CZ20031914A3 - Nové látky-receptory Helicobacter pylori, jejich použití a způsob léčby - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález popisuje látku nebo receptor, který se váže na Helicobacter pylorí, a jeho použití, např. ve farmaceutických a výživných prostředcích pro léčbu stavů způsobených přítomnosti Helicobacter pylori. Tento vynález je také orientován na použití receptoru pro diagnostiku Helicobacter pylori.

Dosavadní stav techniky

Helicobacter pylori souvisí s některými chorobami gastrointestinálního traktu, včetně chronické gastritidy, gastrické choroby přidružené nesteroidnímu protizánětlivému léku (NSAID), duodenálních a gastrických vředů, gastrického MALT lymfomu, a gastrického adenokarcinomu (Axon, 1993; Blaser, 1992; DeCross a Marshall, 1993; Dooley, 1993; Dunn et al., 1997; Lin etai., 1993; Nomura a Stemmermann, 1993; Parsonnet et al., 1994; Sung et al., 2000; Wotherspoon et al.,

1993). Choroby, které zcela nebo částečně nesouvisí s gastrointestinálním traktem, zahrnují syndrom náhlého kojeneckého úmrtí (Kerr et al., 2000 a US 6 038 756), autoimunní choroby, například autoimunní gastritidu a zhoubnou anémii (Appelmelk et al., 1998; Chmiela et al., 1998; Clayesetal., 1998; Jasseletal., 1999; Steininger et al., 1998) a některé kožní choroby (Rebora et al., 1995), pankreatickou chorobu (Correa et al., 1990), choroby jater včetně adenokarcinomu (Nilsson et al., 2000; Avenaud et al., 2000) a choroby srdce, například aterosklerózu (Farsak et al., 2000). Byly posuzovány * mnohočetné choroby způsobené nebo přidružené Helicobacter pylori (Pakodi et al.,

2000). Primární význam pokud se týče bakteriální kolonizace a infekce má mechanizmus (mechanizmy), kterým se bakterie váže k povrchům epiteliálních buněk gastrické sliznice.

Bylo zaznamenáno, že glykokonjugáty, jak založené na lipidech, tak na proteinech, slouží jako receptory pro vazbu tohoto mikroorganizmu, jako, např., sialylované glykokonjugáty (Evans et al., 1988), sulfatid a GM3 (Saitoh et al., 1991), Le^b determinanty (Borén et al., 1993), polyglykosylceramidy (Miller-Podraza et al., 1996;

1997a), laktosylceramidy (Angstróm et al., 1998). Další potenciální receptory • ·· ·· ·· ·· ···· ···· · • · · · · ······ • · · · · · ·

998 99 98 99 88

Helicobacter pylori zahrnují polysacharid heparansulfát (Ascensio et al., 1993), i fosfolipid fosfatidylethanolamin (Lingwood et al., 1992).

US patenty Zopfa et al.: 5 833 079 (březen 1999), 5 753 630 (květen 1998) a 5 514 660 (květen 1996) popisují Neu5Aca3Gal- obsahující sloučeniny jako inhibitory adheze H. pylori. Molekula sialyl-laktózy brání vazbě Helicobacter pylori na řady lidských gastrointestinálních buněk (Simon et al., 1999) a je také účinná pro opičí animální model Rh-faktoru této infekce (Mysore et al., 2000). Tato sloučenina je klinicky zkoušena.

US patent Krivana et al., 5 446 681 (listopad 1995) popisuje receptor bakterie antibiotických konjugátů obsahujících asialo-gangliosid vázaný na penicilinové antibiotikum. Zvláště je nárokována léčba Helicobacter pylori amoxicilin-asialo-GM1 konjugátem. Sekvence oligosacharidů/glykolipidů popisované tímto vynálezem nepatří ke gangliořadám glykolipidů.

US patent Krivana et al., 5 386 027 (leden 1995) a 5 217 715 (červen 1993) popisuje použití sekvencí oligosacharidů nebo glykolipidů k potlačování několika patogenních bakterií, ačkoliv není zahrnuta obvyklá vazebná specifika a Helicobacter pylori není mezi zkoumanými nebo nárokovanými bakteriemi.

Sekvence sacharidu GlcNAcp3Gal je popsána jako receptor pro Streptococcus (Andersson et al., 1986). Některé bakterie mohou mít překrývající se vazebná specifika, ale nelze předpovědět ani vazby blízce příbuzných bakteriálních adhesinů. V případě Helicobacter pylori molekuly vázající sacharidy, s výjimkou vazebné bílkoviny Lewis b, nejsou známy.

Podstata vynálezu

Tento vynález se vztahuje na použití látky nebo receptorů vázajícího se na Helicobacter pylori, který obsahuje sekvenci oligosacharidů [Gal(A)_q(NAc)_r/Glc(A)q(NAc)_ra3/p3]_s[Galp4GlcNAcp3]_tGaip4Glc(NAc)_u kde q, r, s, t, a u jsou každé nezávisle 0 nebo 1, takže když t = 0 a u = 0, je pak sekvence oligosacharidů vázaná na polyvalentní nosič nebo přítomná jako volný oligosacharid ve vysoké koncentraci, a na analogy nebo • · • · • · · · • · ···· ·· · • · ···· · · · • ··· ······ · · ·· ·· · ···· • · ·· ·· ·· ·· deriváty uvedené sekvence oligosacharidu mající vazebnou aktivitu na Helicobacter pylori pro výrobu prostředku majícího vazebné nebo potlačující působení na Helicobacter pylori.

Předmětem vynálezu je také použití Helicobacter pylori vázajících sekvencí oligosacharidů popsaných v tomto vynálezu jako lék, a jejich použití pro výrobu farmaceutického prostředku, zvláště k léčbě jakýchkoliv stavů způsobených přítomností Helicobacter pylori.

Tento vynález se také vztahuje ke způsobům léčby stavů způsobených přítomností Helicobacter pylori. Tento vynález je také orientovaný na použití receptoru (receptorů) popsaných v tomto vynálezu jako Helicobacter pylori vázající nebo potlačující látka pro diagnostiku Helicobacter pylori.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnout látky, farmaceutické prostředky a výživné přísady nebo prostředky obsahující Helicobacter pylori vázající sekvenci (sekvence) oligosacharidů.

Dalšími předměty tohoto vynálezu jsou použití výše zmíněných látek vázajících Helicobacter pylori pro identifikaci bakteriálních adhesinů, typizaci Helicobacter pylori, a vazebné stanovení Helicobacter pylori.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu je použití výše zmíněných látek vázajících Helicobacter pylori pro výrobu vakcíny proti Helicobacter pylori.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1A a 1B. EI/MS permethylovaných oligosacharidů získaných z hexaglykosylceramidu trávením endoglykoceramidázy. Plynový chromatogram oligosacharidů (nahoře) a EI/MS spektra píkú A a, případně, B (dole).

Obrázky 2A a 2B. Aniontová FAB hmotnostní spektra hexa- (2A) a pentaglykosylceramidu (2B).

Obr. 3A a 3B. Protonová NMR spektra ukazující anomerní oblast glykolipidu s šestí cukry (3A) a glykolipidu s pěti cukry (3B). Spektra byla získána přes noc, aby byl získán dobrý odstup signálu od šumu pro složku minoritního typu 1.

Obrázky 4A, 4B a 4C. Enzymatické odbourávání glykosfingolipidů králičího brzlíku. Silikagelové tenkovrstvé desky byly vyvolány v C/M/H2O (60 : 35 : 8, obj.). 4A a 4B, 4-methoxybenzaldehydové vizualizované desky. 4C autoradiogram po pokrytí Helicobacter pylori označené ³⁵S. 1, heptaglykosylceramid (struktura 1, tabulka I); 2, • · ··· ·· ·· ·· ·· desialylovaný heptaglykosylceramid (získaný po úpravě kyselinou); 3, desialylovaný heptaglykosylceramid upravený p4-galaktosidázou; 4, heptaglykosylceramid upravený sialidázou a 34-galaktosidázou; 5, referenční glykosfingolipidy lidských erytrocytů (laktosylceramid, trihexosylceramid a globosid); 6, desialylovaný heptaglykosylceramid upravený p4-galaktosidázou a β-hexosaminidázou; 7, heptaglykosylceramid upravený sialidázou, p4-galaktosidázou a β-hexosaminidázou.

Obr. 5A a 5B. TLC produktů získaných po částečné kyselé hydrolýze králičího brzlíku heptaglykosylceramidem (struktura 1, tabulka I). Vyvolávací rozpouštědlo bylo stejné, jako u obr. 4A, 4B a 4C. 5A, 4-methoxybenzaldehydem vizualizovaná deska; 5B, autoradiogram po pokrytí Helicobacter pylori označené ³⁵S. 1, heptaglykosylceramid; 2, desialylovaný heptaglykosylceramid (po úpravě kyselinou); 3, pentaglykosylceramid; 4, hydrolyzát; 5, referenční glykosfingolipidy (jako u obr. 4A, 4B a 4C),

Obr. 6A a 6B. Zředěné řady glykosfingolipidů. Vazebné působení na TLC bylo zjištěno pomocí metody bakteriálního potažení. Vyvolávací rozpouštědlo bylo stejné, jako u obr. 4A, 4B a 4C. Na desky byly naneseny různé glykolipidy v ekvimolárních množstvích. Kvantifikace glykolipidů byla založena na obsahu hexózy. 6A, hexa- a pentaglykosylceramidy (struktury 2 a 3, tabulka I); 6B, penta- a tetraglykosylceramidy (struktury 4 a 5, Tabulka I). Množství glykolipidů (vyjádřené v pmolech) bylo následující: 1, 1280 (každého); 2, 640; 3, 320; 4, 160; 5, 80; 6, 40; 7, 20 pmolů (každého).

Obr. 7A a 7B. Tenkovrstvý chromatogram se separovanými glykosfingolipidy detekovanými 4-methoxybenzaldehydem (7A) a autoradiogram po vázání radioaktivně označeným druhem Helicobacter pylori 032 (7B). Glykosfingolipidy byly separovány na silikagelových hliníkem podložených 60 HPTLC deskách (Merck) pomocí chloroformu/methanolu/vody 60 :35:8 (obj.) jako rozpouštěcí soustavy. Stanovení vazeb bylo provedeno tak, jak je popsáno v části „Materiály a metody“.

Autoradiografie probíhala 72 hodin. Pásy obsahovaly:

pás 1)) Ga^4GlcNAcp3Ga^4G^1 Cer (neolaktotetraosylceramid), 4 pg;

pás 2)) θ8ΐα3θ3ΐβ4ΟΙοΝΑοβ3θ3ΐβ4ΟΙσβ1ΟβΓ (B5 glykosfingolipid), 4 pg;

pás 3) Gala3Ga^4GlcNf^3Ga^4G^1Cer, 4 pg;

pás 4) θ8ΐα3(Ρυοα2)θ3ΐβ40ΙοΝΑοβ3θ3ΐβ4ΘΙοβ^θΓ (B6 typ 2 glykosfingolipid), 4 pg;

pás 5) ΟΙοΝΑοβ363ΐβ4ΟΙοΝΑοβ363ΐβ4ΟΙοβ1ΟβΓ, 4 pg;

pás 6) θ3ΐβ40ΙοΝΑοβ3θ3ΐβ40ΙοΝ3θβ3θ8ΐβ40Ιοβ10βΓ, 4 pg;

pás 7) θ3ΐΝΑοβ3θ3ΐβ40οΝΑοβ3θ3ΐβ40Ιοβ10βΓ (x₂ glykosfingolipid), 4 pg;

pás 8) ΝθυΑοα3θ3ΐΝΑοβ3θ3ΐβ40ΙοΝΑοβ363ΐβ40Ιοβ10βΓ(ΝβυΑο-χ₂), 4 pg;

·· ···· • · • · · · · • · · · · · ····*· · • · · · · ·· ·· ·· pás 9) Fuca2Galp4GlcNAcp3Gaip4Glcpi Cer (H5 typ 2 glykosfingolipid), 4 pg;

pás 10) ΝθΐιΑοα3θ3ΐβ4ΟΙοΝΑοβ363ΐβ46Ιεβ1ΟθΓ (sialylneolaktotetraosylceramid), 4 pg.

Zdroje glykosfingolipidů jsou stejné jako ty, které jsou uvedené v tabulce 2.

Obr. 8A, 8B, 8C a 8D. Vypočítané konformace s minimální energií tří glykosfingolipidů, které vážou Helícobacter pylori: 63ΐΝΑοβ3θ3ΐβ46ΙοΝΑοβ30θΙβ40ΙοβΟβΓ (8A), θ3ΐΝΑοα3θ3ΐβ4αοΝΑοβ3θ3ΐβ4αοβΟβΓ (8B) a θ3ΐα36θΙβ46ΙοΝΑοβ363ΐβ46ΙοβΟβΓ (8C). Také je ukázána nevázající struktura θ3ΐα363ΐβ46ΙοΝΗ2θβ363ΐβ40ΙοβΟβΓ (8D). Také jsou ukázány pohledy shora na část oligosacharidu každé ze struktur s vypočítanou minimální energií. Nehledě na rozdíly v anomeritě, absenci nebo přítomnost acetamidové skupiny, axiální nebo ekvatoriální poloze 4-OH koncového cukru a na skutečnost, že rovina kruhu koncových obvázaných sloučenin je poněkud zvednuta nad odpovídající rovinu té, která je vázaná β3, existuje mezi těmito strukturami a také GlcNAcp3- zakončenou strukturou odvozenou od králičího brzlíku (viz obr. 9A) podstatná topografická podobnost, vysvětlující tak jejich podobné afinity k bakteriální adhezi. Naopak acetamidová skupina vnitřní ΰΙοΝΑοβ3 je podstatná pro vazbu (srov. 8C a 8D).

Obr. 9A, 9B, 9C a 9D. Vypočítané konformace s minimální energií vazebně aktivních glykosfingolipidů ΟΙοΝΑοβ3θ3ΐβ46ΙοΝΑοβ3θ3ΐβ40ΙοβΟβΓ (9A) a θ3ΐβ4ΟΙοΝΑοβ363ΐβ4-ΟΙοΝ3θβ363ΐβ4ΟΙοβ0βΓ (9B) a nevazebných glykosfingolipidů ΝβυΑοα3θ3ΐΝΑοβ368ΐ β4αοΝΑοβ30θΙβ40ΙοβΟβΓ (9C) a Gala3(Fuca2)Ga^4GlcNAc β3θ3ΐβ4ΰΙοβ0βΓ (9D). Posledně zmíněná dvě prodloužení (9C a 9D) ruší vazbu Helícobacter pylori, zatímco dříve zmíněné (9B) je tolerováno, ale má za následek sníženou afinitu. Společně s poznatkem, že de-N-acylace acetamidové části vnitřní GIcNAc B5 (obr. 8A, 8B, 8C a 8D) zcela ruší vazbu, část tvořící vazebný epitop musí být tvořena koncovým trisacharidem B5, který ukazuje obr. 8C, protože acetamidová skupina koncově umístěného N-acetylgalaktosaminu je nepodstatná.

Obr. 10. Konformer s minimální energií sloučeniny se sedmi cukry NeuGca3Gal β4ΝΑοβ363ΐβ40ΙοΝΑοβ3θ3ΐβ40ΙοβΟβΓ, který je ukázán ve dvou průmětech, rotoval 90 stupňů vzájemně od sebe. Koncový uhlíkový atom glykolylové části sialové kyseliny i uhlíkové atomy methylu acetamidových skupin dvou vnitřních GIcNAc zbytků jsou označeny černě, aby usnadnily orientaci v obrázku. Pro předvedení vazby G^Cer byía libovolně vybrána rozšířená konformace, ale minimální vazebná sekvence • · · • · · ·· ·· • · · • ·· · • · · · · ·· ·· ··

GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp3 je nejpravděpodobněji lépe vystavená přibližujícímu se adhezivu v konformacích GlcpCer, které jsou jiné, než konformace zde ukázaná.

Obr. 11 A, 11B a 11C. Vazba monoklonální antilátky TH2 (11B) a lektinu z E. cristagalli (11C) na zcela nekyselé frakce glykosfingolipidu epiteliálnich buněk lidské sliznice žaludku, lidské granulocyty a lidské erytrocyty separované na tenkovrstvých chromatogramech. Na obr. 11A jsou ukázány stejné frakce s obarvením 4methoxybenzaldehydem. Autoradiograf byl v případech (11B) a (11C) prováděn 12 hodin. V pásech 1 až 6 bylo aplikováno 80 pg zcela nekyselé frakce glykosfingolipidu epiteliálních buněk lidské sliznice žaludku pěti různých jednotlivců krevní skupiny A, zatímco v pásu 6 bylo aplikováno 40 pg zcela nekyselé frakce lidských granulocytů a v pásu 7 bylo aplikováno 40 pg zcela nekyselé frakce lidských erytrocytů. Stanovení vrstev byla prováděna tak, jak je popsáno v „Materiály a Metody“.

Tento vynález popisuje třídu specifických sekvencí oligosacharidů vázajících se na Helicobacter pylori. Tenkovrstvou překrývací analýzou byly prověřovány mnohé přirozeně se vyskytující glykosfingolipidy (tabulka 2). Použité struktury glykosfingolipidů byly charakterizovány protonovou NMR a hmotnostními spektrometrickými zkouškami. Ke srovnání trojrozměrných struktur látek, které se váží na Helicobacter pylori, bylo použito molekulární modelování.

Nová vazebná specifika byla demonstrována srovnáním čtyř pentasacharidových glykolipidů. Bylo zjištěno, že záměna neredukujícího konce koncového sacharidu v GlcNAcp3Galp4GlcNAcp3Galp4GlcpCer za buď GalNAcp3 (krátký název x₂ GSL), GalNAca3 nebo Gala3 (B5), vždy končila vázáním Helicobacter pylori, navzdory rozdílům v anomeritě, absenci nebo přítomnosti acetamidové části a axiální/ekvatoriáiní poloze 4-OH. Tato specifika také zahrnuje struktury se slabší vazbou na Helicobacter pylori: kratší formu Gal34GlcNAcp3Gaip4GlcpCer a p4-prodloužené formy glykolipidů s koncovým N-acetylglukosamiem: Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3Gaip4GlcpCer a NeuGca3Gaip4GlcNAcp3Gal34GlcNacp3Gaip4GlcpCer. Na rozdíl od dříve známých specifik závislých na kyselině sialové (Evans et al., 1998; Miller-Podraza et al., 1996; 1997a), kyselina N-glykolylneuraminová posledně zmíněného glykosfingolipidu může být uvolněna bez vlivu na vazbu Helicobacter pylori.

Vazba na GlcNAcp3Gaip4GlcNAc33Gaip4GlcpCer byla velmi reprodukce schopná, ačkoliv obecné sacharidové vazby Helicobacter pylori bývají poškozeny •9 4··· • 9 · • 9 · • · · ·

4 4 9

44 fázovými variacemi bakterie, a v potaženém vzorku při nízkých pikomolárních množstvích glykolipidu byla viditelná velká afinita vazeb.

Délka vazebného epitopu byla vyznačena pokusem, ukazujícím, že GlcNAcp3Galp4GlcpCer, Galp4GlcNp3Gaip4GlcpCer a

Gala3Gaip4GlcNp3Gaip4GlcpCer (zkrácená forma a N-deacetylované formy aktivních druhů) se nevázali na Helicobacterpylori. Tato fakta ukázala, že vnitřní GIcNAc zbytek se účastní vazby, ale netvoří sám dostatečně siinou vazbu. Za vazebný epitop byi považován koncový trisacharid v epitopech pentasacharidu pojednávaných výše. Pokud jsou přítomny pouze dva zbytky, jako v Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcpCer, je vazba slabší, a v hexasacharidu glykolipidu Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3Gaip4GlcpCer brání koncové Galp4 vazbě, což vysvětluje slabší aktivitu. Heptasacharid glykolipidu mající Gala3 na méně aktivní struktuře hexasacharidu glykolipidu,

Gala3Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3Gaip4glcpCer, má vyšší aktivitu, která také ukazuje, že pro dobrou vazebnou aktivitu jsou žádoucí koncové epitopy trisacharidů.

Specifika byla charakterizována stanovením izomerů a modifikovaných forem aktivních druhů. Prodloužené formy Gal34GlcNAcp3Gaip4GlcpCer, které mají následující modifikace na koncové Gal: Fuca2 (krátký název H5-2), Fuca2 a Gal/GalNAca3 (B6-2, A6-2), Neu5Aca6 (sialyparaglobosidy), nebo Gala4 (P1) byly ve vazebných stanoveních s Helicobacter pylori. Vazba byla také zničena přítomností β6spojenou větví vnitřní galaktózy, kterou ukazuje struktura

Ga^4GlcNAcp3(Gaip4GlcNAcp6)Gaip4GlcpCer. Ukázalo se, že větev mění prezentaci θ8ΐβ4ΟΙοΝΑοβ3-βρϊίορυ a vazebné místo disacharidu je pravděpodobně prostorově bráněno (Teneberg et al., 1994). (Výsledek ovšem ukazuje, že vnitřní zbytek galaktózy, k němuž jsou vazebné epitopy disacharidu nebo trisacharidů vázány pomocí vazby β3, mohou také k vazbě přispívat.) Dále vyšlo najevo, že

Νβυ5οα363ΐΝΑοβ363ΐβ40ΙοΝ3θβ3ΰ3ΐβ46ΙοβΟβΓ (prodloužená forma vazebně aktivního x₂- glykosfingolipidu) nebo 63ΐΝΑοβ363ΐα3θ3ΐβ46ΙοΝΑοβ363ΐβ4ΟΙοβ0βΓ (prodloužená B5 GSL) se neváží na Helicobacter pylori.

Aktivní vazebné struktury a neaktivní druhy byly srovnány pomocí molekulárního modelování. Konformery čtyř pentasacharidových glykosfingolipidů (Ga^4GlcNAcp3Ga^4G^Cer s prodloužením buď ΰΙοΝΑοβ3, GalNacp3, GalNAca3 nebo Gala3) s minimální vypočtenou energií ukazují, že konformace těchto sloučenin mohou blízce napodobovat jedna druhou. Konformace neaktivních glykolipidů byly jiné. Navzdory skutečnosti, že se koncové sacharidy liší také ve své anomerní vazbě (dvě • · ··· · • ·« ·· ·* ·« · · · · * · • · · · · · ··· • · · · · · ··· ·· ·· ·· • · • · · ·· ·· spojené alfa- a dvě beta), ukázalo molekulární modelování, že struktury s minimální energií jsou topograficky velmi podobné. Koncové struktury se liší v tom, že Gala3 nemá přítomnou acetamido skupinu, která je v dalších třech, Gal a GalNAc mají v axiální poloze 4-OH a v ekvitoriální poloze GIcNAc, a kruhové plochy alfa anomerního ukončení jsou lehce zvýšeny nad odpovídající plochou v beta anomerních ukončeních. Prodloužení ukončení je možné v poloze 4 GIcNAc, což také naznačuje, že 4-OH není pro vazbu velmi důležité, ačkoliv prodloužení Gaip4 způsobuje prostorovou interferenci. Nakonec se ani poloha 4-OH, ani absence/přítomnost acetamidové skupiny, ani anomerní struktura koncového monosacharidového zbytku neukazuje podstatnou pro výskyt vazby, protože všechny čtyři pentasacharidové glykosfingolipidy mají podobnou afinitu pro adhesin Helicobacter pylori.

Ve světle těchto vazebných pravidel mohou trisacharidové vazebné epitopy také poskytnout čtyři další koncové monosacharidy ve vazebné látce: Gaip3Gaip4GlcNac, GlcNAca3Gaip4GlcNac, Glcp3Gal34GlcNac a Glca3Gaip4GlcNac. Tyto jsou analogické zkoumaným sekvencím, pouze mají rozdíly v anomerní, 4-epimerní nebo na C2 NAc/OH strukturách. První je přítomna na glykolipidu lidských erytrocytů, zatímco další tři zatím nejsou u lidských tkání známy, aie mohou spíše představovat anaiogy přirozeného receptoru.

Tento vazebný epitop byl ukázán, abychom zahrnuli koncový prvek trisacharidu aktivních pentasacharidových glykolipidů, a alespoň ve větších repetičních Nacetyllaktosoaminech může být tento epitop také uprostřed řetězce sacharidu.

Vynálezci si jsou vědomi, že tyto vazebné epitopy mohou být přítomny četnými způsoby na přirozených nebo biosynteticky vyrobených glykokonjugátech a oligosacharidech, například O-vázaných nebo N- vázaných glykanech glykoproteinů a oligosacharidech poly-N-acetylIaktosoaminu. Chemické a enzymatické způsoby syntézy, zvláště na poli uhlohydrátů, umožňují produkci téměř nekonečného množství derivátů a analogů. Velikost vazebných epitopů umožňuje určité modifikace, jak dokládají příklady na C1,

C2 a C4 koncového monosacharidu, ztrátou neredukujícího koncového monosacharidu nebo prodloužení z koncové GIcNAc z GlcNAcp3Gaip4GlcNAc,např. poloha C4 koncové GlcNAcp3 může být připojena k oligosacharidovému řetězci glykosidickou vazbou. Když je sekvencí oligosacharidu GlcNAcp3Gal|34GlcNAcp3Gaip4Glc, poloha C4 koncové GlcNAcp3 může být připojena k Gaipi- nebo oligosacharidovému řetězci giykosidickou vazbou. Zvláště poiohy C2 a C4 zbytku neredukujícího koncového monosacharidu v epitopu trisacharidu a redukující konce epitopů mohou být použity • «. ·< · * ««·»·· ·» « · .»·· ·· · i · · · · · ··· · · · · .·· ·· · ···· ··.·· ·· ·· ·* ·· k vytváření derivátů a oiigomerních nebo polymerních konjugátů, které mají vazebnou aktivitu k Helicobacter pylori. K výrobě derivátů a analogů mohou být také použity C6 polohy zbytků monosacharidu, zvláště je výhodná poloha C6 nevazebného koncového zbytku v sekvenci trisacharidu a redukující koncový zbytek di- a trisacharidových vazebných látek.

V tomto vynálezu jsou výrazy „analog“ a „derivát“ definovány následovně. Podle tohoto vynálezu je možné navrhovat strukturní analogy nebo deriváty oligosacharidových sekvencí vázajících Helicobacter pylori. Vynález je tedy také zaměřen na strukturní analogy látek podle tohoto vynálezu. Strukturní analogy podle tohoto vynálezu obsahují strukturní prvky důležité pro vázání Helicobacter pylori na sekvence oligosacharidů. Pro konstrukční typ účinných strukturních analogů je důležité znát strukturní prvek, který je důležitý pro vazbu Helicobacter pylori a sacharidy. Důležité strukturní prvky jsou výhodné nemodifikované nebo jsou modifikované velmi blízkou obdobou důležitého strukturního prvku. Tyto prvky nejlépe zahrnují 4- a 6hydroxylové skupiny Gaip4 zbytku v epitopech trisacharidu nebo disacharidu. Důležitým strukturním prkem je také umístění spojení mezi kruhovými strukturami. Pro vazby s velkou afinitou je vhodná acetamidová skupina nebo skupina napodobující acetamidovou skupinu v poloze odpovídající acetamidové skupině redukujícího konce GIcNAc epitopů trisacharidu nebo disacharidu. Acetamidovou skupinu napodobující skupina může být další amid, například alkylamido, arylamido, sekundární amin, výhodněji N-ethyl nebo N-methyl, O-acetyl, nebo O-alkyl, například O-ethyl nebo Omethyl. Pro vazby s velkou afinitou jsou vhodné deriváty amidu ze skupiny karboxylových kyselin koncové kyseliny uronové a její analogy. Domníváme se, že aktivita nemodifikované kyseliny uronové se zvýší při nízkém pH.

Strukturní deriváty podle tohoto vynálezu jsou sekvence oligosacharidů modifikované chemicky podle tohoto vynálezu tak, aby vazba na Helicobacter pylori byla uchována nebo vzrostla. Podle tohoto vynálezu je vhodné derivatizovat jednu nebo několik hydroxylových nebo acetomidových skupin sekvencí oligosacharidů. Tento vynález popisuje několik poloh molekul, které mohou být při přípravě analogů nebo derivátů změněny. Hydroxylové nebo acetamidové skupiny, které tolerují alespoň určité modifikace, jsou označeny pomocí R-skupin ve vzorci 1.

Rozměrné nebo kyselé substituenty a jiné struktury , například zbytky monosacharidů, tolerovány nejsou, alespoň jsou-li vázány v poloze C2, C3 nebo C6 hydroxylů Galp4GlcNac a na C3-hydroxyiovém neredukujícím koncovém

Μ ·«·· «··· * · · · 9 9 * « · ·«·» · · * «· 999 » 999 9 9 9 * , ρ. 999 99 9 9999 ίο »«· »* ·» ·· «» »· monosacharidu epitopů trisacharidu. Způsoby výroby analogů oligosacharidú pro vazby lektinu jsou dobře známy. Například byly vyrobeny mnohé analogy sialyl-Lewis x oligosacharidú reprezentující aktivní funkční skupiny různé konstrukce, viz strana 12 090 Searse a Wonga, 1996. Podobně byly vyrobeny analogy oligosacharidú heparinu společností Sanofi a inhibitory napodobující sialovou kyselinu , například Zanamivir a Tamiflu (Relanza) pro enzym sialydázy mnohými skupinami. Výhodné je, když je analog oligosacharidú postaven na molekule zahrnující alespoň šesti nebo pětičlennou kruhovou strukturu, raději když analog obsahuje alespoň dvě kruhové struktury obsahující alespoň 6 nebo 5 atomů. Vhodný typ analogu oligosacharidú zahrnuje koncový amid kyseliny uronové nebo analog vázaný na strukturu napodobující Galp4GlcNac-sacharid. Jinak je koncový amid kyseliny uronové vázán 1-3 na Gal, který je vázán na strukturu napodobujícíGlcNAc. V napodobujících strukturách mohou být kruhy monosacharidů nahrazenými kruhy, například cyklohexan nebo cyklopentan, aromatické kruhy včetně benzenového kruhu, heterocyklické kruhové struktury mohou obsahovat vedle kyslíku například dusík nebo atomy síry. Pro uzavření aktivních kruhových konformací mohou být kruhové struktury propojeny tolerovanými spojovacími skupinami. Typická mimetická struktura může také zahrnovat analogické struktury peptidů pro sekvenci oligosacharidú nebo její část.

Vliv aktivních skupin na vazebnou aktivitu je kumulativní a nedostatek jedné skupiny může být kompenzován přidáním aktivních zbytků na druhé straně molekuly.

K přípravě analogových struktur Helicobacterpylori vázajících oiigosacharidových sekvencí podle tohoto vynálezu lze použít molekulární modelování, nejlépe pomocí počítače. Výsledky molekulárního modelování několika oiigosacharidových sekvencí jsou uvedeny v příkladech a stejné nebo podobné metody, kromě NMR a rentgenové krystalografie, lze použít k získání struktur pro další oligosacharidové sekvence podle tohoto vynálezu. Abychom našli analogy, mohou být struktury oligosacharidú „zakotveny“ k vazebné molekule (molekulám) uhlohydrátů H. pylori. nejpravděpodobněji k lektinům bakterie a mohou být zkoumány další možné vazebné interakce.

Také jsme si všimli, že monovalenční, oligovalenční nebo polyvalenční oligosacharidy mohou být aktivovány, aby měly větší aktivitu k lektinům tím , že vyrobíme deriváty oligosacharidú pomocí kombinatorické chemie. Když je substitucí jednoho nebo několika zbytků v oligosacharidové sekvenci vytvořena řada, může být považována za odvozenou řadu, nebo když je řada vytvořena z anaiogú oiigosacharidových sekvencí popsaných v tomto vynálezu. Kombinatorická chemická

9444

4 4

44« 4444

4 4 4 4 9 4

444 4 444

4 4 4 4

44 94 řada může být postavena na oligosacharidu nebo jeho prekurzoru nebo na glykokonjugátech podle tohoto vynálezu. Oligosacharidy s variabilním redukujícím koncem mohou být vyrobeny pomocí takzvané karbohydridové technologie.

Ve vhodném včlenění je kombinatorická chemická řada konjugována na vazebné látky Helicobacter pylori popsané tímto vynálezem. Ve vhodnějším včlenění obsahuje kombinatorická chemická řada alespoň 6 různých molekul. Nejlépe jsou kombinatorické chemické modifikace vyrobeny pomocí různých amidů ze skupiny karboxylové kyseliny na Rs podle vzorce 1. Skupina, která má být modifikována v R₈ může být také aldehyd nebo amin nebo jiný typ reakční skupiny. Takovou řadu je výhodné používat ke stanovení mikrobiálních vazeb na oligosacharidové sekvence podle tohoto vynálezu. Komerčně jsou dostupné aminokyseliny nebo soubory organických amidů, tyto látky mohou být použity k syntéze kombinatorické řady amidů kyseliny uranové. Pojivo s velkou afinitou může být určeno z kombinatorické řady například pomocí inhibičního stanovení, v němž jsou sloučeniny řady použity k zabránění bakteriálního vázání na glykolipidy nebo glykokonjugáty popsané tímto vynálezem. Strukturní analogy a deriváty vhodné podle tohoto vynálezu mohou bránit vázání Helicobacter pylori vázajících sekvencí oligosacharidů podle tohoto vynálezu na Helicobacter pylori.

Prostorová překážka způsobená částí lipidu nebo sousedstvím povrchu křemíku pravděpodobně omezuje měření epitopu GalNAcp3Gaip4Glc v běžném TLC stanovení. Pomocí tohoto stanovení nemohla být získána aktivita této sekvence v nedávném výzkumu toxinu A z Clostridium defficile, který specificky zjišťoval stejné čtyři epitopy trisacharidu popsané zde pro Helicobacter pylori (Teneberg et al., 1996). Vazba Gala3Ga^4Glc na toxin A byla demonstrována jinými pomocí velkého polymerního oddělovacího konjugátu sacharidu (Castagliuolo et al., 1996). Vezmeme-li také v úvahu přínos koncového monosacharidu vazbě, ukazuje se, že Glc může být ponecháno na redukujícím koncovém epitopu; v neaktivní N-deacetylované formě je pravděpodobně kladný náboj volné aminové skupiny pro vazbu destruktivnější, než přítomnost hydroxylové skupiny.Trisacharidové epitopy s Glc na redukujícím konci jsou považovány za stejně účinné analogy vazebné látky Helicobacter pylori, jsou-li přítomny v oligovalentní nebo vhodněji v polyvalentní formě. Jedním včleněním tohoto vynálezu jsou sacharidy s Glc na redukujícím konci, které jsou používány jako volné redukují sacharidy s velkou koncentrací, vhodně v rozsahu 1-100 g/l, nejlépe 1 - 20 g/l. Uvědomujeme si, že tyto sacharidy mohou mít menší aktivitu v rozsahu koncentrací 0,1 -1 g/l.

• φφ • φ φ · φ · φ φ φ φ « φφφ φφ φφ φ» • φ φ φ • · φφφ φ • φ φ φφ φφ φ« φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ

Dále je vazebná sekvence Helicobacter pylori popisována jako sekvence oligosacharidu. Zde definovaná sekvence oligosacharidu může být částí přirozeného nebo syntetického glykokonjugátu nebo volného oligosacharidu nebo část volného oligosacharidu. Takové sekvence oligosacharidu mohou být vázány na různé oligosacharidy nebo polysacharidy na řetězce polysacharidů, například když je sekvence sacharidu vyjádřena jako část bakteriálního polysacharidů. Navíc jsou známy různé přirozené modifikace monosacharidů, jak dokazuje příklad O-acetyl nebo sulfátový derivát sekvencí oligosacharidu. Zde definovaná vazebná látka Helicobacter pylori může obsahovat sekvenci oligosacharidu popsanou jako část přirozeného nebo syntetického glykokonjugátu nebo odpovídajícího volného oligosacharidu nebo část volného oligosacharidu. Vazebná látka Helicobacter pylori může také osahovat směs sekvencí oligosacharidu vázajících Helicobacter pylori.

Několik derivátů receptorové sekvence oligosacharidu omezilo vazbu pod limit detekce běžného stanovení, ukazujíce specifiku zjištění. Údaje o vazbách ukazují, že mají-li sekvence oligosacharidu GalNAcp3 vázané na Gala3Gaip4GlcNac (substituovaná sekvence: GalNAcp3Gala3Galp4GlcNAc), nebo Neu5Aca3 vázané na GalNAcp3Gaip4GlcNac (substituovaná sekvence: Neu5Aca3GalNAcp3Gaip4GlcNac), sloučeniny nejsou aktivní. Pokud je uvedená oligosacharidová sekvence Gaip4GlcNAc, není a4-galaktosylovaná (sekvence není Gala4Gaip4GlcNAc), α3-, nebo a6-sialylovaná (sekvence není Neu5Aca3/6Gaip4GlcNAc), a2- nebo a3-fukosylovaná [uvedená oligosacharidová sekvence není Fuca2Gaip4GlcNAc nebo Gaip4(Fuca3)GlcNAc nebo Fuca2Gal34(Fuca3)GlcNAc, a3-fukosylace odkazuje na fukosylaci GIcNAc zbytků laktosaminu tvořícího Lewis x, Gaip4(Fuca3)GlcNAc], Sacharidy, které mají struktury, v nichž je Gaip3 připojeno na GlcNAcp3 (například Galp3GlcNAcp3Gaip4GlcNAc/Glc) mají ve srovnání s vazebnými látkami Helicobacter pylori zde popsanými různé konformace a jejich vazebná specifika byla studována odděleně. Vazebné látky Helicobacter pylori mohou být částí řetězce sacharidu nebo glykokonjugátem nebo směsí glykosloučenin obsahující další známé epitopy vázající Helicobacter, s různými sekvencemi sacharidů a konformací, například Lewis b (Fuca2Gaip3(Fuca4)GlcNAc) nebo Neu5Aca3Gaip4Glc/GlcNAc. Použití několika látek společně může být pro léčbu výhodné.

Oligosacharidové sekvence vázající Helicobacter pylori mohou být enzymaticky syntetizovány pomocí glykosyltransferáz, nebo pomocí transglykosylace katalyzované glykosidázou nebo enzymy transglykosidázy (Ernst et al., 2000). Specifika těchto

• · ·	»4		9 1 •	·· • · ·	•	9	• 19 9 •
• ·		•	r ·	• ·»·	• ·	9	•
• ·		•	•	• ·	>	•	• ·
♦ · ·	··		• ·	··	99		• 9

enzymů a použití ko-faktorů může být řízeno. Specifické modifikované enzymy mohou být použity k získání účinnější syntézy, například glykosyntáza je upravena pouze k provádění transglykosylace. Je známa organická syntéza sacharidů a konjugátů zde popsaných, nebo sloučenin jim podobných (Ernst et al., 2000). sacharidový materiál může být izolován z přírodních zdrojů a modifikován chemicky nebo enzymaticky do sloučenin , které váží Helicobacter pylori. přírodní oligosacharidy mohou být izolovány z mléka produkovaného různými přežvýkavci. K produkci sacharidů mohou být použity transgenní organizmy, například krávy nebo mikroby, které exprimují glykosilující enzymy.

Zbytky monosacharidů uronové kyseliny popsaných v tomto vynálezu mohou být získány způsoby v oboru známými. Například hydroxyl z 6- uhlíku N-acetylglukosaminu nebo N-acetylgalaktosaminů může být chemicky oxidován na kyselinu karboxylovou. Oxidace může být prováděna s vhodně chráněným oligosacharidem nebo monosacharidem.

Ve vhodném včlenění nechráněný polymer nebo oligomer obsahující hexózy, Nacetylhexosaminy nebo hexosaminy, kde vazba mezi monosacharidy není mezi atomy uhlíku 6, je

1) oxidován na odpovídající polymer zbytků uronové kyseliny nebo na polymer obsahující monomery 6-aldehydomonosacharidů

2) dle volby derivatizován ze skupiny karboxylové kyseliny nebo 6-aldehydové skupiny nejlépe na amid nebo na amin a

3) hydrolyzován na monosacharidy kyseliny uronové nebo deriváty monosacharidů kyseliny uronové.

Způsoby, jak oxidovat zbytky monosacharidů na kyseliny uronové a hydrolyzovat amin nebo polymery kyseliny uronové chemicky nebo enzymaticky jsou odborníkům dobře známé. Zvláště je vhodné použít tuto metody na oiigomery nebo polymery celulózy, škrobu nebo jiné glukany s 1-2 nebo 1-4 vazbami, chitin (GIcNAc polymer) nebo chitósan (GlcN polymer), které jsou komerčně dostupné ve velkém rozsahu nebo polysacharidy N- acetylgalaktosamínu/galaktosaminu (například známé z bakteriálních zdrojů), je oxidován na odpovídající sacharid vazby 1-4. Tato metoda může být také použita na polymery gaiaktanu. Deriváty kyseliny uronové mohou být připraveny také z přirozených polymerů obsahujících kyseliny uronové, například z pektinů nebo z glukuronové kyseliny obsahující bakteriální polysacharidy včetně N-acetylheparinu, * +* *» D? 44 ···♦ • 494 9 944 ·· 4 • 4

494 4 4 · · • · · 4 4 «« 4444 hyaluronové a chonroitinové typy bakteriálních exopolysacharidů. Tento způsob zahrnuje

1) derivatizaci skupin karboxylových kyselin polysacharidu, nejlépe amidovou vazbou a

2) hydrolýzu polysacharidu na monosacharidy kyseliny uronové nebo deriváty monosacharidů kyseliny uronové.

Jsou také známé chemické a enzymatické způsoby oxidování primárního alkoholu na uhlíku 6 polysacharidu na aldehyd nebo na karboxylovou kyselinu. Aldehyd může být dále derivatizován , například redukční aminací na amin. Nejlépe je koncový Gal nebo GalNAc oxidován oxidačnímu enzymu primárního alkoholu podobnou oxidázou galaktózy a může pak být dále derivatizován, například aminy.

Zbytky kyseliny uronové mohou být konjugovány na disacharidy nebo oligosacharidy standardními způsoby organické chemie. Nebo může být GIcA vázána transferázou glukuronylu transferujíce GIcA z UDP-GIcA na konečné Lac(NAc).

Deriváty monosacharidů napodobující N-acetylhexozoaminy mohou být vyrobeny z polymeru nebo oligomeru obsahujícího hexosaminy nebo další monosacharidy s volnými primárními aminovými skupinami způsobem zahrnujícím:

1) derivatizaci aminových skupin na sekundárním nebo terciálním aminu nebo amidu

2) hydrolyzování polymeru na odpovídající monosacharidy.

Chitosan a jeho oligosacharidy jsou příklady amin obsahujícího polymeru nebo oligomeru.

Obecně způsob výroby karboxylové kyseliny obsahující, 6-aldehydo zahrnující, amin a/nebo amid zahrnující monosacharid/monosacharidy zahrnuje následující kroky:

1. dle volby vnesení karboxylové kyseliny nebo 6-aldehydové skupiny do uhlohydrátového polymeru, kde je primární hydroxyl dostupný pro modifikaci

2. derivatizaci skupin karboxylové kyseliny nebo 6-aldehydových skupin nebo primárních aminových skupin polymeru na sekundární nebo terciální aminy nebo amidy, je-li použit krok 1, je krok 2 dle volby.

3. hydrolýzu polymeru na odpovídající monosacharidy.

Tato hydrolýza na monosacharidy může být také částečná a poskytnout vhodné disacharidy nebo oligosacharidy, aby poskytly analogické látky. Nejlépe poskytne hydrolýza alespoň 30 % monosacharidů. Metody poskytující tyto chemické kroky jsou v oboru známé. Například oxidace polysacharidů na odpovídající monosacharidy může •0 0000 «** < 0 · • 0*

0 0

0 · 0 · • 0 · 0 · · • · 0 0 0

000 0· 00

0 0 0 • 0 0 0 0 ··· 00« t 0 0 0 0 0 00 00 00 být provedena tak, jak popisuje Muzzarelli et al., 1999 a 2002. Tyto metody jsou vhodnější než použití nechráněných monosacharidú, protože se vyhneme ochraně nebo reaktivním redukujícím koncům monosacharidú.

Ve vhodném včlenění jsou účinně syntetizovány sekvence oligosacharidů obshující GlcAp3LacNAc pomocí transglykosylace pomocí specifické glukuronidázy, například glukuronidázy z hovězích jater. Uvědomili jsme si, že enzym se může polohově specificky přenést z β1 -3 spojení na Gaip4GlcNAc a Gaip4Gic s s neočekávaně velkou produkcí pro reakci transglykosylace. Obecně taková selektivita a výnosy kolem 30 % či více nejsou transglykosylačními reakcemi získány.

Jedním včleněním tohoto vynálezu je použití látky nebo receptoru vázajícího Helicobacter pylori obsahující sekvenci oligosacharidů [Gal(A)q(NAc)_r/Glc(A)_q(NAc)_ra3/p3]s[Galp4GlcNAcp3]_tGal34Glc(NAc)_u kde q, r, s, t, a u jsou každé nezávisle 0 nebo 1, takže když t = 0 a u = 0, je pak sekvence oligosacharidů vázaná na polyvalentní nosič nebo přítomná jako volný oligosacharid ve vysoké koncentraci, a na analogy nebo deriváty uvedené sekvence oligosacharidů mající vazebnou aktivitu na Helicobacter pylori pro výrobu prostředku majícího vazebné nebo potlačující působení na Helicobacter pylori.

A v sekvenci oligosacharidů popsané výše označuje kyselinu uranovou zbytku monosacharidú nebo derivát uhlíku 6 zbytku monosacharidú, nejlépe je derivátem uhlíku 6 amid kyseliny uranové.

Následující sekvence oligosacharidů patří mezi vhodné látky vázající Helicobacter pylori pro použití tohoto vynálezu

Gaip4GlcNac,

GalNAca3Gaip4GlcNAc, GalNAcp3Galp4GlcNAc, GlcNAca3Galp4GlcNAc, 63ΐΝΑοβ3θ8ΐβ4ΟΙοΝΑο, Gala3Ga^4GlcNAc, Ga^3Galp4GlcNAc, Glca3Ga^4GlcNAc, G^3Ga^4GlcNAc, θ3ΐβ40οΝΑοβ363ΐβ46ΙοΝΑο, Galp4GlcNAc33Ga^4Glc,

GalNAca3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc, GalNAcp3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc, GlcNAca3Gaip4GlcNAcp3Galp4Glc, GlcNAcp3Galp4GlcNAcp3Gaip4Glc, Gala3Galp4GlcNAcp3Gaip4Glc, Galp3Gal34GlcNAcp3Galp4Glc, Glca3Gaip4GlcNAcp3Galp4Glc, Glcp3Gaip4GlcNAcp3Galp4Glc, GalANAcp3Galp4GlcNAc, GalANAca3Galp4GlcNAc, GalAp3Galp4GlcNAc, GalAa3Galp4GlcNAc, GalANAcp3Gaip4Glc, GalANAca3Gaip4Glc, GalAp3Gaip4Glc, GalAa3Gaip4Glc,

GlcANAcp3Galp4GlcNAc, GlcANAca3Gaip4GlcNAc, GlcAp3Galp4GlcNAc, GlcAa3Galp4GlcNAc, GlcANAcp3Gaip4Glc, GlcANAca3Galp4Glc, GlcAp3Gaip4Glc, GlcAa3Galp4Glc,

Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc, a jejich polyvalentní konjugáty s redukujícím koncem, i GalNAca3Gaip4Glc, GalNAcp3Galp4Glc, GlcNAca3Gaip4Glc, GlcNAcp3Gaip4Glc, Gala3Galp4Glc, Galp3Gaip4Glc, Glca3Galp4Glc, a Glcp3Gaip4Glc.

Další včlenění tohoto vynálezu je popsáno ve vzorci 1.

Vzorec 1:

Mezi vhodnými látkami vázajícími Helicobacter pylori nebo směsmi těchto látek tohoto vynálezu a pro použití tohoto vynálezu jsou struktury oligosacharidů podle vzorce 1, kde celá čísla I, m, a n mají hodnoty m 4 1, I a n jsou nezávisle 0 nebo 1, a kde Rí je H a R₂ je OH nebo Rí je OH a R₂ je H nebo Rí je H a R₂ je monosacharidyl- nebo oligosacharidyl- skupina nejlépe beta glykosidicky vázaná galaktosylová skupina, R₃ je nezávisle -OH nebo acetamido (-NHCOCH₃) nebo acetamido skupině analogická skupina. Ryje acetamido (-NHCOCH3) nebo acetamidové skupině analogická skupina.

• ·· · · ·· ·· ···· ·· · · · · · · ·· · ··· ···· ·· · ·· · · · ······ · · ··· · · · ···· ····· ·· ·· ·· ··

Když I = 1, R₄ je -H a Rsje kyslík vázaný na vazbu R₈a tvoří beta anomerní glykosidovou vazbu na sacharid B nebo Rsje -H a R₄ je kyslík vázaný na vazbu R₆a tvoří alfa anomerní glykosidickou vazbu na sacharid B, když je I = 0, R₆ je -OH vázáno na Β. X je zbytek monosacharidu nebo ologosacharidu, nejlépe je X laktosyl-, galaktosyl-, poly-N-acetyl-laktosaminyl, nebo část ze sekvence oligosacharidu 0glykanu nebo N-glykanu; Y je vymezovací skupina koncového konjugátu, například část lipidu ceramidu nebo vazba na Z. Z je oligovalentní nebo polyvalentní nosič. Vazebnou látkou může také být analog nebo derivát uvedené látky podle vzorce 1 mající vazebnou aktivitu s ohledem na Helicobacter pylorí, např. kyslíková vazba (-0-) mezi polohou C1 sacharidu B a zbytkem sacharidu X nebo může být vymezovací skupina Y nahrazena vazbou uhlíku (-C-), dusíku (-N-) nebo síry (-S).

Ve vzorci 1 je R₈ nejlépe amid karboxylové kyseliny, například methylamid nebo ethyalamid, hydroxymethyl (-CH2-OH) nebo skupina karboxylové kyseliny nebo její ester. Amid karboxylové kyseliny může zahrnovat alternativní vazbu polyvalentnímu nosiči Z zahrnující amid, například chitosan nebo polysacharid galaktosaminu nebo Z obsahující primární amin obsahující vymezovací skupinu, nejlépe hydrofilní vymezovací skupinu. Struktura v Re může být také napodobující struktura v oboru známá. Například mohou být použity sekundární nebo terciální aminy nebo amidované sekundární aminy.

Ve vzorci 1 je Rg nejlépe hydroxymethyl, ale může být použit pro derivatizaci, jak je popsáno u Re.

R₃ je hydroxyl acetamidová nebo acetamidovou skupinu napodobující skupina, například Ci^ alkylamidy, arylamido, sekundární amin, nejlépe N-ethyl nebo N-methyl, O-acetyl, nebo O-alkyl, například O-ethyl nebo O-methyl. Ryje stejné jako R₃, ale raději acetamidová nebo acetamidovou skupinu napodobující skupina.

R2 může také přednostně zahrnovat šestičlennou kruhovou strukturu napodobující Gaip4-zakončení.

Látky vázající bakterii jsou vhodně reprezentovány v klastrové formě, například glykolipidy na buněčných membránách, micely, lipozomy, nebo na pevných fázích, například TCL-deskách používaných při stanoveních. Klastrové zastoupení se správnými odstupy tvoří vazby s vysokou afinitou.

Podle tohoto vynálezu je také možné používat vazebné epitopy Helicobacter pylorí nebo přirozeně se vyskytující, nebo jejich synteticky připravené analogy či deriváty, které mají podobnou nebo lepší vazebnou aktivitu vzhledem k Helicobacter • · · pylori. Také je možné použít látku obsahující látku vázající bakterii, například receptorový aktivní gangliosid v tomto vynálezu popsaný nebo jeho analog nebo derivát, který má podobnou nebo lepší vazebnou aktivitu vzhledem k Helicobacter pylori. Látkou vázající bakterii může být glykosidicky vázaný koncový epitop oligosacharidového řetězce, nejlépe řetězce polylaktosaminu.

Látka vázající Helicobacter pylori může být konjugována na látku antibiotika, nejlépe antibiotika penicilinového typu. Helicobacter pylori vázající látka je zaměřena na připojení antibiotika na Helicobacter pylori. Takový konjugát je pro léčbu prospěšný, protože je třeba pro léčebný postup nebo léčbu Helicobacter pylori menšího množství antibiotika, což vede k menším vedlejším účinkům antibiotika. Antibiotická část konjugátu je zaměřena na usmrcení nebo oslabení bakterie, ale konjugát může mít také antiadhezní účinek, jak je popsáno dále.

Látky vázající bakterii, nejlépe v oligovalentní nebo klastrové formě, lze použít k léčení choroby nebo stavu způsobeného přítomností Helicobacter pylori. Dělá se to pomocí vazebných látek Helicobacter pylori pro antiadhezi, t.j., aby se zameziio navázání Helicobacter pylori na receptorové epitopy cílových buněk nebo tkání. Když je vazebná látka Helicobacter pylori podána, bude v navázání bakterie konkurovat receptorovým glykokonjugátům na cílových buňkách. Některé nebo veškeré bakterie budou pak navázány na vazebnou látku Helicobacter pylori, místo na receptor cílových buněk nebo tkání. Bakterie vázané na vazebné látky Helicobacter pylori jsou pak z nemocného odstraněny (například proudem tekutiny v gastrointestinálním traktu), z čehož plyne menší účinek bakterií na zdraví nemocného. Nejlépe je použitou látkou rozpustný prostředek obsahující vazebné látky Helicobacter pylori. Tato látka může být vázána na nosnou látku, kterou pokud možno není protein. Při použití nosné molekuly může být několik molekul vazebné látky Helicobacter pylori navázáno najeden nosič a inhibiční schopnost tak bude lepší.

Cílovými buňkami jsou primárně epiteliální buňky cílové tkáně, zvláště gastrointestinálního traktu, dalšími možnými cílovými buňkami jsou, například, játra a slinivka. Glykosilace cílové tkáně může být změněna kvůli infekci patogenem (Karlsson et al., 2000). Cílové buňky mohou být také maligní, transformované nebo rakovinné/nádorové buňky v cílové tkáni. Transformované buňky a tkáně projevují změněný typ glykosilace a mohou bakterii poskytnout receptory. Navázání lektinů nebo sacharidů (interakce uhlohydrát- uhlohydrát) na sacharidy giykoproteinových nebo glykolipidových receptorů může buňky aktivovat, v případě rakovinných/nádorových • · · · ······ · 9 buněk by to mohlo vést k růstu metastáz karcinomu. O několika epitopech oligosacharidů zde popsaných , například GlcNAcp3Galp4GlcNAc (Hu, j. et al., 1994), Gala3Galp4GlcNAc (Castronovo et al., 1989), a neutrálních a sialylovaných polylaktosaminech z maligních buněk (Stroud et al., 1996), se soudí, že jsou spojené s rakovinou nebo rakovinné antigeny. Řetězce oligosacharidů obsahující zde popsané látky byly také popsány pro lymfocyty (Vivier et al., 1993). Helicobacter pylori je spojována s gastrickým lymfomem. Zde popisované látky mohou být použity k prevenci navázání Helicobacter pylori na premaligní nebo maligní buňky a aktivace rozvoje rakoviny nebo metastáz. Inhibice navázání může léčit rakovinu žaludku, zvláště lymfom. Sekvence oligosacharidu vázající Helicobacter pylori byla zaznamenána ve struktuře GlcNAc33Gal34GlcNAcp6GalNAc lidských gastrických mucinů. Tento epitop mucinu a podobné glykoformy O-glycanu jsou nejpravděpodobněji přirozenými receptory s velkou afinitou pro Helicobacter pylori v lidském žaludku. Toto také naznačovala vazba s velkou afinitou podobné sekvence GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp6GlcNAc jako neoglykolipidu k Helicobacter pylori a sekvence GlcNAc33Gal34GlcNAcp6Gal má také ve stejném stanovení určitou vazebnou aktivitu k Helicobacter pylori. Proto vhodné sekvence oligosacharidů zahrnují O-glykany a analogy sekvencí O-glykanů, například GlcNAcp3Galp4GlcNAcp6GlcNAc/GalNAc/Gal,

GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp6GlcNAc/GalNAc/GalaSer/Thr,

GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp6(Gal/GlcNAc p3)GlcNAc/GalNAc/GalaSer/Thr a glykopeptidy a analogy glykopeptidů obsahující sekvence O-glykanu. I sekvence postrádající neredukující konec GIcNAc mohou mít určitou aktivitu. Podle toho jsou také vhodné veškeré další Helicobacter pylori vázající sekvence oligosacharidu (OS) a zvláště jsou velmi vhodné epitopy trisacharidu, když jsou spojeny redukčním koncem, aby vytvořily struktury OSp6Gal(NAc)₀-i nebo OSp6Glc(NAc)₀-i nebo

OS36Gal(NAc)o-iaSer/Thr nebo OS36Glc(NAc)o-iaSer/Thr. Ser nebo Thr- sloučeniny nebo jejich analogy nebo redukční oligosacharidyjsou, pokud jsou spojeny s polyvalentním nosičem), také vhodné.

Cílové buňky také zahrnují krevní buňky, zvláště leukocyty. Také je známo, že kmeny Helicobacter pylori spojené s peptickým vředem, jako kmen zde nejčastěji používaný, stimuluje zánětlivou reakci granulocytů, dokonce i když je bakterie neopsonizována (Rauteiin et ai., 1994a, b). Počáteční jev při fagocytóze bakterie nejpravděpodobněji zahrnuje specifické lektinu podobné interakce, jejichž důsledkem je aglutinace granulocytů (Ofek a Sharon, 1988). Následně po fagocytovém jevu dojde • · ·· ·· ·· ···· • · A A » · · · · • · · A A AAAAAA A A • •A AA A AAAA • A A AA AA AA AA AA k reakcím oxidačního roztržení, které mohou být významné pro patogenezi chorob spojených s Helicobacter pylori (Babior, 1978). Několik sialylovaných a nekyselých glykosfingolipidů, které mají opakující se jednotky N-acetyllaktosaminu, bylo izolováno a charakterizováno z granulocytů (Fakula et al., 1985; Stroud et al., 1996) a mohou tedy sloužit jako potenciální receptory Helicobacter pylori na povrchu buněk bílých krvinek. Dále byl také ze stejného zdroje izolován X2glykosfíngolipid (Teneberg, S., nepublikováno). Tento vynález potvrzuje přítomnost receptoru sacharidů na lidských erytrocytech a granulocytech, což lze zkoumat pomocí specifického lektinu Nacetyllaktosaminu a monoklonální protilátkou (X₂, GalNAc33Gaip4GlcNAc-). Látky vázající Helicobacter pylori mohou být prospěšné pro inhibici vázání leukocytú na Helicobacter pylori a pro prevenci oxidačního roztržení a/nebo zánětu následujícího aktivaci leukocytú.

Je známo, že Helicobacter pylori může vázat několik druhů sekvencí oligosacharidů. Některé vazby specifických kmenů mohou reprezentovat symbiotičtější interakce, které nevedou k rakovině nebo vážným stavům. Tato fakta o vazbách na rakovinné typy epitopů sacharidů ukazují, že látka vázající Helicobacter pylori může předcházet patologičtějším interakcím, přitom může ponechat některé méně patogenní vazby bakterií/kmenů Helicobacter pylori ca další struktury receptorů. Proto nemusí být pro prevenci chorob vztahujících se k Helicobacter pylori nezbytné úplné odstranění bakterií. Méně patogenní bakterie mohou mít dokonce probiotický vliv na prevenci patologíčtějších kmenů Helicobacter pylori.

Jsme si také vědomi, že Helicobacter pylori obsahuje na svém povrchu rozsáhlé oligosacharidy polylaktosaminů, které alespoň u některých kmenů obsahují nefukosylované epitopy, které mohou být bakterií vázány, jak popisuje vynález. Zde popisovaná látka může také předcházet vazbě mezi bakteriemi Helicobacter pylori a takto bránit, například, bakteriím v procesu kolonizace.

Podle tohoto vynálezu je možné začlenit látku vázající Helicobacter pylori, dle volby s nosičem, do farmaceutického prostředku, který je vhodný k léčbě stavů způsobených přítomností Helicobacter pylori v těle nemocného nebo použít iátku vázající Helicobacter pylori ve způsobu léčby takových stavů. Příklady stavů léčitelných podle tohoto vynálezu jsou chronické povrchové gastritidy, žaludeční vřed, dvanáctémíkový vřed, ne-Hodgkinův lymfom lidského žaludku, žaludeční adenokarcinom, a některé choroby slinivky, kůže, jater nebo srdce, syndrom náhlého dětského úmrtí, autoimunitní choroby, včetně autoimunitní gastritidy a zhoubné anemie, • · ·» ·· ·· ··· · • · · · * · · · ·

4 4 4 4 4 444 444 4 • · · · · · · · · ·

494 44 94 44 44 94 a choroby žaludku, které mají vztah k nesteroidním protizánětlivým lékům, všechny, alespoň částečně, způsobené infekcí Helicobacter pylori.

Farmaceutický prostředek obsahující látku vázající Helicobacter pylori může obsahovat také další látky, například inertní přísadu, nebo farmaceuticky přijatelné nosiče, konzervační látky atd., které jsou odborníkům dobře známé. Látka vázající Helicobacter pylori může být podána společně s dalšími léky, například antibiotiky, požitými proti Helicobacter pylori.

Látka vázající Helicobacter pylori nebo farmaceutický prostředek obsahující takovou látku mohou být podány jakoukoliv vhodnou cestou, ačkoliv je nejvhodnější ústní podání.

Zde použitý výraz „léčení“ se vztahuje jak na léčení, aby byla vyléčena nebo zmírněna nějaká choroba nebo nějaký stav, tak na léčení, které má takové chorobě nebo stavu předejít. Léčení může být prováděno akutní nebo chronickou cestou.

Zde použitý výraz „nemocný“ se vztahuje na jakéhokoliv člověka nebo jiného savce, který léčení podle tohoto vynálezu potřebuje.

Je také možné použít látku vázající Helicobacter pylori k identifikaci jednoho nebo více adhesinů vyšetřením na proteiny nebo uhlohydráty (pomocí interakcí uhlohydrát-uhlohydrát), které se váží na látku vázající Helicobacter pylori. Proteinem vázajícím uhlohydrát může být lektin nebo enzym vázající uhlohydrát. Vyšetření může být například provedeno pomocí afinitní chromatografíe nebo metodami afinitního síťování (llver et al., 1998).

Dále je také možné použít látky specificky vázající nebo inaktivující látky vázající Helicobacter pylori na lidských tkáních přítomné, a tak zamezit navázání Helicobacter pylori. Příklady takových látek zahrnují rostlinné lektiny, například Erithrina cristgalli a Erithrina corallodendron (Teneberg et al., 1994). Pokud jsou použity u člověka, měla by být vazebná látka pro takové použití vhodná, například humanizované protilátky nebo rekombinační glykosidy lidského původu, které jsou neimunogenní a schopné štěpit koncový zbytek/zbytky monosacharidů látky vázající Helicobacter pylori.

V gastrointestinálním traktu jsou ovšem mnohé přirozeně se vyskytující lektiny a glykosidázy, které pocházejí například z potravy, tolerovány.

Dále je možné používat látku vázající Helicobacter pylori jako část výživného prostředku, včetně potravin a krmiv. Výhodné je použít látku vázající Helicobacter pylori jako část takzvané funkční nebo funkcionalizované potravy. Uvedená funkční potrava má pozitivní vliv na zdraví člověka nebo živočicha tím, že předchází vázání • · ·· · · ·· ·*·· • · ··· ······ · · ··· · · · · · · · « · · · · »1 · · · · ··

Helicobacter pylori na cílové buňky nebo tkáně. Látka vázající Helicobacter pylori může být částí určité potraviny nebo funkčního potravinového prostředku. Funkční potravina může obsahovat další přijatelné potravinové složky úředně povolené, například Food and Drug Administration v USA. Látka vázající Helicobacter pylori může být také použita jako nutriční přísada, nejlépe jako potravinové nebo nápojové aditivum, pro výrobu funkční potraviny nebo funkčního nápoje, potravina nebo potravinové aditivum může být také vyrobeno například chováním domácího zvířete, například krávy nebo jiného zvířete, produkujícího látku vázající Helicobacter pylori ve větším množství přirozeně ve svém mléce. Toto může být dosaženo chováním domácího zvířete, které přeexprimuje vhodné glykosyltransferázy ve svém mléce. Pro rozsáhlejší výrobu látky vázající Helicobacter pylori mohou být zvoleny a chovány specifické druhy nebo představitelé domácích zvířat. Látka vázající Helicobacter pylori pro výživný prostředek nebo výživné aditivum může být také vyráběna mikroorganizmy, například bakteriemi nebo kvasnicemi.

Zvláště je vhodné mít látku vázající Helicobacter pylori jako část potravy pro malé děti, nejlépe jako část dětské formulace. Mnoho kojenců je krmeno speciálními formulacemi jako náhradou přirozeného mateřského mléka. Tyto formulace mohou postrádat speciální na laktóze založené oligosacharidy mateřského mléka, zvláště prodloužené oligosacharidy, například lakto-N-neotetraóza, Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc a její deriváty. Lakto-N-neotetraóza a para-lakto-N-neohexaóza (Galp4GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc) i Gaip3Gaip4Glc jsou známé z mateřského mléka a mohou být proto považovány za bezpečná aditiva nebo přísady v dětské stravě. Helicobacter pylori je zvláště infekční pro kojence nebo malé děti, a vzhledem k chorobám které může později způsobovat, je rozumné infekci předcházet, také je známo, že Helicobacter pylori způsobuje syndrom náhlého dětského úmrtí, aie léčba silnými antibiotiky používaná k vyhubení bakterie může být zvláště nevhodná pro malé děti nebo kojence.

Vhodné koncentrace oligosacharidů v mateřském mléce ve funkčních potravinách, které mají být konzumovány (například v rozředěné kojenecké formulaci) jsou podobné koncentracím přítomným v mateřském mléce. Bylo zjištěno, že přirozené mateřské mléko obsahuje početné volné oligosacharidy a glykokonjugáty (které mohou být polyvalentní) obsahující sekvenci(sekvence) oligosacharidů popisovaných tímto vynálezem, proto je možné použít dokonce vyšší než přirozené koncentrace jednotlivých molekul, abychom získali výraznější inhibiční účinek pro Helicobacter pylori ·· ·· 0· ·· 0 00 0 • · · · 0 · · 0 · • ··· 000000 · 0 • · · 0 · · 0 0 0 00 00 bez škodlivých vedlejších vlivů. Přirozené mateřské mléko obsahuje lakto-Nneotetraózu alespoň v rozsahu asi 10 až 210 mg/l s individuálními odchylkami (Nakhla et al., 1999). Proto je lakto-N-neotetraóza vhodně používána ve funkčních potravinách v rozsahu koncentrací 0,01 až 10 g/l, vhodněji 0,01 až 5 g/l, nejvhodněji 0,1 až 1 g/l. Jsou-li volnými zde popsanými oligosacharidy, trisacharidy nebo disacharidy se sekvencí Gaip4Gic na redukujícím konci, jsou vhodně konzumovány v koncentracích 1 až 100 g/l, vhodněji v rozsahu koncentrací 1 až 10 g/l. Nebo je celková koncentrace sacharidů používaných ve funkčních potravinách stejná nebo podobná celkové koncentraci přirozených sacharidů v mateřském mléce, které váží Helicobacter pylori jako popisované látky, nebo které obsahují vazebnou sekvenci epitopu/oligosacharidu, naznačenou v tomto vynálezu. Alespoň v jednom případě bylo oznámeno, že mateřské mléko obsahuje Galp3Gaip4Glc jako hlavní neutrální oligosacharid s vysokou koncentrací (Charlwood etal., 1999).

Dále je možné použít látku vázající Helicobacter pylori při diagnóze stavu způsobeného infekcí Helicobacter pylori. Diagnostická použití také zahrnují použití látky vázající Helicobacter pylori pro typizaci Helicobacter pylori. Je-li látka použita při diagnóze nebo typizaci, může být, například, zahrnuta v sondě nebo testovací tyčince, dle volby zahrnující část testovací soupravy. Když se tato sonda nebo testovací tyčinka dostane do kontaktu se vzorkem obsahujícím Helicobacter pylori, bude bakterie navázána na sondu nebo testovací tyčinku a tak může být ze vzorku odstraněna a dále analyzována.

Výsledky také ukazují, že neredukující konec koncového zbytku monosacharidu ve vhodných sekvencích trisacharidu tohoto vynálezu může obsahovat skupinu karboxylové kyseliny na uhlíku 6 (koncový zbytek monosacharidu je kyselina uronová, HexA nebo HexANAc, kde Hex je Gal nebo Glc) nebo derivát uhlíku 6 zbytku HexA(NAc) nebo derivát uhlíku 6 odpovídajícího zbytku Hex(NAc). Takové koncové zbytky vhodně zahrnují β3- vázanou kyselinu glukuronovou a nejlépe 6-amidy, například jejich methylamid. Proto mohou být deriváty a analogy těchto sekvencí vyrobeny záměnou nebo derivatizací koncové 6-polohy epitopů trisacharidu.

Vhodné látky vázající Helicobacter pylori

Bylo zjištěno, že sekvence oligosacharidů podle tohoto vynálezu jsou neočekávaně účinnými pojivý, pokud jsou přítomny na tenkovrstvém povrchu. Tento vynález umožňuje polyvalentní prezentaci sekvencí glykolipidů. Překvapivě vysoká • ·· ·· ·· ·· ♦·· · φ φ · · · φ φ φ · * · • · · · · ··· 9 9 9 9 aktivita této polyvalentní prezentace sekvencí oligosacharidů činí póly valenci vhodnou cestou pro reprezentaci sekvencí oligosacharidů tohoto vynálezu.

Struktury glykolipidů jsou přirozené přítomny na buněčných membránách v polyvalentní formě. Tento typ reprezentace může být napodoben stanovením na pevné fázi popsaným dále nebo výrobou lipozomů z glykolipidů nebo oligosacharidů.

Tyto nové neoglykolipidy připravené redukční aminací hydrofobního hexadecylanilinu umožnily poskytnout účelnou prezentaci oligosacharidů. Většina zatím známých konjugátů glykolipidů používaných pro navázání bakterie obsahuje negativně nabité skupiny, například fosforester neoglykolipidů fosfaditylethanolaminu. Problémem těchto sloučenin je negativní náboj látky a přirozená biologická vazba zahrnující strukturu fosfolipidu. Je známo, že negativně nabité skupiny se účastní početných nespecifických vazeb s proteiny a dalšími biologickými látkami. Navíc jsou mnohé z těchto struktur labilní a mohou být enzymaticky nebo chemicky odbourávány. Tento vynález je zaměřen na nekyselé konjugáty sekvencí oligosacharidů, což znamená, že sekvence oligosacharidů jsou vázány na nekyselé chemické struktury. Tyto nekyselé konjugáty jsou nejlépe neutrální, což znamená, že sekvence oligosacharidů jsou vázány na neutrální, chemické struktury bez náboje. Vhodnými konjugáty podle tohoto vynálezu jsou polyvalentní látky.

V dosavadní technice jsou bioaktivní sekvence oligosacharidů často vázány na hydrofobní struktury nosiče redukcí části struktury oligosacharidů s aktivním receptorem. Jsou používány hydrofobní vymezovací skupiny obsahující řetězce alkylů (-CH2-)n a/nebo benzylové kruhy. Obecně je ovšem známo, že hydrofobní struktury se účastní nespecifických interakcí s proteiny a dalšími bioaktivními molekulami.

Údaje o neolipidech v příkladech uvedených dále ukazují, že za experimentálních podmínek ve stanovení použitých nezpůsobují části hexadecylanilinu sloučenin neoglykolipidů nespecifické vazby pro zkoumanou bakterii. V neoglykolipidech tvoří patrně hexadecylanilinová část konjugátu vrstvu lipidu jako strukturu a není dostupná pro navázání. Tento vynález ukazuje, že redukce zbytku monosacharidů patřícího k vazebnému epitopu může zničit vazbu. Dále jsme si uvědomili, že redukovaný monosacharid může být použit jako hydrofilní vymezovací skupina, aby spojil epitop receptoru a polyvalentní prezentační strukturu. Podle tohoto vynálezu je vhodné vázat na polyvalentní nebo multivalentní molekulu nosiče bioaktivní oligosacharid pomocí hydrofilního vymezovací skupiny, aby se vytvořila polyvalentní nebo oligovalentní/multivalentní struktura. Veškeré polyvalentní (zahrnující více než 10

9 ·	• · 9	• 9 9	9 9 9 9 9	9	9 9 9	999
9 9	9 9	9	9 999	• 9	9
9 9	9	9	9 9	9	9	9
9 9	99	9 9	9 9		99	9 9

zbytků oligosacharidú) a oligovalentní/multivalentní struktury (zahrnující 2 až 10 zbytků oligosacharidú) jsou zde nazývány polyvalentními strukturami, ačkoliv v závislosti na použití mohou být oligovalentní/multivalentní konstrukce vhodnější než větší polyvalentní struktury. Hydrofilní vymezovací skupina zahrnuje nejlépe alespoň jednu hydroxylovou skupinu. Vhodněji obsahuje vymezovací skupina alespoň dvě hydroxylová skupiny a nejlépe obsahuje vymezovací skupina alespoň tři hydroxylová skupiny.

Podle tohoto vynálezu je hydrofilní vymezovací skupinou nejlépe flexibilní řetězec obsahující jednu nebo několik-CHOH- skupin a/nebo amidový postranní řetězec, například acetamido -NHCOCH₃- nebo alkylamidový řetězec. Hydroxylové skupiny a/nebo acetamidová skupina také chrání vymezovací skupinu před enzymatickou hydrolýzou in vivo. Výraz flexibilní znamená, že vymezovací skupina zahrnuje flexibilní vazby a netvoří kruhovou strukturu bez flexibility. Příklady flexibilních hydrofilních vymezovacích skupin jsou redukované zbytky monosacharidů, například takové, které vznikají při redukční aminaci v tomto vynálezu. Flexibilní hydrofilní vymezovací skupina je optimální pro to, abychom zabránili nespecifické vazbě neoglykolipidů nebo polyvalentních konjugátů. Je základní optimální jednotkou při biologických stanoveních a pro bioaktivitu farmaceutických přípravků nebo, například, funkčních potravin.

Obecný vzorec konjugátu s flexibilním hydrofilním spojovníkem má následující vzorec 2:

[OS-O-(X)_n-Li-CH(H/{CHi-₂OH}_pi) - {CHiOH}_p2- {CH(NH-R)}_p3 - {CFhOH}^ - L₂]_m-Z kde Li a L₂jsou spojovací skupiny, které obsahují nezávisle spojovací atom kyslíku, dusíku, síry nebo uhlíku nebo dva spojovací atomy skupiny tvořící spojení, například O, -S, -CH₂-, -N-, -N(COCH3)-, amidové skupiny -CO-NH- nebo -NH-CO- nebo -N-N(derivát hydrazinu) nebo aminooxy vazby -O-N- a -N-Ο-, l_i je vazba uhlíku 1 redukčního konce monosacharidu X nebo, když n = 0, Li nahradí O- a váže se přímo z redukujícího konce C1 patřícího OS.

p1, p2, p3 a p4 jsou nezávisle celá čísla od 0 do 7 s podmínkou, že alespoň jedno z p1, p2, p3 a p4 je alespoň 1. ΟΗμ₂ΟΗ ve větvícím členu {CHi.₂OH}_pi znamená, že koncová skupina řetězce je CH₂OH, a když p1 je větší než 1, existuje sekundární alkoholová skupina -CHOH- spojující koncovou skupinu se zbylou částí vymezovací skupiny. R je nejlépe acetylová skupina (-COCH3) nebo je R alternativní vazba k Z a pak je L₂ koncová skupina řetězce s jedním nebo dvěma atomy, v dalším včlenění je R

• • · ·	• 4 •	44 94	4 4 9	9	9994 4
4	4 9 4
4 9	4 4	9	4 444 9	•	•	4
4 4 4 4 4	4 9 4	9	4 9 9 4 9 4	4 44	9	4 4 49

skupina tvořící analog zahrnující C1-4 acylovou skupinu (nejlépe hydrofilní, například hydroxyalkylovou skupinu) zahrnující amidovou strukturu nebo H nebo Cm alkyl tvořící amin. A m > 1 a Z je polyvalentní nosič. OS a X jsou definovány u vzorce 1.

Vhodné polyvalentní struktury zahrnující flexibilní hydrofilní vymezovací skupinu podle vzorce 2 zahrnují Helicobacter pylori vázající sekvenci oligosacharidů (OS) β1-3 vázanou na Gaip4Glc(red)-Z, a OSp6GlcNAc(red)-Z a OSf36GalNAc(red)-Z, kde „(red)“ znamená strukturu aminové vazby vytvořenu redukční aminací z redukujícího konce monosacharidů a aminové skupiny polyvalentního nosiče Z.

V tomto vynálezu je oligosacharidová skupina nejlépe vázána polyvalentní nebo oligovalentní formou na nosič, kterým není protein nebo peptid, abychom se vyvarovali antigenicity a možných alergických reakcí, nejlépe je hlavním řetězem polypeptidu přírodní neantigenní polysacharid.

Když byly srovnány vazebné aktivity glykolipidů a neoglykolipidů, bylo zjištěno, že sekvence s Gala3Galp- mají při polyvalentní prezentaci na tenkovrstvé desce nižší aktivitu, sekvence s koncovou GalGaipGIcNAc- byly také slabší. Proto zahrnuje optimální nekyselá látka podle tohoto vynálezu koncovou sekvenci oligosacharidu

Gal(A)qi(NAc)_r1/Glc(A)q₂(NAc)_r2a3/p3Gaip4Glc(NAc)_u kde q1, q2, r1, r2 a u jsou každé nezávisle 0 nebo 1, s podmínkou, že když jak q1, tak r1 jsou 0, tak neredukující konec koncového zbytku monosacharidu není Gala. Vhodnější je u = 0 a nejvhodnější sekvencí oligosacharidu přítomnou v polyvalentní formě je

GalNAc/Glc(NAc)_r2a3/p3Ga^4GlcNAc kde r2 je nezávisle 0 nebo 1 a jeho analog nebo derivát.

Následující sekvence oligosacharidů jsou zvláště vhodné. Reprezentují struktury, které nebyly popsány u lidských nebo živočišných tkání: Glc(A)q(NAc)_ra3/p3Gaip4Glc(NAc)_u s podmínkou, že když obsahuje sekvence oligosacharidu vazbu β3, q a r jsou 1 nebo 0; nebo GalA(NAc)_ra3^3Ga^4Glc(NAc)_u.

Novost výše uvedených sekvencí oligosacharidů je činí zvláště vhodnými. Žádné glykosidy štěpící takové sekvence nejsou známy. Proto jsou tyto sekvence zvláště stabilní a za biologických podmínek vhodné. Přirozený typ sekvencí popsaných tímto vynálezem může být štěpen enzymy glykosidázy, které snižují jejich vhodnost, zvláště

	98	98	9 8	88
• · 9	9	9	9 9 9	9	9	•
• ·	• 9	9	9 944	8 9	•	•
• ·	9	9	• ·	•	•	• «
• 9 9	9 9	9 9	99	99		• ·

jsou-li použity v lidském nebo živočišném těle. Je známo, že enzymy glykosidázy tyto sekvence štěpící jsou aktivní v lidském gastrointestinálním traktu. Několik glykosidů, například N-acetylhexosaminidázy nebo galaktosidázy jsou charakterizovány jako trávicí enzymy a jsou také přítomné v potravinách.

Je také známo, že nové látky podle tohoto vynálezu jsou také vhodné pro inhibici toxínu A z Clostrdium difficile S. Teneberg et al 1996. Vazebný profil toxinu A se staršími látkami je velice podobný specifice Helicobacter pylori zde popsané. Tak mohou být vazebné látky Helicobacter pylori použity například pro léčení průjmu způsobeného Clostrdium difficile. Názvosloví glykolipidů a uhlohydrátů je podle doporučení IUPAC-IUB Komise biochemického názvosloví (Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29).

Předpokládá se, že Gal, Glc, GIcNAc a Neu5Ac jsou D- konfigurace, Fuc je Lkonfigurace a všechny jednotky monosacharidů jsou ve formě pyranózy. Glukosamin je uveden jako GlcN nebo GlcNH₂ a galaktosamin jako galN nebo GalNH₂. Glykosidové vazby jsou ukázány částečně v kratším a částečně v delším názvosloví, vazby Neu5Aczbytků a3 a a6 znamenají totéž, co a2-3 a, popřípadě, a2-6, a u dalších zbytků monosacharidů crt-3, β1 -3, β1-4 a β1-6 mohou být zkráceny na α3, β3, β4 a, popřípadě, β6. Laktosamin se vztahuje na N-acetyllaktosamin, Ga^4GlcNAc, a kyselina sialová je kyselina N-acetylneuraminová (Neu5Ac) nebo kyselina Nglykolylneuraminová (Neu5Gc) nebo jakákoliv další přirozená kyselina sialová. Výraz glykan zde znamená povšechně oligosacharidové nebo polysacharidové řetězce přítomné v lidských nebo živočišných glykokonjugátech, zvláště na glykolipidech nebo glykoproteinech. Ve zkráceném názvosloví pro mastné kyseliny a zásady, znamená číslo před dvojtečkou délku uhlíkového řetězce a číslo po dvojtečce udává celkový počet dvojných vazeb v uhlovodíkovém řetězci. Zkratka GSL znamená glykosfingolipid. Zkratky nebo zkrácené názvy nebo symboly glykosfingolipidů jsou udány v textu a v tabulce 1 a 2. Helicobacter pylori znamená i bakterie podobné Helicobacter pylori.

V tomto vynálezu kyselina hex(NAc)-uronová a její deriváty a zbytky jsou označeny následovně: GIcA je kyselina glukuronová a deriváty uhlíku 6 glukózy nebo kyseliny glukuronové, GalA je kyselina galacturonová a deriváty uhlíku 6 galaktózy nebo kyseliny galakturonové, GlcANAc je kyselina N-acetylglukuronová a deriváty uhlíku 6 Nacetylglukosaminu nebo je kyselina N-acetylglukosaminuronová a GalANAcje kyselina N-acetylgalaktosaminuronová a deriváty uhlíku 6 N-acetylgalaktosaminu nebo kyseliny N-acetylgalaktosaminuronové.

• ·· ·* ·8 ·« ···* 9 8 8 9 9 8 8 8 9 8 8

8 8 9 898899 8 8

8 9 9 9 8 8 8 8 8

999 88 89 99 99 88

Výraz „koncová sekvence oligosacharidu“ značí, že oligosacharid není substituován na redukující konec koncového zbytku jiným zbytkem monosacharidu.

Výraz ,,α3/β3“ značí, že sousední zbytky v sekvenci oligosacharidu mohou k sobě být buď vázány a3- nebo β3Tento vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které žádným způsobem nemají vymezovat rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a způsoby

Materiály - TLC silikagel 60 (hliník) desky byly od firmy Merck (Darmstadt, Německo). Veškeré zkoumané glykosfingolipidy byly získány v naší laboratoři, βGalaktosidáza (Escherichia coli) byla zakoupena od firmy Boehringer z Mannheimu (Německo), medium Ham’s F 12 od firmy Gibco (Velká Británie), ³⁵S-methionin z Amershamu (Velká Británie) a FCS (plodové telecí sérum) bylo z Sera-Lab (Anglie). β4-Galaktosidáza (Streptococcus pneumoniae), β-N-acetylhexosaminidáza (Streptococcus pneumoniae) a sialidáza (Arthrobacter ureafaciens) byly z Oxford GlycoSystems (Abington, V. B.). Klinické izoláty Helicobacter pylori (kmeny 002 a 032) získané od nemocných gastritidou a, popřípadě, dvanáctémíkovým vředem byly velkorysým darem Dr. D. Danielssona, Orebro Medical Center, Švédsko. Typ kmene 17875 byl ze sbírky kultur university z Goteborgu (CCUG).

Glykosfingolipidy. Čisté glykosfingolipidy experimentu, který ukazují obrázky 7A a 7B byly připraveny ze zcela kyselých nebo nekyselých frakcí ze zdrojů uvedených v tabulce 2 jak popisuje Karlsson, 1987. Obecně byly jednotlivé glykosfingolipidy získány acetylací (Handa, 1963) celých glykosfingolipidových frakcí a separovány opakovanou sloupcovou chromatografií na kyselině křemičité, a následně strukturně charakterizovány hmotnostní spektrometrií (Samuelsson et al., 1990), NMR (Falk et al., 1979a, b, c; Koerner ml. et al., 1983) a degradačními postupy (Yang a Hakomori, 1971; Stellner et al., 1973). Glykolipidy odvozené z králičího brzlíku jsou popsány dále.

Čištění glykolipidů. Kyselé glykosfingolipidy byly izolovány z 1000 g acetonového prášku králičího brzlíku. (Pel-Freeze Biological lne., Severní Arkansas, USA).

Acetonový prášek byl extrahován v zařízení Soxhlet pomocí chloroform/methanol 2/1 (obj./obj. pokud není uvedeno jinak) 24 hodin a pak pomocí chloroform/methanol/voda 8/1/1 36 hodin. Extrahované lipidy, 240 g, byly podrobeny Folchově separaci (Folch et « 4« »· · · ·· ···* • 4 4 4 4 · 4 « · 4 4 • · · ♦ · ······ « 4

4 4 4« · 4 4 4 4

444 44 44 44 44 44 al., 1957) a sebraná hydrofilní fáze gelové chromatografií na měničích iontů na DE23 celulóze (DEAE, Whatman, Maidstone, VB). Tyto izolační kroky poskytly 2,5 g kyselých glykosfingolipidů. Gangliosidy byly separovány podle počtu sialových kyselin iontoměničovou gelovou chromatografií s otevřenou trubicí na skleněné koloně (50 mm vnitř, průměr). Kolona byla napojena na HPLC pumpu vytvářející konkávní gradient (předprogramovaný gradient č. 4, System Gold Chromatographic Software, Beckman Instruments lne., Kalifornie, USA) počínaje methanolem a konče 0,5M CH3COONH4 v methanolu. Rychlost toku byla 4 ml/min. a bylo sebráno 200 frakcí s 8 ml v každé frakci. Bylo najednou aplikováno 300 - 400 mg směsi gangliosidů na 500 g DEAE Sepharose, (CL6, Pharmacia, Uppsala, Švédsko, výška vrstvy přibližně 130 mm). Monosialylované gangliosidy byly dále separovány pomocí HPLC na křemenné koloně, 300 mm x 22 mm vnitř, průměr, velikost pórů 120 A, velikost částiclO pm (SH-044-10, Yamamura Ltd., Kyoto, Japonsko). Najednou bylo aplikováno přibližné 150 mg monosialylovaných gangliosidů a byl použit přímý eluční gradient (chloroform/methanol/voda od 60/35/8 do 10/103, 4 ml/min, 240 frakcí).

Částečná kyselá hydrolýza - Desializace gangliosidů byla provedena v 1,5% CH3COOH ve vodě při 100 °C, poté byl materiál neutralizován NaOH a sušen pod dusíkem. Kvůli částečnému odbourání hlavního řetězce uhlohydrátu byl glykolipid hydrolyzován v 0,5M HCI po 7 minut ve vařící vodní lázni. Materiál pak byl neutralizován a rozdělen v C/M/H2O, (8:4: 3, obj./obj.)2. Nižší fáze byla sebrána, odpařena pod dusíkem a izolované glykolipidy byly použity pro analýzu.

Příprava pentaglykosylceramidu z hexaglykosylceramidu enzymovou hydrolýzou - hexaglykosylceramid (struktura 2, tabulka 1) získaný z heptaglykosylceramidu (4 mg, z králičího brzlíku) (struktura 1, tabulka 1) kyselou desialylací (viz nahoře) byl znovu rozpuštěn v C/M (2 : 1) a nanesen na malou silikagelovou kolonu (0,4 x 5 cm). Kolona byla vymývána C/M/H₂O, (60 : 35 : 8, obj./obj.). Byly sebrány asi 0,2 ml frakce a testovány na přítomnost uhlohydrátú. Izolovaný hexaglykosylceramid (2,0 mg) byl rozpuštěn v 1,5 ml 0,1 M pufru fosforečnanu draselného, pH 7,2, obsahujícím teurodeoxycholát sodný (1,5 mg/l), MgCI₂ (0,001 M) a β-galaktosidázu (E. coli, 500 U, když stanovována na 2-nitrofenyl-3-D-galaktosidu jako substrátu), a vzorek byl přes noc inkubován při 37 °C. materiál byl pak dělen v C/M/H₂O, (10 : 5 : 3) a glykolipid obsažený v nižší fázi byl čištěn pomocí silikagelové chromatografie (0,4 x 5 cm kolony) jak je popsáno výše u hexaglykosylceramidu. Aby se odstranil veškerý zbývající detergent • fr* ·· ·· frfr ···· • · · · fr · · · · · • frfr frfrfrfr frfr · • · · · · ·»···· · · fr·· ·· · ···· • •••fr ·· ·· ·· ·· byla tato chromatografie opakována dvakrát. Konečný výtěžek pentaglykosylceramidu byl 0,7 mg.

Trávení lipidů endoglykokeramidázou (Ito a Yamagata, 1989) - Reakční směs obsahovala 200 pg glykolipidu, 80 pg teurodeoxycholátu sodného a 0,8 ml) enzymu v 160 pl 50mM acetátového pufru, pH 6,0. Vzorek byl přes noc inkubován při 37 °C, poté byla přidána voda (140 pl) a C/M, 2 : 1, obj., 1500 pl), a vzorek byl třepán a odstředěn. Svrchní fáze byly sušena pod dusíkem, opět rozpuštěna v malém objemu vody a odsolena na koloně (0,4 x 10 cm) Sephadex G-25, která byla ekvilibrována v Η₂Ο a vymyta vodou. Byly sebrány frakce o asi 0,1 ml a testovány na přítomnost cukrů.

Permetylace sacharidů - Permetylace byly prováděna podle Larsona et al., 1987. Hydroxid sodný byl ke vzorkům přidán před methyljodidem, jak doporučili Needs a Selvendran 1993. V některých pokusech byly sacharidy před methylací redukovány NaBH4. V tomto případě bylo množství methyl jododu zvýšeno na konečný poměr DMSO (dimethylsulfoxid)/ methyljodid 1 : 1 (Hansson a Karlsson, 1990).

Plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie - Plynová chromatografie byla prováděna na plynovém chromatografu Hewlett-Packard 5890A Series II vybaveném vstřikovačem na koloně a plamenově ionizačním detektorem. Permethylované oligosacharidy byly analyzovány na kapilární koloně s roztaveným křemíkem (Fluka, 11 m x 0,25 mm vnitř, průměr) potažené zesítěným PS264 (tloušťka filmu 0,03 pm). Vzorek byl rozpuštěn v ethylacetátu a vstříknut na koloně při teplotě 80 °C. Teplota byla naprogramována od 80 °C do 390 °C při rychlosti 10 °C/min. s pozdržením 2 minut při vyšší teplotě. Plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie permetylovaných oligosacharidú byla prováděna na plynovém chromatografu Hewlett-Packard 5890A Series II připojeným na hmotnostní spektrometr JEOL SX-102 (Hansson a Karlsson, 1990). Analýzy FAB-MS byly prováděny na hmotnostním spektrometru JEOL SX-102. Negativní spektra FAB byla vyvolána pomocí Xe atomového bombardování (10 kV) a triethanolaminu jako matrix.

NMR spektroskopie - Na spektrometru Jeol Alpha 500 (Jeol, Tokyo, Japonsko) byla při 11,75 T zaznamenána protonová NMR spektra. Vzorky byly před analýzou zaměněny deuteriem a spektra pak byla zaznamenávána při 30 °C s digitálním rozlišením 0,35 Hz/část. Chemické přesuny jsou udány vzhledem k TMS (tetramethylsilanu) pomocí interního signálu rozpouštědla.

• 9* ·« 99 ·9 9*99 • 9 * · 9 » * 9 «9 9 » «99 » 9 « 9 9 · * ·

99* 99 9 9999

999*9 99 99 9 9 9 9

Analytické enzymatické testy - Enzymatické testy Oxford GlycoSystems byly prováděny podle doporučení výrobce kromě toho, že ke každé inkubační směsi byl přidán Triton X-100 na konečnou koncentraci 0,3 %. Když byla použita pro trávení směs sialidázy a p4-galaktosidázy, byl použit inkubační pufr ze soupravy p4-galaktosidázy. Pokud byla ve směsi přítomna p4-hexosaminidáza byl použit pufr z této soupravy enzymů. Koncentrace enzymů v inkubačních směsích byly: 80 mU/ml Hexp4HexNAcgalaktosidázy (S. pneumoniae), 120 mU/ml β-N-Acetyihexosaminidázy (S. pneumoniae) a 1 U/ml sialidázy (Arthrobacter ureafaciens). Koncentrace substrátu byla asi 20 μΜ. Enzymatické trávení bylo prováděno přes noc při 37 °C. Po trávení byly vzorky sušeny a odsoleny pomocí malých kolon Sephadex G-25 (Wells a Dittmer, 1963), 0,3 g, ekvilibrovány v C/M/H₂0, (60 : 30 : 4,5, obj.). Každý vzorek byl aplikován na kolonu ve 2 ml stejného rozpouštědla a promýván 2,5 ml C/M/H₂O, (60 : 30 : 4,5 a 2,5 ml C/M, (2:1). Aplikační a promývací roztoky byly sebrány a odpařeny pod dusíkem.

Další analytické metody - Hexóza byla zjišťována podle Dubois et al., 1956.

De-N-acylace. Zpracováním různých glykosfingolipidů s bezvodým hydrazinem jak bylo dříve popsáno (Ángstróm et al., 1998) byla dokončena konverze acetamidové části GIcNAc/GalNAc zbytků na amin.

Kultivace bakterií. Kmeny Helicobacter pylori byly uchovávány při -80 °C v tryptické sojové živné půdě obsahující 15 % glycerolu (obj. %). Bakterie byly nejprve kultivovány na GAB-CAMP agaru (Soitesz et al., 1988) za vihkých (98 %) mikroaerofilních podmínek (O₂: 5 až 7 %, CO₂: 8 až 10 % a N₂: 83 až 87 %) při 37 °C po 48 až 72 hodin. Pro označení byly kolonie naočkovány na GAB-CAMP agaru, s výjimkou výsledků uvedených na obr. 1A a 1B, kde byl místo něj použit Brucella agar (Difco, Detroit, Ml), a desky byly postříkány 50 pCi ³⁵S-methioninu (Amersham, Velká Británie), rozpuštěného v 0,5 ml fosforečnanem pufrovaném solném roztoku (PBS), pH 7,3. Po 12 až 24 hodinách inkubace za mikroaerofilních podmínek byly buňky seškrábnuty, třikrát promyty PBS a resuspendovány na 1 x 10⁸ CFU/ml v PBS. Eventuelně byly kolony naočkovány (1 x 10⁵ CFU/ml) v Harrťs F12 (Gibco BRL, VB), doplněny o 10% tepelně inaktivované plodové telecí sérem (Sera-Lab). Pro označení bylo přidáno 50 pCi ³⁵S-methioninu na 10 ml media a za třepání inkubováno za mikroaerofilních podmínek po 24 hodin. Bakteriální buňky byly sklizeny odstředěním a čistota kultur a nízký obsah kokoidních forem byl zajištěn kontrastní fázovou mikroskopií. Po dvou promytích PBS byly buňky resuspendovány na 1 x 10⁸ CFU/ml

4« 4944 • 4* ·4 ·>· ·« 9494 · 4 4 • 94 4449 49 4

494 949449 9 ·

4·4 94 · 9449

444 44 «9 44 44 4· v PBS. Produktem obou označovacích procesů byly suspenze se specifickými aktivitami přibližně 1 cpm na 100 organizmů Helicobacter pylori.

TLC bakteriální stanovení překrýváním. Tenkovrstvá chromatografie byla prováděna na skleněných nebo hliníkem podložených silikagelových 60 HPTLC deskách (Merck, Darmstadt, Německo) pomocí chloroformu/methanolu/vody 60 : 35: 8 (obj. %) jako rozpouštědla. Chemická detekce byla provedena pomocí skvrn anisaldehydem (Waldi, 1962). Bakteriální stanovení překrýváním bylo prováděno podle dřívějšího popisu (Hansson et al., 1985). Glykosfingolipidy (1 až 4 pg/pás, nebo jak je vyznačeno u legendy obrázku) byly chromatografovány na hliníkem podložených silikagelových deskách a pak na nich upraveny 0,3 až 0,5% polyizobutylmethakrylátem v dietylether/n-hexanu 1 : 3 (obj. %) po 1 min., vysušeny a následně namočeny do PBS obsahujícím 2% albumin hovězího séra a 0,1% Tween 20 po 24 hodin. Suspenze radioaktivně označené bakterie (rozpuštěná v PBS na 1 x 10⁸ CFU/ml a 1 až 5 x 10⁶ cpm/ml) byla nastříkána na chromatogram a inkubována po 2 hodiny, následovně opakovaně vymývána pomocí PBS. Po vysušení byly chromatogramy vystaveny rentgenovým filmům XAR-5 (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, USA) po 12 až 72 hodin.

TLC proteinové stanovení překrýváním. Označení ¹²⁵J monoklonální protilátky TH2 a lektinu z Erythrina crístagalii (Vector Laboratories, lne., Burlingame, Kalifornie) bylo provedeno lodogenovou metodou (Aggarwal et al., 1985), která dávala průměrně 2 x 10³ cpm/pg. Postup překrývání byl stejný, jako postup popsaný dříve pro bakterie, s tou výjimkou, že nebyl použit Tween a že byl místo bakteriální suspenze použit protein označený ¹²⁵J zředěný přibližně na 2 x 10³ cpm/μΙ s PBS obsahujícím 2% albumin hovězího séra.

Molekulární modelování. Konformery glykosfingolipidů s minimální energií uvedené v tabulce 1 byly vypočítány v programu molekulárního modelování Biograf (Molecular Simulations lne.) pomocí silového pole Dreiding-ll (Mayo et al., 1990) na pracovní stanici Silicon Graphics 4D/35TG. Dílčí atomové náboje byly vytvořené pomocí metody vyrovnávání nábojů (Rappé a Goddard III, 1991), a pro coulombické interakce byla použita dielektrická konstanta závislá na vzdálenosti (ε = 3,5 r). Navíc byl použit speciální člen vázající vodík, v němž byla maximální interakce (Dhb) nastavena na -4 kcal mol'¹. Torzní úhly Glcpi Cer vazby jsou definovány následovně: 0 = H-1-C-1O-1-C-1^=C-1-O-1-C-1-C-2a0=O-1-C-1-C-2-C-3 počínaje koncem glukózy (viz Nyholm a Pascher, 1993).

• o*	•0 00	0000 0
·· v	•	·· 0 0 0	0
0 0	• »	0 0 000 0 0	0	0
• ·	0	0 0 0 0	0	0 0
000	00	00 i· 00		00

Oligosacharid GlcNAcp3Gaip4GlcNAc byl syntetizován z Gaip4GlcNAc (Sigma, St. Luis, USA) a GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp6GlcNAc byl syntetizován z ΟθΙβ4ΟΙοΝΑοβ66ΙοΝΑο inkubací příjmového sacharidu s β3-Νacetylglukosaminyltransferázou lidského séra a UDP-GIcNAc v přítomnosti 8 mM MnCI₂ a 0,2 mg/ml ATP při 37 °C po 5 dní v 50 mM TRIS-HCI pH 7,5. θ3ΐβ46ΙοΝΑοβ66ΙοΝΑο byl získán z ΟΙοΝΑοββΰΙοΝΑο (Sigma, St. Luis, USA) inkubací disacharidu s β4galaktosyltransferázou (kravské mléko, Calbiochem., Kalifornie, USA) a UDP-Gal v přítomnosti 20 mM MnCI₂ po několik hodin v 50mM MOPS-NaOH pH 7,4. Hexasacharid θ8ΐβ3ΟΙοΝΑοβ363ΐβ46ΙοΝΑοβ3θ3ΐβ46Ιο (1 mg, z Dextra lab., Velká Británie) byl zpracováván přes noc 400mU β3/6-ρ3^Κ^έζου (Calbiochem.,

Kalifornie, USA) podle pokynů výrobce. Oligosacharidy byly čištěni chromatograficky a jejich čistota byla stanovena pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií a NMR. θ3ΐα363ΐβ46ΙοΝΑοβ363ΐβ4ΟΙο byl z Dextra laboratories, Reading, Velká Británie. Glykolipid ΟΙοΑβ363ΐβ46ΙοΝΑοβ363ΐβ40οβΟβΓ (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japonsko) byl redukován na Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer jak je popsáno v Lanne et al. 1995. Derivát glykolipidu

Glc(A-methylamid)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer byl připraven amidatací skupiny karboxylové kyseliny kyseliny glukuronové z 6ΙοΑβ363ΐβ4βΙοΝΑοβ363ΐβ4ΟΙοβΰβΓ jak je popsáno v Lanne et al. 1995.

Výsledky

Heptaglykosylceramid NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer byl purifikován z králičího brzlíku pomocí HPLC podle dříve uvedeného popisu.

Struktura byla charakterizována pomocí NMR a hmotnostní spektrometrií (údaje nejsou uvedeny). Gangliosid heptasacharidu byl vázán většinou izolátů Helicobacter pylori (asi 60) testovaných v laboratoři vynálezců. Abychom zjistili možné menšinové složky v materiálu heptaglykosylceramidu, byl gangliosid desialylován, podroben působení endoglykoceramidázy, po čemž byly uvolněné oligosacharidy permethylovány a analyzovány plynovou chromatografií a EI/MS, (obr. 1A a 1B). V oblasti šesti cukrů byly identifikovány dva sacharidy, které vykázaly očekávanou karbohydrátovou sekvenci Hex-HexNAc-Hex-Hex-HexNAc-Hex-Hex, jak bylo potvrzeno fragmenty iontů při m/z 219, 464, 668, 913 a 1118. Když byly karbohydráty přeměněny na aiditoly (redukcí NaBH₄) před methylací, byly navíc k dříve uvedeným iontům zjištěny (údaje neuvedeny) • · 4 « · ··

zřetelné fragmenty iontů při m/z 235, 684 a 1133. Převládající sacharid, který odpovídal za více než 90 % celkového materiálu (pík B, obr. 1A a 1B), byl charakterizován silným fragmentem iontu při m/z 182, který potvrzoval přítomnost β4ΘΙοΝΑο (neolaktové řady, typ 2 karbohydrátový řetězec). Menšinový sacharid (pík A, obr. 1A a 1B) vykázal spektrum typické pro typ 1 řetězec (lakto řady) s velmi slabým fragmentovým iontem při m/z 182 a silným fragmentovým iontem při m/z 228. Preparát také obsahoval stopy dalších látek pozitivních na cukr, které mohly být sacharidy obsahující čtyři cukry a pět cukrů stejných řad. Fukózu obsahující sacharidy nebyly ve směsi zjištěny. Čistota asialogangliosidu byla také testována pomocí FAB/MS a NMR spektroskopií. Negativní FAB/MS hexaglykosylceramidu (obr. 2A) potvrdil předpovídanou sekvenci uhlohydrátu a ukázal, že ceramidy se skládají hlavně ze sfingosinu a mastné kyseliny C16.0 (m/z 536,5). NMR spektrum hexaglykosylceramidu (obr. 3A) vykázalo čtyři hlavní dublety v anomerické oblasti s β-interakcemi (J~8 Hz). Měly poměr intenzity 2:2:1:1. Signály při 4,655 ppm (GlcNAcp3), 4,256 ppm (vnitřní Ga^), 4,203 ppm (terminální Ga^4) a 4,166 ppm (Οοβ) odpovídaly dříve publikovaným výsledkům pro nLcOse6-Cer (Clausen et al., 1986). Objevil se také malý dublet při 4,804 ppm, který společně s malým signálem methylu při 1,81 ppm (viditelný jako raménko na velkém typu 2 methyl rezonance) naznačoval přítomnost malé frakce řetězce typu 1. V důsledku překrytí v oblasti 4,15 až 4,25 ppm poloha a rozmístění této vazby typu 1 nemohly být stanoveny. Celkové množství vazby typu 1 bylo zhruba 10 %. Protože množství řetězce typu 1 v pentaglykosylceramidu získaného z hexaglykosylceramidu trávením βgalakosidázy bylo také přibližně 5 % (obr. 3B), zdá se pravděpodobné, že vazba typu 1 byla rovnoměrně rozmístěna mezi vnitřní a vnější části řetězce sacharidu, t. j. 5 % glykolipidů by mohlo být typ 1 -typ 1. Abychom zjistili, zda byla vazebná aktivita glykolipidu spojena s dominantní neolakto (typ 2) strukturou, bylo působeno na asialoglykolipid β4-galaktosidázou, a produkty byly zkoumány pomocí TLC a překrývacími zkouškami (obr. 4A, 4B a 4C). Podle očekávání přeměnil první enzym hexaglykosylceramid na heptaglykosylceramid (4A, pás 3) a směs dvou enzymů odbourala materiál na laktosylceramid (4B, pás 6). Podie vizuálního vyhodnocení TLC desek byly obě reakce úplné nebo téměř úplné. Stejné výsledky byly získány pro sialidázou a kyselinou upravený materiál. Odbourávání hexaglykosylceramidu β4galaktosidázou bylo provázeno vymizením vazebné aktivity Helicobacter pylorí v oblasti tohoto glykolipidu na TLC deskách se současným výskytem silné aktivity v oblasti pentaglykosylceramidů (4C, pás 3). Další enzymatické odbourávání • · • · · pentaglykosylceramidu končilo vymizením vazebné aktivity v této oblasti. Výskyt vazebné aktivity v oblasti čtyř cukrů nebyl pozorován. Citlivost chemického zbarvování TLC desek je příliš nízká, aby umožnila pozorování stopových látek.

V samostatném pokusu byl původní gangliosid podroben částečné kyselé degradaci a uvolněné glykolipidy byly zkoumány na vazebnou aktivitu Helicobacter pylori. Obr. 5A a 5B ukazují TLC hydrolyzátu (5A) a odpovídající autoradiogram (5B) po překrývání hydrolyzátu Helicobacter pylori označenou ³⁵S. Glykolipidy umístěné v oblastech hexa-, penta-, tetra- a diglykosylceramidy vykazovaly vazebnou aktivitu, zatímco triglykosylceramid byl inaktivní.

Když byly vazby hexa-, penta-, tetraglykosylceramidů testovány s alespoň třemi kmeny Helicobacter pylori (17875, 002 a 032), byly podobné.

Podrobněji byl zkoumán silně se vázající pentaglykosylceramid vyrobený po oddělení koncové galaktózy od hexaglykosylceramidu a purifikaci pomocí silikagelové chromatografie. Negativní iontové spektrum FAB/MS tohoto glykolipidů potvrdilo uhlohydrátovou sekvenci HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex a vykázalo stejné ceramidové složení jako hexaglykosylceramid (obr. 2B). Protonové NMR spektrum pentaglykosylceramidu (obr. 3B) mělo pět hlavních β-dubletů v anomerické oblasti: při 4,653 ppm (vnitřní 6ΙοΝΑοβ3), 4,615 ppm (koncový ΰΙοΝΑοβ3), 4,261 ppm (dvojitá intenzita, vnitřní Ga^4), 4,166 (ΰΐοβ), shodných s

GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer a také perfektně shodných se sloučeninou šesti cukrů, která byla připravena o koncový ΰθΙβ. Malý β-dublet je také při 4,787 ppm odpovídající 3-substituované ΰΙοΝΑοβ (typ 1 řetězce). Předpokládaný signál methylu byl také pozorován jako raménko na mnohem větším signálu methylu při 1,82 ppm, ale překrývání nedovoluje stanovení množství těchto signálů. Ze základního anomerického protonu lze spočítat, že 6 % glykolipidů obsahovalo řetězec typu 1. Tak byl relativní podíl uhlohydrátových řetězců typu 1 a typu 2 podobný relativnímu podílu glykolipidů s šesti cukry. Dvě skvrny viditelné na TLC deskách jak v hexa-, tak v pentagiykosilové frakci vyjadřovaly spíše než rozdíly ve složení řetězce cukru heterogenitu ceramidu, jak bylo usuzováno z jejich susceptibility k β4-93ΐ3Μθ8ΪΡέζβ. Skvrna horní oblasti penta se objevila jak po neselektivní hydrolýze asialogangliosidu, tak po selektivním štěpení 4vázané galaktózy z asialoproduktu. Dále, když byl hexaglykosylceramid s velkým obsahem horní chromatografické subfrakce odbourán β4-galaktosidázou a βhexosaminidázou, poskytl výsledný laktosylceramid dva zřetelné chromatografické pásy. Chromatograficky homogenní hexaglykosylceramid produkoval pouze jeden • · • ·

laktosylceramidový pás. Jak horní, tak spodní subfrakce v penta oblasti byly velmi aktivní, jak ukazují překrývací testy.

Glykosfingolipidy neolakto řad s šesti, pěti a čtyřmi cukry (struktury 2, 4 a 5, tabulka 1) byly zkoumány semikvantitativními testy pomocí postupu TLC překrývání. Glykolipidy byly aplikovány na silikagelové desky v řadách zředění a jejich vazby na Helícobacter pylori byly po překrývání označenými bakteriemi a autoradiografii vyhodnoceny vizuálně (obr. 6A a 6B). Nejaktivnějším druhem byl pentaglykosylceramid, který vykázal pozitivní odezvu na TLC deskách v množstvích až k 0,039 nmol/skvrnu (znamená hodnotu vypočítanou ze sedmi pokusů, standardní odchylka δ_η-ι = 0,016 nmol). Hexa- a tetraglykosylceramidy vázaly Helícobacter pyiori v množstvích c: a 0,2 a, případně, 0,3 nmolů glakolipidu/skvrnu.

Vázání Helícobacter pylori na vyšší glykolipidy zkoumaných řad bylo velmi reprodukce schopné. Vazebná frekvence Helícobacter pylori, kmen 032, zaznamenaná pro pentaglykosylceramidy a hexaglykosylceramidy byla ~ 90% (celkový počet desek byl asi 100).

Stanovení vazeb ukazující izoreceptory a specifičnost vazeb (obr. 7/\ a 7B).

Navíc k glykosfingolipidů s šesti cukry králičího brzlíku mající neolakto jádro, NeuGca3Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3Gaip4Glc|3Cer, a tetra- až hexaglykosylceramidům odvozených od něj, může vazebná specifičnost zahrnovat další glykolipidy z neolakto řad.

Vazba Helícobacter pylori (kmen 032) na purifikované glykosfingolipidy separované na tenkovrstvých deskách pomocí překrývacího stanovení je ukázána na obr. 7A a 7B. Tyto výsledky jsou společně s výsledky z dalšího množství čištěných glykosfingolipidů shrnuty v tabulce 2. Vazba Helícobacter pylori na neolaktotetraosylceramid (pás 1) a glykosfingolipidy s pěti a šesti cukry (pásy 5 a 6) odvozený od NeuGca3Gal34GlcNAcp3Galp4GlcNacp3Galp4Glc3Cer je identická výsledkům uvedeným nahoře. Neočekávaně byla ovšem také nalezena vazba GalNAcp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcpCer (x₂ glykosfingolipid, pás 7) a defukosylovaného A6-2 glykosfingolipidů GalNAca3Gaip4GlcNAcp3Galp4GlcpCer (č.

12, tabulka 2). Společně s poznatkem, že Gala3Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcpCer (B5 glykosfingolipid, pás 2) je také vazebně aktivní glykosfingolipid, nasvědčují tyto výsledky o možnosti síťování spíše než o přítomnosti vícenásobných adhesinů specifických pro každý z těchto glykosfingolipidů (viz dále). Dále jediné rozšíření různých právě zmíněných glykosfingolipidů obsahujících pět cukrů, které bylo tolerováno bakteriálním • · · • * · • · · • ·· · · • · » ·· adhesinem bylo Galp4 na z brzlíku odvozené GlcNAcp3 ukončené sloučeniny (pás 6). Další prodloužené struktury, jako NeuAc-x₂ (pás 8) a GalNAcp3-B5 (č. 25, tabulka 2), byly všechny shledány nevazebnými. Dále by mělo být uvedeno, že acetamidová skupina vnitřní GlcNAcp3 v B5 je pro vázání základní, protože de-/V-acylace této části působením bezvodého hydrazinu vede k úplné ztrátě vazeb (pás 3), což je stejné v případě, když je podobně zpracován neolaktotetraosylceramid ( č. 6, tabulka 2).

Síťování glykosfingolipidů s pěti cukry. Abychom porozuměli charakteristice vazeb různých neolakto molekul glykosfingolipidů používaných v tomto průzkumu, byly pomocí molekulárního modelování zkoumány preference prostorového uspořádání aktivních i neaktivních struktur. Obr. 8A, 8B, 8C a 8D ukazují x₂ glykosfingolipid společně s třemi dalšími sekvencemi: fukosylované A6-2, B5 a de-A/-acylované B5, které, kromě chemicky modifikované struktury B5, vykazují podobné vazebné síly. Také glykosfingolipid s pěti cukry z králičího brzlíku by měl být do tohoto srovnání zahrnut, protože tato struktura se liší ve srovnání s x₂ strukturou pouze v poloze čtyři koncového zbytku a je stejně aktivní. Tyto čtyři aktivní struktury mají všechny neolaktová jádra, která jsou tak ukončena GalNAcp3, GalNAca3, Gala3 a, případně, GlcNAcp3. Konformery s minimální energií těchto struktur byly vyrobeny podle dřívějšího popisu (Teneberg et al., 1996). Další struktury s minimální energií uvedené v tabulce 2 jsou založeny na dřívějších výsledcích nalezených v literatuře (Bock et al., 1985; Meyer, 1990; Nyholm et al., 1989). Pokud jde o glykosfingolipidy ukončené kyselinou sialovou, byla pro glykosidické torzní úhly a3-vázaných zbytků adoptována synklinální konformace, jak lze vidět v např., obr. 9C, ale také byl testován vliv dalších konformací (Siebert et al., 1992), zvláště antiklinické konformace. Také pro αδ-vázanou variantu bylo ze stejných důvodů vyrobeno několik nízkoenergetických konformerů.

Jak bylo již zmíněno dříve, skutečnost, že existují čtyři vazebně aktivní glykosfingolipidy s pěti cukry (č. 10 až 13, tabulka 2), které mají všechny neolaktové jádro, napovídá, že síťování ke stejnému místu adhesinu může být důvodem těchto pozorování. Na první pohled se ovšem může zdát překvapující, že B5 glykosfingolipid, který se liší v koncové poloze ve srovnání se sloučeninou s pěti cukry získanou z králičího brzlíku, první mající Gala3 a druhý GlcNAcp3, je stejně aktivní a měl by být zahrnut do vazebné specifičnosti neolaktových řad. Přesto, že se tyto dva koncové sacharidy liší ve své anomerické vazbě, je vidět (obr. 8C a 9A), že struktury s minimální energií jsou topograficky velmi podobné, rozdíly jsou v tom, že Gala3 nemá acetamidovou skupinu, má 4-OH v axiální poloze a jeho rovina kruhu je lehce zvednutá

nad odpovídající rovinu ve sloučenině s pěti cukry. Ovšem ani 4-OH poloha, ani absence/přítomnost acetamidové skupiny se nezdá být kritickou pro výskyt vazby, protože také x₂ a defukosylované A6-2 glykosfingolipidy (obr. 8A, B), které jsou ukončeny GalNAcp3 a, případně, GalNAca3, mají podobné afinity pro adhesin Helicobacter pylori. Vzhledem k těmto zjištěním by se také očekávalo, že Gaip3Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcpCer, který byl izolován z lidských erytrocytů, bude vázat bakteriální ahesin. Vzhledem k pravidlům pro vazby jsou také tři další koncové monosacharidy ve vazebných epitopech Helicobacter pylori možnými vazebnými epitopy trisacharidu, a sice GlcNAca3Gaip4GlcNAc, Glcp3Gaip4GlcNAc a Glca3Gaip4GlcNAc. Takové sloučeniny doposud u lidských tkání nejsou známé, ale mohou spíše reprezentovat analogy přirozených receptorů. Ani Gaip3Gaip4GlcNAcglykolipid, ani tři analogy nebyly, bohužel, pro testování k dispozici. Také neolaktová sloučenina se sedmi cukry NeuGca3Gaip4GlcNAc33Gaip4GlcNac33Gaip4GlcpCer byla podrobena molekulárnímu modelování. Obr. 10 ukazuje dvě různé představy struktury s minimální energií s vazbou GlcpCer v rozšířené konformaci. Sialové kyselině byla dána synklinická konformace, ale v nerozvětvených strukturách je také pravděpodobný antikonformer (Siebert et al., 1992). Zdá se, že kyselina sialová ve srovnání se sloučeninou se šesti cukry, 9B, má malý vliv na vazebnou aktivitu vůči Helicobacter pylori. Srovnání první představy s obrázky 9A a 9B naznačuje, že stejný vazebný epitop je také dostupný ve struktuře se sedmi cukry.

Zobrazení neolakto vazebného epitopu. Relativní vazebná síla struktur získaných chemickým a enzymatickým odbouráváním sloučeniny se sedmi cukry z králičího brzlíku (č. 1,5, 10 a 21, tabulka 2) naznačuje, že sekvence se šesti cukry GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3 může představovat sekvenci minimální vazby. Ve sloučenině se šesti cukry je tedy očekáván potlačující efekt koncové Gaip4, zatímco u neolaktotetraosyceramidu omezuje chybějící koncové GlcNAcp3 vazebnou sílu, protože v epitopu jsou přítomny pouze dva cukry ze tří. Podstata vnitřní GlcNAcp3 je jasně ukázána ztrátou bakteriální vazby jak k neolaktotetraosyceramidu, tak B5 následující de-N-acylaci acetamidové skupiny na amin (č. 6 a 14, tabulka 2). Tato nevazebnost může nastat buď ztrátou příznivé interakce mezi adhesinem a acetamidovou částí a/nebo změněnými konformačními preferencemi těchto glykolipidů. Je ovšem obtížné předvídat situaci, kdy by změněná orientace vnitřní Gaip4 prostorově zamezovala přístupu k vazebnému epitopu. Když je tedy potvrzeno, že minimální vazebná sekvence musí doprovázet GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3 sekvenci, je nyní snadné vysvětlit • · nepřítomnost vazby pro Pí, H5-2 a dvě struktury sialylparaglobosidu (č. 15, 18 až 20, tabulkal), protože tato rozšíření přímo interferují s navrženým vazebným epitopem. Také glykosfingolipid z hovězího podmáslí (Teneberg et al., 1994), který má β6 vázanou větev Gaip4GlcNacp připojenou na vnitřní Gaip4 neolaktotetraosyceramidu (č. 26, tabulka 2), je díky blokovanému přístupu k vazebnému epitopu nevazebný.

Prodloužení různých vazebně aktivních sekvencí s pěti cukry v tabulce 2 ukazuje, že pouze přídavek Galp4 ke struktuře odvozené z brzlíku je tolerován, což odpovídá pozorování, že poloha 4-OH může být jak ekvatoriální, tak axiální, ale s následnou ztrátou vazebné afinity kvůli prostorové interferenci. Přídavek buď NeuAca3 k x₂ nebo GalNAcp3 k B5 tak má za následek úplnou ztrátu vazby (č. 24 a 25, tabulka 2). Dále je vidět, že negativní vliv jednotky Fuca2 jako v H5-2je potvrzen tím, že se Helicobacter pylori neváže jak na A6-2, tak na B6-2 (č. 22 a 23, tabulka 2). Pokud jde o prodlouženou strukturu (č. 28, tabulka 2), ukončenou stejným trisacharidem jako byl nalezen v B5, musí to být, jako v B5, tento koncový trisacharid, který je zodpovědný za pozorovanou vazbu, ačkoliv je také přítomen druhý vnitřní vazebný epitop. Vazba na vnitřní epitop může být pravděpodobněji vyloučena, protože by se očekávalo, že Gaip4 je získána nebo nezávisí jak na typu kmene, tak na podmínkách produkce (MilíerPodraza et al., 1996, 1997 a, b).

Shrneme-li to, musí vazebný epitop neolaktových řad, aby získal maximální aktivitu, zahrnovat sekvenci s třemi cukry GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3. Ze srovnání vazebného charakteru potencionálních izoreceptorú použitých v tomto průzkumu lze ze struktur uvedených na obr. 8A až D a 9A až D odvodit, že téměř celý tento trisacharid je důležitý pro výskyt vazby, vyjma acetamidové skupiny koncové GlcNAcp3 a 4-OH na stejném zbytku, které nejsou rozhodující.

Biologická přítomnost receptorů. Ze čtyř glykosfingolipidů s pěti cukry, které mohou in vitro působit zaměnitelně jako receptory pro Helicobacter pylori pouze x₂ se vyskytuje přirozeně v lidské tkáni, ale ještě nebyl nalezen v gastrické mukóze, vyjma případu rakoviny žaludku, kdy byl identifikován v tkáni tumoru (Kannagi et al., 1982b). Průzkum Thorna et al., 1992, ukázal, že glykosfingolipid x₂ a prodloužené struktury mající koncovou GalNAcp3Gaip4GlcNacp3 sekvenci jsou přítomny v několika lidských tkáních, ale gastrická epitelová tkáň, bohužel, nebyla mezi zkoumanými. Proto bylo provedeno tenkovrstvé pokrytí chromatogramu GalNAcp3Gaip4GlcNacp-specifickou monoklonální protilátkou TH2 prepárátů zcela nekyselých glykosfingolipidů z epitelových buněk lidské gastrické mukózy několika jedinců s krevní skupinou A (pásy • · · • · · až 6, obr. 11B). Pomocí tohoto stanovení nebyla pozorována žádná pozorovatelná vazba na glykosfingolipidy odvozené z epitelu žaludku. Odpovídající překrývání pomocí Gaip4GlcNac-vazebný lektin z E. cristagalli je ukázáno na obr. 11A, 11B a 11C. Ze tří preparátů glykosfingolipidu gastrického epitelového původu ukazují první tři pásy slabou vazbu na pásy v oblasti čtyř cukrů, což pravděpodobně odpovídá neolaktotetraosyceramidu, ale nebyla rozlišena žádná pozorovatelná vazba Helicobacter pylori na tyto pásy díky nízkému množství tohoto glykosfingolipidu (Teneberg et al., 2001).

Dále sekvence Gala3Gaip4GlcNacp, ať už přítomná v B5 glykosfingolipidu nebo v prodloužené struktuře pojednávané dříve (č. 28, tabulka 2), se asi vůbec v normální lidské tkáni nenachází, díky neexprimování transferázy zodpovědné za adici Gala3 (Larsen et al., 1990). Proto nezbývá než dojít k závěru, že pokud je(jsou) cílové receptory přítomny na povrchu gastrických epitelových buněk, mohou být založeny na opakovaných N-acetyllaktosaminových prvcích v glykoproteinech a ne na strukturách založených na lipidech.

Je ovšem známo, že kmeny Helicobacter pylori spojované s peptickým vředem, jako je kmen zde hlavně používaný, stimulují zánétlivou reakci granulocytů, dokonce i když bakterie nejsou opsonizovány (Rautelin et al., 1994a,b). Počáteční jev fagocytózy bakterie pravděpodobně zahrnuje specifické lektinu podobné interakce, které mají za následek shlukování granulocytů (Ofek a Sharon, 1988). Po fagocytóze dochází k oxidačním trhacím reakcím, které mohou být významné pro patogenezí chorob spojených s Helicobacter pylori (Babior, 1978). Několik kyselých a nekyselých glykosfingolipidů z granulocytů, které mají neolaktové jádro a opakující se laktosaminové jednotky, včetně č. 21 v tabulce 2 a sialylované sloučeniny se sedmi cukry (č. 27, tabulka 2), kde je acetamidová skupina kyseliny sialové v acetyl formě, byly izolovány a charakterizovány (Fakuda et al., 1985; Stroud et al., 1996) a mohou tak působit jako potenciální receptory Helicobacter pylori na povrchu buněk bílých krvinek. Dále byl ze stejného zdroje izolován i x₂ glykosfingoiipid (Teneberg, S., nepublikováno).

Vrátíme-li se k obr. 11B, je vidět, že monoklonální protilátka TH2 se skutečně váže na pásy v oblasti pěti cukrů, jak pro granulocyty, tak pro erytrocyty (pásy 7 a, popřípadě, 8), což může odpovídat x₂ glykosfingolipidu (Teneberg, S., nepublikováno; Thorn et al., 1992; Teneberg et al., 1996). Podobně bylo zjištěno, že neolaktotetraosyceramid je přítomný jak v granulocytech, tak v erytrocytech, když je náhradou použit v překrývacím stanovení E. cristagalli lektin (obr. 11C, pásy 7 a 8).

• · · · · ·

V těchto dvou případech se Helicobacter pylori váže na neolaktotetraosyceramid (Bergstóm, J., nepublikováno). V souhlase s výsledky Fakudy et al., 1985, je pro granulocyty nalezen další spíše slabý pás v oblasti šesti cukrů, patrně odpovídající neolaktotetraosyceramidu rozšířenému jednou jednotkou N-acetyiiaktosaminu (srov. č. 21, tabulka 2). Zbývá objasnit, zda tyto glykosfingolipidy jsou primárními cíly v procesu shlukování pojednávaném dříve.

Analýza neoglykolipidů a nové glykolipidy

Oligosacharidy GlcNAcp3Galp4GlcNac, GlcNAcp3Gaip4GlcNacp6GlcNac,

Gala3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc a GlcNAcp3Galp4GlcNacp3Gaip4Glc a maltoheptaóza (Sigma, Saint Louis, USA) byly redukčně aminovány s 4-hexadecylanilinem (zkratka HDA, od fy Aldrich, Stokholm, Švédsko) pomocí kyanoborohydridu (Halina MillerPodraza, bude publikováno později). Produkty byly charakterizovány pomocí hmotnostní spektrometrie a byly potvrzeny jako GlcNAcp3Gaip4GlcNac(red)-HDA, GlcNAcp3Gaip4GlcNacp6GlcNac(red)-HDA, Gala3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc(red)-HDA a GlcNAcp3Gaip4GlcNacp3Gaip4Glc(red)-HDA a maltoheptaóza(red)-HDA [kde „(red)“ znamená aminovou spojovací strukturu vytvořenou redukční aminací z redukčních konců glukóz sacharidů a aminové skupiny hexadecylanilinu (HDA)]. Sloučeniny Gala3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc(red)-HDAa GlcNAcp3Galp4GlcNacp3Galp4Glc(red)HDA mají zřetelnou vazebnou aktivitu a GlcNAcp3Galp4GlcNacp6GlcNac(red)-HDA má silnou vazebnou aktivitu vůči Helicobacter pylori v TLC překrývacím stanovení popsaném dříve, zatímco GlcNAcp3Gaip4GlcNac(red)-HDA a maltoheptaóza(red)-HDA byly slabě vazebné nebo neaktivní. Příklad ukazuje, že tetrasacharid

GlcNAcp3Gal[34GlcNacp3Gal je struktura, která se váže k Helicobacter pylori.

Redukující konec Glc zbytku není patrně pro vazbu třeba, protože redukce ničí kruhovou strukturu pyranózy Glc-zbytku. Naopak neporušená kruhová struktura redukujícího konce GIcNAcje potřebná pro dobrou vazbu trisacharidu GlcNAcp3Gaip4GlcNac.

Biosyntetický analog prekurzoru NHK-1 glykolipidu

GlcA33Gaip4GlcNacš3Gal34GlcpCer, a nové glykolipidy

Glcp3Galp4GlcNacp3Gaip4GlcpCer a Glc(Amethylamid)p3Gaip4GlcNacp3Gaip4GlcpCer byly testovány v TLC překrývacím stanovení a bylo pozorováno, že byly vazebně aktivní vůči Helicobacter pylori. Glc(Amethyiamid) znamená derivát kyseliny giukuronové, v němž je skupina karboxylové ·· ···· kyseliny amidována methylaminem. Struktura Glcp3Gaip4GlcNacp3Gal34GlcpCer má silnou vazbu k H. pylori a Glc(A-methylamid)p3Gaip4GlcNacp3Gaip4GlcpCer má velmi silnou vazbu k Helicobacter pylori.

Výroba GlcAp3Gaip4Glc(Nac) transglykosylací

Akceptorový sacharid Gaip4Glc nebo Gaip4GlcNac (asi 10 až 20mM) je za míchání roztoku po dva dny při 37 °C inkubován s desetinásobným molárním přebytkem kyseliny paranitrofenyl-beta-glukuronové a β-glukuronidázou hovězích jater (20 000U, Sigma) v pufru majícím pH asi 5. Produkt je purifikován pomocí HPLC.

·« *···

• · • · • 9

Reference

Aggarwal, Β. B., Eessalu, T. E. a Hass, P. E. (1985) Nátuře, 318, 665 až 667. Andersson, B., Porras, 0., Halson, L. A., Lagergard, T., a Svanborg-Eden, C. (1986)

J. Inf. Dis.153, 232 až 7

Angstrom, J., Teneberg, S., Abul Milh, M., Larsson, T., Leonardsson, L, Olsson, B.M., Olwegard Halvarsson, M., Danielsson, D., Náslund, I., Ljung, A., Wadstróm, T. a Karlsson, K.-A. (1998) Glycobiology, 8, 297 až 309.

Ascencio, F., Fransson, L-A. a Wadstróm, T. (1993) J. Med. Microbiol., 38, 240 až 244.

Appelmelk, B.J., Faller, G., Clayes, D., Kirchner, T., a VandenbrouckeGrauls.C.M.J.E. (1998) Immol. Today 19, 296 až 299.

Avenaud, P., Marais, A., Monteiro, L., Le Bail, B., BiolacSaga, P., Balabaud, C., a Mégraud, F. (2000) Cancer 89, 1431 až 1439. Axon, A. T. R. (1993) J. of Antimícrobial Chemotherapy, 32, 61 až 68.

Babior, Β. M. (1978) N. Eng. J. Med., 298, 659 až 668.

Blaser, M. J. (1992) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 4 (dodatek 1), 17 až 19.

Bock. K., Breimer, Μ. E., Brignole, A., Hansson, G. C., Karlsson, K.-A., Larson, G., Leffler, H., Samuelsson, Β. E., Strómberg, N., Svanborg-Eden, C. aThurin, J.

(1985) J. Biol. Chem., 260, 8545-8551.

Borén, T., Falk, P., Roth, K. A., Larson, G. a Normark, S. (1993) Science, 262, 1892 až 1895.

Breg, J., Kroon-Batenburg, L. M. J., Strecker, G., Montreuil, J. a Vliegenthart, F. G. (1989) Eur. J. Biochem., 178, 727 až 739.

Castagliuolo, I., La Mont, J. T„ Qiu, B., Nikulasson, S. T., a Pothoulakis, C. (1996) Gastroenterology 111,433 až 438.

Castronovo, V., Colin, C., Parent, B., Foidart, J.-M., Lambotte, R., a Mahieu, P. (1989) J.Nail. Cancer Inst., 81,212 až 216

Charlwood, J., Tolson, D., Dwek, M., and Camillen, P. (1999) Anal. Biochem., 273, 261 až 77.

Clausen, H., Levery, S.B., Kannagi, R. a Hakomori, S.-i. (1986) J. Biol.

Chem., 261, 1380 až 1387.

Chmiela, M., Wadstróm, T., Folkesson, H., Planeta Malecka, I., Czkwianianc, E.,Rechcinski, T., a Rudnická, W. 1998) Immunol. Lett. 61, 119 až 125.

Claeys, D., Faller, G., Appelmelk, B.J., Negrini, R, a Kirchner, T. (1998) ·« ····

··

9 · · ♦ 11 1

9 19 9

9

99

9

9 9

9 9

9 9 9

99

Gastroenterology 115, 340 až 347.

Correa, T.L., Fox, J., Fontham, E., Ruiz, b., Lín, Y., zaula, D., Taylor, N., Mackinley, D.,deLima, E., Portilla, H., Zarama, G. (1990) CancerQQ, 596 až 574.

DeCross. A. J. a Marshall, B. J. (1993) Am. J. Med. Sci., 306, 381 až 392.

Dooley, C.P. (1993) Curr. Opin. Gastroenterol., 9, 112 až 117.

Dubois, M., Gilles, K.A.,Hamilton, J.K., Rebers, PA. a Smith, F. (1956) Anaiytical Chemistry 28, 350 až 356.

Dunn, B.E., Cohen, H. a Blaser, M.J. (1997) din. Microbiol. Rev., 10, 720 až 741.

Ernst, B., Hart, G.W., a Sinay, P. (vyd.) (2000) Carbohydrates in Chemistry and Biology, ISBN 3-527-29511-9, Wiley-VCH, Weinheim.

Eto, T., Ichikawa, Y., Nishimura, K., Ando, S. a Yamakawa, T. (1968) J. Biochem. (Tokyo), 64, 205 až 213.

Evans, D. G., Evans ml, D.J., Molds, J. J., a Graham, D. Y. (1988) Infect. Immun., 56, 2896 až 06

Falk, K.-E., Karlsson, K.-A. a Samuelsson, Β. E. (1979a) Arch. Biochem. Biophys., 192,164 až 176.

Falk, K.-E., Karlsson, K.-A. a Samuelsson, Β. E. (1979b)Arch. Biochem. Biophys., 192, 177 až 190.

Falk, K.-E., Karlsson, K.-A. a Samuelsson, Β. E. (1979c) Arch. Biochem. Biophys., 192, 191 až 202.

Farsak, B., Yildirir, A., Akyón, Y., Pinar, A., Óc, M., Boke, E., Kes, S., a Tokgózoglu, L.(2000) J. Clin. Microbiol. 38, 4408 až 4411.

Folch, J., Lees, M., a Sloane-Stanley, G.H. (1957) J. Biol. Chem. 226, 497 až 509. Fukuda, Μ. N., Dell, A.. Oates, J. E.., Wu, P., Klock, J. C. a Fukuda, M. (1985) J. Biol Chem., 260, 1067 až 1082.

Handa, S. (1963) Jap. J. Exp. Med., 33, 347 až 360.

Hansson, G. C., Karlsson, K.-A., Larson, G., Strómberg, N. a Thurin, J. (1985) Anal. Biochem., 146, 158 až 163.

Hansson, G.C. a Karlsson, H. (1990) Methods Enzymol, 193, 733 až 738.

Hu, J., Stults, C.L., Holmes, E.H., a Macher, B.A. (1994) Glycobiology 4, 251 až 7.

Ilver, D., Arnqvist, A., Ogren, J., Frick, I. M., Kersulyte, D., Incecik, E. T., Berg, D.

E., Covacci, A., Engstrand, L., a Bořen T. (1998) Science, 279(5349), 373 až 377.

Ito, M. a Yamagata, T. (1989) Methods Enzymol, 179, 488 až 496.

»« 0000

Jassel, S.V., Ardill, J.E.S., Fillmore, D., Bamford, K.B., 0'Connor, F.A., a Buchanan.K.D. Q. J. Med. 92, 373 až 377.

Kannagi, R., Levine, P., Watanabe, K. a Hakomori, S.-i. (1982b) Cancer Res., 42, 5249 až 5254.

Karlsson, N. G., Olson, F. J., Jovall, P-A, Andersch, Y., Enerbáck, L., a Hansson G. C. (2000) Biochem. J., 350, 805 až 814.

Karlsson, K.-A. (1987) Meth. Enzymol., 138, 212 až 220.

Karlsson, K.-A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, 309 až 350.

Karlsson, K.-A. a Larsson, G. (1981a) J. Biol. Chem. 256, 3512 až 3524.

Karlsson, K.-A. a Larsson, G. (1981b) FEBS Letí, 128, 71 až 74.

Kerr, J.R., Al-Khattaf, A., Barson, A. J., a Bumie, J.P. (2000) Arch. Child. Dis., 83, 429 až 434.

Koerner ml, T. A. W., Prestegard, J. H., Děrnou, P. C. a Yu, R. K. (1983) Biochemistry, 22, 2676-2687.

Koscielak, J., Piasek, A., Gorniak, H._t Gardas, A. a Gregor, A. (1973) Enr. J. Biochem., 37, 214 až 215.

Laine, R. A., Stellner, K. a Hakomori, S.-i. (1974) Meth Membr. Biol., 2, 205 až 244. Lanne, B., Uggla, L., Stenhagen, G., a Karlsson, K-A. (1995) Biochemistry 34, 1845 až 1850

Lanne, B., Miller-Podraza, H., Abul Milh, M., Teneberg, S., Uggla, L., Larsson, T., Leonardsson, I., Jovall, P.-A., Bergstróm, J. a Karlsson, K.-A. (2001) rukopis se připravuje

Larsen, R. D., Rivera-Marrero, C. A., Ernst, L. K, Cummings, R. D. and Lowe, J. B. (1990) J. Biol. Chem., 265, 7055 až 7061.

Larson, G., Karlsson, H., Hansson, G.C. a Pimlott, W. (1987) Carbohydr. Res., 161, 281 až 290

Ledeen, R. a Yu, R. K. (1978) Res. Methods Neurochem., 4, 371 až 410.

Lin. J.-T., Wang, J.-T., Wang, M.-S., Wu, M.-S. a Chen, C.-J. (1993) HepatoGastroenterol., 40, 596 až 599.

Lingwood, C. A., Huesca, M. a Kuksis, A. (1992) Infect. Immun., 60, 2470 až 2474.

Mayo, S. L., Olafsen, B. D. a Goddard III, W. A. (1990) J. Chem. Phys., 94, 8897 až 8909.

McKibbin, J. M., Spencer, W. A., Smith, E. L., Mansson, J. E., Karlsson, K-A, Samuelsson, Β. E., Li, Y-T a Li, S. C. (1982) J. Biol. Chem., 257, 755 až 760.

• « · · 4 ·

Meyer. Β. (1990) Topics Curr. Chem., 154, 141 až 208.

Miller-Podraza, H., Abul Milh, M., Bergstróm, J. a Karlsson, K.-A. (1996) Glycoconj. J.,13, 453 až 460.

Miller-Podraza, H., Bergstróm, J., Abul Milh, M. a Karlsson, K.-A. (1997a) Glycoconj. J.,14, 467 až 471.

Miller-Podraza, H., Abul Milh, M., Teneberg, S. and Karlsson, K.-A. (1997b) Infect. Immun., 65, 2480 až 2482.

Miller-Podraza, H., Abul Milh, M., Angstróm, J., Jovall. P.-A., Wilhelmsson, U., Lanne, B., Karlsson, H., a Karlsson, K.-A. (2001) rukopis se připravuje.

Muzzarelli, R.A.A., Mattioli-Belmonte, M., Miliani, M., Muzzarelli, C., Gabbanelli, F., a Biagini, G. (2002) Carbohyrate Polym. 48,15 až 21

Muzzarelli, R.A.A., Muzzarelli, C., Cosani, A., a Terbojevich, M. (1999) Carbohyrate Polym. 39, 361 až 367

Mysore, J.V., Wiggington, T., Simon, P.M., Zopf, D., Heman-Ackah, L.M. and Dubois, A. (1999) Gastroenterology, 111, 1316 až 1325

Naiki, M., Fong, J., Ledeen, R. a Marcus, D. M. (1975) Biochemistry, 14, 4831 až 4836. Nakhla, T., Fu, D., Zopf, D., Brodsky, N., a Hurt, H. (1999) British J. Nutr. 82, 361 až 367.

Needs, P.W. a Selvendran, R.R. (1993) Carbohydr. Res., 245,1 až 10.

Nilsson, H.-O., Taneera, J., Castedal, M., Glatz, E., Olsson, R., a Wadstróm, T. (2000) J.CIin. Microbiol. 38, 1072 až 1076.

Nilsson, 0., Mansson, J.-E., Tibblin, E. a Svennerholm, L. (1981) FEBS Letí., 133, 197 až 200.

Nomenclature of glycoproteins (1988) J. Biol. Chem., 262, 13 až 18.

Nomura, A. a Stemmermann, G. N. (1993) J. Gastroenterol. Hepatol., 8, 294 až 303. Nyholm, P. G.. Samuelsson, Β. E., Breimer, M. a Pascher, I. (1989) J. Mol. Recog., 2, 103 až 113.

Nyholm, P.-G. a Pascher, I. (1993) Biochemistry, 32, 1225 až 1234.

Ofek, I. a Sharon, N. (1988) Infect. Immun., 56, 539 až 547.

Pakodi, F., Abdel-Salam, O.M.E., Debraceni, A., a Mozsik, G. (2000) J. Physiol.

(Paris), 94, 139 až 152.

Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vandersteen, D.P., Chang, Y., Vogelman, J.H., Orentreich, N. a Sibley, R.K. (1991) N. Engl. J. Med., 325, 1127 až 31 Rappé, A. K. a Goddard III, W. A. (1991) J. Chem. Phys., 95, 3358 až 3363.

·< ·♦··

Rautelin, H., Blomberg, B., Járnerot, G. a Danielsson, D. (1994a) Scand. J. Gastroenterol., 29, 128 až 132.

Rautelin, H., von Bonsdorff, C.-H., Blomberg, B. a Danielsson, D. (1994b) J. Clin.Pathol., 47, 667 až 669.

Rebora, R., Drago, F., and Parodi, A. (1995) Dermatology 191, 6 až 8.

Saitoh, T., Natomi, H., Zhao, W., Okuzumi, K., Sugano, K., Iwamori, M. a Nagai, Y. (1991) FEBS Letí., 282, 385 až 387.

Samuelsson, Β. E., Pimlott, W. a Karlsson, K.-A. (1990) Meth. Enzymoí, 193, 623 až 646

Sears, P., a Wong, C-H. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci., 93,12 086 až 12 093.

Siebert, H.-C., Reuter, G., Schauer, R., von der Lieth, C.-W. and Dabrowski, J.

(1992) Biochemistry, 31,6962-6971.

Simon, P. M., Goode, P. L., Mobasseri, A., aZopf, D. (1997) Infect. Immun. 65, 750 až 757

Soltesz, V., Schalen, C. a Mardh, P. A. (1988) Proceedings ofthe Fourth International Workshop on Campylobacter Infections (Kaijser, B. a Falsen, E., vyd.) str. 433 až 436, Goterna, Kungálv, Švédsko.

Steininger, H., Faller, G., Dewald, E., Brabletz, T., Jung, A., a Kirchner, T. (1998) Virchows Arch. 433, 13 až 18.

Stellner, K., Saito, H. a Hakomori, S.-i. (1973) Arch. Biochem. Biophys., 155, 464 až 472.

Stellner, K. a Hakomori, S.-i. (1974) J. Biol. Chem., 249, 1022 až 1025.

Stroud, M. R., Handa, K., Salyan, Μ. E. K., Ito, K., Levery, S. B., Hakomori, S.-i., Reinhold, Β. B. a Reinhold, V. N. (1996) Biochemistry, 35, 758 až 769.

Sung, J., Russell, R.L, Neyomans, Chán, F.K., Chen, S., Fock, K., Goh, K.L., Kullavanijaya, P., Kimura, K., Lau, C., Louw, J., Sollano, J., Triadiafalopulos, G., Xiao, S., Brooks, P. (2000). Gastroenterol. Hepatol. 15, Suppl: G58 až 68.

Teneberg, S., Angstróm, J., Jovall, P.-A. a Karlsson, K.-A. (1994) J. Biol. Chem., 269, 8554 až 8563.

Teneberg, S., Lónnroth, I., Torres Lopez, J. F., Galili, U., Olwegard Halvarsson, M.,

Angstróm, J. a Karlsson, K.-A. (1996) Gtycobiology, 6, 599 až 609.

Teneberg, S., Abul Milh, M., Lanne, B., Jovall, P.-A., Karlsson, H., Angstróm, J.,

Olwegard Halvarsson, M., Danielsson, D., Ljung, A., Wadstróm, T. a Karlsson, K.-A.

9 9 ♦ · · ♦ • · · · · • · 8

99

9

9

9 · • 8 9 (2001, rukopis se připravuje).

Thorn, J. J., Levery, S. B., Salyan, Μ. E. K., Stroucí, M. R., Cedergren, B., Nilsson, B., Hakomori, S.-i. a Clausen, H. (1992) Biochemistry, 31, 6509 až 6517.

Thurin, J., Brodin, T., Bechtel, B., Jovall, P.-A., Karlsson, H., Strómberg, N., Teneberg, S., Sjógren, H. 0. a Karlsson, K.-A. (1989) Biochim. Biophys. Acta, 1002, 267 až 272. Vivier, E., Sorrell, J. M., Ackerly M., Robertson M. J., Rasmussen R. A., Levine H., a Anderson P. (1993) J. Exp. Med., 178(6), 2023 až 33.

Waldi, D. (1962) v Dunnschicht-Chromatographie (Stáhl, E., vyd.) str. 496 až 515, Springer-Verlag, Berlin.

Watanabe, K. a Hakomori, S.-i. (1979) Biochemistry, 18, 5502 až 5504.

Wells, M.E. a Dittmer, J.C. (1963) Biochemistry, 2,1259 až 1263.

Wotherspoon, A.C., Doglioni, C., Diss, T.C., Pan, L., Moschini, A., de Boni, M. a

Isaacson, P.G. (1993) Lancet, 342, 575 až 577

Yamakawa, T. (1966) Colloq. Ges. Physiol. Chem., 16, 87 až 111.

Yang, H.-j. a Hakomori, S.-i. (1971) J. Biol. Chem., 246, 1192 až 1200.

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití látky, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci oligosacharidu vázající Helicobacter pylori [Gal(A)_q(NAc)_r/Glc(A)_q(NAc)_ra3/p3]_s[Gal34GlcNAcp3]tGaip4Glc(NAc)_u, kde q, r, s, t, a u jsou každé nezávisle 0 nebo 1, takže když t = 0 a u = 0, je pak sekvence oligosacharidu vázaná na polyvalentní nosič nebo přítomná jako volný oligosacharid ve vysoké koncentraci, a analogy nebo deriváty uvedené sekvence oligosacharidu mající vazebnou aktivitu vůči Helicobacter pylori pro výrobu prostředku majícího vazebnou nebo potlačující aktivitu vůči Helicobacter pylori.
2. 2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená látka obsahuje sekvenci oligosacharidu

   GlcNAcp3Galp4GlcNAc nebo GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc, kde poloha C4 koncového GlcNAcp3 je dle volby vázána na Gaipi- nebo řetězec oligosacharidu pomocí glykosidické vazby.
3. 3. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená látka obsahuje jednu nebo několik následujících sekvencí oligosacharidu

   Galp4GlcNAc,

   GalNAca3Gaip4GlcNAc, GalNAcp3Galp4GlcNAc, GlcNAca3Galp4GlcNAc,

   GlcNAcp3Galp4GlcNAc, Galp3Galp4GlcNAc, Glca3Galp4GlcNAc, Glcp3Galp4GlcNAc,

   Galp4GlcNAcp3Gaip4GlcNAc, Galp4GlcNAcp3Galp4Glc,

   GalNAca3Galp4GlcNAcp3Gal34Glc, GalNAcp3Gaip4GlcNAcp3Galp4Glc,

   GlcNAca3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc, GlcNAcp3Galp4GlcNAcp3Gaip4Glc, ·V· ·

   Galp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc, GIca3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc, Glcp3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc,

   GalANAcp3Gaip4GlcNAc, GalANAca3Gaip4GlcNAc, GalAp3Galp4GlcNAc, GalAa3Gaip4GlcNAc, GalANAcp3Galp4Glc, GalANAca3Galp4Glc, GalAp3Galp4Glc, GalAa3Gaip4Glc,

   GlcANAcp3Galp4GlcNAc, GlcANAca3Galp4GlcNAc, GlcAp3Gaip4GlcNAc, GlcAa3Gaip4GlcNAc, GlcANAcp3Galp4Glc, GlcANAca3Galp4Glc, GlcAp3Gaip4Glc, GlcAa3Gaip4Glc,

   Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc, a jejich polyvalentní konjugáty s redukujícím koncem.
4. 4. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená látka obsahuje jednu nebo několik následujících sekvencí oligosacharidu

   GalNAca3Galp4Glc, GalNAcp3Gaip4Glc, GlcNAca3Gaip4Glc, GlcNAcp3Gal34Glc, Gaip3Galp4Glc, Glca3Gaip4Glc, Glcp3Gaip4Glc a jejich polyvalentní konjugáty s redukujícím koncem.
5. 5. Použití podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená látka obsahuje jednu nebo několik následujících sekvencí oligosacharidu

   Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc (lakto-N-neotetraóza),

   Gaip4GlcNAcp3Gaip4GlcNAcp3Gaip4Glc (para-lakto-N-neohexaóza), a jejich polyvalentní konjugáty s redukujícím koncem.
6. 6. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že uvedená látka je konjugována na polysacharid, nejlépe na řetězec polylaktosaminu nebo jeho konjugáty.
7. 7. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že uvedená látka je glykolipid.

   ·♦ »·»·

   51 ... «· “ .....
8. 8. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že uvedená látka je oligomerní molekula obsahující alespoň dva a nebo tři řetězce oligosacharidú.
9. 9. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se uvedená látka skládá z micely obsahující jednu nebo více látek definovaných v nárocích 1 až 8.
10. 10. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že uvedená látka(látky) je/jsou konjugovány na nosič.
11. 11. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že uvedená látka je kovalentně konjugována s antibiotikem účinným proti Helicobacter pylori, nejlépe s penicilinovým typem antibiotika.
12. 12. Použití podle nároku 10, vyznačující se tím, že poloha C1 redukčního konce koncové Glc nebo GIcNAc uvedené sekvence oligosacharidú (OS) je kyslík vázaný (-O-) na oligovalentní nebo polyvalentní nosič (Z), pomocí vymezovací skupiny (Y) a dle volby pomocí zbytku monosacharidu nebo oligosacharidú (X), přičemž tvoří následující strukturu [OS -O- (X)n-Yjm-Z kde celá čísla man mají hodnoty m > 1, a n je nezávisle 0 nebo 1; X je nejlépe laktosyl-, galaktosyl-, poly-N-acetyl-laktosaminyl, nebo část O-glycanu nebo sekvence N-glycan oligosacharidú, Y je vymezovací skupina nebo koncový konjugát například ceramidolipidová část nebo vazba na Z; nebo derivát látky uvedené struktury mající vazebnou aktivitu vůči Helicobacter pylori.
13. 13. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedená látka je použita pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu nebo profylaxi jakéhokoliv stavu způsobeného přítomností Helicobacter pylori.
14. 14. Použití podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený farmaceutický prostředek je pro léčbu chronické povrchové gastritidy, žaludečního vředu, dvanáctémíkového vředu, žaludečního adenokarcinomu, ne-Hodgkinova lymfomu lidského žaludku, ·» »» ·· ···· • «· · « ♦ · • · · · « · · β · ·»· · » · * • · · · 2 *·« «· ·· »· ·· choroby jater, choroby slinivky, kožních chorob, chorob srdce, nebo autoimunitních chorob včetně autoimunitní gastritidy a zhoubné anemie a chorob žaludku, které mají vztah k nesteroidním protizánětlivým lékům (NSAID), nebo k prevenci syndromu náhlého kojeneckého úmrtí.
15. 15. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12, vyznačující se tím, že je použita pro diagnózu stavů způsobených infekcí Helicobacter pylori.
16. 16. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12, vyznačující se tím, že je použita pro výrobu nutriční přísady nebo prostředku pro léčbu nebo profylaxi jakéhokoliv stavu způsobeného přítomností Helicobacter pylori.
17. 17. Použití podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená nutriční přísada nebo prostředek je pro dětskou výživu.
18. 18. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12, vyznačující se tím, že je použita pro identifikaci bakteriálního adhesinu.
19. 19. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12 nebo látky shodující se s nárokem 18, vyznačující se tím, že je použita pro výrobu vakcíny proti Helicobacter pylori.
20. 20. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12, vyznačující se tím, že je použita pro typizaci Helicobacter pylori.
21. 21. Použití látky, která je definována v nárocích 1 až 12, vyznačující se tím, že je použita pro stanovení vazebnosti Helicobacter pylori.
22. 22. Látka vázající Helicobacter pylori, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci oligosacharidu

    Gal(A)_q(NAc)_ra3/p3Galp4Glc(NAc)_u kde q, r a u jsou nezávisle 0 nebo 1, s podmínkou, že když uvedená sekvence oligosacharidu obsahuje vazbu β3, jak q, tak r jsou 0 nebo 1; nebo

    GalA(NAc)_r a3^3Ga^4Glc(NAc)_u kde r a u jsou nezávisle 0 nebo 1, a vazebné analogy Helícobacter pylori jsou její deriváty.
23. 23. Nekyselá polyvalentní látka vázající Helícobacter pylori obsahující sekvenci oligosacharidu, která je definována v nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená sekvence oligosacharidu (OS) je částí struktury [OS -O- (X)_n-Y]_m—Z, která je definována v nároku 12, Y je hydrofilní vymezovací skupina, nejlépe flexibilní hydrofilní vymezovací skupina, a vazebné analogy Helícobacter pylori a jejich deriváty.
24. 24. Nekyselá polyvalentní látka vázající Helícobacter pylori podle nároku 23, vyznačující se tím, že vazebná struktura Y je [OS-O-(X)_n-Li-CH(H/{CHi.₂OH}pi) - {CH₁OH}_p2- {CH(NH-R)}_p3 - {ChhOH}^ - L₂]_m-Z kde U a L₂ jsou spojovací skupiny, které obsahují nezávisle spojovací atom kyslíku, dusíku, síry nebo uhlíku nebo dva spojovací atomy skupiny tvořící spojení, například 0-, -S-, -CH₂-, -N-, -N(C0CH3)-, amidové skupiny -CO-NH- nebo -NH-CO- nebo -N-N(derivát hydrazinu) nebo aminooxy vazby -O-N- a -N-Ο-, Li je vazba z uhlíku 1 redukčního konce monosacharidu X nebo, když η = O, M nahradí -O- a váže se přímo z redukujícího konce C1 patřícího OS; p1, p2, p3 a p4 jsou nezávisle celá čísla od O do 7 s podmínkou, že alespoň jedno z p1, p2, p3 a p4 je alespoň 1; {CH^OHJpi znamená, že koncová skupina řetězce je CH₂OH a když p1 je větší než 1, existuje sekundární alkoholová skupina -CHOH- spojující koncovou skupinu se zbylou částí vymezovací skupiny; Rje nejlépe acetylová skupina (-COCH₃) neboje R alternativní vazba k Z a pak je L₂ koncová skupina řetězce s jedním nebo dvěma atomy, v dalším včlenění je R skupina tvořící analog zahrnující C1-4 acylovou skupinu zahrnující amidovou strukturu ··· · · nebo Η nebo C1-4 alkyl tvořící amin; a m > 1 a Z je polyvalentní nosič; OS a Xjsou podle definice v nároku 12.
25. 25. Látka vázající Helicobacter pylori, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci oligosacharidů

    Gal(A)q(NAc)_r/ Glc(A)_q(NAc)_r a3/p3Galp4Glc(NAc)_u kde q, r a u jsou každé nezávisle 0 nebo 1, s podmínkou, že uvedená sekvence oligosacharidů není Gala3Gaip4Glc/GlcNAc, jako neredukující konec koncové sekvence, a vazebné analogy Helicobacter pylori a jejich deriváty.
26. 26. Látka podle jakéhokoliv z nároků 22 až 25, vyznačující se tím, že je k použití pro vázání bakterií, toxinů a virů.
27. 27. Látka podle jakéhokoliv z nároků 22 až 25, vyznačující se tím, že je k použití jako lék.
28. 28. Způsob léčby stavu způsobeného přítomností Helicobacter pylori, vyznačující se tím, že farmaceuticky účinné množství látky, která je definována v kterémkoliv z nároků 1 až 12 nebo 22 až 25, je podáváno jedinci, který takovou léčbu potřebuje.
29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že uvedený stav je způsoben přítomností Helicobacter pylori v gastrointestináiním traktu nemocného.
30. 30. Způsob podle nároku 28 , vyznačující se tím, že je pro léčbu chronické povrchové gastritidy, žaludečního vředu, dvanácterníkového vředu, žaludečního adenokarcinomu, ne-Hodgkinova lymfomu lidského žaludku, choroby jater, choroby slinivky, kožních chorob, chorob srdce, nebo autoimunitních chorob včetně autoimunitní gastritidy a zhoubné anemie a chorob žaludku, které mají vztah k nesteroidním protizánětlivým lékům (NSAID), nebo k prevenci syndromu náhlého kojeneckého úmrtí.
31. 31. Způsob léčby podle jakéhokoliv z nároků 28 až 30, vyznačující se tím, že uvedená látky je nutriční přísadou nebo částí nutričního prostředku.
32. 32. Látka podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedený toxin je toxin z Clostridium difficile.
33. 33. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená sekvence oligosacharidů je vázána β1 -6 z redukujícího konce na GalNAc, GIcNAc, Gal nebo Glc.
34. 34. Použití podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedená sekvence oligosacharidů je Glc(A)_q(NAc)_r β36θΙβ4ΘΙοΝΑο q a r jsou podle definice v nároku 1.