CZ2003460A3 - Způsob zvýšení selektivity, snížení cytoxicity a dávky léčebného prostředku - Google Patents

Description

Oblast techniky

Popisuje se zvýšení specifity léčby onemocnění.

Podstata vynálezu

Onemocnění jater je stále těžko léčitelné, zvláště virová hepatitida B a C. Vyvinuly se různé přístupy léčby. V závislosti na použitém léčebném prostředku je možné léčbu klasifikovat jako přímou antivirovou léčbu, nepřímou antivirovou léčbu nebo kombinaci nepřímé a přímé antivirové léčby.

Přímá antivirová léčba ruší replikaci viru a/nebo jeho uspořádání. Je možné například použít analogy nukleosidů, aby se snížila replikace viru inhibicí virové reverzní transkriptázy. Analogy nukleosidů se však často spojují s vedlejšími účinky, které zahrnují anémii a/nebo neutropenii. U některých virových kmenů, když jsou dlouhodobě vystaveny působení analogů nukleosidů, dochází k vývoji rezistence na léky. Aby se předešlo alespoň některým problémům spojených s rezistencí na léčebný prostředek, aplikují se koktejly analogů nukleosidů. Koktejly analogů nukleosidů v typickém případě pouze oddalují vývoj rezistence vůči léčebnému prostředku. Dále analogy nukleosidů v obecném případě nevykazují selektivitu mezi replikací viru a replikací rychle se dělících buněk hostitelského organizmu, čímž vykazují podstatnou toxicitu vůči hostiteli.

, V jiném případě se mohou použít proteázové inhibitory, aby porušily správně sestavené virové proteiny. Proteázové inhibitory jsou vysoce specifické vůči virovým proteázám, čímž se v typickém případě předchází problémům spojených s omezenou selektivitou mezi replikací viru a replikací rychle se ···· ·· ·· ·· ···· • · · · · · · ·· ···· ·· ·· dělících hostitelských buněk. Dokonce při relativně nízkých dávkách se objevují vedlejší účinky, jako je nauzea, průjem, cukrovka a ledvinové kameny. Některé inhibitory proteáz jsou však ve vodných roztocích pouze slabě rozpustné, čímž se snižuje potencionální množství, které se dopraví k pacientovi. Ukázalo se, že rezistence virů vůči některým inhibitorům proteáz se objeví až po delší léčbě.

Nepřímá virová léčba se může použít ke stimulaci imunitního systému, aby se rozeznal virový antigen nebo se změnila rovnováha cytokinů imunitního systému vůči cytokinové odezvě typu 1, která zodpovídá za vznik imunitní odezvy proti buňkám infikovaných virem. K léčbě chronické hepatitidy C je možné použít například IFN-alfa. U některých pacientů léčených IFN-alfa po zastavení léčby dojde k recidivě onemocnění a u některých pacientů dojde během léčby k rozšíření virů. Dále aplikace . nízkých dávek IFN-alfa má tendenci způsobovat teplotu, bolesti hlavy, letargii, ztrátu chuti, úzkost a depresi a při aplikaci vysokých dávek potlačení kostní dřeně a nízký počet krevních buněk.

Přímé a nepřímé antivirové léčby nebo jejich kombinace lze dosáhnout společnou aplikací prostředku ribavirin s interferonem alfa a u mnoha pacientů dochází k podstatnému snížení zánětu a množství ALT v séru. Navzdory relativně lepší účinnosti léčby, stále přetrvávají různé problémy spojené s prostředkem ribavirin. Je známo, že při aplikaci vysokých dávek vnitrobuněčná fosforylace léčebného prostředku ribavirin, ke které dochází v erytrocytech, se podílí na hemolytické anémii. Fosforylovaný ribavirin se hromadí v erytrocytech, čímž se podstatně snižuje účinná dávka. Proto je nutné aplikovat relativně vyšší dávky, aby se dosáhlo vhodné dávky ribavirinu v hepatocytech.

Ačkoliv existují různá složení a způsoby vhodné pro cílenou léčbu onemocnění jater, všechny nebo skoro všechny způsoby vykazují jednu nebo více nevýhod. Proto je stále nutné »· · · vyvinout prostředky nebo způsoby vhodné pro cílenou léčbu uvedených onemocnění.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsoby a prostředky pro zvýšení selektivity léčebného prostředku. V obecném případě se léčebný prostředek kovalentně upravuje chránící skupinou.

V jednom výhodném provedení vynálezu se chránící skupina spojila s léčebným prostředkem prostřednictvím atomu dusíku, který se nachází v chránící skupině. Chránící skupina v upraveném léčebném prostředku snižuje metabolickou přeměnu a akumulaci léčebného prostředku v necílových buňkách a je ji možné v cílové buňce enzymaticky odstranit.

V jiném provedení vynálezu metabolická přeměna léčebného prostředku vyvolá poškození cílové buňky a dále se zjistilo, že chránící skupina zachycená k léčebnému prostředku prostřednictvím atomu dusíku, který je obsažen v chránící skupině, brání metabólické přeměně, přičemž V cílové buňce je možné uvedenou skupinu odštěpit. Následně se předpokládá, že úprava léčebného prostředku pomocí chránící skupiny a aplikace léčebného prostředku do systému, který obsahuje cílové buňky a buňky, které nejsou cíleny, snižuje toxicitu.

Je zřejmé, že metabolická přeměna léčebného prostředku v cílové buňce snižuje účinnou koncentraci léčebného prostředku a dále, že chránící skupina zachycena na léčebném prostředku prostřednictvím atomu dusíku, který je obsažen v chránící skupině, brání metabólické přeměně a že uvedenou skupinu je možné v cílové buňce z léčebného prostředku odštěpit. Předpokládá se, že úprava léčiva chránící skupinou může snižovat dávku. Také se předpokládá, že léčebný prostředek se aplikuje do systému, který obsahuje cílené a necílené buňky.

• · · · • · · · · • · · · ·· ··

Léčebné prostředky zahrnují karboxamidovou skupinu a zvláště zvažované léčebné prostředky jsou Ι-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamid a 2-^-D-ribofuranosyl-4-thiazolkarboxamid, které se mohou vyskytovat v jejich L-izoformě. Zatímco chránící skupina se neomezuje na určitou chemickou strukturu, je výhodné, aby chránící skupina obsahovala atom dusíku. Zvláště výhodná chránící skupina je skupina =NH. Předpokládané cílené buňky se neomezují na zvláštní typy buněk a mohou být infikovány virem nebo nemusí být infikovány virem nebo mohou být hyperproliferativní. Zvláště výhodné jsou virem infikované nebo hyperproliferativní hepatocyty a neurony a buňky, které nejsou cíleny a které zahrnují erytrocyty.

Termín „farmakologický účinek znamená libovolnou změnu metabolizmu, replikace, struktury nebo délky života buňky v systému, který obsahuje buňky. Tato změna může být způsobena systému.

Například inhibice polymerázového považuje za molekulou, která se přidá do anabolické, katabolické reakce nebo reakce typu, která je katalyzováha enzymem, se farmakologický účinek. Podobně depolymerizace tubulinu KinI kineziny se považuje za farmakoligický účinek. Naopak alosterická inhibice enzymu metabolitem produkovaná v buňce v systému se nepovažuje za farmakologický účinek, protože se do systému nepřidal alosterický inhibitor.

Dále termín „cílená buňka znamená buňku, ve které léčebný prostředek vykazuje farmakologický účinek. Hepatocyt infikovaný virem se považuje za cílenou buňku v případě léčebného prostředku ribavirin. Naopak termín „necílená buňka zahrnuje všechny buňky v systému obsahujícím buňky, které nejsou cílené.

Je obecně známo, že zatímco jisté léčebné prostředky vykazují v případě určitých buněk svůj farmakologický účinek (to jsou cílené buňky), necílené buňky mohou v podstatné měře metabolizovat tyto léčebné prostředky, což často vede • · · · • · • · • · · ·

• · · · · · ·«· · ♦ · · · • · · · · · · • · ···· ·· ·· k nežádoucím nespecifickým vedlejším účinkům. Zjistilo se, že takové požadované metabolické přeměně (to je v necílených buňkách nebo na jejich povrchu) je možné předejít úpravou léčebného prostředku pomocí chránící skupiny, kterou je možné v cílové buňce selektivně odstranit, čímž se zvýší selektivita farmakologického účinku léčebného prostředku, přičemž se také sníží cytotoxicita a dávka léčebného prostředku.

V jednom provedení vynálezu selektivita farmakologického účinku léčebného prostředku se zvýší způsobem, kde je možné jediným krokem zjistit, zda léčebný prostředek má požadovaný farmakologický účinek v případě cílené buňky. Léčebný prostředek se dále upravuje pomocí chránící skupiny, která je kovalentně zachycena na léčebném prostředku prostřednictvím atomu dusíku obsaženém v chránící skupině. Chránící skupina dále snižuje hromadění léčebného prostředku v necílené buňce a je možné ji v cílené buňce enzymaticky odstranit z léčebného prostředku. Termín „selektivita léčebného prostředku s ohledem na farmakologické účinky znamená schopnost léčebného prostředku produkovat farmakologický účinek v případě cílené buňky ve smyslu cíle léčby ve srovnání se schopností léčebného prostředku způsobit farmakologický účinek v případě necílených buněk ve smyslu nežádoucího vedlejšího účinku léčebného prostředku v necílené buňce.

Například selektivita farmakologického účinku l-p,D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamidu (Ribavin, struktura 1) se zvýšila kovalentním spojením skupiny =NH s léčebným prostředkem ribavirin za vzniku karboxamidinové skupiny. Je známo, že léčebný prostředek ribavirin vykazuje antivirové vlastnosti u hepatocytů infikovaných virem (popisuje se v publikaci Marcellin, P. and Benhamou J., Treatment of chronic viral hepatitis, Baillieres Clin Gastroenterol 1994 Jun., 8(2): 233-53). Je také známo, že léčebný prostředek ribavirin je v podstatné míře fosforylován už v erytrocytech na farmakologický aktivní formu ribavirin-fosforečnan ·<·· ·· ·· ·· ···· • · · · · · · · • · -· · · ·«·· · • · · · · ···· • ·· · ······ · · ·· (popisuje se například v publikaci Homma, M. et al., Highperformance liquid chromatographic determination of Ribavirin in whole blood to assess disposition in erythrocytes; Antimicrob Agents Chemother 1999 Nov., 43(11): 2716-9), které redukují selektivní farmakologický účinek. Překvapivě se zjistilo, že léčebný prostředek ribavirin upravený pomocí skupiny =NH (Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamidin, struktura 2) není v erytrocytech podstatně fosforylován nebo se fosforyluje pouze nepodstatně. Dále se zjistilo, že skupina =NH ve sloučenině Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamidin se může v hepatocytech specificky a enzymaticky odstranit za vzniku l-β,D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamidu.

struktura 1 struktura 2

Snížení selektivního hromadění upraveného léčebného prostředku ribavirin je zobrazeno na obrázku č. IA a 1B. Na obrázku č. IA erytrocyt 100 (necílená buňka) je v kontaktu s léčebným prostředkem ribavirin (R) . Ribavirin vstupuje do erytrocytu a je fosforylován za aktivního prostředku ribavirin-fosfát v erytrocytu. Podobně hepatocyt 110 v kontaktu s léčebným prostředkem ribavirin (R) vstupuje do hepatocytu a je vzniku farmakologický (R-P), který zůstává (cílená buňka) je fosforylován

Ribavirin za vzniku ···· • · • * · · ♦ · farmakologicky aktivního prostředku ribavirin-fosfát (R-P), který zůstává v hepatocytu.

Na obrázku č. 1B je erytrocyt 101 (necílená buňka) v kontaktu s upraveným léčebným prostředkem ribavirin (R*, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamidin). Upravený ribavirin vstupuje do erytrocytu a není však fosforylován a může proto opustit erytrocyt. Podobně hepatocyt 111 (cílená buňka) je v kontaktu s upraveným léčebným prostředkem ribavirin (R*). Ribavirin vstupuje do hepatocytu a enzymaticky se odstraňuje aminoskupina za vzniku ribavirinu, který se následně fosforyluje za vzniku ribavirinu (R-P)_z jenž zůstává v hepatocytu.

V jiném provedení vynálezu existuje mimo ribavinu řada léčebných prostředků, které jsou vhodné pro použití vynálezu. V obecném případě vhodné léčebné prostředky zahrnují léky, které se metabolizují, aktivují a/nebo deaktivují v buňce, která není cílenou buňkou, a zvláště vhodné jsou léčebné prostředky, které zahrnují nukleosidy, nukleotidy, analogy nukleosidů a nukleotidů. Například thiazofurin (2^-D-ribofuranosyl-4-thiazolkarboxamid) je analog nukleosidu s karboxamidovou skupinou, kterou je snadné upravit skupinou =NH za vzniku odpovídajícího karboxamidinu. V jiném příkladu další léčebný prostředek obsahuje nukleosid uráčil nebo analog nukleosidu 5'-fluorouracil (5'-FU).

Podle vynálezu chránící skupina se nemusí omezovat pouze na skupinu =NH, ale může také zahrnovat různé primární a sekundární aminy, pokud se může chránící skupina kovalentně spojovat s léčebným prostředkem prostřednictvím atomu dusíku. Termín „chránící skupina znamená chemickou skupinu, která se může kovalentně zachytit na léčebný prostředek a blokuje alespoň jednu metabolickou přeměnu léčebného prostředku. Termín „metabolická přeměna léčebného prostředku znamená libovolnou vnitrobuněčnou a/nebo extrabuněčnou chemickou změnu léčebného prostředku, ke které dochází při metabolizmu v buňce • ·

Zvláště je z léčebného nebo v buněčném systému a zvláště zahrnuje enzymatický rozklad (například oxidaci, hydrolytické štěpení) a úpravu enzymem (například glykosylaci, fosforylaci).

V obecném případě se předpokládá, že vhodné chránící skupiny mají strukturu N(R_X) (R₂) nebo =NRi, kdy symboly R_x a R₂ jsou nezávisle na sobě vodík, lineární nebo větvený alkyl, alkenyl, alkynyl, arylkyl, aralkenyl nebo aralkynyl, aryl. Všechny uvedené deriváty mohou dále obsahovat heteroatomy zahrnující dusík, kyslík, síru nebo halogen.

výhodné, když jiné chránící skupiny se mohou prostředku enzymaticky odstranit a zvláště vhodné enzymy zahrnují aminohydrolázy specifické pro játra, jako jsou deaminázy (například adenozinová nebo cytosinová deamináza), jaterní deaminázy (například deamináza nikotinamidu) a jaterní transaminázy (glutamát-pyruvát transamináza).

Předpokládané chránící skupiny se mohou kovalentně vázat do různých poloh molekuly léčebného prostředku a zatímco je v obecném případě výhodné, že karboxamidová část předpokládaných léčebných prostředků se upravuje, je možné uvažovat mimo karboxamidové skupiny další polohy, zvláště pak karbonylové skupiny (jako je například karboxylová kyselina a karbonyl tvořený ketonem). Každá z karbonylových skupin v kruhové části uracilu nebo jeho analog 5'-FU může být upravena chránící skupinou.

Předpokládá se, že pokud je léčebný prostředek přítomen v necílené buňce, chránící skupina může deaktivovat léčebný prostředek nebo bránit následné aktivaci. Jestliže je například chránící skupina spojena s léčebným prostředkem v poloze, která je podstatná pro specifickou interakci léčebného prostředku s cílenou molekulou (například receptor nebo vazebné místo substrátu), pak chránící skupina může deaktivovat léčebný prostředek. Na druhou stranu chránící skupina se může spojit s léčebným prostředkem v poloze, která může bránit metabolické aktivaci.

• A A A A A* A A AA AAA· • · A A A A A A A A ·· A A A A A A A A • A AAA A A A A

AAA A AA AAAA AA A A

V závislosti na chemické podstatě léčebného prostředku a/nebo chránící skupiny se předpokládá, že chránící skupina může nahradit funkční skupinu nebo substituent nebo že chránící skupina je zachycena na funkční skupině nebo substituentu. Například v případě, že léčebný prostředek je ribavirin a chránící skupina je skupina =NH, atom kyslíku v karboxamidové skupině ribavirinu je nahrazen skupinou =NH. Na druhou stranu, jestliže léčebný prostředek obsahuje nukleofilní skupinu (například -0) a chránící skupina obsahuje sekundární amin s vhodnou odstupující skupinou, sekundární amin se může zachytit na nukleofilní skupině.

S ohledem na krok úpravy léčebného prostředku se předpokládá, že úprava může zahrnovat organosyntetickou úpravu, enzymatickou úpravu nebo novou syntézu za vzniku upraveného léčebného prostředku. Jestliže například léčebný prostředek obsahuje aktivovanou karbonylovou funkci, amidace atomu karbonylu je možné dosáhnout vzájemnou výměnou nukleofilů. V jiném případě zvláště když léčebný prostředek má řadu reaktivních skupin, které se liší od skupiny, na které je zachycena chránící skupina, je ekonomicky výhodnější použít novou syntézu, při které vzniká upravený léčebný prostředek. Zvláště se předpokládá, že vhodné léčebné prostředky se mohou také enzymaticky upravovat, zavedením chránící skupiny do léčebného prostředku reakcí, která využívá chránící skupinu a léčebný prostředek jako enzymatický substrát. Jestliže je to možné, je výhodné, aby enzym vhodný pro úpravu se získal z cílové buňky (například z alogenního nebo xenogenního zdroje nebo z rekombinantního zdroje, který exprimuje gen kódující enzym).

Je výhodné, že v závislosti na typu necílené buňky a chemické podstaty léčebného prostředku a/nebo chránící skupiny, je možné zabránit hromadění léčebného prostředku v nedlených buňkách použitím alespoň jednoho mechanizmu. Tyto mechanizmy zahrnují snížení pohlcení prostřednictvím transportérů, které jsou specifické pro léčebný prostředek, zeslabení metabolické přeměny na formy, které zůstanou zachovány (to je například způsobeno dalším nebo novým elektrickým nábojem, změnou hydrofobičnosti nebo změnou při rozeznávání expotérem) nebo zesílením exportu z nedlených buněk je možné zabránit hromadění léčebného prostředku (například začlenění sekrečního signálu do chránící skupiny). Předpokládá se například, že v případě, že léčebný prostředek je analog nukleosidu a nedlené buňky mají nukleosidový transportér, který selektivně importuje nukleosidy bez lipofilické části, pak přidání lipofilické skupiny jako chránící skupiny k léčebnému prostředku může bránit hromadění léčebného prostředku. V jiném příkladu se zvažuje, že fosforylace (a současné hromadění) různých nukleosidů v erytrocytech může bránit přeměně karboxamidové skupiny na karboxamidinovou skupinu.

Co se týče enzymatického odstranění chránící skupiny v cílené buňce, předpokládá se, že záleží na typu cílové buňky, chránící skupiny a léčebného prostředku. Schopnost enzymatického odstranění může podstatně kolísat. Enzymatické odstranění se může provést enzymy z různých tříd, které zahrnují hydrolázy, transferázy, lyázy a oxidoreduktázy a zvláště výhodnou podtřídou jsou deaminázy adenozinu a cytosinu, arginázy, transaminázy a arylamidázy. Dále je výhodné, když uvažované enzymy odstranění chránící skupiny se v cílových buňkách. Avšak v jiném provedení vynálezu se popisují enzymy exprimované v buňkách, které nejsou cílovými buňkami, pokud není exprese uvedených enzymů rozšířena- do všech buněk v systému. Dále je vhodné, aby se uvažované enzymy přirozeně exprimovaly (to znamená, že nejsou rekombinantní) v cílených buňkách za normálních a/nebo patologických podmínek. Je známo, například, že glutamin-pyruvátová transamináza se podstatně exprimuje s relativně vysokou vhodné pro enzymatické mohou exprimovat pouze

selektivitou v jaterních buňkách a může proto být vhodným enzymem při odstranění chránící skupiny. V jiném případě je známo, že deamináza cytosinu se exprimuje v relativně velkém množství v buňkách karcinomu tlustého střeva, ale v normálních buňkách tlustého střeva se exprimuje pouze v malém množství nebo vůbec.

V jiném provedení vynálezu se cytotoxicita léčebného prostředku vůči necíleným buňkám zeslabuje způsobem, že metabolická přeměna léčebného prostředku v necílené buňce vyvolává poškození nedlené buňky. Termín „cytotoxicita znamená nežádoucí farmakologický účinek na nedlenou buňku, kde požadovaný farmakologický účinek zvláště zahrnuje inhibici replikace, energii-metabolizmus nebo zahrnuje odumírání buněk. V dalším kroku se léčebný prostředek upravuje chránící skupinou, kde chránící skupina se kovalentně váže na léčebný prostředek prostřednictvím atomu dusíku v chránící skupině a kde chránící skupina snižuje metabolickou přeměnu léčebného prostředku v necílové buňce a v dlené buňce se enzymaticky odštěpuje z léčebného prostředku. V dalším kroku se léčebný prostředek aplikuje do systému, který obsahuje dlenou buňku a nedlenou buňku, kde chránící skupina se kovalentně spojuje s léčebným prostředkem.

Při snížení toxicity léčebného prostředku v nedlené buňce metabolická přeměna zahrnuje fosforylaci léčebného prostředku na odpovídající léčebný prostředek-fosforečnan v erytrocytu. Je známo, že fosforylace antivirového léčebného prostředku ribavirin v různých buňkách produkuje farmakologicky aktivní ribavirin-5'-monofosforečnan (popisuje se například v publikaci Homma, M. et al., High-performance liquid chromatographic determination of Ribavirin in whole blood to in erythrocytes, Antimicrob Agents

43(11):2716-9), přičemž sloučenina se dehydrogenázy inosinmonofosforečnanu assess disposition Chemother 1999 Nov., podílí na inhibici (IMPDH). Prostředek ribavirin-5'-monofosforečnan má výrazný ·«·· • to · · · · · · · to · · · · • · ·· to··· • · ··· ···· · • · ··· · ··· ··*· ······ >· 9· cytotoxický účinek v případě erytrocytů (popisuje se v publikaci De Franceschi, et al., Hemolytic anemia induced ribavirin therapy in patients with chronic hepatitis C virus infection: role of membrane oxidative damage, Hepatology 2000 Apr. 31(4): 997-1004) a následně se ukazuje, že prevence nebo zeslabení tvorby prostředku ribavirin-5'-monofosforečnan v erytrocytech bude podstatně zeslabovat cytotoxicitu ribavirinu.

Je výhodné, že se zvažují různé metabolické přeměny léčebného prostředku v necílené buňce, které jsou odlišné od fosforylace. Tyto způsoby se nazývají oxidace, redukce, hydrolytické štěpení kovalentní vazby u léčebného prostředku, adice nebo odstranění zachycených skupin a reakce, které otevírají kruh. Předpokládá se, že v případě, že necílená buňka je hepatocyt, metabolická přeměna může zahrnovat různé enzymatické detoxifikace nebo rozpouštěcí reakce, které probíhají v játrech (například glykosylace, oxidace zprostředkovaná cytochromem P₄₅₀, atd.). V jiném případě metabolické přeměny mohou zahrnovat fosfatázovou nebo esterázovou aktivitu.

V závislosti na typu metabolické přeměny uvedená přeměna může být omezena na cílovou buňku jednoho typu, ale může k ní také docházet u více než jednoho buněčného typu. Když necílová buňka vykazuje relativně vysokou rychlost syntézy nukleové kyseliny a metabolická přeměna je zprostředkována enzymem, který se podílí na syntéze nukleové kyseliny, pak různé typy rychle rostoucích buněk mohou vykazovat metabolickou přeměnu. Na druhé straně metabolická přeměna může být také místně omezena dosažitelností léčebného prostředku určitou buňkou nebo orgány.

Je výhodné použití různých dobře známých laboratorních postupů pro rozeznávání a/nebo ověření, že chránící skupiny kovalentnš vázané na léčebném prostředku zeslabují metabolickou přeměnu v cílové buňce. V případě, že necílené ©♦·· «« ·« • · I © · · 4 ·· ·· buňky se kultivují in vitro, předpokládá se, že necílené buňky se mohou inkubovat s odpovídajícími radioaktivně značeným léčebným prostředkem a metabolity radioaktivně značených léčebných prostředků se pak mohou stanovit různými způsoby, které zahrnují imunologické testy, chromatografií na tenké vrstvě nebo GC-MS. V jiném případě, kdy se necílené buňky nacházejí u savců, biopsie tkáně může poskytnout dostatečný vzorek pro izolaci nebo identifikaci metabolitů aplikovaného léčebného prostředku.

Dále se předpokládá, že typ poškození necílové buňky se může podstatně lišit a může se pohybovat v rozsahu od zpomalení buněčného metabolizmu v případě necílených buněk až po jejich odumírání. V případě, že metabolická přeměna produkuje inhibitor enzymu, který se účastní glykolytické dráhy, energie v případě necílené buňky se může alespoň částečně získat z této dráhy. V případě, že proběhne metabolická přeměna léčebného prostředku za vzniku inhibitoru enzymu relativně pomalou rychlostí, zesílení exprese enzymu ovlivněného inhibitorem může skoro zcela kompenzovat redukci počtu aktivních míst. Na druhou stranu v případě, že při metabolické přeměně dochází ke vzniku radikálů, peroxidace lipidů může vést k vážnému poškození membrány a následnému odumírání buněk.

Dále se předpokládá, že poškození vzniklé metabolickou přeměnou léčebného prostředku může být způsobeno přímo nebo nepřímo. V případě, že při metabolické přeměně dochází k zablokování enzymu inhibitorem, pak poškození se považuje za přímé. Na druhou stranu v případě, že metabolická přeměna produkuje meziprodukty, které po následné vnitrobuněčné nebo extrabuněčné úpravě se dále mění na inhibitor enzymu, pak se poškození považuje za nepřímé.

Co se týče aplikace léčebného prostředku do systému, předpokládá se, že vhodná léčiva se budou aplikovat ve formě libovolného vhodného léčebného prostředku a podle libovolného ···· ♦ · ·· * * · · · • · · 4 ♦ · · ♦ · • · · · • ·· »··· ·· ·«·· » · · 4 ·· ·· že vhodné léčebné jako farmaceuticky formy léčiv, odborníka je vhodného protokolu. Aplikace pak může probíhat orálně, parenterálně (subkutánní injekcí, intravenózní, intramuskulární, intrasternální injekcí nebo infúzí), inhalací spreje, rektálně, povrchově atd., přičemž formulace v jednotkové dávce obsahují běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans a pojivá. Předpokládá se, prostředky se mohou aplikovat orálně, přijatelné sole nebo v jiném případě intravenózně ve fyziologickém roztoku (který je například upraven tak, aby jeho pH bylo přibližně 7,2 až 7,5). Pro tyto účely je možné použít pufry, jako jsou fosforečnany, uhličitany nebo citráty.

V oboru je známo, že je vhodné upravit způsoby aplikace a režim dávek určitého léčebného prostředku za účelem zaručit farmakokinetiku sloučenin, která vykazuje pro pacienty nejlepší účinek.

U jistých forem farmaceutických aplikací se zvažují prokteré předcházejí léčebnému prostředku. Pro jednoduché rozeznat, jak je nutné upravit předpokládané pro-formy léčebných prostředků, aby se umožnilo zavedení aktivních látek do cílového místa hostitelského organizmu nebo pacienta. Odborník může také využít výhodných farmakokinetických parametrů pro-forem léčiv, aby se maximalizoval předpokládaný účinek sloučeniny v cílovém místě hostitelského organizmu nebo pacienta.

Dále je výhodné, že zvažované léčivo se může aplikovat samotné nebo v kombinaci s jinými farmakologicky aktivními činidly, které se mohou aplikovat odděleně nebo společně.

V případě, že se aplikují odděleně může aplikace probíhat současně nebo odděleně v libovolném pořadí. Předpokládaná farmakologicky aktivní činidla zahrnují antivirová činidla, jako jsou interferony (například interferon a a γ) , fungicidní činidla, jako je tolnaftát, Fungizone™, Lotrimin™, Mycelex™, Nystatin a Amphoteracin, činidla určená proti parazitům, jako je Mintezol™, Niclocide™, Vermox™ a Flagyl™, střevní činidla,

• ··	··*♦ •	•		• *	«	Φ » •	•
•	• ·	•	•		• ·	•	«
•	• •		• *·	• ····	•	' · »·	• · ··

jako je Immodium™, Lomotil™ a Phazyme™, anti-nádorová činidla, jako je interferon a a γ, Adriamycin™, Cytoxan™, Imuran™, Methotrexate™, Mithracin™, Tiazofurin™, Taxol™, dermatologická činidla, jako je Aclovate™, Cyclocort™, Denorex™, Florone™, Oxsoralen™, uhelný dehet a kyselina sylicylová, prostředky sloužící proti migréně, jako jsou steroidy a imunosupresivní činidla, která nejsou uvedena shora v textu a zahrnují Diprosone™, hydrokortizon, Floron™, Lidex™, Topicort a Valisone a metabolická činidla, jako je insulin a jiná léčiva, které nemusí spadat do uvedených kategorií, která například zahrnují cytokiny, jako je IL2, IL4, IL6, IL8, IL10 a IL12.

Co se týče dávky uvažovaných léčebných prostředků a farmakologicky aktivních činidel předpokládá se, že terapeuticky účinné množství bude záviset na léčeném stavu, jeho vážnosti a režimu léčby, farmakokinetice použitého činidla a pacientovi (zvíře nebo člověk), který je léčen. Dále se předpokládá, že jsou vhodné různé dávky. Je to 0,5 mg/kg a 0,1 mg/kg a méně, ale také dávky mezi 0,5 a 1,0 mg/kg a vyšší. Zatímco se v obecném případě preferuje, když systém obsahující cílovou buňku a necílovou buňku je savec (nejvýhodněji člověk), jsou také vhodné různé jiné systémy a zvláště vhodné jsou systémy zahrnující buňky in vitro a tkáňovou kulturu.

Co se týká léčebného prostředku, chránící skupiny, kroku upravující léčebný prostředek, cílené buňky a necílené buňky v uvažovaných metodách snížení toxicity léčebného prostředku vůči necílené buňce, aplikuje se stejná úvaha, jako se popisuje shora v textu.

Vynález dále popisuje snížení dávky léčebného prostředku v systému způsobem, kde metabolická přeměna buňce snižuje koncentraci který zahrnuje necílenou léčebného léčebného a cílenou prostředku v cílové prostředku v systému, buňku. V dalším kroku se léčivo upravuje chránící skupinou,

	• · · · •	•	♦ · •	• · • ·	•	·· •	• · · · •
	• ·	•	*	• ·	•	•	•
	•	•	•	•	•	•	• ·
• ·	•		·«	·«··		• ·	e ·

která se kovalentně váže na léčebný prostředek prostřednictvím atomu dusíku v chránící skupině a kde chránící skupina snižuje metabolickou přeměnu léčebného prostředku v necílové buňce. V následném kroku se léčebný prostředek aplikuje do systému, kde chránící skupina je kovalentně spojena s léčebným prostředkem a kde chránící skupina se enzymaticky odstranila z léčebného prostředku v cílené buňce.

V případě snížení dávky léčebného prostředku v systému se jako léčebný prostředek používá ribavirin, jako cílená buňka se používá hepatocyt infikovaný virem a necílenou buňkou je erytrocyt. Je dobře známo v oboru (jak se popisuje shora v textu), že ribavirin se metabolicky mění na ribavirinfosforečnan a že tento prostředek se uchovává v erytrocytech, čímž se podstatně snižuje koncentrace ribavirinu. Ribavirin se upravil kovalentním zachycením chránící skupiny =NH na uhlíku karboxamidu, čímž nahrazuje kyslík karbonylu v karboxamidu. Ukázalo se, že (popisuje se dále v textu) , že metabolická přeměna ribavirinu upraveného chránící skupinou =NH se v erytrocytech podstatně snižuje. Dále se popisuje, že výhodná dávka jedné orální aplikace v případě člověka je 50 až 300 mg.

Je známo, že když se ribavirin aplikuje člověku orálně jako antivirové léčivo, je vhodné použít alespoň jednu dávku v množství 600 až 1 200 mg. Počáteční koncentrace ribavirinu v systému (například u člověka) se pohybuje přibližně mezi 1 μΜ a několika stovkami mikromolů. Koncentrace ribavirinu se však v typickém případě v systému snižuje hromaděním do erytrocytů po dobu 24 hodin až na přibližně 85 a 50 % hodnoty počáteční koncentrace, což je způsobeno fosforylací ribavirinu v erytrocytech. Ukázalo se, že úprava ribavirinu na Ι-β-D-ribafuranosyl-1,2,4,triazol-3-karboxamid podstatně fosforylací ribavirinu (popisuje se dále v textu) předpokládá, že celá nebo alespoň ribavirinu je dostupná zeslabuje Proto se počáteční požadovaný většina pro koncentrace farmaceutický účinek v cílových buňkách. Následně se ···· · · * · · · · · · · • ···· · · · • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 999999 9 9 9 9 předpokládá, že úprava ribavirinu chránící skupinou se může použít při snížení dávky ribavirinu o přibližně 5 hmotnostních procent, výhodné je o přibližně 10 hmotnostních procent, výhodnější je snížení o 25 hmotnostních procent a nejvýhodnější je snížení o 50 hmotnostních procent.

Předpokládá se použití jiných dávek než je uvedené množství 600 až 1 200 mg. Je to 200 až 600 mg, 20 až 200 mg a méně. V případě, že se ribavirin použije jako imunomodulační léčebný prostředek, může být i nižší dávka, přibližně 100 až 300 mg, dostatečně účinná. Na druhou stranu v případě, že se požaduje podstatně vyšší koncentrace, zvažuje se množství 600 až 800 mg a více. Je výhodné, když v závislosti na určité metabolické přeměně, může snížení dávky významně kolísat. Například v případě, že metabolická přeměna je relativně rychlá a probíhá ve velkém množství buněk, zvažuje se snížení dávky mezi 25 a 80 hmotnostními procenty a více. Na druhou stranu v případě, že metabolická přeměna je relativně pomalá, zvažuje se snížení dávky mezi 25 a 5-ti hmotnostními procenty.

Co se týče léčebného prostředku, chránící skupiny, metabolické přeměny, úpravy léčebného prostředku, systému, aplikace, cílené buňky a necílené buňky v uvažovaných metodách snížení dávky léčebného prostředku aplikuje se stejná úvaha popsaná shora v textu.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázky č. 1A a IB schématicky znázorňují pohlcení a zadržení léčebného prostředku podle vynálezu. Na obrázku č. 1A erytrocyt 100 (necílená buňka) je v kontaktu s léčebným prostředkem ribavirin (R) . Ribavirin vstupuje do erytrocytu a je fosforylován za vzniku farmakologicky aktivního prostředku ribavirin-fosfát (R-P) , který zůstává v erytrocytu. Podobně hepatocyt 110 (cílená buňka) je v kontaktu s léčebným prostředkem ribavirin (R) . Ribavirin vstupuje do hepatocytu a • ·· · • · je fosforylován za vzniku farmakologicky aktivního prostředku ribavirin-fosfát (R-P), který zůstává v hepatocytu.

Na obrázku č. IB je erytrocyt 101 (necílená buňka) je v kontaktu s upraveným léčebným prostředkem ribavirin (R*, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamidin). Upravený ribavirin vstupuje do erytrocytu a není však fosforylován a může proto opustit erytrocyt. Podobně hepatocyt 111 (cílená buňka) je v kontaktu s upraveným léčebným prostředkem ribavirin (R*) . Ribavirin vstupuje do hepatocytu a enzymaticky se odstraňuje aminoskupina za vzniku ribavirinu, který se následně fosforyluje za vzniku sloučeniny ribavirin-fosforečnan (R-P), jenž zůstává v hepatocytu.

Obrázek č. 2 znázorňuje příklad schématu syntézy prostředku ribavirin.

Obrázek č. 3 znázorňuje schéma syntézy upraveného prostředku ribavirinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Syntéza ribavirinu

Příklad syntézy ribavirinu je znázorněn na obrázku č. 2 a popisuje se dále v textu.

Syntéza sloučeniny vzorce 3, kterou je metyl-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-p-D-ribofurano-syl)-1,2,4-triazol-3-karboxylát, a sloučeniny vzorce 4, kterou je metyl-1-(2,3, 5-tri-O-acetyl^-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol-5-karboxylát.

Směs obsahující sloučeninu vzorce 1, kterou je metyl-1,2,4-triazol-3-karboxylát, v množství 25,4 g a v koncentraci 200 mmol, sloučeninu vzorce 2, kterou je 1,2,3,5-tetra-O-acetyl-p-D-ribofuranóza, v množství 63,66 g a v koncentraci 200 mmol a sloučeninu bis(p-nitrofenyl)fosforečnan v množství 1 g se umístila do reakční nádoby RB o objemu 500 ml. Reakční • · f« ·· • · · ·

nádoba se umístila na dobu 25 minut do olejové lázně s teplotou 165 až 175 °C a za stálého míchání se vytvořilo vodní vývěvou vákuum. Unikající kyselina octová se jímala do ledem chlazeného lapače, který se umístil mezi vodní vývěvu a reakční nádobu RB. Reakční nádoba se pak vyňala z olejové lázně a nechala se vychladnout. Když teplota v reakční nádobě dosáhla přibližně 60 až 70 °C, přidalo se 300 ml etylacetátu a 150 ml saturovaného hydrogenuhličitanu sodného a proběhla extrakce etylacetátem. Vodní fáze se znovu extrahovala 200 ml etylacetátu. Smíchaný extrakt etylacetátu se promyl saturovaným hydrogenuhličitanem sodným o objemu 300 ml, 200 ml vody a 150 ml roztoku chloridu sodného. Organická fáze se sušila pomocí bezvodého síranu sodného, filtrovala se a sušila se filtrací ve vakuu. Zbytek se rozpustil ve 100 ml etanolu a ředil se 60 ml metanolu. Roztok se nechal stát po dobu 12 hodin při teplotě 0 °C a objevily se bezbarvé krystaly. Pevná látka se izolovala filtrací, promyla se minimálním množstvím chlazeného etanolu (20 ml) a sušila se ve vakuu za pomoci pevného hydroxidu sodného. Získalo se 60 g pevné látky. Výtěžek je 78 %. Filtrát se sušil odpařováním a čistil se na křemenné koloně, kde se jako eluent použil trichlórmetyl rozpuštěný v etylacetátu v poměru 9:1. Z filtrátu se izolovaly dva produkty. Jeden produkt je rychle se pohybující produkt, získal se v množství 8,5 g, což odpovídá výtěžku 11 %, a druhým je pomalu se pohybující produkt, který se získal v množství 5 g, což odpovídá výtěžku 6,5 %. Pomalu pohybující se produkt odpovídá krystalizovanému produktu. Zjistilo se, že rychle se pohybující produkt je sloučenina vzorce 4 a získala se ve formě pěny. Kombinovaný výtěžek sloučeniny vzorce 3 je 65 g, což odpovídá 84 %.

Teplota tání je 108 až 110 °C ^XH NMR(CDC1₃) sloučeniny vzorce 3: 82,ll(s, 3H, COCH₃) , 2,12(s, 3H, COCH₃), 2,13(s, 3H, OCH₃) , 3,99(s, 3H, COCH₃) , 4,22 (dd,

..........

1H), 4,46(m, 2H), 5,55(t, 1H, J=6,0 Hz), 5,75(m, 1H) , 6,05(d, 1H, CiH J=3,6 Hz) a 8,41(s, 1H, C₅H) analýza (C15H19N3O9) C, Η, N.

^XH NMR(CDC1₃) sloučeniny vzorce 4: 82,02(s, 3H, COCH₃) , 2,10(s, 3H, COCH3), 2,12(s, 3H, OCH₃) , 4,00(s, 3H, COCH₃) , 4,14(m, 1H) , 4,42(m, 2H), 5,76(t, 1H) , 5,81(m, 1H) , 6,94(d, 1H, CiH J=2,lHz), 8,03(s, 1H, C₅H) analýza (C15H19N3O9) C,H,N.

Syntéza sloučeniny vzorce 5, kterou je Ι-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamid.

Sloučenina vzorce 3, kterou je metyl-1-(2,3,5-tri-O-acetyl^-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol-3-karboxylát, v množství 62 g a v koncentraci 161 mmol se umístila do tlakové nádoby a aplikoval se čerstvě připravený roztok amoniaku v metanolu o objemu 350 ml při teplotě 0 °C. Tento roztok se připravil tak, že plynný bezvodý amoniak se rozpouštěl v bezvodém metanolu při teplotě 0 °C až do úplné saturace. Tlaková nádoba se uzavřela a míchala se při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Tlaková nádoba se ochladila na teplotu 0°C, otevřela se a obsah se odpařoval do sucha. Ke zbytku se aplikovalo 100 ml suchého etanolu a roztok se odpařil do sucha. Získaný zbytek se trituroval acetonem a vznikla pevná látka, která se filtrovala a promyla se. acetonem. Pevná látka se nechala schnout přes noc při teplotě místnosti a rozpustila se ve směsi obsahující 600 ml hořkého etanolu a 10 ml vody. Zahřátím za stálého míchání se objem roztoku etanolu snížil na 150 ml. Při ochlazení horkého roztoku etanolu vznikly krystaly, které se získaly filtrací, promyly se acetonem a sušily se ve vakuu. Při zvýšení koncentrace filtrátu vznikl další materiál. Celkový výtěžek je 35 g, což odpovídá 89 %.

Teplota tání je 177 až 179 °C • 9 9 · 9 ·· ·· ·· «· · «··· 9 9 • · ·· ···· • 9 999 9999 9

9 9 9 «999

.......... ·* “ [oc]²⁰d-35, 3 (c, 10, Η₂Ο), ^χΗ NMR (Me₂SO-d₆) :83, 46 (m, 1H, C₅H) ,

3,60(m, 1H, C₅H), 3,94(m, 1H, C₄H) , 4,12 (m, 1H) , 4,34 (m, 1H) , 4,95(t, 1H,C₅OH), 5,22(d, 1H) , 5,60(d, 1H) , 5,80(d, 1H, J=3,9 Hz, C_XH), 7,64(bs, 1H, NH₂) , 7,84(bs, 1H, NH₂) , 8,87(s, 1H,

C₅H) . ¹³C NMR(Me₂SO₄-d₆)861,8, 70,2, 74, 4, 86, 0, 91, 6, 144,9,

157,4, 160,6.

analýza (C₈Hi₂N₄O₅) C, Η, N.

Příklad 2: Syntéza ribavirinu upraveného skupinou =NH

Syntéza ribavirinu upraveného skupinou =NH je znázorněna na obrázku č. 3 a probíhá podle postupu popsaného dále v textu.

Syntéza sloučeniny vzorce 7, kterou je 3-kyan-l-(2,3,5-tri-O— -acetyl-p-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol.

Směs obsahující sloučeninu vzorce 6, kterou je 3-kyan-1,2,4-triazol, v množství 18,8 g a v koncentraci 200 mmol a bis(p-nitrofenyl)fosforečnan v množství 1 g se umístila do reakční nádoby RB o objemu 500 ml. Reakční nádoba se umístila na dobu 25 minut do olejové lázně s teplotou 165 až 175 °C a za stálého míchání se vytvořilo vodní vývěvou vakuum. Unikající kyselina octová se jímala do ledem chlazeného lapače, který se umístil mezi vodní vývšvu a reakční nádobu RB. Reakční nádoba se pak vyňala z olejové lázně a nechala se vychladnout. Když teplota v reakční nádobě dosáhla přibližně 60 až 70 °C, přidalo se 300 ml etylacetátu a 150 ml saturovaného hydrogenuhličitanu sodného a proběhla extrakce Vodní fáze se znovu extrahovala

Smíchaný extrakt etylacetátu se saturovaným hydrogenuhličitanem sodným o objemu 300 ml, 200 ml vody a 150 ml roztoku chloridu sodného. Organická fáze se sušila pomocí bezvodého síranu sodného, filtrovala se a sušila se filtrací ve vakuu. Zbytek se rozpustil ve 100 ml éteru.

200 ml promyl etylacetátem. etylacetátu.

• · · · « ·

Roztok se nechal stát po dobu 12 hodin při teplotě 0 °C a objevily se bezbarvé krystaly. Pevná látka se izolovala filtrací, promyla se minimálním množstvím chlazeného etanolu (20 ml) a sušila se vakuu za pomoci pevného hydroxidu sodného. Získalo se 56,4 g látky. Výtěžek je 80 %.

Teplota tání je 96 až 97 °C ¹H NMR(CDC1₃): 62,11(s, 3H, COCH₃) , 2,13(s, 3H, COCH₃) , 2,14(s, 3H, COCH₃), 4,22(dd, 1H) , 4,46(m, 2H) , 5,52(t, 1H, J=6,0 Hz), 5,70(m, 1H), 6,01(d, 1H, C_XH J=3,6 Hz) a 8,39(s, 1H, C₅H) Analytický výpočet v případě Ci₄Hi₆N₄O7 (352,30) je C, 47,73; H, 4,58; N, 15,90.

Zjištěné hodnoty jsou C, 47,70; H, 4,63; N, 16,01.

Syntéza sloučeniny vzorce 8, kterou je hydrochlorid Ι-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamid.

Směs obsahující sloučeninu vzorce 7 v množství 14,08 g a koncentraci 40,0 mmol, 2,14 g chloridu amonného v koncentraci 40,0 mmol a bezvodý amoniak v množství 150 ml se zahřívala v tlakové nádobě na teplotu 85 °C po dobu 18 hodin. Tlaková nádoba se ochladila, otevřela se a obsah se nechal odpařit do sucha. Zbytek se krystalizoval ze směsi metylkyanidu a etanolu za vzniku 10,6 g sloučeniny vzorce 8, což odpovídá výtěžku 95 o

o ·

Teplota tání je 177 až 179 °C.

^xHMR(DMSO-d₆) : 53,44-4,2(m, 3H) , 4,40(m, 2H) , 5,04(t, 1H) , 5,29(m, 1H), 5,74(m, 1H) , 5,87(d, 1H,C_XH), 8,96(bs, 3H)a 9,17(s, 1H, C₅H).

Analytický výpočet pro C8Hi₄ClN₅O₄ (279, 68) je C, 34,35, H, 5,05, A,25,04, Cl,12,69.

Zjištěné hodnoty jsou C, 34,39, H, 5,10, N, 25,14, Cl, 12,71.

Příklad alternativního způsobu syntézy, sloučenina je ribavirin.

kde počáteční • · · ·

9* · 9

Syntéza sloučeniny vzorce 9, kterou je 2 ', 3', 5'-tri-CHacetyl-Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid.

Suspenze obsahující Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid (ribavirin) v množství 28,4 g a v koncentraci 116,4 mmol ve 200 ml anhydridu kyseliny octové a 50 ml pyridinu se míchala při teplotě místnosti přes noc. Výsledný čirý roztok se zahustil ve vakuu za vzniku 43,1 g čiré pěny. Použitím TLC se prokázalo, že tato pěna je homogenní a použila se přímo bez dalšího čištění v dalším kroku. Malé množství se čistilo rozprašovací chromatografií za vzniku analytického

vzorku.
XH NMR(300	MHz) ,	(DMSO-d6)52,01, 2,08,	2,09 (3s,	r 9H,
COCH3) 4,10(m,	1H) ,	3,52(m, 2H) , 5,58(t, 1H)	, 5,66 (m	, 1H) ,
6,33(d, 1H,	J=3, 0	Hz, CiH), 7,73, 7, 92(2,	s, 2H,	CONH2) ,

8,86(s, 1H, C₅H triazol).

Analýza (CioH₁₈N₄08) C, Η, N.

Syntéza sloučeniny vzorce 10, kterou je 3-kyan-2',3',5'-tri-O-acetyl-l-fl-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol.

Do roztoku, který obsahuje 43,1 g sloučeniny vzorce 9 v koncentraci 116,4 mmol v 500 ml chloroformu, se přidalo 244 ml trietylaminu a směs se ochladila na teplotu 0 °C v lázni obsahující led a sůl. Po kapkách za stálého míchání se přidalo

30,7 ml fosforoxychloridu v koncentraci 330 mmol a roztok se nechal zahřát na teplotu místnosti. Pak se směs míchala po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti a použitím TLC (hexan/aceton 3:1) se ukázalo, že počáteční materiál zcela vymizel. Hnědá reakční směs se sušila ve vakuu a suchý zbytek se rozpustil v 500 ml chloroformu. Tento organický roztok se třikrát promyl 200 ml saturovaného vodného roztoku uhličitanu sodného, sušil se použitím bezvodého síranu Sodného a jeho koncentrace se zvýšila ve vakuu. Zbytek se podrobil chromatografické analýze na silikagelu (rozprašovací

9999 99 99 99 9999 · 9 9 9 9 9 9 · • · · · 9 9 9 9 • · · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

..............

chromatografie) za použití 20 % acetonu v hexanu.* Vzniklo

33,14 g čisté sloučeniny vzorce 10 ve formě amorfní pevné látky, což odpovídá výtěžku 81 % vztaženo k ribavirinu. Tato pevná látka byla ve všech ohledech shodná s autentickým vzorkem.

Teplota tání je 101 až 103 °C.

IR (bromid draselný) v2250(CN), 1750 (C=0) , cm¹, ^XH NMR (300 Mhz,

CDCI3) δ2, 04, 2,06, 2,07 (3s, 9H, acetylmetyly), 4,15(dd, 1H) ,

4,40(m, 1H), 5,47(t, 1H) , 5,63(dd, 1H) , 5,95(d, 1H, J=3,2Hz,

C]H), 8,34(s, 1H, C5H triazol) .

Syntéza sloučeniny vzorce 8, kterou je hydrochlorid Ι-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamid.

K suspenzi obsahující sloučeninu vzorce 10 v množství 4,0 g a v koncentraci 11,4 mmol ve 100 ml metanolu se přidalo 12 ml molárního roztoku metanolového metoxidu sodného a směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Roztok se okyselil na hodnotu pH 4 pomocí metanolem promyté pryskyřice Dowex H+. Pryskyřice se filtrovala a filtrát se sušil ve vakuu. Zbytek se rozpustil v minimálním množství etanolu, což odpovídá 15 ml a přenesl se do tlakové nádoby. Přidalo se 0,61 g chloridu amonného v koncentraci 11,4 mmol a roztok metanolu se saturoval při teplotě 0 °C bezvodým plynným amoniakem o objemu 75 ml. Reakční nádoba se utěsnila a roztok se míchal při teplotě místnosti přes noc. Roztok se sušil ve vakuu a výsledný zbytek krystalizoval ze směsi obsahující acetonitril a etanol za vzniku sloučeniny vzorce 8. Získalo se 2,95 g krystalické pevné látky, což odpovídá výtěžku 93 %. Tento vzorek byl shodný ve všech ohledech a autentickým vzorkem.

Dalším alternativním způsobem syntézy, případ, kdy sloučenina vzorce 8, kterou je hydrochlorid Ι-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-karboxamidin, se může produkovat enzymatickou reakcí za použití kultury mikroorganizmu, • ·» · • · neporušené buňky mikroorganizmu nebo buněčného extraktu, jako zdroje enzymu (za podmínek, kdy se mikroorganizmus nerozmnožuje). Sloučenina vzorce 7, kterou je 3-kyan-l-(2,3,5-tri-O-acetyl-p-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol, se může připravit tak, že se do přivedou do kontaktu 3-kyan-l,2,4-triazol nebo jeho sůl a dárce ribózy v přítomnosti zdroje enzymu, kterým je mikroorganizmus. Pak se sloučenina vzorce 7 přidá k sloučenině vzorce 8, přičemž se sloučenina vzorce 7 ošetří roztokem amoniaku. V jiném případě sloučenina hydrochlorid 1,2,4-triazol-3-karboamidínu může reagovat s donorem ribózy v přítomnosti enzymu za přímého vzniku sloučeniny vzorce 8.

Příklad 3: Deaminace upraveného ribavirinu v játrech za vzniku ribavirinu

U myší po osmidenní orální opakované aplikaci dávky ³Hribavirinu a ³H-ribavirinu upraveného skupinou =NH při dávce 300 mg/kg byla střední a minimální koncentrace radioaktivity (Cmin) v játrech podstatně nižší v případě ribavirinu ve srovnání s upraveným ribavirinem. Je třeba zdůraznit, že ribavirin tvořil přibližně 90 % radioaktivity v játrech myši ošetřené ribavirinem a 10 % této aktivity tvořila ribofuranosyltriazolkarboxylová kyselina (RTCA). Naopak upravený ribavirin tvořil přibližně 30 % a ribavirin přibližně 70 % radioaktivity v játrech myší ošetřených upraveným ribavirinem (popisuje se také v tabulce č. 1).

Tabulka č. 1: Radioaktivita v játrech myší

	3H-ribavirin	3H-(=NH)upravený ribavirin
celková radioaktivita játrech	v	18,4 gg ekvivalentu na 1 gram	23,8 μς ekvivalentu na 1 gram
RTCA	~1,8 μς ekvivalentu	nedetekováno

···· •9 9999 « · 9 9999 9« 9 • · 99 9-9 9 9 • 9 999 9999 9 • · 999 9 9 9 9 «· · · 99 9999 99 9·

	na 1 gram	1
ribavirin	~16,6 qg ekvivalentu na 1 gram	~16, 6 qg ekvivalentu na 1 gram
upravený ribavirin	nedetekováno	~7,2 qg ekvivalentu na 1 gram

Příklad 4: Diferencionální rozložení radioaktivity způsobené ribavirinem a ribavirinem upraveným skupinou =NH v červených krvinkách (RBC).

Ukázalo se, že ribavirin se v červených krvinkách fosforyluje a dále se předpokládá, že fosoforylovaný ribavirin je agens způsobující hemolytickou anémii, ke které dochází při dlouhodobé léčbě lidí ribavirinem nebo když se lidem aplikuje ve vysokých dávkách. Ribavirin upravený skupinou .=NH není transportovaný do červených krvinek přímo, což potvrdila studie provedená in vitro (data nejsou uvedena) a následně se také předpokládá, že upravený ribavirin se bude hromadit v červených krvinkách pouze po deaminaci v játrech a následné fosoforylaci na odpovídající fosforečnan, jak je zobrazeno v tabulce č. 2 dále v textu.

q

U myší po osmidenní opakované orální aplikaci dávky Hribavirinu a ³H-ribavirinu upraveného skupinou =NH při dávce 300 mg/kg byla střední a minimální koncentrace radioaktivity (Cmin) v játrech podstatně nižší v případě upraveného ribavirinu ve srovnání s ribavirinem. Jak se odhaduje z diferenciálních dat zobrazených v tabulce č. 1 a 2, terapeutický index (to je poměr mezi koncentrací ribavirinu v játrech a koncentrací ribavirinu v červených krvinkách) v případě upraveného ribavirinu je přibližně třikrát vyšší než v případě indexu pro ribavirin.

Maximální koncentrace radioaktivity v červených krvinkách opic cynomolgus, kterým byla odebrána krev kanylou zavedenou do portální žíly, po aplikaci jediné orální dávce 30 mg/kg ³H ribavirinu nebo ³H ribavirinu upraveného skupinou =NH, bylo ·· ···· • · · · ♦ · « · * · • · · · · · · · • · · · · ···· · • · · ·· · · · ·

..............

dosaženo po 24 hodinách a tato koncentrace zůstává stále stabilní. Maximální koncentrace radioaktivity v případě ³Hribavirinu a ³H-ribavirinu upraveného skupinou =NH vykazovala poločas rozpadu Τχ/₂ přibližně 1 998 hodin respektive 577 hodin. Po více dávkách 30 mg/kg ustálená koncentrace radioaktivity byla podstatně vyšší v případě ribavirinu, což se porovnává s ³H-ribavirinem upraveným skupinou =NH (popisuje se v tabulce č. 2).

Tabulka č. 2: Diferencionální rozložení radioaktivity v červených krvinkách způsobené ribavirinem a ribavirinem upraveným skupinou =NH

	3H-ribavirin	3H-(=NH)upravený ribavirin
střední radioaktivita v RBC	1,36 qg ekvivalentu na 1 gram	0,38 μg ekvivalentu na 1 gram
střední radioaktivita v RBC (opice-jediná dávka)	~41 gg ekvivalentu na 1 gram	~17 μg ekvivalentu na 1 gram
střední radioaktivita v RBC (opice-opakované dávky)	~5089 μg ekvivalentu na 1 gram	~606 μg ekvivalentu na 1 gram

Data uvedená v tabulce č. 2 jsou také v souladu se zjištěnou toxicitou. Opicím se aplikovalo 60 mg/kg ribavirinu a pak 30 mg/kg. Po deseti dnech se u nich objevily příznaky hemolytické anémie a podstatně se snížil počet červených krvinek. Naopak opice, kterým se aplikovaly stejné dávky upraveného ribavirinu vykazují nepodstatné změny v počtu červených krvinek.

Na základě rozdílu mezi portální plazmou a systémovou plazmou v portálu u opic po orální aplikaci buď ribavirinu nebo upraveného ribavirinu, kdy se krev odebrala pomocí kanyly zavedené do žíly se odhadlo, že koncentrace radioaktivity • ···· ·· ·♦ ·· ··♦· ·· ····**· · • * · ♦ · · · · · ··· · ·· *♦·· ·* ·· v játrech po orální aplikaci upraveného ribavirinu je přibližně o 50 % vyšší než po orální aplikaci ribavirinu. Pak v případě upraveného ribavirinu bude nutné aplikovat pouze přibližně 66 % dávky ribavirinu, aby se dosáhlo stejné koncentrace ribavirinu v játrech. Na základě nižší radioaktivity v červených krvinkách (přibližně 12 %) a vyšší radioaktivity v játrech (přibližně 50 %) v případě upraveného ribavirinu, což se srovnává s ribavirinem, se odhadlo, že terapeutický poměr v případě upraveného ribavirinu je přibližně dvanáctkrát vyšší než u ribavirinu. Předpokládá se, že upravený ribavirin se může aplikovat v dávce, která tvoří přibližně 65 % ribavirinu, a dosáhne se přibližně stejná účinnost jako v případě ribavirinu a při tom se v podstatě neobjeví hemolytická anémie, nebo že upravený ribavirin se může aplikovat ve stejné dávce jako ribavirin, aby se dosáhlo vyšší účinnosti jako v případě ribavirinu. Dále se předpokládá, že upravený ribavirin se může také aplikovat v dávce, která tvoří přibližně 5 až 50 %, s výhodou 20 až 50 %, výhodněji 10 až 50 % a ne j výhodněj ší je dávka 5 až 6 % dávky ribavirinu, přičemž se dosáhne stejného terapeutického účinku jako u ribavirinu.

Příklad 5: Deaminace in vitro ribavirinu upraveného skupinou =NH za vzniku ribavirinu

Adenosinová deamináza (ADA) izolovaná ze střeva telete se získala od firmy Boehringer Manheim. Test proběhl v pufru PBS Dulbecco (8 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KC1, 138 mM NaCl) při teplotě místnosti (to je 23 °C) . Získalo se UV spektrum ribavirinu upraveného skupinou =NH a ribavirinu (koncentrace sloučenin je 0,2 mM) a absorbční rozdíl při vlnové délce 240 nm se využil pro sledování hydrolytické deaminace ribavirinu upraveného skupinou =NH na ribavirin. Za nepřítomnosti enzymu nedošlo v pufru s hodnotou pH 7,2 po dobu 1,5 hodin k spontánní hydrolýze ribavirinu upraveného skupinou =NH (data • 9 ·· ·

9 ·

9 t·· • * ·

9999 ·· ···· nejsou uvedena), což ukazuje, že sloučenina je velmi štabilní. Jestliže se zohlední omezení testovací metody používající UV spektrum, spontánní hydrolýza ribavirinu je méně než 2,5x 10^-5 min^-1. Další experimenty ukazují, že adice iontu zinku v pufru nezvyšuje rychlost spontánní hydrolýzy (data nejsou zobrazena) .

ADA h₂o nh₃

min^-1 za současných podmínek testu spektra tetraexcitované

V přítomnosti 0,2 μΜ ADA se deaminace ribavirinu upraveného skupinou =NH zrychlila. Počet přeměn enzymu se odhaduje na 2,5 Analýza hmotnostního konfigurace produktu enzymatické reakce ukazuje, že více než 75 % ribavirinu upraveného skupinou =NH se přeměnilo na ribavirin po té, co se 0,2 mM ribavirin upravený skupinou =NH inkuboval přes noc s 0,5 μΜ

ADA.

Tímto se dokládá specifické provedení vynálezu, které zvyšuje specifitu léčby onemocnění. Mělo by být jasné, že jsou možné i další modifikace, které vycházejí z vynálezu. Vynález se proto neomezuje pouze, na uvedené nároky. Termín „obsahuje a „obsahující zahrnuje elementy, komponenty nebo kroky ukazující že elementy, komponenty a kroky mohou existovat nebo se mohou využít nebo kombinovat s jinými elementy, komponenty nebo kroky, které nejsou zmiňovány.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY 7

   1. Způsob zvýšení selektivity léčebného prostředku s ohledem na farmakologický účinek, vyznačující se tím, ž e se identifikuje léčebný prostředek, který má požadovaný farmakologický účinek na cílovou buňku, a léčebný prostředek se upravuje chránící skupinou, která se na něm kovalentně zachycuje prostřednictvím atomu dusíku obsaženého v chránící skupině, přičemž chránící skupina snižuje hromadění léčebného prostředku v necílené buňce a je ji možné v cílené buňce z léčebného prostředku enzymaticky odstranit.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e léčebný prostředek se vybral ze skupiny zahrnující nukleotid, nukleosid, analog nukleotidu a nukleosidu.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e léčebný prostředek je Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid nebo 2-^-D-ribofuranosyl-4-thiazol-karboxamid.

   4. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c i s e t i m, ž e chránící skupina obsahuje alespoň jeden primární a sekundární amin. 5. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c i s e t i m, ž e chránící skupina je skupina =NH. 6. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c i s e t i m, ž e cílová buňka je hepatocyt. 7. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c i s e t i m,

   ž e cílová buňka je infikována virem.

   8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e cílová buňka je hyperproliferativní buňka.

   • to to • · to · · · • · · · · • « to · to < · • · > « · • ·< ···· • •toto • to ···· to to

   9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se' tím, ž e hromadění léčebného prostředku v necílené buňce zahrnuje fosforylaci léčebného prostředku v necílené buňce.

   10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e necílená buňka je erytrocyt.

   11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e enzymatické odstranění chránící skupiny z léčebného prostředku je katalyzováno aminohydrolázou.

   12. Způsob snížení toxicity léčebného prostředku v necílené buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje rozpoznání, že metabolická přeměna léčebného prostředku v necílené buňce způsobuje poškození necílené buňky, a úpravu léčebného prostředku chránící skupinou, která je kovalentně spojena s léčebným prostředkem prostřednictvím atomu dusíku obsaženém v chránící skupině a snižuje metabolickou přeměnu léčebného prostředku v necílené buňce a v cílené buňce se enzymaticky odštěpuje z léčebného prostředku, a aplikaci léčebného prostředku do systému obsahujícího cílenou a nedlenou buňku, přičemž chránící skupina je kovalentně spojena s léčebným prostředkem.

   13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e léčebným prostředkem je Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid a metabolická přeměna zahrnuje fosforylaci léčebného prostředku.

   14. Způsob podle nároku 12, vyzná č u j í c í s e t í m, ž e necílenou buňkou je erytrocyt. 15. Způsob podle nároku 12, vyzná č u j í c í s e t í m, ž e chránící skupina je skupina =NH. 16. Způsob podle nároku 12, vyzná č u j í c z 1 s e t í m,

   ž e poškození zahrnuje inhibici dehydrogenázy inosin-5'-monofosforečnanu.

   17. Způsob snižující dávku léčebného prostředku v systému, který zahrnuje dlenou a vyznačující se tím, necílenou buňku, ž e zahrnuje přípravu

   18.

   19.
4. 4 44 4

   4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4

   4 4 * 4 4 44

   4 4 4 4 4

   44 4444 44

   44 4444 léčebného prostředku, kde metabolická přeměna léčebného prostředku v necílené buňce snižuje koncentraci léčebného prostředku v systému zahrnujícím necílenou a cílenou buňku, a úpravu léčebného prostředku chránící skupinou, která je kovalentně spojena s léčebným prostředkem prostřednictvím atomu dusíku v chránící skupině a snižuje metabolickou přeměnu léčebného prostředku v necílené buňce, a aplikaci léčebného prostředku do systému, přičemž chránící skupina je kovalentně spojena s léčebným prostředkem a v cílené buňce je možné ji z léčebného prostředku odstranit.

   Způsob podle nároku 17, vyznačující ž e systém zahrnuje savce.

   Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, ž e léčebným prostředkem je Ι-β-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid a chránící skupinou je skupina =NH.

   enzymaticky