(HO)₂-P(O)O-1 ,2-C₂B₉Hi₀) -(1 ’,2’-C₂B₉H₁₀)-3-Co] Na₂.nH₂O

Látka byla připravena reakcemi výše popsané látky GB-8 s fosforylchloridem a hydrolýzou vzniklého intermediátu tak, jak to bylo popsáno v práci (Plešek J, Gruner B, Císařová I, Báča J, Selucký P, Rais J. (2002) J. Organometal. Chem. 657, 59-70).

GB-23 [(C₂B₉H₁₀)₂-3-Fe]Na.4H₂O

Látka byla připravena procedurou popsanou v literatuře (Hawthorne MF, Young DC, Wegner PA (1965) J. Am. Chem. Soc. 87,1818).

3. Syntéza nových látek

Číselné údaje chemických posuvů v NMR spektrech jsou uvedeny v ppm.

GB-21 [(1_I2-C₂B₉H₁o)-3,3^,-Co(1^,,2’-C₂B₉Hii)-8-(OCH₂CH₂)₂OCH(C₆H₅)CH₂(C₆H₅)(OH)]Na

GB-22 [(1,2-C₂B₉H₁o)-3,3^,-Co(1’,2^,-C2B9Hn)-8(OCH2CH2)2OCH(C6H5)CH(C6H5)(OCH2CH2)2-8”-0-(1”,2”-C2B9H1o)-3”,3”^,-Co(1”^,,2”’C2B₉Hii)]Na₂ « 4

- 19 - - '

K meso-hydrobenzoinu deprotonizovanému jedním nebo dvěma ekvivalenty NaH byl přikapán roztok obsahující jeden nebo dva ekvivalenty 8-dioxan-kobalt bis(dikarbollidu) v toluenu. U disubstituovaného produktu byla reakční doba 5 h. Reakční směs byla rozložena vodou 30 ml, několika kapkami 10% kyseliny octové a produkty reakce byly vytřepány do diethyletheru (2x 30 ml), organická fáze byla odpařena a produkty přečištěny chromatografií na silikagelu.

GB-21 ¹H NMR: 400 MHz, aceton-d₆, 8,01 (s, 1H, HO-), 7,24-7,17 (m, 10H, overlaped 2 Phgroups), 4,24 (broad s., 2H, H₂O), CH^oran: 4,23 (s, H) a 3,10 (s,2H), seskupení OCH₂CH₂O-B : 4,11 (t, 2H) a 3,81 (t, 2H), seskupení O-CH₂CH₂O-: obě CH₂-skupiny rezonují v rozmezí 3,64-3,59 (m, 4H).

¹¹B NMR: (128 MHz) aceton-d₆: 23,92s (2B, B8), 5,57d (2B, B8’), 0,5d (2B, B10’), 2,47d (2B, B10), -4,6 d (4B, B4’,7’), -6,92 d, -7,347 d (8B, B9, 12, 9’,12’), -8,63 d(4B, B4, 7), -17,17 d (4B, B5’, 11’), -20,21 d (4B, B5, 11), -21,97 d (2B, B6’), -28,44 d(2B, B6).

GB-22 ¹H NMR: 400 MHz, aceton-d₆, 7,33 - 7,24 (asym. M., 10 H, 2 Ph-gmt%, 3,78 (s, 2H, 2 CH g&>%,,265 (s, 8H, 2 x 2 H₂O), CH_karbOran·. 4,2 (s, H) a 3,1 (s,2H), seskupení O-CH₂CH₂O-B : 4,1 (t, 2H) a 3,8 (t, 2H), seskupení O-CH₂CH₂O-: obě CH2-skupiny 3,6 (m, 4H).

¹¹B NMR: (128 MHz) aceton-d₆: 23,92s (2B, B8), 5,57d (2B, B8’), 0,5d (2B, B10’), 2,47d (2B, B10), -4,6 d (4B, B4’,7’), -6,92 d, -7,347 d (8B, B9, 12, 9’,12’), -8,63 d(4B, B4, 7), -17,17 d (4B, B5’, 11’), -20,21 d (4B, B5, 11), -21,97 d (2B, B6’), -28,44 d(2B, B6).

Podrobné charakteristiky látek s jinými terminálními substituenty (o-PhCH2—C₆H₄—, p-t-Oktyl—C6H4— a o-CH₃O—C₆H4— jsou popsány v Plešek J. et al.: Polyhedron 2002, 21, 975-986. Obecně jsou v ¹H NMR charakteristické dvě skupiny CHkarboran: 4.23 (s, H) a 3.10 (s,2H), seskupení O-CH2CH2O-B : 4,11 (t, 2H) a 3,81 (t, 2H), seskupení O-CH2CH2O-: obě CH₂-skupiny rejonují v rozmezí 3,64-3,59 (m, 4H). Hydratační voda: charakteristicky široký signál při cca 4,30.

¹¹B NMR: Překryv dvou sextetů s poměrem intensit 1:1:2:2:2:1, tj. teoreticky 12 signálů. Rozlišitelných je 11, dva splývají (při -22,1), Pouze signál při 23,4 je singlet (Odpovídá B(gj-O-), ostatní jsou dublety. Mimořádně velký rozsah spektra cca 52

-20-(Na od + 22,93 do -28,42) , je dán rozsahem spektra substituovaného ligandu v něm skryté signály nesubstituovaného ligandu mají rozsah jen 22,5.

GB-24 [(1,2-C2B9H₁o)-3,3’-Co(1’,2^,-C2B₉Hio)-8,8’-p-NH-CH₂-CH(OH)-CH2-8,8’-p-NH-(1’’,2’’- C₂B₉Hio)-3”,3’”-Co(1 '.^-CzBgHio)]

Dvakrát po 150 mg (0,44 mmol) amino derivátu [(1,2-C₂B₉Hio)-3,3’-Co(1’,2’- C₂B₉Hio)-8,8’-p-NH] připraveného podle popsané procedury H₂SO₄ (Plesek J, Heřmánek S, Baše K, Todd LJ, F. WW. (1976) Collection Czechoslovak. Chem. Commun. 41, 3509-3515; Plešek J, Rajabi FH, Vangani V, Fušek J. (1994) Collection Czechoslovak. Chem. Commun. 59, 1326-1336) bylo rozpuštěno v diethylenglykol dimethyletheru (DME) (15 ml) ve dvou baňkách a k roztoku bylo v obou případech za míchání v atmosféře suchého dusíku přidáno 12 mg NaH s velkým specifickým povrchem (2 m²g'¹). Reakční směs v baňce A byla míchána 1h za laboratorní teploty, pak bylo přes septum přidáno 35 pl epichlorhydrinu a reakční směs byla míchána 2h za laboratorní teploty. Z baňky B byl obsah převeden vzniklý roztok kanylou přes septum do baňky A. reakční směs byla míchána 2h při laboratorní teplotě a pak za refluxu po dobu 26h. Po ochlazení byl do baňky přidán silikagel pro chromatografii (Merck, 2g) a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Silikagel pokrytý odpařenými produkty reakce byl vnesen na kolonu naplněnou silikagelem (2x 25 cm) a produkty reakce byly eluovány nejprve směsí benzen-hexan 2: 1 do vymytí nezreagováné výchozí látky, pak benzenem. Byla jímána látka odpovídající červené skvrně na TLC (Silufol, benzen) s Rf= 0,37. Roztok byl odpařen produkt byl znovu přečištěn chromatografii na silikagelu. Výtěžek 105 mg (32 %).

¹H NMR: 400 MHz, aceton-d₆, 7,41 (2H, NH), 4,791 (2H, CH2), 4,241 (2H, CH) 3, 296 (8H, CHkarboran·)· ¹¹B NMR: (128 MHz) aceton-d₆: 5,044 s (4B), -1,021 d (4B), -8,66 d, -9,891 d, -11,15 d (16B), -15,77 d (8B), -25,59 d (4B).

GB-25 [3,3^,-Co-(1',2^,-C₂B₉Hi₁)(8-1,2-C₂B₉H₁o-(0-CH₂-CH₂)₄0-8-1,2-C₂B₉H₁o)(1’,2’-C₂B₉H₁₁)-3,3'-Co]Na₂ [(8-HO-(CH₂-CH₂O)₂-1,2-C₂B₉H₁₀)(1’,2’-C₂B₉Hi₁)-3,3^,-Co]Me₃NH (100mg, 0,2 mmol) připravený postupem uvedeným níže byl rozpuštěn vbezvodém ethylenglykol — 21 — <Tí dimethyljéteru (DME) (30 ml) a k roztoku byl za míchání přidán pevný NaH (98%) s velkým specifickým povrchem (12 mg, 0,49 mmol). Reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 2h. Poté byla reakční baňka evakuována a oddestilováno 10 ml rozpouštědla spolu se zbytky Me₃N. Do baňky byl přikapán roztok 8-dioxan-kobalt bis(dicarbollidu) (84 mg, (j2 mmol) (Plesek J, Heřmánek S, Franken A, Císařová I, Nachtigal C. (1997) Collection Czechoslovak. Chem. Commun. 62, 47-56) v 20 ml bezvodého toluenu. Reakční směs byla za míchání zahřívána 2h při 8oJjC. Po ochlazení bylo přidáno 5Íg silikagelu Merck pro LC a rozpouštědla byla odpařena ve vakuu. Silikagel byl vsypán na suchý sloupec stejného silikagelu 2,5x 25 cm a produkt byl eluován směsi CH3CN-CHCI3 1: 3, byla jímána frakce obsahující hlavní žluto-oranžový pás. Rozpouštědla byla odpařena ve vakuu. Výtěžek 141 mg (82^/o). Produkt byl charakterizován ¹H a ¹¹B NMR NMR spektroskopií:

¹H {¹¹ Bseiektivni} NMR, 400 MHz, aceton-d₆: 4,15 (2H, CH_karboran.), 4,104 (4H,

CHkarboran.) 3,790-3,712 m (12H, CH₂-O), 3,632 m (4H, CH₂-O), [2,95] (H10’), [2,89] (H4’,7'), [2,69] (H10), [2,61] (H8’), [2,058] (H9’,12’), [1,846] (H4, 7, 9, 12), [1,73] (H6’), [1,622] (H5’, 11’), [1,541] (H5, 11), [1,46] (H6).

¹¹B NMR: (128 MHz) aceton-d₆: 23,92s (2B, B8), 5,57d (2B, B8’), 0,5d (2B, B10’), 2,47d (2B, B10), -4,6 d (4B, B4’,7’), -6,92 d, -7,347 d (8B, B9, 12, 9’,12’), -8,63 d(4B, B4, 7), -17,17 d (4B, B5’, 11’), -20,21 d (4B, B5, 11), -21,97 d (2B, B6’), -28,44 d(2B, B6).

4. Testování účinnosti známých i nových látek in vitro

Známé i nové látky byly nejprve testovány na svou schopnost inhibovat specifickou aktivitu HIV proteasy in vitro s použitím čisté rekombinantní HIV proteasy a chromogenního peptidového substrátu odvozeného z aminokyselinové sekvence jednoho ze štěpených míst virového polyproteinu. Testování bylo provedeno podle metfyody publikované jedním ze spoluautorů této PV (Konvalinka, J., Litera, J., Weber, J., Vondrásek, J., Hradilek, M., Souček, M., Pichová, I., Majer, P., Strop, P., Sedláček, J., Heuser, A.-M., Kottler, H. and Kraeusslich, H.-G. (1997). Eur. J. Biochem. 250, 559-566). V typickém experimentu bylo k 15μΜ chromogenního substrátu o sekvenci KARVNIeF(NC>2)EANIe-NH2 (kde Nle značí norleucin a F(NO₂) je para-nitrofenylalanin) v 1ml acetátového pufru pH 4,7 obsahujícího 0.3 M NaCI přidán různé množství testovaného inhibitoru rozpuštěného v DMSO (tak, aby finální

- 22 koncentrace DMSO nepřesáhla 2,5 %) a reakce je odstartována přidáním čisté rekombinantní HIV proteasy do finální koncentrace 8 nM. Průběh reakce je sledován na spektrofotometru jako pokles absorbance při 305 nm. Hodnoty IC₅₀ a K, testovaných sloučenin byly vypočítány z experimentálních dat jak bylo popsáno v práci (Majer, P., Urban, J., Gregorová, E., Konvalinka, J„ Novek, P., Stehlíková, J., Andreánsky, M., Sedláček, J. and Strop, P. (1993) Arch.Biochem.Biophys. 304, 1-8). Mechanismus účinku testovaných sloučenin (typ inhibice) byl určován ze závislosti počáteční rychlosti reakce na koncentraci substrátu při různých koncentracích inhibitoru (Lineweaver-Burkův výnos) a je demonstrován na°j06rázku 4. Dále byla testována inhibice pro wt HIV-2, mutant HIV-1 PR 3/1 a cathepsin D. Výsledky jsou ’&· uvedeny v Tabulce 2.

Tabulka 1: Hodnoty IC₅₀ jednotlivých inhibitorů stanovené pro wt HIV-1 PR.

Inhibitor	IC50
GB-1	6,1μΜ
GB-8	13,5 μΜ
GB-12	5,2 μΜ
GB-16	6,2 μΜ
GB-18	1,1 μΜ
GB-21	130 nM
GB-22	50 nM
GB-23	550 nM
GB-24	160 nM
GB-25	60 nM

Tabulka 2: Hodnoty K| a IC₅o pro inhibitor GB-16 a různé proteázy.

Typ rekombinantní proteasy	ic50	κ,
wt HIV-1 PR	6,2 μΜ	16,3 μΜ
wt HIV-2 PR	15,4 μΜ	7,4 μΜ
HIV-1 PR 3/1	13,4 μΜ	3,6 μΜ
cathepsin D	32,9 μΜ	17,2 μΜ

» «»

Příklad stanovení mechanismu účinku inhibitoru GB16 výnosem dle Lineweavera a Burka je znázorněn na obrázku 4. Proměřuje se závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu při různých koncentracích inhibitoru (zde 0 a 15 μΜ). Měření bylo prováděno při pH 4_Z7; 37j°C v 0,1 M acetátovém pufru obsahujícím 0_;3M NaCI. Osa y: reciproká hodnota počáteční rychlosti enzymové reakce, osa x: reciproká hodnota koncentrace substrátu (v mol/dm³). Jedná se o kompetitivní inhibitor.

5. Testování inhibice infektivity viru HIV ve tkáňových kulturách

Blokování infektivity HIV ve tkáňových kulturách bylo testováno variantou publikované met§ódy publikovaného postupu (Benyoucef S, Hober D, Shen L, Ajana F, Gerard Y, Bocket-Mouton L, Mouton Y, Wattre P. (1996) Microbiol Immunol. 40(5), 381-8). Stručně, HeLa buňky byly transfekovány DNA kódující provirus pNL-43 viru HIV obsahující gen pro beta-galaktosidasu v místě virového genu nef v přítomnosti různých koncentrací testovaných sloučenin. Supernatant transfekovaných buněk byl použit k dalšímu kolu infekce reportérových buněk. Infektivita byla kvantifikována enzymovou aktivitou beta-galaktosidasy v infikovaných buňkách a infikované buňky byly vi$uali$ovány z použitím chromogenního substrátu beta-galaktosidasy (X-gal). Virové proteiny nově vytvořených virionů byly rozděleny pomocí SDS PAGE a imunochemicky višuali$ovány pomocí protilátek proti kapsidovému proteinu (Western blot).

Inhibiční vlastnosti sloučenin GB-8, GB-12 a GB-16 byly stanoveny pokusy ve tkáňových kulturách. HIV byl produkován v buňkách 293 T transfekovaných provirovým klonem NL 4-3 s použitím Chen-Okayamovy metjipdy. Všechny transfeckce byly prováděny v duplikátech. Médium bylo vyměňováno den po transfekci a do čerstvého média byly přidávány inhibitory proteasy rozpuštěné v DMSO. Kontrolní buňky byly inkubovány ve stejné koncentraci DMSO jako testované buňky Virová infektivita byla kvantifikována titrací buněčného supernatantu pomocí buněk TZM (reportérové buňky nesoucí ve svém genomu LTR promotor z HIV spojený s genem pro beta-galaktosidasu, aktivovaným Tat proteinem produkovaným virem). Dva dny po infekci byly reportérové buňky lysovány a fixovány směsí methanol/ aceton. Beta-galaktosidasová aktivita infikovaných buněk byla vijualilována modrým zbarvením po přidání chromogenního substrátu X-gal. Výsledek typického experimentu je ukázán na°0br. 5. Pokus dokazuje, že 10 μΜ roztok inhibitoru GB-16 snižuje infektivitu HIV na cca 27^% původní hodnoty; 100 μΜ roztok inhibitoru GB-8 byl zapotřebí pro srovnatelnou aktivitu.

Inhibitory GB-8, GB-12 a GB-16 blokují infektivitu viru. Buňky 293T byly transfekovány provirovým klonem NL4-3. Testované látky byly přidány do média v DMSO do finální koncentrace naznačené v obrázku 5. Buněčné supernatanty (obsahující virus) byly sklizeny 2 dny po transfekci a titrovány pomocí TZM buněk, které byly obarveny a infikované buňky byly spočítány. Kontrola bez inhibitoru byla položena rovná 100j%.

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný ve farmaceutickém průmyslu a v medicíně k léčbě AIDS.

'TV 2z>oU~ 462.

Claims (10)

1. Patentové nároky

   1.Inhibitory HIV proteasy obsahující klastry vybrané ze skupiny tvořené borany a/nebo karborany a/nebo metallakarborany, s počtem atomů boru v každém individuálním klastru 6 až 12, kde náboj každého individuálního boranového, karboranového, nebo metallakarboranového klastru je 0, -1 nebo -2, boranové, karboranové, nebo metallakarboranové klastry jsou periferně substituovány skupinami zvýšujícími interakční energii mezi HIV proteasou a inhibitorem, přičemž počet boranových, karboranových, nebo metallakarboranových klastrů v molekule inhibitoru je 1 až 9, přičemž karboranové klastry v metallakarboranových inhibitorech jsou koordinovány na atom přechodného kovu, vybraného ze skupiny tvořené Co,

   Fe, Ni a Ru,
2. 2.Inhibitory HIV proteasy podle nároku 1 obsahující klastry v nichž jsou přítomné další heteroatomy, které jsou vybrány ze skupiny tvořené N, P, Si, Ge, Sn, S.
3. 3. Inhibitory HIV proteasy podle nároku 1 a 2 obecného vzorce (l>

   (R¹)_nA(—X—Y-—Z)_m (U, kde A je klastrový anion ΒιοΗ,/-’, Βι,Η,Λ¹, CB6H7^H, CB7H₈ ^h,CB7H8^h, CB9H₁₀ ^h, CB,oH,o^h, CBnH,?-’, SiB„Hi2^H, SÍBuH,,¹²-’, SnB,,H,?²->, GeBnH,,'²’¹, 7,8C2B₉H,2^H, 7,9-C2B3H12^h,SÍ2B_i0H₁₂ ^h, [(1 ,2-C2B9H„)2-3-Co(III)]⁽-’, [(U-CjBgHuJj-SCo(lll)]^|-⁾,[(C2B9Hi1)Co(lll)(C₂B₈H₁o)|Co(IIIKC2B₉H„)]^<2-⁾,[(1,2-C2B9H1l)2-3-Fe(lll)]⁽-¹, [(1,7-C2B₉H„)2-3-Fe(lIl)]^H, [(1,2-C2B9H,,>2-3-Ni(l11)]^H, [1 -(C5H₅)Fe(l11)(CB«H,,)]^H, [(C5H5)Co(III)(1 ,2-CB10H,[(C5H5)Ni(IIIX1 ,2-CB,0H„)]^h, [(C2B_1oH,₂)2M(Ill)]^H nebo neutrální klastr 1,2-C2B₈Hio, 1,6-C2B₈Hio,1,1O-C₂B_eHio, 1,2-C2BioHi2,1,7-C2B10H12, 1,12-C2BioHi2, P2B10H-10, SB11H11, NB11H11, PB11H-11, [[(C5H5XI ,2C₂BgHn)-Co(lll)], [(C₅H₅)(1 ,7-C2B₉Hii)-3-Co(III)], [(CsHsXV-CzBgH^-FeíllQL [(CsHsXIJ-CzBgHnXFeíllDj.KCsHsJíl^-CzBgHiONiílll)], [(C₅H₅)Fe(IIXC₃B₈H₁₁)], [(CsHsjRuOlXCaBeHu)], [(CaBeHuh-Feíll)], [(C₅H₅)Fe(IIXC3B₇H₁₀)], (1 (C5H₅)Fe(ll)(PC₂B₈H₁₀)], [(CzBgHnXCoílllXCaBeHn)], [(C₂B₁₀H₁₂)-M(l ll)(C₅H₅)] kde substituenty obecného vzorce —X—Y—Z a R¹ jsou navázány na atomech boru, uhlíku nebo heteroatomech klastru A, kde j je 1 až 3,

   M značí Fe, Co, Ni, Ru a kde R¹ je stejné nebo různé a je vybráno ze skupiny obsahující vodík, halogen, methyl, hydroxy, fenyl, fenylen, thiol, methoxy a trifluoromethoxy skupinu, m je 0,1 a 2, n je 0 až 12,

   X je různé nebo stejné a značí skupinu —0—, —C(=0)—, —CH₂—, —N(R³)—, —P(R³)—, —S —, Ci až C-io alkandiyl, —O(CH2CH2O)_q—, fenylen substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, v případě metallakarboranů typu [(1,2-θ2Β₉Η₁₁)₂-3-Μ(Ι1Ι)]^(-) je dále X můstkově vázaná skupina >S, >N, >P, >0₂P, >0₂P(=0), fenylen substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, ethandiyl substituovaný nezávisle O až 3 substituenty R¹⁴, na níž je připojen substituent Y , kde M má vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde q nabývá hodnot O až 12, kde R³ je stejné nebo různé a značí vodík, Ci až Ce alkyl substituovaný O až 3 R¹⁰,

   C₂ až Cs alkenyl substituovaný O až 3 R¹⁰, C2 až Ce alkynyl substituovaný O až 3 R¹⁰, a C3 až Cu karbocyklický systém substituovaný O až 5 R¹⁰ nebo O až 5 R¹¹, nebo 5až lOfčlenný heterocyklus obsahující obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané ze skupiny tvořené z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný O až 2 R¹¹, kde R¹⁰ je stejné nebo různé a značí ketoskupinu, halogen, kyanoskupinu, —CH2N(R⁷)(R⁸), — N(R⁷)(R⁸), — C(=O)O(R⁷), — C(=O)(R⁵), —0C(=0) (R⁷), —0(R⁷), C2 až C₆ alkoxyalkyl, —S(=O)_k(R⁷), —NHC(=NH)NH(R⁷), —C(=NH)NH(R⁷), —C(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)C(=O)(R⁷), =N—0(R⁸), —N(R⁸)C(=O)O(R⁸), —OC(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)C(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)S(=O)₂N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)S(=O)2(R⁷), —S(=O)2N(R⁷)(R⁸), Cl až C₄ alkyl, C₂ až C₄ alkenyl, C₃ až C_w cykloalkyl, C3 až C₆ cykloalkylmethyl, fenylmethyl, fenethyl, fenoxy, fenylmethoxy, nitro, C₇ažCio arylalkyl, —C(=0)—NH(OH), — C(=0)—NH(NH₂), — B(OH)₂, sulfonamid, formyl, C₃ až C₆ cykloalkoxy, až C₄ alkyl substituovaný — N(R⁷)(R⁸), Ci až C4 hydroxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, Ci až C4 haloalkyl, Ci až C4 haloalkoxy, Ci až C4 alkoxykarbonyl, Ci až C4 alkylkarbonyloxy, Ci až C4 alkylkarbonyl, C1 až C4 alkylkarbonylamino, —OCH2C(=O)O(R⁷), 2-(1morfolino)ethoxy, azido, — C(R⁸)=N—O(R⁸), C5 až C₁₄ karbocyklický zbytek substituovaný 0 až 5 R¹¹, nebo 5- až 10-členný heterocyklus obsahující /^bsahujtef 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 2 R¹¹, kde k nabývá hodnot 0, 1 a 2 kde R⁷ je stejné nebo různé a značí vodík, fenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, fenylmethyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, Ci až C3 alkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C2 až C4 alkenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C1 až C3 alkylkarbonyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C1 až C3 alkoxykarbonyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C-i až C6 alkylaminokarbonyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, C3 až C₆ alkoxyalkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁴, libovolnou chránící skupinu na aminoskupině, pokud je R⁷ vázán na atom dusíku, nebo libovolnou chránící skupinu na hydroxyskupině, pokud je R⁷ vázán na atom kyslíku, kde R¹⁴ je různé nebo stejné a značí

   H, keto, halogen, kyano, —CH2NH2, —NH₂, —C(=O)OH, —OC(=O)(C₁ až C₃ alkyl), —OH, C₂ až C₆ alkoxyalkyl, —C(=O)NH₂, —OC(=O)NH₂, —NHC(=O)NH₂, —S(=O)₂NH₂, Ci až C₄ alkyl, C₂ až C₄ alkenyl, C₃ až C10 cykloalkyl, C₃ až C₆ cykloalkylmethyl, benzyl, fenethyl, fenoxy, benzyloxy, nitro, C7 až C10 arylalkyl, —C(=O)—NH(OH), —C(=O)—NH(NH₂), —B(OH)₂, C₃ až C₆ cykloalkoxy,

   C-ι až C₄ alkyl substituovaný—NH₂, Ci až C₄ hydroxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, C1 až C₄ haloalkyl, C1 až C₄ haloalkoxy, C1 až C₄ alkoxykarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonyloxy, C1 až C₄ alkylkarbonyl, C1 až C₄ alkylkarbonylamino, —OCH₂C(=O)OH, 2-(1-morfolino)ethoxy, azido, aryl(Ci až C₃ alkyl), C₅ až C₁₄ karbocyklický zbytek, 5- až lóíclenný heterocyklus obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 3 R⁶, kde R⁶, pokud je substituentem na uhlíku, je různé nebo stejné a značí

   - 28fenyl, fenylmethyl, fenethyl, fenoxy, fenylmethoxy, halogen, hydroxy, nitro, kyano, Ci až C₄ alkyl, C₃ až C₆ cykloalkyl, C₃ až C₆ cykloalkylmethyl, C₇ až C₁₀ arylalkyl, Ci až C₄ alkoxy,—C(=O)OH, , — C(=O)—NH(OH), — C(=O)—NH(NH₂), — B(OH)₂, sulfonamid, formyl, C₃ až C₆ cykloalkoxy, —O(R⁷), Ci až C4 alkyl substituovaný —N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), C2 až C₆ alkoxyalkyl, Ci až C₄ hydroxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, Ci až C₄ haloalkyl, Ci až C₄ haloalkoxy, Ci až C₄ alkoxykarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonyloxy, Ci až C₄ alkylkarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonylamino, — S(=O)_k(R⁷), — S(=O)2N(R⁷)(R⁸), —NHS(=O)2(R⁸), —OCH₂C(=O)OH, 2-(1-morfolino)ethoxy, —C(R⁸)=N—O(R⁸),

   5- až lofclenný heterocyklus obsahující bbsahujíef 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 3 R⁹, C₃ až C₄ uhlíkatý řetězec jehož druhý konec je připojený k vedlejšímu atomu uhlíku na kruhu a vytváří 5- nebo 6-členný kruh, tento 5- nebo 6-jčlenný kruh může být substituovaný na některém z alifatických uhlíků skupinami halogen, Ci až C₄ alkyl, Ci až C₄ alkoxy, hydroxy, —N(R⁷)(R⁸), nebo pokud je R⁶ připojen k nasycenému atomu uhlíku, R⁶ může být =0 nebo =S, kde k a R⁷ má vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R⁸ je stejné nebo různé a značí vodík, hydroxy, trifluoromethyl, Ci až C₆ alkoxy, C₂ až C₆ alkenyl, fenylmethyl, amino, Ci až C₆ alkyl substituovaný O až 3 skupinami vybranými nezávisle z hydroxy, Ci až C₄ alkoxy, halogen, amino, libovolnou chránící skupinu na aminoskupině, pokud je R⁸ vázán na atom dusíku, nebo libovolnou chránící skupinu na hydroxyskupině, pokud je R⁸ vázán na atom kyslíku, kde R⁹ je různé nebo stejné a značí vodík nebo methyl, kde R⁸, pokud je substituentem na dusíku, je různé nebo stejné a značí fenyl, fenylmethyl, fenethyl, hydroxy, Ci až C4 hydroxyalkyl, Ci až C4 alkoxy, Ci až C4 alkyl, C3 až Ce cykloalkyl, C3 až C6 cykloalkylmethyl, —CH2N(R⁷)(R⁸), — N(R⁷)(R⁸), C2 až C6 alkoxyalkyl, Ci až C₄ haloalkyl, Ci až C₄ alkoxykarbonyl, — C(=O)OH, Ci až C₄ alkylkarbonyloxy, Ci až C₄ alkylkarbonyl C(R⁸)=N—0(R⁸), kde R⁷ a R⁸ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam,

   R⁷ a R⁸ mohou být alternativně připojeny tak, aby tvořily —(CH₂)₄—, —(CH₂)s—, —CH₂CH₂N(R⁹)CH₂CH2— nebo — CH₂CH₂OCH₂CH2—, kde R⁵ je různé nebo stejné a značí vodík, halogen, fenylmethyl, fenethyl,, —C(=O)—NH(OH), —C(=O)—NH(NH₂), —B(OH)₂, sulfonamid, azido, formyl, fenoxy, fenylmethoxy, nitro, kyano, -CH₂N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), —OCH₂C(=O)OH, —C(=O)O(R⁷), —OC(=O)(R⁷), —O(R⁷), C2 až C6 alkoxyalkyl, —S(=O)k(R⁷), — NHC(=NH)NH(R⁷), —C(=NH)NH(R⁷), —C(=O)N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)C(=O)(R⁷), =N—O(R⁸), —N(R⁸)C(=O)O(R⁸), OC(=O)N(R⁷)(R⁸), — N(R⁷)C(—O)N(R⁷)(R⁸), — C(R⁸)=N—O(R⁸), -N(R⁸)S(=O)2N(R⁷)(R⁸), —N(R⁸)S(=O)2(R⁷), —S(=O)2N(R⁷)(R⁸), Ci až C4 alkyl, C2 až C4 alkenyl, C3 až C10 cykloalkyl, C3 až C6 cykloalkylmethyl, C7 až C10 arylalkyl, C3 až Ce cykloalkoxy, Ci až C4 alkyl substituovaný—N(R⁷)(R⁸), Ci až C4 hydroxyalkyl, Ci až C₄ haloalkyl, Ci až C₄ haloalkoxy, Ci až C₄ alkoxykarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonyloxy, Ci až C₄ alkylkarbonyl, Ci až C₄ alkylkarbonylamino, 2-(1morfolino)ethoxy, —(Ci až C₃ alkyl)aryl substituovaný 0 až 2 R⁶, C5 až C₁₄ karbocyklický zbytek substituovaný 0 až 3 R⁸, 5- až 1 Ójclenný heterocyklus obsahující obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 3 R⁸, kde k, R⁸, R⁷ a R⁸ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R¹¹, pokud je substituentem na uhlíku, je různé nebo stejné a značí fenethyl, fenoxy, C₃ až C10 cykloalkyl, C₃ až C₆ cykloalkylmethyl, C₇ až C10 arylalkyl, C₂ až Ce alkoxyalkyl, methylendioxy, ethylendioxy, C1 až C₄ alkylkarbonyloxy, — NHS(=O)₂(R⁸), fenylmethoxy, halogen, 2-(1-morfolino)ethoxy, —C(=O)O(R⁷), —C(=O)—NH(OH), —C(=O)—NH(NH₂), —B(OH)_2i —C(=O)N(R⁷)N(R⁷)(R⁸), kyano, sulfonamid, formyl, C3—C6 cykloalkoxy, C1 až C4 haloalkyl, C1 až C4 haloalkoxy, C2 až C4 haloalkenyl, C2 až C4 haloalkynyl, —N(R⁷)(R⁸), —C(R⁸)=N— O(R⁸), —NO2i—O(R⁷), —N(R¹²)(R¹³), - S(=O)k(R⁷), -S(=O)kN(R⁷)(R⁸), -C(=O)N(R⁷)(R⁸), —OC(=O)N(R⁷)(R⁸), —C(=O)(R⁵), —OC(=O)(R⁵), —OC(=O)O(R⁷), fenyl, — C(=O)N(R⁷)—(C1 až C₄ alkyl), N(R⁷)(R⁸), —C(=O)N(R¹²)(R¹³), — C(=O)—(Ci až C₄ alkyl)—N(R⁷)C(=O)O(R⁷),

   Ci až C₄ alkoxy substituovaný 0 až 4 skupinami nezávisle vybranými ze skupin :

   ”30 —R⁵, C₃ až C₆ cykloalkyl, —C(=O)O(R⁷), —C(=O)N(R⁷)(R⁸), — N(R⁷)(R⁸) nebo hydroxyl,

   Ci až C4 alkyl substituovaný 0 až 4 skupinami nezávisle vybranými ze skupin:

   —R⁵, =N(R⁸), =NN(R⁷)C(=O)N(R⁷)(R⁸) nebo-N(R⁷)(R⁸),

   C₂ až C₄ alkenyl substituovaný 0 až 4 R⁵, C₂ až C₄ alkynyl substituovaný 0 až 4 R⁵, 5- až 6/ýlenný heterocyklus obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, C3 až C4 uhlíkatý řetězec jehož druhý konec je připojený k vedlejšímu atomu uhlíku na kruhu a vytváří 5- nebo 6-členný kruh, tento 5- nebo 6členný kruh může být substituovaný na některém z alifatických uhlíků skupinami halogen, C1 až C4 alkyl, C1 až C4 alkoxy, hydroxy, —N(R⁷)(R⁸), nebo pokud je R¹¹ připojen k nasycenému atomu uhlíku, R¹¹ může být =0 nebo =S, kde k, R⁵, R⁷ a R⁸ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R¹² je různé nebo stejné a značí vodík nebo C-ι až C₃ alkyl, kde R¹³ je různé nebo stejné a značí —C(=O)N(R⁷)(R⁸), —C(=O)N(R⁷)NH(R⁸), —C(=O)C(R⁵)2N(R⁷)(R⁸), — C(=O)C(R⁵)2N(R⁷)NH(R⁸), —C(=O)C(R⁵)2N(R⁷)C(=O)O(R⁷), —C(=O)H, — C(=0)(R⁵), -0(=0)-((^ až C4 alkyl)—N(R⁷)(R⁸), — C(=0)—(0_Ί až C₄ alkyl)—, N(R⁷)C(=O)O(R⁷) nebo 1 až 3 aminokyseliny spojené amidovými vazbami k atomu dusíku pomocí karboxylových skupin, kde R⁵, R⁷ a R⁸ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R¹¹, pokud je substituentem na dusíku, je různé nebo stejné a značí fenyl, fenylmethyl, fenethyl, hydroxyl, C1 až C₄ hydroxyalkyl, C1 až C₄ alkoxy, Ci až

   C4 alkyl, C3 až C₆ cykloalkyl, 0₃ až C₆ cykloalkylmethyl, —CH₂N(R⁷)(R⁸), —N(R⁷)(R⁸), C₂ až C₆ alkoxyalkyl, C1 až C₄ haloalkyl, C1 až C₄ alkoxykarbonyl, —C(=O)OH, C1 až C4 alkylkarbonyloxy, C1 až C4 alkylkarbonyl nebo —C(R⁸)=N— -0(R⁸), kde R⁷ a R⁸ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde Y je různé nebo stejné a značí C! až C10 alkandiyl substituovaný O až 4 skupinami R²; oligoethylenglykol, nebo substituovaný oligoethylenglykol « ~

   - 31 substituovaný skupinou R²; nebo Ci až C10 cykloalkandiyl substituovaný 0 až 4 skupinami R²; —C(=O)—;

   —S(=O)_k—; —P(=O)(OR³)—X—i —P(=O)(N(R³)(R⁴))—X—;

   —P(=O)(N(R³)(R⁴))—X—; —C(=O)—X—; —(CF₂)_q—; fenylen substituovaný nezávisle 0 až 3 substituenty R¹⁴, kde k, q a R³ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R² je různé nebo stejné a značí vodík, —A, —X—A, —O(R⁷), — S(R⁷), —N(R⁷), —C(=O)O(R⁷), keto, Ci až Cg alkyl substituovaný 0 až 3 R⁵, C₂ až Cg alkenyl substituovaný 0 až 3 R⁵, fenyl, fenyl substituovaný nezávisle 0 až 5 substituenty R¹⁴, fenylen substituovaný nezávisle 0 až 3 substituenty R¹⁴, alkynyl substituovaný 0 až 3 R⁵, Ci až Cg perfluoroalkyl, C3 až C14 karbocyklus substituovaný 0 až 3 R⁵ nebo 0 až 3 R⁶, nebo 5 až až 10 až členný heterocyklus obsahující 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 2, oligoethylene glykol, R⁶, kde A, X, R⁵, R⁶, a R⁷ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde R⁴ je různé nebo stejné a značí vodík, C1 až Cg alkyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, C2 až Cg alkenyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, C2 až Cg alkynyl substituovaný 0 až 3 R¹⁰, a C₃ až Cu karbocyklický zbytek substituovaný 0 až 5 R¹⁰ nebo 0 až 5 R¹¹, nebo 5až 10-členný heterocyklus obsahující ^bsatíojlc^ 1 až 4 heteroatomy vybrané nezávisle z kyslíku, síry a dusíku, nebo týž heterocyklus substituovaný 0 až 2 R¹¹, kde R¹⁰ a R¹¹ mají vpředu v tomto nároku uvedený význam, kde Z je různé nebo stejné a značí vodík, A, —X—A, —C(=O)—X—Δ, —CH(OH)—X—A, — CH(NH₂)—X—A, NH-A, NH-CH(OH)CH-NH-A —S(=O)_k—X—A, —O—P(=O)(OR³)—X—A, — O—P(=O)(N(R³)(R⁴))—X—A, R³ a C-!

   až C10 alkyl substituovaný 0 až 4 skupinami R², kde k, A, X, R², R³ a R⁴ mají vpředu ýdomto náfektJ uvedený význam, a jejich farmaceuticky využitelné sole.
4. 4. Inhibitory HIV proteasy podle nároku 1 a 2 obecného vzorce ^ll)^ (R¹)_nA(—X—Z)_m QT) kde A, X ,Z a R¹ a m,n mají |zpřed^ v předcházejícím nároku uvedený význam,

   - 32 — a jejich farmaceuticky využitelné sole.
5. 5. Sloučeniny [(8-HO-(CH2-CH2O)2-1,2-C₂B₉H₁₀)(1^,,2^,-C₂B₉H₁₁)-3,3^,-Co]Na [8-(OH-1_I2-C₂B₉H₁o)(1^,,2’-C₂B₉H₁₁)-3_I3’-Co]Na.nH₂0 [8,8’-p-0-(C₂B₉Hio)2-3-Co]Na [(8-(HO)₂-P(O)O-1,2-C₂B₉H₁₀) -(1^,,2’-C₂B₉H₁₀)-3-Co] Na₂.nH₂O [(C₂B₉Hio)2-3-Fe]Na.4H₂0 [(1_I2-C₂B₉H₁o)-3,3^,-Co(1^,,2’-C₂B₉H₁₁)-8-(OCH₂CH2)20CH(C₆H₅)CH2(C₆H₅)(OH)]Na [(1 ,2-C₂B₉H₁₀)-3,3’-Co(1 ’,2’-C₂B₉Hh)-8- (OCH₂CH2)₂OCH(C₆H5)CH(C₆H₅)(OCH₂CH₂)₂-8”-0-(1 ”,2”-C₂B₉Hio)-3”,3”’-Co(1 .—- C₂B₉Hn)]Na₂ [(1,2-C₂B₉H₁₀)-3,3’-Co(1 2’-C₂B₉Hi₀)-8, 8’-p-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-8,8’-p-NH-(1 ”,2~

   - C₂B₉Hio)-3,3’-Co(1’”,2’”-C₂B₉Hio)] a [S.S-Co-íl^-CzBgHiijíe-l^-CzBgHio-ÍO-CHz-CHzj^-e-l^-CzBgHioXI'^'- C₂B₉Hii)-3,3'-Co]Na₂.
6. 6. Způsob přípravy sloučenin [(1,2-C₂B₉Hio)-3,3’-Co(1’,2’-C₂B₉Hii)-8-(OCH₂CH₂)₂OCH(C₆H5)CH2(C₆H₅)(OH)]Na a [(1 ,2-C₂B₉Hio)-3₁3’-Co(1^,,2’-C2B9H1i)-8(OCH2CH2)20CH(C6H5)CH(C6H5)(OCH2CH2)2-8”-0-(1”,2”-C2B9H1o)-3”i3”^,-Co(1’”,2’”C2B₉Hii)]Na₂ podle nároku 5, vyznačující se tím, že se na meso-hydrobenzoin deprotonizovaný jedním nebo dvěma ekvivalenty NaH působí za laboratorní teploty roztokem obsahujícím jeden nebo dva ekvivalenty 8-dioxan-kobalt bis(dikarbollidu) v toluenu.

   - 33
7. 7. Způsob přípravy sloučeniny [(1,2-C₂B₉H₁₀)-3,3’-Co(1 ’,2’-C₂B₉Hio)-8,8’-p-NH-CH₂CH(OH)-CH₂-8,8’-p-NH-(1”,2”-C₂B₉Hio)-3”,3^,”-Co(1”’,2”’-C₂B₉H₁o)] podle nároku 5, vyznačující se tím, že se na látku [(1,2^269^0)43,3-00(1’,2’-C₂B₉H₁₀)-8,8’-p-NH] deprotonizovanou NaH a rozpuštěnou v diethylenglykol dimethyletheru (DME) působí za laboratorní teploty epichlorhydrinem a produkt se získá purifikací reakční směsi na sílikagelové koloně.
8. 8. Způsob přípravy sloučeniny [S^-Co-Cr.Z^BgH^Xe-V^BgHio-ÍO-CHir CH₂)40-8-1,2-C₂B9Hio)(1',2'-C₂B9Hii)-3,3'-Co]Na₂ podle nároku 5, vyznačující se tím, že se na látku [(8-HO-(CH₂-CH₂O)₂-1,2-C₂B9H₁₀)(1^,,2^,-C₂B₉H₁₁)-3,3^,-Co]Me3NH deprotonizovanou NaH a rozpuštěnou v diethylenglykol dimethyletheru t(DME) působí za laboratorní teploty 8-dioxan-kobalt bis(dikarbollidem) a produkt se získá purifikací reakční směsi na sílikagelové koloně.
9. 9. Léčivo určené k léčbě AIDS vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden inhibitor HIV proteázy obecného vzorce-.(I), podle nároku 3 a/nebo obecného vzorce -(II); podle nároku 4.
10. 10. Léčivo určené k léčbě AIDS vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden z inibitorů HIV proteázy podle nároku 5.