SK10042003A3 - Použitie látky obsahujúcej Helicobacter pylori - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález popisuje účinnú látku alebo receptor viažuci Helicobacter pylori a jej použitie vo farmaceutických a výživových kompozíciách pre liečenie stavov spojených s prítomnosťou Helicobacter pylori. Vynález sa tiež týka použitia receptora pre diagnózy Helicobacter pylori.

Doterajší stav techniky

Helicobacter pylori je súčasťou mnohých ochorení gastrointestinálneho traktu ako sú chronická gastritída, ochorenie žalúdka pôsobením nesteroidných protizápalových liekov (NSAID), vredy dvanástnika a žalúdka, gastrický MÁLT lymfóm a gastrický adenokarcinóm (Axon, 1993; Blaser, 1992; DeCross a Marshall, 1993; Dooley, 1993; Dunn a spol., 1997; Lin a spol., 1993; Nomura a Stemmermann, 1993; Parsonnet a spol., 1994; Sung a spol., 2000; Wotherspoon a spol., 1993). Úplné alebo čiastočné negastrointestinálne ochorenia sú také, ako syndróm náhleho úmrtia dojčiat (Kerr a spol., 2000 a US 6,083,756), autoimúnne ochorenia, ako sú autoimúnna gastritída a perniciózna anémia (Appelmelk a spol., 1998; Chmiela a spol., 1998; Clayes a spol., 1998; Jassel a spol., 1999; Steininger a spol., 1998) a niektoré ochorenia kože (Rebora a spol., 1995), ochorenie pankreasu (Correa a spol., 1990), ochorenia pečene vrátane adenokarcinómu (Nilsson a spol., 2000; Avenaud a spol., 2000) a ochorenia srdca, ako je ateroskleróza (Farsak a spol., 2000). Prehlad velkého počtu ochorení spôsobených alebo ktoré sú v spojení s Helicobacter pylori uvádza Pakodi a spol., 2000. Prvotným záujmom v zmysle bakteriálnej kolonizácie a infekcie je mechanizmus (mechanizmy), ktorým táto baktéria adheruje na povrch epiteliálnych buniek gastrickej mukózy.

Je známe, že glykokonjugáty, glykolipidy aj glykoproteíny, pôsobia ako napríklad, receptory pre väzbu tohoto mikroorganizmu ako, napríklad, sialyzované glykokonjugáty (Evans a spol., 1988), sírany a GM3 (Saitoh a spol., 1991), Le^b determinanty (Borén a spol., 1993), polyglykozylkeramidy (Miller-Podraza a spol., 1996; 1997a), laktozylkeramid (Anstrom a spol., 1998) a gangliotetraozylkeramid (Lingwood a spol., 1992, Angstrom a spol., 1998). Iné možné receptory pre Helicobacter pylori sú síran polysacharidového heparanu (Ascensio a spol., 1993) a rovnako fosfolipid fosfatidyletanolamínu (Lingwood a spol., 1992).

US patenty Zopf a spol.: 5,883,079 (marec 1999), 5,753,630 (máj 1989) a 5,514,660 (máj 1996) popisujú zlúčeniny obsahujúce Neu5Aca3Gal-, ktoré pôsobia ako inhibítory adhézie Helicobacter pylori. Sialyl-laktózová molekula inhibuje väzbu Helicobacter pylori na ludské gastrointestinálne bunkové línie (Šimon a spol., 1999) a je tiež účinná v zvieracom modeli infekcie u rhesus opíc (Mysore a spol., 2000). Zlúčenina je v klinickom testovaní.

US patent Kriváň a spol. 5,446,681 (november 1995) popisuje antibiotický konjugát pre bakteriálny receptor, ktorý obsahuje asialo gangliozid naviazaný na antibiotikum penicilín. Predovšetkým je nárokované liečenie Helicobacter pylori amoxicilin-asialo-GMl konjugátom. Oligosacharidová sekvencia/glykolipidy popísaná vo vynáleze nie je gangliozidom glykolipidov.

US patenty Kriváň a spol.: 5,386,027 (január 1995) a 5,217,715 (jún 1993) popisujú použitie oligosacharidových alebo glykolipidových sekvencií, ktoré inhibujú niektoré patogénne baktérie, avšak bežná väzobná špecificita nie je uvedená a Helicobacter pylori nie je medzi hodnotenými baktériami a nie je uvedený v nárokoch.

Bola popísaná sacharidová sekvencia GlcAc53Gal ako receptor pre Streptococcus (Andersson a spol., 1986). Niektoré baktérie môžu mať iné väzobné vlastnosti, ale nie je možné predpokladať väzby dokonca ani blízkych bakteriálnych adhezínov. V prípade Helicobacter pylori nie sú známe sacharidové väzobné molekuly, s výnimkou Lewis b väzobného proteínu.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka použitia účinnej látky, alebo väzby receptora na Helicobacter pylori, ktorá obsahuje oligosacharidovú sekvenciu [Gal (A) _q (NAc) _r/Glc (A) _q (NAc) _ra3/B3] _s [GalB4GlcNAcú4GlcNAcB3] _tGAlB 4Glc(NAc)_u kde q, r, s, t a u sú každé nezávisle 0 alebo 1, takže, keď t=0 a u=0, potom oligosacharidová sekvencia je naviazaná na polyvalentný nosič alebo je ako volný oligosacharid vo vysokej koncentrácii, a analógy alebo deriváty uvedenej oligosacharidovej sekvencie majú väzobnú kapacitu pre Helicobacter pylori pre tvorbu kompozície pre väzobnú alebo inhibičnú aktivitu voči Helicobacter pylori.

Medzi ciele vynálezu patrí použitie oligosacharidových sekvencii viažucich Helicobacter pylori popísaných v predkladanom vynáleze, ako lieku, a ich použitie pre prípravu farmaceutickej kompozície, predovšetkým pre liečenie akéhokoľvek stavu spôsobeného prítomnosťou Helicobacter pylori.

Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobov pre liečenie stavov spôsobených prítomnosťou Helicobacter pylori. Vynález je tiež smerovaný na použitie receptora (receptorov) popísaných vo vynáleze ako Helicobacter pylori viažuca alebo inhibujúca väzobná látka pre diagnózy Helicobacter pylori.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnutie látok, farmaceutických kompozícií a výživovývh doplnkov obsahujúcich oligosacharidovú sekvenciu (sekvencie) viažucu Helicobacter pylori.

Inými cieľmi predkladaného vynálezu sú použitie vyššie uvedených väzobných látok pre Helicobacter pylori pre identifikáciu bakteriálneho adhezínu, typizácia Helicobacter pylori a väzobné stanovenie Helicobacter pylori.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je použitie vyššie uvedených väzobných látok pre Helicobacter pylori pre prípravu vakcíny voči Helicobacter pylori.

Popis obrázkov

Obr. IA a 1B: EI/MS permetylovaných oligosacharidov získaných z hexaglykozylkeramidu pôsobením endoglykokeramidázy. Záznam plynovej chromatografie oligosacharidov (hoe) a EI/MS spektrá vrcholov A a B (dole).

Obr. 2A a 2B: Negatívne iónové FAB hmotnostné spektrum hexa(2A) a pentaglykozylkeramidu (2B).

Obr. 3A a 3B: Protónové NMR spektrum ukazuje anometrickú oblasť glykolípídu so šiestimi cukrami (3A) a glykolipidu s piatimi cukrami (3B), Spektra boli merané cez noc, aby sa tak získal dobrý signál a minimalizoval sa šum pre zložku 1 minoritného typu.

Obr. 4A, 4B a 4C: Enzymatická degradácia glykosfingolipidov z králičieho týmusu. Platne s tenkou vrstvou silikagélu boli delené v C/M/H^O ¢60:35:8, objem/objem). 4A a 4B, platne vizualizované 4-metoxybenzaldehydom. 4C, autorádiogram po nanesení ³⁵S-označeného Helicobacter pylori. 1, heptaglykozylkeramid (štruktúra 1, Tabulka I); 2, desialyzovaný heptaglykozylkeramid (získaný po opracovaní kyselinou); 3, desialyzovaný heptaglykozylkeramid po pôsobení 54-galaktozídázy; 4, heptaglykozylkeramid po pôsobení sialidázy a 54galaktozidázy; 5, referenčné glykosfingolipidy ľudských erytrocytov (laktozylkeramid, trihexozylkeramid a globozid); 6, desialyzovaný heptaglykozylkeramid po pôsobení 54galaktozidázy a 5-hexozaminidázy; 7, heptaglykozylkeramid po pôsobení sialidázy, 54-galaktozidázy a 5-hexozaminídázy.

Obr. 5A a 5B: TLC produktov získaných po parciálnej kyslej hydrolýze heptaglykozylkeramidu z králičieho týmusu (štruktúra 1, Tabuľka I). Mobilná fáza bola taká istá ako na Obr. 4A, 4B a 4C. 5A, vizualizácia platne 4-metoxybenzaldehydom; 5B, autorádiogram po nanesení ³⁵S-označeného Helicobacter pylori. 1, heptaglykozylkeramid; 2, desializovaný heptaglykozylkeramid (po pôsobení kyseliny); 3, pentaglykozylkeramid; 4, hydrolyzát; 5, referenčné glykosfingolipidy (ako na Obr. 4A, 4B a 4C).

Obr. 6A a 6B: Séria riedení glykosfingolipidov. Väzobná aktivita na TLC platniach bola určená použitím techniky prekrytia baktériou. TLC vyvíjači roztok bol ten istý ako na Obr. 4A, 4B a 4C. Rôzne glykolipidy boli nanesené na platne v ekvimolárnom množstve. Kvantifikácia glykolipidov bola založená na obsahu hexózy. 6A, hexa- a pentaglykozylkeramidy (štruktúry 2 a 3, Tabuľka I); 6B, penta- a tetraglykozylkeramidy (štruktúry 4 a 5, Tabulka I) . Množstvá glykolipidov (vyjadrené v pmol) boli: 1, 1280 (každý); 2, 640; 3, 320; 4, 160; 5, 80; 6, 40; 7, 20 pmol (každý).

Obr. 7A a 7B: Chromatogram tenkovrstevnej chromatografíe s rozdelenými glykosfingolipidmi detekovaný 4-metoxybenzaldehydom (7A) a autorádiogram po väzbe rádiooznačeného

Helicobacter pylori kmeň 032 <7B). Glykosfingolipidy boli rozdelené na silikagéli 60 s hliníkovým podkladom na HPTLC platniach (Merck) a použitím chloroform/metanol/voda (60:35:8, objem) ako mobilnej fázy. Stanovenie väzby sa uskutočnilo tak, ako je popísané v kapitole „Materiál a metódy. Autorádiografia trvala 72 hodín. Jednotlivé riadky obsahovali:

riadok 1) GalB4GlcNAcB3GalB4GlcfllCer (neolaktotetraozylkeramid), 4 pg;

riadok 2) Gala3Galft4GlcNAcB3GalB4GlchlCer (B5 glykosfingolipid), 4 pg;

riadok 3) Gala3Galh4GlcNH₂B3GalB4GlcBlCer, 4 pg;

riadok 4) Gala3(Fuca2)GalB4GlcNAcB3GalB4GlcňlCer (B6 typ 2 glykosfingolipid), 4 pg;

riadok 5) GlcNAch3Galh4GlcNAcfi3GalB4GlchlCer, 4 pg;

riadok 6) GalB4GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBlCer, 4 pg; riadok 7) GalNAcň3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBlCer (x₂ glykosfingolipid) , 4 pg;

riadok 8) NeuAca2GalNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBlCer (NeuAcX2) , 4 pg;

riadok 9) FucaGalB4GlcNAcB3Galfi4GlcBlCer (H5 typ 2 glykosfingolipid) , 4 pg;

riadok 10) NeuAca3GalB4GlcNAcB3Galfi4GlchlCer (sialylneolaktotetraozylkeramid), 4 pg.

Zdroje glykosfingolipidov boli také isté ako je uvedené v Tabulke 2.

Obr. 8A, 8B, 8C a 8D: Vypočítané minimálne energetické konformácie troch glykosfingolipidov, ktoré viažu Helicobacter pylori:

GalNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcôCer (8A) ,

GalNAca3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (8B) a

Gala3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (8C) .

Znázornená je tiež štruktúra

Gala3Galfi4GlcNH233Galň4GlcBCer (8D) , ktorá sa neviaže. V hornej časti obrázkov sú tiež zaznamenané časti štruktúry sacharidu s vypočítanou minimálnou energiou. Napriek rozdielom v anometrii, neprítomnosti alebo prítomnosti amino skupiny, osovej alebo rovnobežnej polohy 4-OH v terminálnom cukri a skutočnosť, že kruh terminálnych a3 zlúčenín je nad príslušnou rovinou štruktúr s E3-väzbou, existuje významná topografická podobnosť medzi týmito štruktúrami a štruktúrou zakončenou GlcNAcň3, ktorá je odvodená z králičieho týmusu (pozri Obr. 9A) . Vysvetľuje to ich podobné afinity pre bakteriálny adhezín. Naproti tomu acetamido skupina interného GlcNAcB3 je nevyhnutná pre väzbu (8C a 8D) .

Obr. 9A, 9B, 9C a 9D: Vypočítané minimálne energetické konformácie väzobno aktívnych glykosfingolipidov GlcNAcftGalň4GlcNAcfi3GalB4GlcBCer (9A) a

Galfi4GlcNAcft3Galfí4-GlcNAcB3Galh4GlcBCer (9B) a neviažucich glykosfingolipidov NeuAca3GalNAcB3Galň4GlcNAcS3GalB4GlcBCer (9C) a Gala3(Fuca2)Galfi4GlcNAcfi3Galfi4GlcBCer (9D). Posledné dve predĺženia (9C a 9D) rušia väzbu Helicohacter pylori, kým predchádzajúca štruktúra (9B) je tolerovaná, ale má zníženú afinitu. Spolu so zistením, že de-N-acylácia acetamidového podielu terminálneho GlcNAc v B5 (Obr. 8A, 8B, 8C a 8D) úplne ruší väzbu, časť tvoriaca väzobný epitop musí obsahovať terminálny trisacharid v B5, čo je znázornené na Obr. 8C, aj napriek tomu, že acetamido skupina terminálneho N-acetylgalaktozamínu nie je esenciálna.

Obr. 10: Minimálna energetická konformácia zlúčeniny

NeuGca3GalB4GlcNAcfi3GalB4GlcNAcô3GalMGlcfiCer so siedmimi cukrami znázornená z dvoch pohľadov. Koncový atóm uhlíka orientáciu.

konformácia, glykolylového podielu sialovej kyseliny a rovnako uhlíkové atómy metylu v acetamído skupinách v dvoch vnútorných GlcNAc zvyškoch sú označené len čiernou farbou, čo umožní lepšiu Pre väzbu GlchCer bola vybratá predĺžená ale minimálna väzobná sekvencia

GlcNAcB3GalL4GlcNAcL3 je pravdepodobne lepšie vystavená smerom k adhezínu v GlcftCer konformáciách ako je tá, ktorá je tu prezentovaná.

Obr. 11A, 11B a 11C: Väzba monoklonálnej protilátky TH2 (11B) a lektínu z E. cristagalli (11C) na celkové glykosfingolipidové frakcie z epiteliálnych buniek ludskej gastrickej mukózy, ludských granulocytov a ľudských erytrocytov rozdelených chromatografiou na tenkej vrstve. Na Obr. 11A sú zaznamenané rovnaké frakcie po zafarbení 4-metoxybenzaldehydom. Autorádiografia v prípade (11B) a (11C) trvala dvanásť hodín. V riadkoch 1-6 bolo aplikovaných 80 pg celkových frakcií z epiteliálnych buniek ľudskej gastrickej mukózy piatich jedincov s rôznou krvnou skupinou A. V riadku 6 bolo aplikovaných 40 pg celej nekyslej frakcie ludských granulocytov a v riadku 7 bolo aplikovaných 40 pg z celkovej nekyslej frakcie ludských erytrocytov. Uskutočnili sa stanovenia metódou prekrytia tak, ako je popísané v kapitole „Materiál a metódy.

Podrobný popis vynálezu

Predkladaný vynález popisuje sekvencie rodiny špecifických oligosacharidov, ktoré sa viažu na Helicobacter pylori. Prekrývacou tenkovrstevnou chromatografiou bol vyšetrený velký počet prirodzene sa vyskytujúcich glykosfingolipidov (Tabulka 2). Použité štruktúry glykosfingolipidov boli charakterizované protónovou NMR a hmotnostnou spektroskopiou. Použité bolo molekulárne modelovanie, ktoré umožnilo porovnať trojrozmerné štruktúry účinných látok viažucich sa na Helicobacter pylori.

Porovnaním štyroch pentasacharid glykolipidov bola zistená nová väzobná špecificita. Zistilo sa, že výmena neredukujúceho zakončenia koncového sacharidu v GlcNAcB3GalB4GlcNAcň3GalB4GlcBCer za buď GalNAcň3 (krátky názov x₂ GSL), GalNAca3 alebo Gala3 (B5) vedie k väzbe Helicobacter pylori, napriek rozdielom v anometrii, neprítomnosti alebo prítomnosti acetamido zoskupenia a osovo/rovnobežnej polohy 4-OH. Špecificita tiež zahrňuje štruktúry so slabšou väzbou na Helicobacter pylori·. kratšia forma GalL4GlcNAcB3Galh4GlcBCer a B4-predížené formy glykolipidu s koncovým N-acetylglukozamínom:

GalB4GlcNAcň3GalB4GlcNAcň3Galň4GlcECer a

NeuGca3GalB4GlcNAcň3Galň4GlcNAcfi3GalE4GlcňCer. Naproti doteraz známej závislosti špecificity na kyseline sialovej (Evans a spol., 1988; Miller-Podraza a spol., 1996; 1997a), kyselina N-glykolyl neuraminová posledného vymenovaného glykosfingolipidu môže byť uvoľnená bez toho, aby sa zmenila väzba na Helicobacter pylori.

Väzba na GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer bola dobre reprodukovateľná, hoci vo všeobecnosti sacharidovým väzbám Helicobacter pylori chýbajú fázové variácie baktérií. V prekrývacom stanovení s nízkymi pikomolárnymi množstvami glykolipidu bola pozorovaná vysoká väzobná afinita.

Dĺžka väzobného epitopu bola učená v pokusoch, ktoré ukázali, že GlcNAcň3Galň4GlcňCer, GalB4GlcNB3GalB4GlcňCer a Gala3GalB4GlcNE3GalB4GlcECer (skrátený z N-deacetylovaných foriem aktívnych látok) sa neviazali na Helicobacter pylori. Výsledky ukázali, že vnútorný GlcNAc zvyšok sa účastní väzby, ale nevytvára dostatočne silnú väzbu. Uvažovalo sa o tom, že väzobný epitop je koncový trisacharid pentasacharidových epitopov uvedených vyššie. Keď sú prítomné len dva zvyšky v GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer je väzba slabšia, a v hexasacharidovom glykolipide

Galň4GlcNAch3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer, koncový GalB4 inhibuje väzbu, čo vysvetľuje slabšiu aktivitu. Heptasacharidový glykolipid Gala3 v menej aktívnej hexasacharidovej glykolipidovej štruktúre

Galct3GalB4GlcNAcB3Galh4GlcNAcB3GalB4GlcBCer, má vyššiu aktivitu. Znamená to, že pre dobrú väzobnú aktivitu sú potrebné koncové trisacharidové epitopy.

Špecificita väzby bola charakterizovaná stanovením izomérov a modifikovaných foriem aktívnych látok. Predĺžené formy Galfl4GlcNAcB3GalB4GlcB s modifikáciami na koncovom Gal: Fuca2 (krátky názov H5-2), Fuc<x2 a Gal/GalNAca3 (B6-2, A62), Neu5Aca3 alebo Neu5Aca6 (sialylparaglobozidy), alebo Gala4 (PI) boli inktívne pri stanovení väzby na Helicobacter pylori. Väzba bola tiež porušená prítomnosťou B6-vetvenia na vnútornej galaktóze v štruktúre

Galň4GlcNAch3(GalB4GlcNAcB6)GalB4GlcBCer. Ukázalo sa, že rozvetvenie mení GalB4GlcNAcB-epitop a disacharidové väzobné miesto je pravdepodobne stericky prekryté (Teneberg a spol., 1994). Výsledok však ukazuje, že vnútorný zvyšok galaktózy, na ktorý sú naviazané disacharidové alebo trisacharidové väzobné epitopy B3 väzbou, môžu tiež prispievať k väzbe). Zdá sa, že Neu5Aca3GalNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (predĺžená forma väzobné aktívneho x₂-glykosfingolipidu), alebo GalNAcB3Gala3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (predĺžený B5 GSL) sa neviažu na Helicobacter pylori.

Na porovnanie aktívnych väzobných štruktúr a neaktívnych druhov bolo použité molekulové modelovanie. Vypočítané konformácie s minimálnou energiou štyroch pentasacharidových glykosfingolipidov (GalB4GlcNAcB3Gal54GlcBCer s predĺžením buď GlcNAcfi3, GalNAcň3, GalNAca3 alebo Gala3) ukázali, že konformácie zlúčenín môžu velmi napodobňovať jedna druhú. Konformácie inaktívnych glykolipidov boli rôzne. Napriek skutočnosti, že koncové sacharidy sa líšia tiež v ich anomerickej väzbe (dve alfa- a dve beta- väzby), molekulové modelovanie ukázalo, že štruktúry s minimálnou energiou sú topograficky velmi podobné. Rozdiely koncových štruktúr sú: Galcc3 chýba acetamidová skupina, ktorá je prítomná v iných troch štruktúrach, Gal a GalNAc má 4-OH v osovej polohe a GlcNAc v rovnobežnej polohe, a roviny kruhov alfa anomerického zakončenia sú mierne nad príslušnou rovinou beta anomerických štruktúr. Predĺženie zakončenia je možné v polohe 4 v GlcNAc, čo znamená, že 4-OH nie je veľmi dôležitá pre väzbu, hoci Galú4 predĺženie spôsobuje stérickú interferenciu. Záverom možno konštatovať, že ani poloha 4-OH a ani prítomnosť/neprítomnosť acetamidovej skupiny a ani anomerická štruktúra koncového monosacharidu nie sú potrebné pre väzbu, napriek tomu, že pentasacharidové glykolipidy majú podobné afinity pre adhezín Helicobacter pylorí.

Z pohľadu týchto zásad väzby, ďalšie štyri koncové monosacharidy väzobnej látky môžu tvoriť trisacharidové väzobné epitopy: GalE3GalE4GlcNAc, GlcNAca3Galú4GlcNAc, Glcň3Galft4GlcNAc a Glca3GalB4GlcNAc. Tieto sú analógne študovaným sekvenciam a líšia sa v anomérnych, 4-epimérnych alebo C2 NAc/OH štruktúrach. Prvá je prítomná na glykolipide ľudských erytrocytov, kým ďalšie tri nie sú známe v ľudských tkanivách, ale môžu predstavovať skôr analógy prirodzeného receptora.

Ukázalo sa, že väzobný epitop obsahuje prvok koncového trisacharidu aktívnych pentasacharidových glykolipidov, najmenej vo väčších repetitívnych N-acetyllaktozamínoch, epitop môže byť tiež v strede sacharidového reťazca. Predkladatelia vynálezu si uvedomujú, že väzobné epitopy môžu byť prítomné v rôznych formách na prirodzených alebo biosynteticky pripravených glykokonjugátoch a oligosacharidoch ako sú O-naviazané alebo N-naviazané glykany glykoproteínov a poly-N-acetyllaktozamín oligosacharidov. Spôsoby chemických a enzymatických syntéz, predovšetkým sacharidov, umožňujú prípravu temer neohraničeného množstva derivátov a analógov. Velkosť väzobného epitopu umožňuje niektoré modifikácie. Príkladom sú modifikácie Cl, C2 a C4 na koncovom monosacharide, odstránenie neredukujúceho koncového monosacharidu alebo predĺženie od C4 koncového GlcNAc na GlcNAcE3Galb4GlcNAc, to znamená, poloha C4 na GlcNAcE3 môže byť naviazaná na oligosacharidový reťazec glykozidickou väzbou. Keď je oligosacharidová sekvencia

GlcNAcB3Galň4GlcNAcb3GalE4Glc, poloha C4 na koncovom GlcNAcfí môže byť naviazaná na Galfil-, alebo na oligosacharidový reťazec glykozidickou väzbou. Predovšetkým polohy C2 a C4 neredukujúceho koncového monosacharidového zvyšku v trisacharidovom epitope a redukujúce konce epitopov môžu byť použité pre prípravu derivátov a oligomérnych alebo polymérnych konjugátov, ktoré majú väzobnú aktivitu k Helicobacter pylori. Pre prípravu derivátov a analógov môžu byť tiež použité C6 polohy monosacharidových zvyškov, predovšetkým C6 poloha neredukujúceho koncového zvyšku trisacharidovej sekvencie a výhodný je redukujúci koncový zvyšok di- a trisacharidových väzobných látok.

V predkladanom vynáleze výraz „analóg a „derivát sú definované nasledovne. Podľa predkladaného vynálezu je možné navrhnúť štruktúrne analógy alebo deriváty sekvencii oligosacharidu viažuceho Helicobacter pylori. Vynález sa preto týka štruktúrnych analógov látok podľa predkladaného vynálezu. Štruktúrne analógy podľa vynálezu obsahujú štruktúrne prvky dôležité pre väzbu oligosacharidovej sekvencie na Helicobacter pylori. Pre navrhnutie účinných štruktúrnych analógov je dôležité poznať štruktúrny prvok, ktorý je dôležitý pre väzbu medzi Helicobacter pylori a sacharidmi. Dôležité štruktúrne prvky sú výhodne nemodifikované, alebo tieto sú modifikované v tesnej blízkosti dôležitého štruktúrneho prvku. Tieto prvky výhodne obsahujú 4-, a 6hydroxylové skupiny v GalB4 zvyšku trisacharidových a disacharidových epitopov. Významným štruktúrnym prvkom je tiež poloha naviazania medzi kruhovými štruktúrami. Pre vysokú afinitnú väzbu je výhodná acetamido skupina alebo acetamido napodobňujúca skupina v polohe zodpovedajúcej acetamido skupine v redukujúcom zakončení GlcNAc di- a trisacharidových epitopov. Acetamido napodobňujúca skupina môže byť iný amid, ako alkylamido, arylamido, sekundárny amín, výhodne N-etyl alebo N-metyl, O-acetyl, alebo O-alkyl, napríklad O-etyl alebo O-metyl. Pre vysokú afinitnú väzbu sú preto výhodné amidové deriváty karboxylovej kyseliny v koncovej uronovej kyseline a ich analógy. Aktivita nemodifikovanej uronovej kyseliny sa zvyšuje v nižšom pH.

Štruktúrne deriváty podľa predkladaného vynálezu sú oligosacharidové sekvencie podlá vynálezu chemicky modifikované tak, že väzba na Helicobacter pylori je zachovaná, alebo zvýšená. Podlá vynálezu je výhodné derivatizovať jednu alebo viac hydroxyl alebo acetamido skupín v oligosacharidovéj sekvencii. Vynález popisuje niekoľko polôh v molekule, ktoré môžu byť zmenené pri príprave analógov alebo derivátov. Hydroxylové alebo acetamidové skupiny, ktoré tolerujú aspoň niektoré modifikácie sú označené ako R-skupiny vo vzorci 1.

Objemné alebo kyslé substituenty a iné štruktúry, ako sú monosacharidové zvyšky, nie sú tolerované vtedy, keď sú naviazané v polohe C2, C3 alebo C6 hydroxylov v GalE4GlcNAc a na C3 hydroxyl v neredukujúcom koncovom monosacharide trisacharidových epitopov. Spôsoby prípravy oligosacharidových analógov pre väzbu lektínov sú dobre známe. Napríklad, bol pripravený velký počet analógov sialyl-Lewis x oligosacharidov s aktívnymi funkčnými skupinami rôzneho premostenia (pozri strana 12090 Sears a Wong, 1996). Podobné analógy heparínových oligosacharidov pripravila spoločnosť Sanofi a mnohé skupiny pripravili inhibítory napodobňujúce sialovú kyselinu, ako je Zanamivir a Tamiflu (Relenza), pre enzým sialidáza. Výhodný je oligosacharidový analóg pripravený z molekuly obsahujúcej najmenej jeden šesť- alebo päť- členný štruktúrny kruh, výhodnejšie analóg obsahuje najmenej dve kruhové štruktúry s obsahom 6 alebo 5 atómov. Výhodný analóg oligosacharidového typu obsahuje amid koncovej uronovej kyseliny, alebo je analóg naviazaný na GalE4GlcNAc-sacharid napodobňujúcu štruktúru. Alternatívne je amid koncovej uronovej kyseliny 1-3 naviazaný na Gal, ktorý je naviazaný na GlcNAc napodobňujúcu štruktúru. V napodobňujúcich štruktúrach monosacharidové kruhy môžu byť nahradené kruhmi ako cyklo15 hexán alebo cyklopentan, aromatickými kruhmi ako je benzénový kruh, heterocyklické kruhové štruktúry môžu obsahovať okrem kyslíka atómy dusíka a síry. Na uzamknutie aktívnych kruhových konformácii môžu byť kruhové štruktúry navzájom spojené tolerovanými spájajúcimi skupinami. Typická mimetická štruktúra môže tiež obsahovať peptidové analógy pre oligosacharidovú sekvenciu, alebo jej časť.

Účinky aktívnych skupín pre väzobnú aktivitu sú kumulatívne a neprítomnosť jednej skupiny môže byť kompenzovaná pridaním aktívneho zvyšku na druhú stranu molekuly. Podlá predkladaného vynálezu pre prípravu analógových štruktúr sekvencií väzobných oligosacharidov pre Helicobacter pylori môže byť použité molekulové modelovanie, výhodne počítačové molekulové modelovanie. Výsledky molekulového modelovania mnohých oligosacharidových sekvencií sú uvedené v príkladoch a tie isté, alebo podobné spôsoby, okrem NMR a rôntgenovej kryštalografie, môžu byť použité pre získanie štruktúr pre iné oligosacharidové sekvencie podlá vynálezu. Pre získanie analógov môžu byť oligosacharidové štruktúry „zakotvené v uhlohydrátovej väzobnej molekule (molekulách) Helicobacter pylori, najpravdepodobnejšie do bakteriálnych lektínov.

Treba tiež poznamenať, že monovalentné, oligovalentné alebo polyvalentné oligosacharidy môžu byť aktivované na vyššiu aktivitu voči lektínom prípravou derivátu oligosacharidu kombinatórnou chémiou. Po vytvorení knižnice substitúciou jedného alebo viacerých zvyškov v oligosacharidovej sekvencií, môže byť táto považovaná za knižnicu derivátov ale tiež vtedy, keď je knižnica pripravená z analógov oligosacharidových sekvencií popísaných vo vynáleze. Podlá vynálezu knižnica vytvorená kombinatórnou chémiou môže byť vytvorená z oligosacharidu alebo jeho prekurzoru alebo glykokonjugátov. Napríklad, karbohydrid technológiou môžu byť pripravené oligosacharidy s rôznym redukujúcim zakončením.

Vo výhodnom uskutočnení knižnica je vytvorená kombinatórnou chémiou a je konjugovaná na Helicobacter pylori väzobnými látkami popísanými vynálezom. Vo výhodnejšom uskutočnení knižnica obsahuje najmenej 6 rôznych molekúl. Výhodné modifikácie kombinatórnej chémie sú vytvorené rôznymi amidmi zo skupiny karboxylovej kyseliny na R₈ podía vzorca I. Skupina, ktorá má byť modifikovaná na R₈ môže byť tiež aldehydová alebo amínová skupina, alebo reaktívna skupina iného typu. Takáto knižnica je výhodná pre použitie pri stanovení väzby mikróbov na oligosacharidovú sekvenciu podlá predkladaného vynálezu. Aminokyseliny alebo kolekcie organických amidov sú komerčne dostupné. Tieto látky môžu byť použité pre syntézy kombinatórnej knižnice amidov uronovej kyseliny. Napríklad, látka s vysokou väzobnou afinitou môže byť identifikovaná z kombinatórnej knižnice použitím inhibičného stanovenia, kde sú použité látky z knižnice a hodnotí sa inhibícia väzby baktérií na glykolipidy alebo glykokonjugáty popísané v predkladanom vynáleze. Podía vynálezu sú výhodné štruktúrne analógy a deriváty, ktoré môžu inhibovať väzbu Helicobacter pylori na sekvenciu väzobných oligosacharidov podía vynálezu.

Stérická prekážka lipidovej časti, alebo blízkosť silika povrchu pravdepodobne obmedzuje meranie epitopu GlcNAcfi3GalE4Glc pri bežnom TLC stanovení. Stanovenie aktivity tejto sekvencie nie je možné pri štúdiu toxínu A z Clostridium difficile, ktorý špecificky rozpoznáva rovnaké štyri trisacharidové epitopy, tu popísané pre Helicobacter pylori (Teneberg a spol., 1996). Avšak, väzba Gala3GalB4Glc na toxín A bola dokázaná použitím veľkého polymérneho spacerom modifikovaného konjugátu sacharidu (Castagliuolo a spol., 1996). Príspevok koncového monosacharidu pre väzbu znamená, že Glc je možný v redukujúcom zakončení epitopu. Trisacharidové epitopy s Glc na redukujúcom zakončení sú považované ako účinné analógy látok viažucich Helicobacter pylori, keď sú prítomné v oligovalentnej, alebo výhodnejšie polyvalentnej forme. V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu sú sacharidy s Glc na redukujúcom zakončení, a sú použité ako voľné redukujúce sacharidy vo vysokej koncentrácii, výhodne v rozsahu 1 až 100 g/1, výhodnejšie 1 až 20 g/1. Tieto sacharidy môžu mať malú aktivitu v rozsahu koncentrácií 0,1 až 1 g/1.

Nasleduje popis Helicobacter pylori viažucej sekvencie akou je oligosacharidová sekvencia. Tu definovaná oligosacharidová sekvnecia môže byť časťou prirodzeného alebo syntetického glykokonjugátu alebo voľného oligosacharidu, alebo časťou voľného oligosacharidu. Takáto oligosacharidová sekvencia môže byť naviazaná na rôzne monosacharidy alebo oligosacharidy alebo polysacharidy v polysacharidových reťazcoch. Napríklad, keď je sacharidová sekvencia časťou bakteriálneho polysacharidu. Okrem toho, je známy veľký počet prírodných modifikácií monosacharidov, ako je napríklad, 0acetyl alebo síranový derivát oligosacharidových sekvencii. Tu definovaná Helicobacter pylori viažuca látka môže obsahovať oligosacharidovú sekvenciu popísanú ako časť prirodzeného alebo syntetického glykokonjugátu alebo príslušného voľného oligosacharidu alebo časť voľného oligosacharidu. Helicobacter pylori viažuca látka môže tiež obsahovať zmes Helicobacter pylori viažucich oligosacharidových sekvencii.

Niektoré obmeny receptorovej oligosacharidovej sekvencie znižujú väzbu pod hranicu stanovenia bežnou metódou, čo je dôkazom špecificity. Výsledky väzobných štúdií ukazujú, že keď uvedené oligosacharidové sekvencie majú GalNAcB3 sú naviazané na Gala3Galft4GlcNAc (substituovaná sekvencia: GalNAcL3Gala3Galň4GlcNAc), alebo Neu5Aca3 naviazaný na GalNAcL3GalL4GlcNAc (substituovaná sekvencia:

Neu5Aca3GalNAcB3Galh4GlcNAc), nie sú aktívne. Keď uvedená oligosacharidová sekvencie je Galh4GlcNAc, nie je to a4galaktozylovaná (sekvencia nie je Gala4GalL4GlcNAc) , ct3-, alebo αβ-sialyzovaná (sekvencia nie je

Neu5Aca3/6GalB4GlcNÄc) , (x2- alebo a3-fukozylovaná (uvedená oligosacharidová sekvencia nie je Fuca2Galb4GlcNAc alebo Galh4(Fuca3)GlcNAc alebo Fuca2Galft4(Fuca3)GlcNAc, a3-fukozylácia sa týka fukozylácie GlcNAc zvyškov laktozamínu tvoriaceho Lewis x, Galh4(Fuca3)GlcNAc). Sacharidy so štruktúrou, kde Galb3 je naviazaná na GlcNAcL3 (ako je

GalL3GlcNAcB3GalL4GlcNAc/Glc) majú rôzne konformácie v porovnaní s tu poopísanými Helicobacter pylori viažucimi látkami a ich väzobná špecificita bola študovaná oddelene. Helicobacter pylori viažuce látky môžu byť časťou sacharidového reťazca alebo glykokonjugátu alebo zmesou glykozlúčenín obsahujúcich iné Helicobacter pylori viažuce epítopy, s inými sacharidovými sekvenciami a konformáciami, ako Lewis b (Fuca2GalL3(Fuca4)GlcNAc) , alebo Neu5Aca3GalE4Glc/GlcNAc. Pre liečenie môže byť osožné spoločné použitie viacerých väzobných látok.

Helicobacter pylori viažuce oligosacharidové sekvencie môžu byť syntetizované enzymaticky glykozyltransferázami, alebo transglykozyláciou katalyzovanou glykozidázou alebo transglykozidázou (Ernst a spol., 2000). Môžu byť použité špecificita týchto enzýmov a kofaktory. Pre účinnú syntézu môžu byť použité špecificky modifikované enzýmy. Napríklad, glykosyntéza je modifikovaná pre uskutočnenie len transglykozylácie. Známe sú organické syntézy sacharidov a tu popísaných konjugátov alebo ich podobných zlúčenín (Ernst a spol., 2000). Pre získanie Helicobacter pylori viažucich zlúčenín môže byť sacharidový materiál izolovaný z prírodných zdrojov a môže byť modifikovaný chemicky alebo enzymaticky. Prírodné oligosacharidy môžu byť izolované z mliek rôznych prežúvavcov. Pre produkciu sacharidov môžu byť použité transgénne organizmy, ako sú kravy alebo mikróby exprimujúce glykozylačné enzýmy.

Zvyšky monosacharidov obsahujúce uronovú kyselinu popísané vo vynáleze môžu byť získané spôsobmi známymi v odbore. Napríklad, hydroxyl 6-uhlíkového N-acetylglukozamínu alebo Nacetylgalaktozamínov môžu byť chemicky oxidované na karboxylovú kyselinu. Oxidácia sa môže uskutočniť u vhodne ochráneného oligosacharidu alebo monosacharidu.

Vo výhodnom uskutočnení neochránený polymér alebo oligomér obsahujúci hexózy, N-acetylhexozamíny alebo hexozamíny, kde väzba medzi monosacharidmi nie je medzi atómami, je

1) oxidovaný na príslušný polymér zvyškov uronovej kyseliny, alebo polymér obsahuje monoméry 6aldehydomonosacharidov

2) možná derivatizácia skupiny karboxylovej kyseliny alebo

6-aldehydo skupiny, výhodne na amid alebo amín a

3) hydrolýza na monosacharidy urónovej kyseliny alebo monosacharidy derivátov uronovej kyseliny.

Chemické alebo enzymatické spôsoby oxidácie monosacharidových zvyškov uronovej kyseliny a hydrolýzy amínu alebo polymérov uronovej kyseliny sú v odbore dobre známe. Zvlášť je výhodné použitie oligomérov alebo polymérov celulózy, škrobu alebo iných glykanov s 1-2 alebo 1-3 alebo 1-4 väzbami, chitínu (GlcNAc polymér) alebo chitosanu (GlcN polymér), ktoré sú komerčne dostupné ako velká skupina Nacetylgalaktozamín/galaktozamín polysacharidov (napríklad, z bakteriálnych zdrojov), ktorý je oxidovaný na príslušný 1-4 naviazaný sacharid. Tento spôsob môže byť použitý tiež na polyméry galaktanu. Deriváty uronovej kyseliny môžu byť pripravené tiež z prírodných polymérov, ktoré obsahujú uronovú kyselinu, ako sú pektíny alebo bakteriálne polysacharidy obsahujúce glukuronovú kyselinu, vrátane Nacetylheparinu, alebo bakteriálne exopolysacharidy obsahujúce kyselinu hyaluronovú a chondroitin. Tieto spôsoby zahrňujú:

1) derivatizáciu skupiny karboxylovej kyseliny polysacharidu, výhodne amidovou väzbou a

2) hydrolýzu polysacharidu na monosacharidy uronovej kyseliny, alebo deriváty monosacharidov s urónovou kyselinou.

Chemické a enzymatické spôsoby sú známe tiež pre oxidáciu primárneho alkoholu na uhlíku 6 v polysacharide za vzniku aldehydu alebo karboxylovej kyseliny. Alkohol môže byť ďalej derivatizovaný, napríklad redukčnou amináciou na amín. Výhodne koncový Gal alebo GAlNAc je oxidovaný primárnym oxidačným enzýmom podobným galaktózovej oxidáze a môže byť ďalej derivatizovaný, napríklad, amínmi.

Štandardnými spôsobmi organickej chémie môžu byť zvyšky kyseliny uronovej konjugované na disacharidy alebo oligosacharidy. GlcA môže byť naviazaný pôsobením glykuronyl transferázy na koncový Lac(NAc), prenosom GlcA z UDP-GlcA.

Monosacharidové deriváty napodobňujúce N-acetylhexozamíny môžu byť pripravené z polyméru alebo oligoméru obsahujúceho hexozamíny alebo iné monosacharidy s voľnou primárnou amino skupinou spôsobom, ktorý obsahuje:

1) derivátizáciu aminoskupín na sekundárny alebo terciálny amín alebo amid

2) hydrolýzu polyméru na príslušné monosacharidy.

Chitosan a jeho oligosacharidy sú príkladom polyméru alebo oligoméru obsahujúceho amín.

Všeobecne, spôsoby pre prípravu karboxylovej kyseliny obsahujúcej 6-aldehydo s amino a/alebo amid monosacharidom/monosacharidmi tvoria kroky:

1) voliteľné vloženie karboxylovej kyseliny alebo 6aldehydo skupiny do uhlohydrátového polyméru, keď primárny hydroxyl je dostupný modifikácii;

2) . derivatizácia skupiny karboxylovej kyseliny alebo 6aldehydických skupín alebo primárnych amino skupín polyméru na sekundárne alebo terciálne amíny alebo amidy, keď sa použije krok 1, krok 2 je voliteľný;

3) hydrolýza polyméru na príslušné monosacharidy.

Hydrolýza monosacharidov môže byť tiež čiastočná a vytvára užitočný disacharid alebo oligosacharid pre tvorbu analógnych látok. Výhodne hydrolýza poskytuje najmenej 30 % monosacharidov. Spôsoby chemických postupov sú známe v odbore. Napríklad, oxidácia polysacharidov na príslušné monosacharidy môže byť uskutočnená tak, ako popísal Muzzarelli a spol., (1999 a 2002). Tieto spôsoby sú výhodné pre použitie nechránených monosacharidov, nakoľko sa tým vyhne ochráneniu reakčných zakončení monosacharidov.

Vo výhodnom uskutočnení oligosacharidová sekvencia obsahuje GlcAB3Lac alebo GlcAB3LAcNAc a je účinne syntetizovaná transglykozyláciou použitím špecifickej glukuronidázy ako je glukoronidáza z hovädzej pečene. Enzým môže špecificky prenášať BI väzbu na GalB4GlcNAc a GalB4Glc s neočakávane vysokými výťažkami transglykozylačnej reakcie. Všeobecne, takáto selektivita a výťažky blízke 30 % a viac nie sú bežné pre transglykozylačné reakcie.

Jedno uskutočnenie predkladaného vynálezu je použitie látky alebo receptora viažuceho sa na Helicobacter pylori obsahujúce oligosacharidovú sekvenciu [Gal (A) q (NAc) _r/Glc (A) _q (NAc) χα3/β3] ₃ [GalB4GlcNAcE3] _tGalE4Glc (NAc)_u kde q, r, s, t a u sú každé nezávisle 0 alebo 1, keď t=0 a u=0, potom oligosacharidová sekvencia je naviazaná na polyvalentný nosič alebo je prítomná ako voiný oligosacharid vo vysokej koncentrácii, a analógy alebo deriváty uvedenej oligosacharidovéj sekvencie, ktoré majú väzobnú aktivitu voči Helicobacter pylori pre tvorbu látky, ktorá má väzobnú alebo inhibičnú aktivitu voči Helicobacter pylori.

Sekvencia uvedeného oligosacharidu indikuje kyselinu uronovu v monosacharidovom zvyšku, alebo 6 derivát monosacharidového zvyšku, najvýhodnejší derivát uhlíka 6 je amid kyseliny uronovej.

Pre použitie podlá vynálezu sú výhodné nasledujúce Helicobacter pylori oligosacharidové sekvencie viažucich látok:

Galň4GlcNAc,

GalNAca3Galfi4GlcNAc, GalNAcB3Galfl4GlcNAc,

GlcNAca3GalB4GlcNAc, GlcNAcfi3GalB4GlcNAc, Gala3GalB4GlcNAc, GalB3GalE4GlcNAc, Glca3GalS4GlcNAc, Glcft3Galfi4GlcNAc, GalE4GlcNAcfí3GalB4GlcNAc, GalB4GlcNAcB3Galfi4Glc, GalNAca3GalB4GlcNAcB3Galb4Glc, GalNAcB3GalE4GlcNAcB3GalE4Glc, GlcNAca3GalB4GlcNAcfi3GalB4Glc, GlcNAcB3GalE4GlcNAcB3GalE4Glc, Gala3GalB4GlcNAcB3GalB4Glc, GalB3GalE4GlcNAcB3GalB4Glc, Glca3GalE4GlcNAcE3Galft4Glc, GlcB3Galb4GlcNAcE3Galft4Glc, GalANAcB3GalB4GlcNAc, GalANAca3GalĎ4GlcNAc,

GalAE3Galft4GlcNAc, GalAa3GalE4GlcNAc, GalANAB3Galfí4Glc,

GalANAca3GalB4Glc, GalAB3Gal54Glc, GalAa3Galň4Glc,

GlcANAcB3GalB4GlcNAc, GlcANAca3GalB4GlcNAc,

GlcAň3GalB4GlcNAc, GlcAa3GalL4GlcNAc, GlcANAcB3GalB4Glc, GlcANAca3Galft4Glc, GlcAň3Galb4Glc, GlcAa3GalB4Glc, Galfi4GlcNAcft3Galň4GlcNAcň3GalB4Glc, a ich polyvalentné konjugáty s redukujúcim zakončením, ako aj GalNAca3GalB4Glc, GalNAcň3Galfl4Glc, GlcNAca3GalB4Glc, GlcNAcfi3GalB4Glc, Gala3GalB4Glc, Galfí3GalB4Glc, Glca3GalB4Glc a Glch3Galh4Glc.

Iné uskutočnenie vynálezu popisuje Vzorec 1.

A-sacharid

B-sacharid

Podía vynálezu sú výhodné látky alebo ich zmesi viažuce Helicobacter pylori, alebo pre použitie vynálezu, ktoré majú oligosacharidovú Štruktúru podlá vzorca 1, kde čísla 1, m a n majú hodnotu >1, 1 a n sú nezávisle 0 alebo 1, a kde R_x je H a R₂ je OH, alebo R_x je OH a R₂ je H, alebo Ri je H a R₂ je monosacharidylová alebo oligosacharidylová skupina, výhodne beta glykozidicky naviazaná galaktozylová skupina, R₃ je nezávisle -OH alebo acetamido (-NHCOCH₃) alebo acetamido analógna skupina. R₇ je acetamido (-NHCOCH3) alebo acetamido analógna skupina. Keď 1=1, R₄ je -H a R₅ je kyslík viažuci R₆ a vytvára beta anomerickú glykozidickú väzbu so sacharidom B alebo R5 je -H a R₄ je kyslík viažuci Rô a vytvára alfa anomerickú glykozidickú väzbu so sacharidom B. Keď 1=0, Rô je -OH naviazaný na B. X je monosacharidový alebo oligosacha24 ridový zvyšok, výhodne X je laktozyl-, galaktozyl-, poly-Nacetyl-laktozaminyl, alebo časť O-glykanu alebo N-glykan oligosacharidová sekvencia; Y je skupina spacera alebo koncový konjugát, ako keramidový lipid, alebo väzba na Z. Z je oligovalentný alebo polyvalentný nosič. Väzobná látka môže tiež byť analógom alebo derivátom uvedenej látky podía vzorca 1, ktorá má väzobnú aktivitu voči Helicobacter pylori. Znamená to že, kyslíková väzba (-0-) medzi polohou Cl na B sacharide a sacharidovým zvyškom X, alebo skupinou spacera Y môže byť nahradená uhlíkom (-C-) , dusíkom (-N-) alebo sírou (-S-).

Vo vzorci 1 je R₈ výhodne amid karboxylovej kyseliny, ako je metylamid alebo etylamid, hydroxymetyl (-CH₂-OH) alebo skupina karboxylovej kyseliny alebo ich ester, ako je metyl alebo etyl ester. Amid karboxylovej kyseliny môže obsahovať alternatívnu väzbu s polyvalentným nosičom Z obsahujúci amín, ako je chitosanový alebo galaktozamínový polysacharid, alebo Z obsahuje primárny amín so spacerom, výhodný je hydrofilný spacer. Štruktúra v R₈ môže byť podobná štruktúram, ktoré sú známe odborníkom. Napríklad, môžu byť použité sekundárne alebo terciálne amíny alebo amidovaný sekundárny amín.

Vo vzorci 1 je R₉ výhodne hydroxymetyl, ale môže byť derivatizovaný tak, ako je popísané pre Rg·

R ₃ je hydroxyl, acetamido alebo acetimidovú skupinu napodobňujúce skupiny, ako Ci-6 alkylamidy, arylamido, sekundárny amín, výhodne N-etyl alebo N-metyl, O-acetyl alebo 0alkyl, napríklad O-etyl alebo 0-metyl. R7 je rovnaký ako R3 ale výhodnejšie sú acetimido alebo acetamido napodobňujúce skupiny.

R₂ môže tiež výhodne obsahovať šesťčlenný kruh, napodobňujúci GalB4-zakončenie.

Látky viažuce baktérie sú výhodne v zhluku ako glykolipidy na bunkových membránach, micely, lipozómy, alebo na pevnom podklade ako TLC platne používané pri stanovení. Zhluky so správnym usporiadaním vytvárajú väzbu s vysokou afinitou.

Podlá vynálezu je možné použiť väzobné epitopy pre Helicobacter pylori prírodné sa vyskytujúce alebo ich synteticky pripravené analógy alebo deriváty, ktoré majú podobnú alebo lepšiu väzobnú aktivitu na Helicobacter pylori. Je tiež možné použiť látku obsahujúcu baktérie viažucu látku, ako receptorový aktívny gangliozid popísaný vo vynáleze, alebo jeho analóg alebo derivát, ktorý má podobnú alebo lepšiu väzobnú aktivitu voči Helicobacter pylori. Látka viažuca baktérie môže byť glykozidicky naviazaný koncový epitop oligosacharidového reťazca. Epitop viažuci baktérie môže byť vetvou oligosacharidového reťazca, výhodne polylaktozaminového reťazca.

Látka viažuca Helicobacter pylori môže byť konjugovaná na antibiotikum, výhodne na antibiotikum penicilínového typu. Látka viažuca Helicobacter pylori nasmeruje antibiotikum k Helicobacter pylori. Takýto konjugát je výhodný pre liečenie, nakoľko je potrebné menšie množstvo antibiotika pre liečenie ochorenia spôsobeného Helicobacter pylori, a má za následok zníženie vedľajších účinkov antibiotika. Antibiotická časť konjugátu zabíja alebo zoslabuje baktérie, ale konjugát môže mať aj antiadhezívny účinok, ako bude popísané ďalej.

Látky viažuce baktérie, výhodne v oligovalentnej forme alebo v zhlukoch, môžu byť použité na liečenie ochorenia alebo stavov spôsobených prítomnosťou Helicobacter pylori. Umožňujú to látky viažuce Helicobacter pylori antiadhéziou, čo znamená, že inhibujú väzbu Helicobacter pylori na receptorové epitopy cieľových buniek alebo tkanív. Keď je podaná látka viažuca Helicobacter pylori, alebo farmaceutická kompozícia, táto bude kompetovať s receptorovými glykokonjugátmi na cieľových bunkách pre väzbu baktérií. Niektoré, alebo všetky baktérie budú potom naviazané na látku viažucu Helicobacter pylori a nie na receptor na cieľových bunkách alebo tkanivách. Baktérie naviazané na látky viažuce Helicobacter pylori sú potom odstránené z pacienta (napríklad prietokom kvapaliny v gastrointestinálnom trakte), čo vedie k zníženiu účinku baktérií na zdravie pacienta. Výhodne použitá látka je rozpustná kompozícia obsahujúca látky viažuce Helicobacter pylori. Látka môže byť pripojená na nosič, ktorý výhodne nie je bielkovina. Pri použití nosiča niekoľko molekúl látky viažucej Helicobacter pylori je pripojených na jeden nosič, čím sa zlepší inhibičná účinnosť.

Cieľovými bunkami sú primárne epiteliálne bunky cieľového tkaniva, predovšetkým gastrointestinálneho traktu, iné možné delové tkanivá sú napríklad, pečeň a pankreas. Glykozylácia delového tkaniva môže byť zmenená v dôsledku infekcie patogénom (Karlsson a spol., 2000). Cieľové bunky môžu byť tiež malígne, transformované alebo rakovinové/nádorové bunky cieľového tkaniva. Transformované bunky a tkanivá majú zmenené typy glykozylácie a môžu tvoriť receptory pre baktérie. Väzba lektínov alebo sacharidov (interakcia karbohydrát-karbohydrát) na sacharidy v glykoproteínovom alebo glykolipidovom receptore môže aktivovať bunky, v prípade rakovinových/malígnych buniek to môže viesť k rastu alebo metastázam rakoviny. Je známe, že niektoré oligosacharidové epitopy tu popísané, ako GlcNAcfi3GalB4GlcNAc (Hu a spol., 1994), Gala3Galô4GlcNAc (Castronovo a spol., 1989), a neutrálne a sialyzované polylaktozamíny maligných buniek (Stroud a spol., 1996) sú spojené s rakovinou alebo sú rakovinové antigény. Oligosacharidové reťazce obsahujúce tu popísané látky boli tiež popísané v lymfocytoch (Vivier a spol., 1993). Helicobacter pylori je spojený s gastrickým lymfómom. Látky tu popísané môžu byť použité na prevenciu väzby Helicobacter pylori na premalígne alebo malígne bunky a aktiváciu rozvoja rakoviny alebo metastáz. Inhibícia väzby môže liečiť žalúdočný vred, predovšetkým lymfóm. Je známe, že oligosacharidová sekvencia viažuca Helicobacter pylori je v štruktúre GlcNAcE3GalĎ4GlcNAcň6GalNAc z ľudských gastrických mucínov. Tento mucínový epitop a podobné O-glykan glykoformy sú väčšinou prirodzené receptory s vysokou afinitou pre Helicobacter pylori v ľudskom žalúdku. Ukázalo sa to aj vysokou väzobnou afinitou analógnej sekvencie GlcNAcB3Galň4GlcNAcĎ6GlcNAc, neoglykolipidu, pre Helicobacter pylori, a tiež sekvencia GlcNAcň3Galň4GlcNAcE6Gal má nejakú aktivitu voči Helicobacter pylori. Preto výhodné oligosacharidové sekvencie zahrňujú O-glykany a analógy O-glykanových sekvencií ako sú:

GlcNAcB3Galfi4GlcNAcB6GlcNAc/GalNAc/Gal,

GlcNAcň3GalĎ4GlcNAcb6GlcNAc/GAlNAc/GalaSer/Thr

GlcNAcb3Gaie4GlcNAcB6(Gal/GlcNAcB3)GlcNAc/GalNAc/GalaSer/Thr a glykopeptidy a analógy glykopeptidov obsahujúce O-glykanové sekvencie. Dokonca sekvencie bez neredukujúceho zakončenia GlcNAc môžu mať nejakú aktivitu. Na základe tohoto, všetky oligosacharidové sekvencie (OS) viažuce Helicobacter pylori a predovšetkým trisacharidové epitopy sú zvlášť výhodné keď sú naviazané na redukujúcom zakončení a tvoria štruktúry OSE6Gal (NAc) o-i alebo OS56Glc (NAc) ₀-i alebo

OSEôGal (NAc) o-iaSer/Thr alebo OSB6Glc (NAc) ₀-i<xSer/Thr. Ser alebo Thr- zlúčeniny alebo ich analógy alebo redukujúce oligosacharidy sú tiež výhodné vtedy, keď sú naviazané na polyvalentný nosič. Redukujúce oligosacharidy môžu byť redukčné naviazané na polyvalentný nosič.

Cieľové bunky zahrňujú tiež krvné bunky, predovšetkým leukocyty. Je známe, že kmene Helicobacter pylori spôsobujúce peptidický vred, je kmeň, ktorý sa tu hlavne používa, stimuluje zápalovú odpoveď granulocytov, dokonca aj vtedy, keď baktérie nie sú nonopsonizované (Rautelin a spol., 1994a, b). Počiatočný krok fagocytózy baktérií najpravdepodobnejšie zahrňuje špecifické lektínu podobné interakcie vedúce k aglutinácii granulocytov (Ofek a Sharon, 1988) . Po kroku fagocytózy nastávajú oxidačné spaľovacie reakcie, ktoré môžu byť dôvodom patogenézy ochorení spôsobených Helicobacter pylori (Babior, 1978). Z granulocytov bolo izolovaných a charakterizovaných niekoľko sialyzovaných a nekyslých glykosfingolipidov s opakovanými N-acetyllaktózamínovými jednotkami (Fukuda a spol., 1985; Stroud a spol., 1996), ktoré môžu pôsobiť ako možné receptory pre Helicobacter pylori na povrchu bielych krviniek. Ďalej, z rovnakého zdroja bol izolovaný x2 glykosfingolipid (Teneberg, S., nepublikované). Predkladaný vynález potvrdzuje prítomnosť receptorových sacharidov na ľudských erytrocytoch a granulocytoch, ktorý môže byť rozpoznaný N-acetyllaktozamín špecifickým lektínom a monoklonálnou protilátkou (x2, GlaNAcB3GalB4GlcNAc-). Látky viažuce Helicobacter pylori môžu byť užitočné na inhibíciu väzby leukocytov na Helicobacter pylori a pri prevencii oxidatívneho spaľovania a/alebo zápalu po aktivácii leukocytov.

Je známe, že Helicobacter pylori môže viazať niekoľko druhov oligosacharidových sekvencií. Niektoré väzby špecifickými kmeňmi môžu predstavovať skôr symbiotické interakcie, ktoré nevedú k rakovine alebo ťažkým stavom. Údaje o väzbe na sacharidové epitopy rakovinového typu znamenajú, že látky viažuce Helicobacter pylori môžu zabrániť patogénnym interak29 ciám, pričom ponechávajú menej patogénne Helicobacter pylori baktérie/kmene aby sa viazali na iné receptorové štruktúry. Preto pre prevenciu ochorení spôsobených Helicobacter pylori nemusí byť potrebné úplné odstránenie baktérií. Menej patogénne baktérie môžu dokonca mať probiotický účinok v prevencii viac patogénnych kmeňov Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori obsahuje na svojom povrchu veľké polylaktozamínové oligosacharidy, ktoré v niektorých kmeňoch obsahuje nefukozylované epitopy, ktoré môžu byť viazané baktériami tak, ako popisuje predkladaný vynález. Látka tu popísaná môže tiež zabrániť väzbe medzi Helicobacter pylori a týmto spôsobom inhibovať kolonizáciu baktérií.

Podlá vynálezu je možné inkorporovať látku viažucu Helicobacter pylori, voliteľne s nosičom, do farmaceutickej kompozície, ktorá je vhodná pre liečenie stavov spojených s prítomnosťou Helicobacter pylori u pacienta, alebo použitie látky viažucej Helicobacter pylori v spôsobe pre liečenie takýchto stavov. Príkladmi stavov, ktoré môžu byť liečené podľa vynálezu sú chronická superficiálna gastritída, žalúdočný vred, vred dvanástnika, non-Hodgkin lymfóm v ľudskom žalúdku, gastrický adenokarcinóm, a niektoré gastrické, kožné, pečeňové, alebo srdcové ochorenia, syndróm náhleho úmrtia dojčiat, autoimúnne ochorenia vrátane autoimúnnej gastritídy a pernicióznej anémie a gastrického ochorenia spojeného so zápalom po nesteroidných liekoch (NSAID). Všetky, najmenej čiastočne, sú spôsobené infekciou Helicobacter pylori.

Farmaceutická kompozícia obsahujúca látku viažucu Helicobacter pylori môže tiež obsahovať iné zložky, ako je inertné vehikulum, alebo farmaceutický prijateľné nosiče, ochranné látky a podobne, ktoré sú dobre známe odborníkom.

Látka viažuca Helicobacter pylori môže byť podávaná spolu s inými liekmi ako sú antibiotiká používané voči Helicobacter pylori.

Látka viažuca Helicobacter pylori, alebo farmaceutická kompozícia obsahujúca takúto látku môže byť podávaná akýmkoľvek vhodným spôsobom, výhodným je orálne podávanie.

Výraz „liečenie, ktoré sa tu používa, sa týka spôsobu liečby alebo zmiernenia choroby alebo stavu, a spôsobu liečenia pre prevenciu rozvoja ochorenia alebo stavu. Liečenie môže byť akútne alebo chronické.

Výraz „pacient, tak ako sa tu používa, sa týka človeka, alebo iného cicavca, ktorý potrebuje liečenie podlá vynálezu.

Je tiež možné použiť látku viažucu Helicobacter pylori na identifikáciu jedného alebo viacerých adhezínov pri hľadaní proteínov alebo karbohydrátov (karbohydrát-karbohydrát interakcie), ktoré viažu látku viažucu Helicobacter pylori. Karbohydrát viažuci proteín môže byť lektín alebo karbohydrát viažuci enzým. Vyhľadávanie sa môže uskutočniť, napríklad, afinitnou chromatografiou alebo afinitnými skríženými spôsobmi (Uver a spol., 1998).

Ďalej je možné použitie látok špecificky viažucich alebo inaktivujúcich látky viažuce Helicobacter pylori, ktoré sú prítomné na ľudských tkanivách a tým zabrániť väzbe Helicobacter pylori. Príkladmi takýchto látok sú rastlinné lektíny ako Erythrina cristagalli a Erythrina corallodendron (Teneberg a spol·., 1994). Pri použití u ľudí, väzobná látka by mala byť vhodná pre takéto použitie. Sú to humanizovaná protilátka alebo rekombinantná glykozidáza ľudského pôvodu, ktoré nie sú imunogénne a sú schopné odštiepiť koncový monosacharidový zvyšok/zvyšky z látok viažucich Helicobacter pylori. V gastrointestinálnom trakte je tolerovaných veľa prirodzene sa vyskytujúcich lektínov a glykozidáz z potravy.

Ďalej, je možné použitie látky viažucej Helicobacter pylori ako súčasť výživových kompozícií vrátane potravinových doplnkov. Výhodné je použitie látky viažucej Helicobacter pylori ako súčasti takzvanej funkcionálnej alebo funkcionalizovanej potravy. Uvedená funkcionálna potrava má pozitívny účinok na zdravie osoby alebo zvieraťa inhibíciou alebo prevenciou väzby Helicobacter pylori na cieľové bunky alebo tkanivá. Látka viažuca Helicobacter pylori môže byť súčasťou definovanej potravy alebo funkcionálnej potravinovej kompozície. Funkcionálna potrava môže obsahovať iné prijateľné zložky potravy povolené oficiálnymi autoritami ako je Food and Drug Administration v USA. Látka viažuca Helicobacter pylori môže byť tiež používaná ako výživový doplnok, výhodne ako aditívum v potrave alebo v nápojoch za vytvorenia funkcionálne j potravy alebo funkcionálneho nápoja. Potrava, alebo doplnok potravy môže byť tiež pripravený, napríklad, z domácich zvierat ako je krava alebo iné zviera, ktoré vo veľkom množstve produkuje v mlieku látku viažucu Helicobacter pylori. Toto sa dosiahne u zvierat, ktoré produkujú vo veľkom množstve vhodné glykozyltransferázy v ich mlieku. Je možné vybrať a chovať vo veľkochove špecifické kmene alebo druhy domácich zvierat, ktoré produkujú látku viažucu Helicobacter pylori. Látka viažuca Helicobacter pylori pre výživové kompozície, alebo ako výživové aditívum môže byť tiež produkovaná mikroorganizmami, ako sú baktérie alebo kvasinky.

Zvlášť užitočné je mať látku viažucu Helicobacter pylori ako súčasť potravy pre dojčatá, predovšetkým ako súčasť dojčeneckej potravy. Veľa dojčiat príjma špeciálnu náhradnú potravu namiesto prirodzeného materského mlieka Takéto náhradné mlieka nemusia obsahovať špeciálne laktózové oligosacharidy ľudského mlieka, predovšetkým predĺžené oligosacharidy ako sú lakto-N-neotetraoza, Gal54GlcNAc53Gal54Glc, a ich deriváty. Lakto-N-neotetraoza a para-lakto-N-neohexaoza (Galh4GlcNAcB3Galb4GlcNAcL3GalL4Glc) ako aj Galfi3Galh4Glc sú prítomné v ľudskom mlieku a možno ich preto považovať ako bezpečné aditíva alebo súčasti dojčeneckej potravy. Helicobacter pylori je hlavne infekčný u dojčiat alebo malých detí. Je vhodné zabrániť takejto infekcii vzhľadom na ochorenia, ktoré môže spôsobiť v neskoršom veku. Helicobacter pylori je známy tým, že spôsobuje syndróm náhleho úmrtia dojčiat, avšak intenzívne liečenie antibiotikami na eradikáciu baktérií môže byť zvlášť nevhodné pre malé deti alebo dojčatá.

Výhodné koncentrácie oligosacharidov ľudského mlieka vo funkcionálnej potrave (napríklad v umelých náhradách mlieka) sú podobné ako koncentrácie v prirodzenom ľudskom mlieku. Prirodzené ludské mlieko obsahuje velký počet volných oligosacharidov a glykokonjugátov (ktoré môžu byť polyvalentné) obsahujúcich sekvenciu (sekvencie) oligosacharidu popísaných v predkladanom vynáleze. Preto je možné použitie dokonca aj vyšších ako prirodzených koncentrácií jednotlivých molekúl, čím sa dosiahne účinnejšia inhibícia Helicobacter pylori bez škodlivých vedľajších účinkov. Prirodzené ludské mlieko obsahuje lakto-N-neoteraózu v rozsahu 10 až 210 mg/1 s individuálnymi odchýlkami (Nakhla a spol., 1999). Následne, lakto-N-neoteraóza je výhodne použitá vo funkcionálnej potrave v koncentrácii 0,01 až 10 g/1, výhodnejšie 0,01 až 5 g/1 a najvýhodnejšie 0,1 až 1 g/1. Keď tu popísané oligosacharidy sú trisacharidy alebo disacharid so sekvenciou Galfi4Glc na redukujúcom zakončení, sú výhodne príjmané v koncentráciách 1 až 100 g/1, výhodnejšie v rozsahu koncentrácií 1 až 20 g/1. Celková koncentrácia sacharidov použitá vo funkcionálnej potrave je rovnaká alebo podobná celkovej koncentrácii sacharidov v ľudskom mlieku, ktoré viažu popísané látky pre

Helicohacter pylori, alebo ktoré obsahujú väzobný epitop/oligosacharidovú sekvenciu uvedenú vo vynáleze. Je známe, že najmenej jedno ľudské mlieko obsahuje vo vysokej koncentrácii GalB3Galft4Glc ako hlavný neutrálny oligosacharid (Charlwood a spol., 1999).

Je možné použitie látky viažucej Helicohacter pylori pre diagnózu stavov spôsobených infekciou Helicohacter pylori. Diagnostické použitie tiež zahrňuje použitie látky viažucej Helicohacter pylori pre typizáciu Helicohacter pylori. Keď je látka použitá pre diagnózu alebo typizáciu, môže byť súčasťou, napríklad próby alebo testovacej tyčinky, ktoré sú súčasťou testovacieho kitu. Keď sa próba alebo tyčinka dostane do kontaktu so vzorkou obsahujúcou Helicohacter pylori, baktérie sa naviažu na próbu alebo tyčinku a môžu byť odstránené zo vzorky a potom ďalej analyzované.

Výsledky tiež ukazujú, že neredukujúce zakončenie koncového monosacharidového zvyšku vo výhodných trisacharidových sekvenciách podía vynálezu môže obsahovať skupinu karboxylovej kyseliny na uhlíku 6 (koncový monosacharidový zvyšok je uronová kyselina, HexA alebo HexANAc, kde Hex je Gal alebo Glc), alebo derivát uhlíka 6 na HexA(NAc) zvyšku, alebo derivát uhlíka 6 príslušného Hex(NAc)zvyšku. Takéto koncové zvyšky výhodne zahrňujú fi3- naviazanú kyselinu glukurónovú a výhodnejšie jej 6-amidy, ako je metylamid. Preto analógy a deriváty sekvencie môžu byť pripravené zmenou alebo derivatizáciou koncovej 6-polohy trisacharidových epitopov.

Výhodné látky viažuce Helicohacter pylori

Zistilo sa, oligosacharidové sekvencie podlá vynálezu sú neočakávane účinné väzobné látky po nanesení na tenkovrstvový povrch. Tento spôsob umožňuje prezentáciu glykolipidových sekvencii. Prekvapivo vysoká aktivita polyvanlentnej prezentácie oligosacharidových sekvencii dáva polyvalencii výhodný spôsob reprezentácie oligosacharidových sekvencii podlá vynálezu.

Glykolipióické štruktúry sa prirodzene vyskytujú v polyvalentnej forme na bunkových membránach. Tento typ prítomnosti môže byť napodobnený stanovením na pevnej fáze, ktorá bude ďalej popísaná, alebo môže byť použitý pre prípravu glykolipidových alebo neoglykolipidových lipozómov.

Predkladané nové neoglykolipidy pripravené redukčnou amináciou hydrofóbneho hexadecylanilínu boli schopné poskytnúť účinnú prezentáciu oligosacharidov. Najnovšie známe neoglypidové konjugáty používané pre väzbu baktérií obsahujú skupiny s negatívnym nábojom, ako fosfor ester fosfadityl etanolamínových neoglykolipidov. Problémami takýchto zlúčenín sú negatívny náboj látky a prirodzená väzba fosfolipidovej štruktúry. Molekuly s negatívnym nábojom sú známe tým, že sa účastnia mnohých nešpecifických väzieb s proteínmi a inými biologickými látkami. Okrem toho, mnohé z týchto látok sú labilné a môžu byť enzymaticky alebo chemicky degradované. Predkladaný vynález sa týka nekyslých konjugátov oligosacharidových sekvencii, čo znamená, že oligosacharidové sekvencie sú naviazané na nekyslé chemické štruktúry. Výhodne sú nekyslé konjugáty neutrálne, čo znamená, že oligosacharidové sekvencie sú naviazané na neutrálne chemické štruktúry bez náboja. Výhodné konjugáty podľa vynálezu sú polyvalentné látky.

V doterajšej literatúre sekvencie bioaktívnych oligosacharidov sú často naviazané na nosičové štruktúry redukciou časti receptorovej aktívnej oligosacharidovej štruktúry. Boli použité hydrofóbne spacery obsahujúce alkylové reťazce (-CH₂-)_n a/alebo benzylové kruhy. Avšak je všeobecne známe, že hydrofóbne štruktúry sa zapájajú do nešpecifických interakcií s proteínmi a inými bioaktívnymi molekulami.

Hodnoty neoglykolipidov uvedených v Príkladoch ukazujú, že v použitých experimentálnych podmienkach stanovenia, hexadecylanilínové časti neoglykolipidových zlúčenín nespôsobujú nešpecifickú väzbu so sledovanými baktériami. V neoglykolipidoch hexadecylanilínová časť konjugátu vytvára formy, pravdepodobne štruktúru podobnú lipidickej vrstve, ktorá nie je prístupná väzbe. Vynález ukazuje, že redukcia monosacharidového zvyšku vo väzobnom epitope môže poškodiť väzbu. Ďalej sa zistilo, že redukovaný monosacharid môže byť použitý ako hydrofilný spacer pre naviazanie receptorového epitopu a polyvalentnej štruktúry. Podľa vynálezu je výhodné naviazať bioaktívny oligosacharid cez hydrofilný spacer na polyvalentnú alebo multivalentnú molekulu za vzniku polyvalentnej alebo oligovalentnej/multivalentnej štruktúry. Všetky polyvalentné (obsahujúce 2 až 10 oligosacharidových zvyškov) sa tu označujú ako polyvalentné štruktúry, takže, v závislosti od aplikácie, môžu byť výhodnejšie oligovalentné/multivalentné konštrukty ako väčšie polyvalentné štruktúry. Skupina hydrofilného spacera obsahuje výhodne najmenej jednu hydoxylovú skupinu. Výhodnejšie spacer obsahuje najmenej dve hydroxylové skupiny a najvýhodnejšie spacer obsahuje najmenej tri hydroxylové skupiny.

Podľa vynálezu skupina hydrofilného spacera je výhodne flexibilný reťazec obsahujúci jeden alebo niekoľko -CHOHskupín a/alebo amidový vedľajší reťazec ako je acetamido -NHCOCH3, alebo alkylamido. Hydroxylové skupiny a/alebo acetamidová skupina ochraňuje spacer pred enzymatickou hydrolýzou in vivo. Výraz „flexibilný znamená, že spacer obsahuje flexibilné väzby a nevytvára neflexibilnú kruhovú štruktúru. Také redukované monosacharidové zvyšky ako sú tie, ktoré boli vytvorené redukčnou amináciou v predkladanom vynáleze, sú príkladom flexibilných hydrofilných spacerov. Flexibilný hydrofilný spacer je optimálny pre neprítomnosť nešpecifickej väzby neoglykolipidových alebo polyvalentných konjugátov. Táto vlastnosť je zásadnou optimálnou aktivitou, napríklad, pri biostanovení a pre bioaktivitu farmaceutických alebo funkcionálnych potravín.

Všeobecný vzorec konjugátu s flexibilným hydrofilným linkerom má nasledovný Vzorec 2:

[0S-0- (X) n-Li-CH (H / {CH1-2OH }_pl) - {CHiOH }_p2- {CH (NH-R) }_p3- {CH_XOH}_p4-L₂] _m-Z kde Li a L₂ sú väzobné skupiny obsahujúce nezávisle atóm kyslíka, dusíka, síry alebo uhlíka, alebo dva väzobné atómy skupiny tvoriacej väzby ako sú -0-, -S-, -CH2-, -N-,

-N(COCH₃)-, amidové skupiny -CO-NH- alebo -NHCO- alebo -N-N(derivát hydrazínu) alebo amino oxy-väzby -0-N- a -N-0-. Li je väzba od uhlíka na redukujúcom zakončení monosacharidu X alebo keď n=0, L₃ nahrádza -0- a viaže sa priamo z redukujúceho zakončenia Cl v OS.

pl, p2, p3 a p4 sú nezávisle čísla 0 až 7 s tým, že najmenej jeden pl, p2, p3 a p4 je najmenej 1. CHi_₂ v koncovom {CHi-₂OH}_pi znamená, že koncová skupina reťazca je CH₂OH a keď pl je viac ako 1, sú prítomné sekundárne alkoholové skupiny -CHOH-, ktoré viažu koncovú skupinu na zvyšok spacera. R je výhodne acetylová skupina (-COCH₃) , alebo R je alternatívne väzba na Z a potom L₂ je jeden alebo dva atómy koncovej skupiny reťazca. V inom uskutočnení je R analógom tvoriacim skupinu C1-14 (výhodne hydrofilnú, ako je hydroxy alkyl) obsahujúcu amidovú štruktúru alebo H alebo C1-14 alkyl obsahujúci amín. m>l a Z je polyvalentný nosič. OS a X definuje vzorec 1.

Výhodné polyvalentné štruktúry obsahujú flexibilný spacer podľa vzorca 2 a obsahujú oligosacharidovú (OS) sekvenciu β1-3 viažucu Helicobacter pylori, ktorá je naviazaná na GalE4Glc(red)-Z, a OS66GicNAc(red)-Z a OS56GalNAc(red)-Z, kde „red znamená amínovú väzobnú štruktúru vytvorenú redukčnou amináciou na redukujúcom zakončení monosacharidov a amínovú skupinu polyvalentného nosiča Z.

V predkladanom vynáleze oligosacharidová skupina je výhodne naviazaná v polyvalentnej alebo oligovalentnej forme na nosič, ktorý nie je bielkovina alebo peptid, čím sa vyhne antigenicite a možným alergickým reakciám, výhodne je kostrou prírodný neantigénny polysacharid.

Keď sa porovnávali väzobné aktivity glykolipidov a neoglykolipidov sa zistilo, že sekvencie s Gal(a3GalB3-) majú nižšiu aktivitu v polyvalentnej prezentácii na platni s tenkou vrstvou. Sekvencie s koncovou GalB4GlcNAc- sekvenciou boli tiež slabšie. Preto optimálna polyvalentná nekyslá látka podľa vynálezu obsahuje koncovú oligosacharidovú sekvenciu: Gal (A) _qi (NAc) n/Glc (A) _q2 (NAc) _r2a3/E3GalB4Glc (NAc) _u kde ql, q2, rl r2 a u sú každé nezávisle 0 alebo 1, s tým, že keď ql a rl sú 0, potom neredukujúce zakončenie koncového monosacharidového zvyšku nie je Gala. Výhodnejšie sa u=0 a najvýhodnejšie oligosacharidová sekvencia v polyvalentnej forme je GalNAc/Glc (NAc) _r2a3/B3GalE4GlcNAc kde r2 je nezávisle 0 alebo 1 a jej deriváty.

Výhodné sú nasledujúce oligosacharidové sekvencie. Sú to štruktúry, ktoré neboli popísané v ľudských alebo zvieracích tkanivách:

Glc (A) _q (NAc) _ra3/B3GalB4 (NAc)_u s tým, že keď oligosacharidová sekvencia obsahuje E3 väzbu, q a r sú 1 alebo 0; alebo GalA (NAc) _ra3/53GalB4Glc (NAc) _u.

Zvlášť je výhodná novosť vyššie uvedených oligosacharidových sekvencii. Nie sú známe glykozidázy, ktoré štiepia takéto sekvencie. Preto sú takéto sekvencie v biologických podmienkach zvlášť stabilné a výhodné. Prirodzený typ sekvencii popísaných vo vynáleze môže byť štiepený glykozidázami, enzýmami ktoré redukujú ich účinnosť vtedy, keď sa používajú v ľudskom alebo zvieracom tele. Je známe, že glykozidázy štiepiace sekvencie sú aktívne v ľudskom gastrointestinálnom trakte. Popísaných bolo niekoľko glykozidáz, ako N-acetylhexozaminidázy alebo galaktozidázy, ako tráviace enzýmy, a ktoré sú tiež prítomné v potrave.

Uvedomujeme si, že nové látky podľa vynálezu sú tiež vhodné pre inhibíciu toxínu A z Clostridium difficile (S. Teneberg a spol·., 1996). Väzobný profil toxínu A so staršími látkami je velmi podobný špecificite s tu popísanou pre Helicobacter pylori. Preto Helicobacter pylori viažuce látky môžu byť použité pre liečenie, napríklad, hnačky spôsobenej Clostridium difficile.

Glykolipidové a karbohydrátové názvoslovie je podlá odporúčaní IUPAC-IUB Komisie pre Biochemické Názvoslovie (Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29).

Predpokladá sa, že Gal, Glc, GlcNAc a Neu5Ac majú Dkonfiguráciu, L-konfiguráciu má Fuc a všetky monosacharidové jednotky v pyranózovej forme. Glukózamin je vo forme GlcN alebo GlcNH₂ a galaktozamín ako GalN alebo GalNH₂. Glykozidické väzby sú označené čiastočne v krátkom a čiastočne v dlhšom názvosloví, väzba Neu5Ac- zvyškov a3 a a6 znamená to isté ako a2-3 a a2-6, a s inými monosacharidovými zvyš-kami al-3, Bl-3, Bl-4, a Bl-6 môže byť skrátená ako α3, B3, β4 a β6. Laktozamín označuje N-acetyllaktozamín, Galfi4GlcNAc, a sialová kyselina je N-acetylneuramínová kyselina (Neu5Ac) alebo N-glykolylneuramínová kyselina (Neu5Gc), alebo ktorákoľvek prirodzená sialová kyselina. Výraz glykan znamená tiež oligosacharidové alebo polysacharidové reťazce v ľudských alebo zvieracích glykokonjugátoch, predovšetkým v glykolipidoch alebo glykoproteínoch. V krátkom názvosloví pre mastné kyseliny _xa zásady, číslo pred- označuje dĺžku uhlíkového reťazca, číslo za- označuje počet dvojných väzieb v uhľohydrátovom reťazci. Skratka GSL označuje glykosfingolipid. Skratky, alebo krátke názvy alebo symboly glykosfinkolipidov sú uvedené v texte a v Tabuľkách 1 a 2. Helicobacter pylori označuje tiež baktérie, ktoré sú podobné Helicobacter pylori.

V predkladanom vynáleze hex(NAc)-uronová kyselina a jej deriváty a zvyšky sú nasledovné: GlcA je glukuronová kyselina a deriváty uhlíka 6 glukózy alebo glukuronovej kyseliny, GA1A je galakturonová kyselina a deriváty uhlíka 6 galaktózy alebo galakturonovej kyseliny, GlcANAc je N-acetylglykuronová kyselina a deriváty uhlíka 6 N-acetylglukozamínu alebo Nacetylglukozamínovej kyseliny a GalANAc je N-acetylgalaktozamín urónová kyselina a deriváty uhlíka 6 v N-acetylgalaktozamíne alebo v N-acetylgalaktozamíne urónovej kyseliny.

Výraz „koncová oligosacharidová sekvencia znamená, že oligosacharid nie je substituovaný na neredukujúcom zakončení koncového zvyšku iným monosacharidovým zvyškom.

Výraz „α3/β3 označuje to, že pripojené zvyšky v oligosacharidovej sekvencií môžu byť navzájom cc3- alebo β3 naviazané.

Predkladaný vynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré v žiadnom prípade nie sú nezávislé a neobmedzujú ciele vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

MATERIÁL A METÓDY

MATERIÁL

TLC silikagél 60 (hliníkové) platne boli od firmy Merc (Darmstadt, Nemecko). Všetky vyšetrované glykosfingolipidy mali pôvod v domácom laboratóriu. β-galaktozidáza (Escherichia coli) bola zakúpená od Boehringer Mannheim (Nemecko), Ham's F12 médium od firmy Gibco (Veľká Británia), ³⁵S-metionín od firmy Amersham (Veľká Británia) a FCS (teľacie fetálne sérum) od firmy Sera-Lab (Anglicko). β4 galaktozidáza (Streptococcus pneumoniae), β-Ν-acetylhexozaminidáza (Streptococcus pneumoniae) a sialidáza (Ärthrobacter ureafaciens) boli od Oxford GlycoSystems (Abington, V.B.). Klinické izoláty Helicobacter pylori (kmene 002 a 032) boli získané od pacientov s gastrickým a dvanástnikovým vredom a boli darom od Dr. D. Danielssona, Orebro Medical Center, Švédsko. Typ kmeňa 17875 bol zo zbierky kultúr v University of Goteborg (CCUG).

Glykosfingolipidy

Čisté glykosfingolipidy, ktoré boli použité v pokuse na Obrázkoch 7A a 7B, boli pripravené z celkových kyslých alebo nekyslých frakcií zo zdrojov, ktoré sú uvedené v Tabulke 2 a popísané Karlssonom (1987). Všeobecne, jednotlivé glykosfingolipidy boli získané acetyláciou (Handa, 1963) celkových glykosfingolipidových frakcií a opakovanou chromatografiou na kyslej silika kolóne, nasledovala štrukturálna charakterizácia hmotnostnou spektroskopiou (Samuelsson a spol., 1990), NMR (Falk a spol., 1979a, b, c; Koerner jr. a spol., 1983) a degradácia (Yang a Hakomori, 1971; Stellner a spol., 1973). Nasleduje popis glykolipidov získaných z králičieho týmusu.

Prečistenie glykolipidov

Kyslé glykosfingolipidy boli izolované z acetónového prášku pripraveného z 1 000 g králičieho týmusu (Pel-Freeze Biological Inc., Severný Arkansas, Ärk., USA). Acetónový prášok bol extrahovaný v Soxhlet prístroji chloroform/metanol (2/1, objem/objem, keď nie je uvedené inak) počas 24 hodín. Potom nasledovala extrakcia zmesou chloroform/metanol/voda 8/1/1 počas 36 hodín. Extrahované lipidy, 240 g, boli vystavené deleniu podľa Folcha (Folch a spol., 1957) a získané hydrofilné fázy boli chromatograficky delené na ionomeničovej DE23 celulóze (DEAE, Whatman, Maidstone, V.B.). Tri izolačné kroky poskytli 2,5 g kyslých glykosfingolipidov. Gangliozidy boli rozdelené podía počtu sialových kyselín na gélovom ionomeniči s otvorenou-tubulárnou chromatografiou v sklenenej kolóne (vnútorný priemer 50 mm) . Kolóna bola napojená na HPLC pumpu, ktorá vytvárala konkávny gradient (predprogramovaný gradient č. 4, Systém Gold Chromatographic Software, Beckman Instruments, Inc., CA, USA) s počiatočným metanolom a koncovým 0,5 M CH3COONH4 v metanole. Rýchlosť prietoku bola 4 ml/min a zbierali sa 8 ml frakcie, celkovo bolo zozbieraných 200 frakcií. 300 až 400 mg zmesi gangliozidov bolo nanesených na 500 g DEAE sefarózu (CL6, Pharmacia, Uppsala, Švédsko, výška náplne asi 130 mm). Monosialyzované gangliozidy boli ďalej rozdelené HPLC na silika kolóne, 300 mm x 22 mm (vnútorný priemer), veľkosť pórov 120 A, veľkosť častíc 10 pm (SH-044-10, Yamamura Ltd., Kyoto, Japonsko). Bolo aplikovaných približne 150 mg monosialyzovaných gangliozidov a použil sa priamy elučný gradient (chloroform/metanol/voda od 60/35/8 do 10/103,4 ml/min, 240 frakcii).

Čiastočná kyslá hydrolýza

Desialyzácia gangliozidov sa uskutočnila v 1,5 % CH₃COOH vo vode pri teplote 100 °C. Potom bol materiál neutralizovaný pridaním NaOH a vysušený v atmosfére dusíka. Štyri degradované uhlohydrátové kostry glykolipidu boli hydrolyzované 7 minút v 0,5 M HCI vo vriacom vodnom kúpeli. Materiál bol potom neutralizovaný a rozdelený v C/M/H₂O (8:4:3, objem/objem) . Odobrala sa nižšia fáza, ktorá bola potom odparená a rekonštituované glykolipidy boli použité pre analýzy.

Príprava pentaglykozylkeramidu z hexaglykozylkeramidu enzymatickou hydrolýzou

Hexaglykozylkeramid (štruktúra 2, Tabulka 1) získaný z heptaglykozylkeramidu (4 mg, z králičieho týmusu) (štruktúra 1, Tabulka 1) kyslou desialyzáciou (pozri vyššie) bol rozpustený v C/M (2:1) a nanesený na malú silikagélovú kolónu (0,4 x 5 cm). Kolóna bola eluovaná C/M/H₂O (60:35:8; objem/objem) . Zbierali sa 0,2 ml frakcie ktoré boli testované na prítomnosť uhľohydrátov. Získaný hexaglykozylkeramid (2,0 mg) bol rozpustený v 1,5 ml 0,1 M pufru fosforečnanu draselného, pH 7,2 s obsahom taurodeoxycholátu sodného (1,5 mg/ml), MgCl₂ (0,001 M) a β-galaktozidázy (E. coli, 500 U pri stanovení s 2-nitrofenyl-h-galaktozidázou ako substrátu) a vzorka bola inkubovaná pri teplote 37 °C cez noc. Materiál bol potom rozdelený v C/M/H₂O (10:5:3) a glykolipid prítomný v spodnej fáze bol prečistený chromatografiou na silikagéli (kolóny 0,4 x 5 cm) tak, ako je uvedené pre hexaglykozylkeramid. Aby sa odstránil všetok kontaminujúci detergent, chromatografia bola opakovaná dvakrát. Konečný výťažok pentaglykozylkeramidu bol 0,7 mg.

Natrávenie glykolipidov endoglykokeramidázou (Ito a Yamagata, 1989)

Reakčná zmes obsahovala 200 pg glykolipidu, 80 pg taurodeoxycholátu sodného a 0,8 mU enzýmu v 160 pl 50 mM acetátového pufru, pH 6,0. Vzorka bola inkubovaná pri teplote 37 °C cez noc, potom bola pridaná voda (140 pl) a C/M (2:1, objem/objem, 1500 pl) a vzorka bola premiešaná a centrifugovaná. Horná fáza bola vysušená v atmosfére dusíka a rozpustená v malom objeme vody a odsolená na Sephadex G-25 kolóne (0,4 x 10 cm), ktorá bola ekvilibrovaná vodou, potom bola vzorka eluovaná vodou. Zbierali sa frakcie 0,1 ml, ktoré boli testované na prítomnosť cukrov.

Permetylácia sacharidov

Permetylácia sa uskutočnila podlá Larsona a spol. (1987). Hydroxid sodný bol pridaný do vzoriek pred pridaním metyljodidu podľa odporúčania Needs a Selvendrana (1993). V niektorých pokusoch boli sacharidy redukované NaBH₄ pred metyláciou. V tomto prípade množstvo metyljodidu bolo zvýšené na výsledné množstvo DMSO (dimetylsulfoxid)/metyljodid 1:1 (Hansson a Karlsson, 1990).

Plynová chromatografia/hmotnostná spektroskopia

Plynová chromatografia sa uskutočnila na prístroji Hewlett-Packard 5890 Šerieš II s injektorom a plameňovým ionizačným detektorom. Permetylované oligosacharidy boli analyzované na silica kapilárnej kolóne (Fluka, 11 cm x 0,25 mm, vnútorný priemer) pokrytej kross-linked PS264 (hrúbka filmu 0,03 pm). Vzorka bola rozpustená v etylacetáte a bola injikovaná na kolónu pri teplote 80 °C. Teplota bola naprogramovaná v rozsahu 80 ° až 390 °C rýchlosťou 10 °C/minúta s 2 minútovým zdržaním pri hornej teplote. Plynová chromatografia/hmotnostná spektroskopia permetylovaných oligosacharidov sa uskutočnila na prístroji Hewlett-Packard 5890 Šerieš II spojeným s JEOL SX-102 hmotnostným spektrometrom (Hansson a Karlsson, 1990). FAB-MS analýzy boli uskutočnené v JEOL SX102 hmotnostnom spektrometri. Negatívne FAB spektrá vznikli bombardovaním Xe atómom (10 kV) pri použití trietanolamínu ako matrixu.

NMR spektroskopia

Protónové NMR spektrá sa zaznamenávali pri 11,75 T v JEOL Alpha 500 (Jeol, Tokyo, Japonsko) spektrometri. Pred analýzou boli vzorky opracované deutériom a spektrá boli zaznamenávané pri teplote 30 °C s digitálnym záznamom 0,35 Hz/pt. Chemické posuny sú vyjadrené ako relatívne hodnoty k TMS (tetrametylsilan) pri použití vnútorného signálu rozpúšťadla.

Analytické enzymatická testy

Použili sa Oxford GlycoSystems enzymatické testy podľa odporúčania výrobcu s výnimkou, že do každej inkubačnej zmesi bol pridaný Triton X-100 vo výslednej koncentrácii 0,3 %. Keď zmes sialidázy a B4-galaktozidázy bola použitá na natrávenie, bol použitý pufer z kitu pre β4 galaktozidázu. Keď v zmesi na natrávenie bola prítomná β-hexozaminidáza, použil sa pufer z kitu pre stanovenie tohoto enzýmu. Koncentrácie enzýmov v inkubačných zmesiach boli: 80 mU/ml HexB4HexNAc-galaktozidázy (S. pneumoniae), 120 mU/ml β-Ν-acetylhexozaminidázy (S. pneumoniae) a 1 U/ml sialidázy (Arthrobacter ureafaciens) . Koncentrácia substrátu bola približne 20 μΜ. Enzymatické natrávenie pri teplote 37 °C trvalo cez noc. Po natrávení boli vzorky vysušené a odsolené použitím malých Sephadex G-25 kolón (Wells a Dittmer, 1963), 0,3 g, ekvilib45 rovaných C/M/H2O (60:30:45, objem/objem). Každá vzorka bola nanesená na kolónu v objeme 2 ml toho istého rozpúšťadla a eluovaná s 2,5 ml C/M/H₂O (60:30:4,5) a 2,5 ml C/M (2:1). Eluáty boli zozbierané a odparené v atmosfére dusíka.

Iné analytické metódy

Hexóza bola stanovená podía Dubois a spol. (1956).

De-N-acylácia

Konverzia acetamidového podielu z GlcNAc/GalNAc zvyškov na amín bola uskutočnená opracovaním rôznych glykosfingolipidov s bezvodým hydrazínom tak, ako už bolo popísané (Angstrom a spol., 1998).

Rast baktérii

Kmene Helicobacter pylori boli skladované pri -80 °C v tryptickom sójovom médiu s obsahom 15 % glycerolu (objem). Baktérie na začiatku rástli na GAB-CAMP agare (Soltesz a spol., 1988) vo vlhkom (98 %) prostredí (O₂: 5 až 7 %, C0₂: 8 až 10 %, N₂: 83 až 87 %) pri teplote 37 °C 48 až 72 hodín. Pre označenie kolónií, boli tieto inokulované na GAB-CAMP agar, výnimkou sú výsledky na Obr. 1A a 1B, kde bol použitý Brucella agar (Difco, Detroid, MI), a na platne bolo nanesených 50 pCi ³⁵S-metionínu (Amersham, V.B.) v 0,5 ml fosfátového pufru (PBS), pH 7,3. Po inkubácii pri teplote 37 °C počas 12 až 24 hodín vo vlhkom prostredí boli bunky zoškrabané, premyté trikrát PBS a resuspendované na lxlO⁸ CFU/ml v PBS. Alebo, kolónie boli inokulované (lxlO⁵ CFU/ml) v Ham F12 médiu (Gibco BRL, V.B.) s 10 % tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (Sera-Lab). Pre označenie sa pridalo 50 pCi ³⁵S-metionínu na 10 ml média a inkubácia vo vlhkom prostredí za pohybu trvala 24 hodín. Centrifugáciou boli oddelené bunky, čistota kultúr a nízky obsah koloidných foriem boli potvrdené mikroskopicky. Po dvojnásobnom premytí s PBS boli bunky resuspendované na lxlO⁸ CFU/ml v PBS. Obe metódy označenia poskytli suspenzie so špecifickou aktivitou približne 1 cpm/100 baktérií Helicobacter pylori.

TLC bakteriálne prekrytie

Tenkovrstevná chromatografia bola uskutočnená na silikagél 60 HPTLC platniach so skleneným alebo hliníkovým podkladom (Merck, Darmstadt, Nemecko), mobilnou fázou bola zmes chloroform/metanol/voda (60:35:8, objemy). Chemická detekcia sa uskutočnila farbením anizaldehydom (Waldi, 1962). Bakteriálne stanovenie prekrytím sa uskutočnilo tak, ako už bolo popísané (Hansson a spol., 1985). Glykosfingolipidy (1-4 pg/vzorka, alebo tak, ako je uvedené v legende pre obrázok) boli chromatograficky rozdelené na hliníkových silikagélových platniach. Potom bol na 1 minútu nanesený 0,3-0,5 % polyizobutylmetakrylát v dietyléter/n-hexáne (1:3, objem). Platne boli potom vysušené a počas 2 hodín navlhčené PBS s obsahom 2 % hovädzieho sérového albumínu a 0,1 % Tween 20. Na chromatogramy bola nanesená suspenzia rádiooznačených baktérií (zriedené v PBS na lxlO⁸ CFU/ml a l-5xl0⁶ cpm/ml) a inkubácia trvala 2 hodiny. Potom nasledovalo opakované premývanie s PBS a vysušenie. Na chromatogramy boli položené XAR-5 rontgenové filmy (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, USA) po dobu 12 až 72 hodín.

TLC prekrývanie proteinov

Iodogen metóda (Aggarwal a spol., 1985) sa použila na ¹²⁵I označenie monoklonálnej protilátky TH2 a lektínu z Erythrina cristalli (Vector Laboratories, Inc., Burlingame,

CA) s výslednou hodnotou 2xl0³ cpm/pg. Prekrývacia metóda bola rovnaká ako je popísané vyššie pre baktérie s výnimkou, že nebol použitý Tween, a že namiesto bakteriálnej suspenzie bol použitý ¹²⁵I-označený proteín, zriedený približne na 2xl0³ cpm/μΐ PBS s obsahom 2 % hovädzieho sérového albumínu

Molekulové modelovanie

Glykolipidové konformácie s minimálnou energiou uvedené v Tabulke 1 boli vypočítané pomocou Biograf molekulárneho modelovacieho programu (Molecular Simulation Inc.) použitím Dreiding-II silového póla (Mayo a spol., 1990) na Silicon Graphics 4D/35TG workstation. Čiastočné atómové náboje boli generované použitím metódy nábojovej ekvilibrácie (Rappé a Goddard III, 1991) a pre Coulombové interakcie bola použitá konštanta závislá na vzdialenosti (e=3,5r). bola použitá špeciálna vodíková väzba, kde dielektrická Okrem toho, maximálna interakcia (D_hb) bola nastavená na -4 kcal mol ^χ. Dihedrálne uhly GlcBl väzby sú definované nasledovne: φ=Η-1C-l-O-l-C-1, v=C-l-O-l-C-l-C-2 a 0=O-l-C-l-C-2-C-3 so začiatkom od glukózového zakončenia (pozri Nyholm a Pascher, 1993).

Oligosacharid GlcNAcň3Gal54GlcNAc bol syntetizovaný z Gal54GlcNAc (Sigma, St. Louis, USA) a GlcNAcE3Gal54GlcNAcE6GlcNAc bol syntetizovaný z

Gal54GlcNAc56GlcNAc inkubáciou akceptorového sacharidu s ľudskou sérovou 53-N-acetylglukozaminyltransferázou a UDPGlcNAc v prítomnosti 8 mM MnCl₂ a 0,2 mg/ml ATP pri teplote 37 °C počas 5 dní v 50 mM TRIS-HC1, pH 7,5. Gal54GlcNAc56GlcNAc bol získaný z GlcNAc56GlcNAc (Sigma, St Louis, USA) inkubáciou disacharidu s 54galaktozyltransferázou (kravské mlieko, Calbiochem, CA, USA) a UDP-Gal v prítomnosti 20 mM MnCl₂ počas niekoľkých hodín v 50 mM MOPS-NaOH, pH 7,4. Hexasacharid Gal53GlcNAcB3Gal54GlcNAc53Gal54Glc (1 mg, Dextra labs, V.B.) bol natrávený 400 mU B3/6-galaktozidázou (Calbiochem, CA, USA) cez noc tak, ako odporúča výrobca.

Oligosacharidy boli prečistené chromatograficky a ich čistota bola stanovená MALDI-TOF hmotnostnou spektrometriou a NMR. Gala3GalE4GlcNAcb3GalE4Glc bol z Dextra laboratories, Reading, V. B. Glykolipid GlcAB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japonsko) bol redukovaný na Glc53GalB4GlcNAcB3Gal54GlcLCer tak, ako popísal Lanne a spol. (1995). Derivát glykolipidu Glc (A-metylamid)53Gal54GlcNAcfi3GalB4GlcBCer bol pripravený amidáciou karboxylovej skupiny glukuronovej kyseliny v

GalcL3GalB4GlcNAcL3Gal54GlcfiCer tak, ako popísal Lanne a spol. (1995).

VÝSLEDKY

Heptaglykozylkeramid

NeuGca3GalB4GlcNAc53Gal54GlcNAcB3GalL4GlcLCer bol prečistený z králičieho týmusu HPLC tak, ako bolo popísané vyššie. Štruktúra bola charakterizovaná NMR a hmotnostnou spektrometriou (hodnoty nie sú uvedené). Heptasacharidový gangliozid bol naviazaný väčšinou v laboratóriu testovaných izolátov Helicobacter pylori (asi 60) . Aby sa detekovali možné minoritné izomérne zložky v heptaglykozylkeramidovom materiáli, gangliozid bol desialyzovaný, opracovaný endoglykokeramidázou, a uvoľnené oligosacharidy boli permetylované a analyzované plynovou chromatografiou a EI/MS (Obr. 1A a 1B) . Boli identifikované dva sacharidy v šesťuhlíkatej oblasti, čo ukazuje na očakávanú sekvenciu Hex-HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex. Potvrdené to bolo fragmentovými iónmi pri m/z 219, 464, 668, 913 a 1118. Keď boli uhľohydráty konvertované na alditoly (redukciou s NaBH₄) pred metyláciou, pri m/z 235, 684 a 1133 sa zistili okrem už uvedených iónov (neuvedené hodnoty) rozdielne fragmentačné ióny. Dominantný sacharid, ktorý tvorí

V zmesi neboli Čistota asialoganglioNMR spektroskopiou. (Obr. 2A) potvrdila viac ako 90 % celkového materiálu (vrchol B, Obr. 1A a IB) , bol charakterizovaný silným fragmentačným iónom pri m/z 182, čo potvrdilo prítomnosť B4GlcNAc (neolakto série, typ 2 uhlohydrátového reťazca). Minoritný sacharid (vrchol A, Obr. 1A a IB) dával spektrum typické pre typ-1 reťazca (lakto série) s velmi slabým fragmentovým iónom pri m/z 182 a silným fragmentovým iónom pri m/z 228. Prípravok tiež obsahoval stopy cukor-pozitívnych látok, ktoré môžu byť 4- alebo 5cukor obsahujúce sacharidy rovnakej série zistené sacharidy obsahujúce fukózu zidu bola testovaná tiež FAB/MS a Negatívne FAB/MS hexaglykozylkeramidu predpokladanú uhlohydrátovú sekvenciu a ukázala, že keramidy boli prítomné hlavne ako sfingozín a C16:0 mastné kyseliny (m/z 536,5). NMR spektrum hexaglykozylkeramidu (Obr. 3A) ukázalo na prítomnosť štyroch hlavných dubletov v anomérnej oblasti s β väzbou (J~8 Hz). Pomer intenzity bol 2:2:1:1. Signály pri 4,655 ppm (GlcNAch3), 4,256 ppm (vnútorná GalB4), 4,203 ppm (koncová Galh4) a 4,166 ppm (Glch) boli v súhlase s predchádzajúcimi výsledkami pre nLcOse₆-Cer (Clausen a spol., 1986). Prítomný bol tiež malý dublet pri 4,804 ppm, ktorý spolu s malým signálom pri 1,81 ppm (viditelný ako rameno pri 2 metyl rezonancii) znamená prítomnosť malej frakcie reťazca typu 1. V dôsledku prekrývania oblastí 4,15 až 4,25, nemohla byť stanovená pozícia a distribúcia väzby typu 1. Celkové množstvo väzby typu 1 bolo zhruba 10 %.

Nakoľko množstvo reťazca typu získanom z hexaglykozylkeramidu bolo približne 5 % (Obr. 3B) , zdá sa, že väzba typu 1 bola nerovnomerne distribuovaná medzi vnútorné a vonkajšie časti sacharidového reťazca. Znamená to, že 5 % glykolipidov môže byt typl-typl.

v pentaglykozylkeramide pôsobením β-galaktozidázy

Pre zistenie, či väzobná aktivita glykolipidu bola spojená s prevládajúcou neolakto (typ 2) štruktúrou, bol asialo-glypid natrávený galaktozidázou a β-hexozaminidázou a produkty boli analyzované TLC a prekrývacím testom (Obr. 4A, 4B a 4C). Ako sa očakávalo, enzým najprv premenil hexaglykozylkeramid na pentaglykozylkeramid (Obr. 4A, pruh 3) a zmes dvoch enzýmov degradujúcich materiál na laktozylkeramid (Obr. 4B, pruh 6) . Vizualizáciou TLC platní sa ukázalo, že obe reakcie boli úplné alebo temer úplné. Rovnaké výsledky sa získali pri hodnotení materiálu po pôsobení sialidázy alebo po kyslom opracovaní. B4-galaktozidázová degradácia hexaglykozylkeramidu bola sprevádzaná vymiznutím Helicohacter pylori väzobnej aktivity v oblasti tohoto glykolipidu na TLC platniach so súčasným objavením sa silnej aktivity v oblasti pentaglykozylkeramidov (Obr. 4C, pruh 3) . Ďalšia enzymatická degradácia pentaglykozylkeramidu viedla k vymiznutiu väzobnej aktivity v tejto oblasti. Nepozorovalo sa objavenie väzobnej aktivity v oblasti štyroch cukrov. Citlivosť chemického farbenia TLC platní je velmi nízka na to, aby umožnila pozorovanie stopových látok.

V inom pokuse bola hodnotená čiastočná kyslá degradácia pôvodného gangliozidu. Uvoľnené glykolipidy boli hodnotené schopnosťou viazať Helicohacter pylori. Obr. 5A a 5B zaznamenávajú TLC hydrolyzátu (5A) a príslušný autorádiogram (5B) po prekrytí hydrolyzátu ³⁵S-označeným Helicohacter pylori. Glykolipidy v oblastiach hexa-, penta-, tetra- a diglykozylkeramidov mali väzobnú aktivitu a triglykozylkeramid bol neaktívny.

Väzba hexa-, penta-, tetraglykozylkeramidov bola rovnaká pri testovaní s aspoň tromi kmeňmi Helicohacter pylori (17875, 002 a 032).

Podrobnejšie bol študovaný pevne viažuci pentaglykozylkeramid, ktorý vznikol po odštiepení koncovej galaktózy z hexaglykozylkeramidu, a po prečistení chromatografiou na silikagéli. Negatívne iónové FAB/MS spektrum tohoto glykolipidu potvrdilo uhľohydrátovú sekvenciu HexNAc-Hex-HexNAcHex-Hex a potvrdilo keramidovú zlúčeninu hexaglykozylkeramid (Obr. 2B). Protónové NMR spektrum pentaglykozylkeramidu (Obr. 3B) malo päť hlavných β-dubletov v anomérnej oblasti: 4,653 ppm (vnútorné GlcNAc β3), 4,615 ppm (koncové GlcNAcB3), 4,261 ppm (dvojitá intenzita, vnútorné GalB4), 4,166 (GlcB), súhlasí s GlcNAcfi3GalB4GlcNAcB3Galfi4GlcBCer a šesť cukrovou zlúčeninou, ktorá bola hodnotená pre koncové Galfi. Prítomný bol aj malý β-dublet pri 4,787 ppm, ktorý zodpovedá 3substituovanému GlcNAcB (reťazec typu 1). Pozorovaný bol tiež očakávaný metylový signál na ramene oveľa väčšieho metylového signálu pri 1,82 ppm, ale prekrývanie signálov zakazuje kvantifikáciu týchto signálov. Hodnoty anomérneho protónu umožňujú výpočet, že 60 % glykolipidu obsahuje reťazec typu 1. Takže relatívny protónový podiel typu 2 a typu 1 uhlohydrátových reťazcov bol rovnaký ako v šesťcukornom glykolipide. Dve viditeľné škvrny na TLC platniach vo frakciách hexa- a pentaglykozylov, znamenajú skôr heterogenitu ako rozdiely v zložení cukorného reťazca na základe ich citlivosti voči B4-galaktozidáze. Horná škvrna pentaoblasti sa objavuje po neselektívnej hydrolýze asialogangliozidu a selektívnom odštiepení 4-viazanej galaktózy z asialoproduktu. Ďalej, keď hexaglykozylkeramid s vysokým obsahom vyšších chromatografických subfrakcií bol degradovaný β-galaktozidázou a β-hexozaminidázou, výsledný laktozylkeramid dával dva rozdielne chromatografické prúžky. Chromatograf icky homogénny hexaglykozylkeramid dával len jeden laktozylkeramidový prúžok. Ako ukazuje prekrývací test, boli horné aj spodné subfrakcie penta-oblasti velmi aktívne.

Glykosfingolipidy neolakto série so 6, 5 a 4 cukrami (štruktúry 2, 4 a 5, Tabuľka 1) boli hodnotené semikvantitatívnymi testami použitím TLC prekrývacej metódy. Séria riedení glykolipidov bola nanesená na silikagélové platne a vizuálne, a tiež autorádiograficky, hodnotila sa ich väzba na Helicobacter pylori po prekrytí s označenými baktériami (Obr. 6A a 6B). Najaktívnejším druhom bol pentaglykozylkeramid, ktorý dával pozitívnu odpoveď na TLC platniach v množstvách nižších ako 0,039 nmol/škvrna (priemerná hodnota zo 7 pokusov, SD=0,016 nmol). Hexa- a tetraglykozylkeramidy viazali Helicobacter pylori v množstvách 0,2 a 0,3 nmolov glykolipidu/škvrna.

Väzba Helicobacter pylori na vyššie glykolipidy vyšetrovanej série bola velmi reprodukovateľná. Frekvencia väzby pre Helicobacter pylori kmeň 032, zaznamenaná pre pentaglykozyla hexaglykozylkeramidy bola ~90 % (celkový počet platní bol asi 100).

Väzobné stanovenia pre izoreceptory a špecificita väzby (Obr. 7A a 7B)

Okrem heptasacharidových glykosfingolipidov z králičieho týmusu a neolakto jadra,

NeuGca3Galô4GlcNAcE3GalE4GlcNAcb3Galb4GlcĎCer, a ich tetraaž hexaglykozylkeramidy, môže väzobná špecificita zahrňovať iné glykolipidy z neolakto série.

Väzba Helicobacter pylori (kmeň 032) na prečistené glykosfingolipidy rozdelené na tenkovrstevných platniach použitím prekrývaceho stanovenia je zaznamenaná na Obr. 7A a 7B. Tieto výsledky spolu s tými z ďalších prečistených glykosfingolipidov sú sumarizované v Tabulke 2. Väzba Helicobacter pylori na neolaktotetraozylkeramid (pruh 1) a päť- a šesťsacharidové glykosfingolipidy (pruhy 5 a 6) odvodené od NeuGca3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer je identická s vyššie uvedenými výsledkami. Neočakávane sa však zistila väzba GalNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (x₂ glykosfingolipid, pruh 7) a defukozylovaného A6-2 glykosfingolipidu GalNAca3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (č. 12, Tabulka 2) . Spolu so zistením, že Gala3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcBCer (B5 glykosfingolipid, pruh 2) je tiež väzobné aktívny, tieto výsledky predpokladajú skôr možnosť skríženej väzby ako prítomnosť viacerých adhezínov pre každý z týchto fosfolipidov (pozri vyššie). Ďalej, len jedno predĺženie rôznych glykosfingolipidov s piatimi cukrami, ktoré bolo tolerované bakteriálnymi adhezínmi, bolo GalB4 voči GlcNAcB3 zlúčenine z týmusu (pruh 6) . Zistilo sa, že iné predĺžené štruktúry, ako NeuAc-x₂ (pruh 8) a GalNAcB3-B5 (č. 25, Tabulka 2) nevykazujú väzobnú aktivitu. Treba tiež poznamenať, že acetamidová skupina vnútorného GlcNAcB3 v B5 je zásadná pre väzbu, nakoľko de-N-acetylácia tejto časti pôsobením bezvodého hydrazínu vedie k úplnej strate väzby (pruh 3) . Rovnaký výsledok sa vzťahuje aj po rovnakom ošetrení neolaktotetraozylkeramidu (č. 6, Tabulka 2).

Skrížená väzba glykosfingolipidov s piatimi cukrami.

Pre pochopenie väzobných vlastností rôznych neolakto glykosfingolipidov použitých v tejto štúdii, boli molekulovým modelovaním hodnotené konformačné uprednostnenie aktívnych a rovnako neaktívnych štruktúr. Obr. 8A, 8B, 8C a 8D ukazujú x₂ glykolipid spolu s tromi ďalšími sekvenciami: defukozylovaný A6-2, B5 a de-N-acetylovaný B5, ktoré, ako sa očakávalo, s výnimkou chemicky modifikovanej B5 štruktúry, majú rovnakú väzbu. Pre porovnanie by mal byť tiež zahrnutý pentasacharidový glykosfingolipid z králičieho týmusu (pozri Obr. 9A) , nakoľko táto štruktúra sa líši len polohou štyri v koncovom zvyšku v porovnaní s x₂ štruktúrou, a je rovnako aktívna. Všetky štyri aktívne štruktúry majú neolakto jadro a sú ukončené GalNAcB3, GalNAca3, Gala3 a GlcNAcB3. Konformácie s minimálnou energiou týchto štruktúr boli vytvorené tak, ako už bolo popísané (Teneberg a spol., 1996). Iné štruktúry s minimálnou energiou sú uvedené v Tabuľke 2 a sú založené na predchádzajúcich výsledkoch v literatúre (Bock a spol., 1985; Meyer, 1990; Nyholm a spol., 1989). Pre glykosfingolipidy s koncovou sialovou kyselinou bola prevzatá synklinálna konformácia pre glykozidické uhly a3-navíazaných zvyškov tak, ako je uvedené na Obr. 9C, ale bol testovaný aj účinok iných konformácií (Siebert a spol., 1992), predovšetkým antoklinálna konformácia. Pre niektoré účely boli tiež pripravené a6naviazané varianty, ako nízkoenergetické konformácie (Breg a spol., 1989).

Ako už bolo uvedené vyššie, skutočnosť, že štyri väzobno-aktívne pentasacharidové glykosfingolipidy (č. 10-13, Tabuľka 2), majú neolakto jadro, predpokladá, že skrížená väzba s rovnakým adhezínovým miestom môže byť príčinou tohoto pozorovania. Na prvý pohlad môže byť prekvapením, že B5 glykosfingolipid, ktorý sa líši koncovou polohou Gala3, v porovnaní s pentasacharidovou zlúčeninou GlcNAcB3 získanou z králičieho týmusu, je rovnako aktívny a mal by byť na základe väzobnej špecificity zahrnutý do neolakto série. Napriek skutočnosti, že tieto dva koncové sacharidy sa líšia tiež v ich anomérnej väzbe (Obr. 8C a 9A) , sú ale velmi podobné minimálnou energiou topografickej štruktúry. Rozdiely sú v tom, že Gala3 chýba acetamidová skupina, má 4-OH v axiálnej polohe a rovina jeho kruhu je mierne na príslušnou rovinou pentasacharidovej zlúčeniny. Nezdá sa však, že ani 4OH poloha, a ani prítomnosť/neprítomnosť acetamidovej skupiny nie je najdôležitejšia pre väzbu, hoci tiež x₂ a defukozylo55 vané A6-2 glykosfingolipidy (Obr. 8A, B), ktoré sú zakončené GalNAcB3 a GalNAca3, majú rovnaké afinity pre adhezín Helicobacter pylori. Z pohľadu týchto zistení možno očakávať, že GalB3Galň4GlcNAcB3Galfi4GlcBCer, izolovaný z ľudských erytrocytov, (Stellner a Hakomori, 1974) sa viaže na bakteriálny adhezín. Na základe väzobných zásad, tiež iné tri koncové monosacharidy vo väzobných epitopoch Helicobacter pylori, sú možné trisacharidové väzobné epitopy, predovšetkým GlcNAca3GalB4GlcNAc, GlcB3GalB4GlcNAc a Glca3GalB4GlcNAc. Takéto zlúčeniny nie sú známe v ľudských tkanivách a môžu predstavovať analógy prirodzeného receptora. Nebolo možné testovať GalB3GalB4GlcNAc-glykolipid a ani tri analógy.

Molekulovému modelovaniu bola tiež vystavená neolakto zlúčenina so siedmimi cukrami,

NeuGca3GalB4GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4GlchCer. Obr. 10 zaznamenáva dve rozdielne projekcie štruktúry s minimálnou energiou s GlcBCer väzbou v predĺženej konformácii. Sialovej kyseline bola udelená syn konformácia, ale anti konformácia je pravdepodobná v nerozvetvených štruktúrach (Siebert a spol., 1992). Zdá sa, že sialová kyselina má malý vplyv na väzobnú aktivitu voči Helicobacter pylori v porovnaní so zlúčeninou so šiestimi cukrami (Obr. 9B) . Porovnanie prvej projekcie s Obr. 9A a 9B predpokladá, že rovnaký väzobný epitop je tiež prístupný v štruktúre so siedmimi cukrami.

Delineácia neolakto väzobného epitopu

Relatívna väzobná sila štruktúr získaných chemickou a enzymatickou degradáciou zlúčenín so siedmimi cukrami z králičieho týmusu (č. 1, 5, 10 a 21, Tabulka 2) predpokladá, že trisacharidové sekvencie GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3 môžu tvoriť minimálnu väzobnú sekvenciu. Potom, v zlúčenine so šiestimi cukrami možno očakávať inhibičný účinok koncového GalB4, kým v neolaktotetraozylkeramide neprítomnosť koncového GlcNAcfi3 znižuje väzobnú silu, nakoľko v epitope sú prítomné len dva z troch cukrov. Dôležitosť koncového GlcNAcfi3 je jasne dokázaná stratou väzby baktérií na neolaktotetraozylkeramid a B5 po de-N-acylácii acetamidovej skupiny na amín (č. 6 a 14, Tabulka 2) . Strata väzby môže byť spôsobená buď stratou výhodných interakcií medzi adhezínom a acetamidovou skupinou a/alebo zmenou konformácie týchto glykosfingolipidov. Avšak, je ťažko predpokladať situáciu, kde zmenená orientácia koncového GalB4 stéricky zabraňuje prístupu k väzobnému epitopu. Po zistení, že minimálna väzobná sekvencia musí obsahovať sekvenciu GlcNAcĎ3Galft4GlcNAcB3, je preto ľahké zdôvodniť neprítomnosť väzby P_x, H5-2 a dvoch sialylparaglobozidových štruktúr (č. 15, 18-20, Tabulka 2), nakoľko tieto predĺženia priamo interferujú s navrhovaným väzobným epitopom. Tiež glykosfingolipid z kravského mlieka (Teneberg a spol·., 1994), ktorý má B6-naviazané vetvenie GalB4GlcNAcB pripojené na vnútorný GalE4 neolaktotetraozylkeramid (č. 26, Tabulka 2), sa neviaže v dôsledku zablokovaného prístupu k väzobnému epitopu.

Predĺženie pentasacharidových sekvencií s rôznou väzobnou aktivitou v Tabulke 2 ukazuje, že je tolerované len pridanie Galfí k štruktúram odvodeným z týmusu. Je to v súhlase s pozorovaním, že 4-OH poloha môže byť buď rovnobežná, alebo kolmá, ale s predpokladom straty väzobnej afinity v dôvodu sférickej interferencie. Pridanie buď NeuAca3 k x₂, alebo GalNAcň3 k B5 bude viesť k úplnej strate väzby (č. 24 a 25, Tabuľka 2) . Negatívny vplyv Fuca2 jednotky v H5-2 je potvrdený neprítomnosťou väzby na Helicobacter pylori pre A62 a B6-2 (č. 22 a 23, Tabuľka 2) . Čo sa týka predĺženej štruktúry (č. 28, Tabulka 2), zakončenej rovnakým trisacha5Ί ridom ako v B5, musí byť tento koncový trisacharid, ako v B5, zodpovedný za pozorovanú väzbu, hoci je prítomný druhý vnútorný väzobný epitop. Väzba na interný epitop však môže byť pravdepodobne vylúčená.

Záverom treba uviesť, že pre získanie maximálnej aktivity musí väzobný epitop neolakto série glykosfingolipidov obsahovať sekvenciu s tromi cukrami GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3. Na základe štruktúr uvedených na Obr. 8A-D a 9A-D a z porovnávania väzieb potencionálnych izoreceptorov použitých v tejto štúdii možno dedukovať, že temer každý z týchto trisacharidov je dôležitý pre uskutočnenie väzby. Výnimkou je acetamidová skupina koncového GlcNAcB3 a 4-OH na týchto zvyškoch, ktoré nie sú dôležité.

Biologická prítomnosť receptorov.

Zo štyroch pentasacharidových glykosfingolipidov, ktoré in vitro môžu pôsobiť vzájomnou výmenou ako receptory pre Helicobacter pylori, len x₂ sa prirodzene vyskytuje v ľudskom tkanive. Doteraz sa nezistia jeho prítomnosť v gastrickej mukóze, s výnimkou prípadu gastrickej rakoviny, kde bol identifikovaný v nádorovom tkanive (Kannagi a spol., 1982b). Štúdia Thorn a spol. (1992) však ukázala, že x₂ glykosfingolipid a predĺžené štruktúry majú koncovú sekvenciu GalNAcB3Galh4GlcNAcB a sú prítomné vo viacerých ľudských tkanivách, avšak gastrické epiteliálne tkanivo nebolo medzi vyšetrovanými tkanivami. Uskutočnilo sa preto chromatografické prekrytie GalNAcB3GalB4GlcNAcB-špecifickou monoklonálnou protilátkou TH2 prípravkov celkových nekyslých glykosfingolipidov z epiteliálnych buniek ľudskej gastrickej mukózy jedincov z niekoľkých krvných skupín A (pruhy 1-6, Obr. 11B). Pozorovala sa nedetekovatelná väzba na glykosfingolipidy epitelu žalúdka. Prekrytie GalB4GlcNAc-väzobným lektínom z E. cristagalli je zaznamenané na Obr. 11A, 11B a 11C. Z rôznych glykosfingolipidových prípravkov gastroepiteliálneho pôvodu, prvé tri pruhy zaznamenávajú slabú väzbu na prúžky v oblasti štyroch cukrov, čo pravdepodobne zodpovedá neolaktotetraozylkeramidu, ale z dôvodu malého množstva tohoto glykosfingolipidu sa nezistila žiadna detekovateľná väzba Helicobacter pylori na tieto prúžky (Teneberg a spol., 2001).

Ďalej, sekvencia Gala3GalB4GlcNAcB, keď je prítomná v B5 glykosfingolipide alebo predĺženej štruktúre uvedenej vyššie, (č. 28, Tabulka 2), nie je zistená v normálnom ľudskom tkanive v dôsledku neprítomnosti transferázy zodpovednej za pridanie Gala3 (Larsen a spol., 1990). Možno vysloviť záver, že keď je cieľový receptor (receptory) s väzobným epitopom popísaným vyššie, prítomný na povrchu gastrických epiteliálnych buniek, môže mať repetitívne N-acetyllaktózamínové prvky v glykoproteínoch.

Je známe, že kmene Helicobacter pylori, ktoré sa spájajú so žalúdočným vredom, ako kmene, ktoré sa v predkladanej práci hlavne používajú, stimulujú zápalovú odpoveď granulocytov, dokonca aj keď baktérie sú nonopsonizované (Rautelin a spol., 1994a,b). Počiatočné deje fagocytózy baktérií pravdepodobne zahrňujú špecifické lektín-podobné interakcie, ktoré vedú k aglutinácií granulocytov (Ofek a Sharon, 1988). Po fagocytóze nasledujú oxidačné reakcie, ktoré môžu spôsobovať patogenézu ochorení spojených s Helicobacter pylori (Babior, 1978). Z granulocytov bolo izolovaných a charakterizovaných niekolko kyslých a nekyslých glykosfingolipidov, ktoré majú neolakto jadro a opakujúce sa laktozamínové jednotky, vrátane č. 21 v Tabulke 2 a sialyzovaná zlúčenina so siedmimi cukrami (č. 27, Tabulka 2), kde acetamidová skupina v sialovej kyseline je vo forme acetylu, a ktoré môžu byť potencionálnymi receptormi pre Helicobacter pylori na bunkovom povrchu bielych krviniek. Z rovnakého zdroja bol tiež izolovaný x₂ glykosfingolipid (Teneberg, nepublikované).

Podlá Obr. 11B sa zdá, že monoklonálna protilátka TH2 sa skutočne viaže na prúžky v oblasti piatich cukrov, tak granulocytov ako aj erytrocytov (pruh 7 a 8), čo môže zodpovedať x₂ glykosfingolipidu (Teneberg, S., nepublikované; Thorn a spol., 1992; Teneberg a spol., 1996). Podobne sa zistila prítomnosť neolaktotetraozykeramidu v granulocytoch a erytrocytoch pri použití E. cristagalli lektínu v prekrývacej analýze (Obr. 11C, pruhy 7 a 8) . V týchto dvoch prípadoch sa Helicobacter pylori viaže na neolaktotetraozylkeramid (Bergstom, J., nepublikované). V súhlase s výsledkami Fukuda a spol. (1985) sa u granulocytov našiel ďalší slabý prúžok v oblasti šiestich cukrov, čo pravdepodobne korešponduje neolaktotetraozylkeramidu, ktorý je predĺžený o jednu Nacetyllaktózamínovú jednotku (č. 21, Tabulka 2). Naďalej však zostáva zodpovedať otázku, či tieto glykosfigolipidy sú primárnymi cieľmi v procese aglutinácie.

Analýza neoglykolipídov a nových glykolipidov

Oligosacharidy GlcNAcB3GalB4GlcNAc, GlcNAcB3GalB4GlcNAcB6GlcNAc, GAla3GalB4GlcNAcB3GalB4Glc a GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4Glc a maltoheptaóza (Sigma,

S.Louis, USA) boli redukčné aminované s 4-hexadecylanilínom (skratka HDA, Aldrich, Stockholm, Švédsko) cyanoborohydridom (Halina Miller-Podraza, bude publikované neskôr). Produkty boli charakterizované hmotnostnou spektrometriou a potvrdilo sa, že sú GlcNAcB3GalB4GlcNAc(red)-HDA,

GlcNAcB3GalB4GlcNAcB6GlcNAc(red)-HDA,

GAla3Gal54GlcNAcB3GalB4Glc(red)-HDA a

GlcNAcB3GalB4GlcNAcB3GalB4Glc(red)-HDA a maltoheptaóza(red)HDA, kde [(„(red) - znamená amínovú väzobnú štruktúru vytvo-

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie látky obsahujúcej oligosacharidovú sekvenciu viažucu Helicobacter pylori [Gal (A) q (NAc) _r/Glc (A) _q (NAc) _Γα3/β3] _s [GalÉ4GlcNAcÉ3] _tGAlE4Glc (NAc) _u kde q, r, s, t a u sú každé nezávisle 0 alebo 1, takže, keď t=0 a u=0, potom oligosacharidová sekvencia je naviazaná na polyvalentný nosič alebo je ako volný oligosacharid vo vysokej koncentrácii, a analógy alebo deriváty uvedenej oligosacharidovej sekvencie, ktoré majú väzobnú aktivitu pre Helicobacter pylori.
2. 2. Použitie podlá nároku 1, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka má oligosacharidovú sekvenciu GlcNAcĎ3Gal64GlcNAc alebo GlcNAcB3Galfi4GlcNAc53GalĎ4Glc, kde C4 koncového GlcNAcfi3 je volitelne pripojený na Galfil-, alebo glykozidickou väzbou na oligosacharidový reťazec.
3. 3. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka obsahuje jednu alebo niekoľko nasledujúcich oligosacharidových sekvencií:

   GalB4GlcNAc,

   GalNAca3GalÉ4GlcNAc, GalNAcÉ3GalÉ4GlcNAc,

   GlcNAca3GalÉ4GlcNAc, GlcNAcB3GalB4GlcNAc, GalE3GalB4GlcNAc, Glcoc3GalĎ4GlcNAc, GlcÉ3GalE4GlcNAc, GalMGlcNAcE3Galb4GlcNAc, Galb4GlcNAcfi3GalÚ4Glc, GalNAca3Galň4GlcNAcB3GalE4Glc, GalNAcb3GalE4GlcNAcÉ3GalÉ4Glc, GlcNAca3GalÉ4GlcNAcE3GaiE4Glc, GlcNAcň3Galfí4GlcNAcÉ3Galfi4Glc, Glca3GalÉ4GlcNAcĎ3Galň4Gic, GalE3GalS4GlcNAcB3GalB4Glc, GlcB3GalB4GlcNAcb3GalE4Glc, GalANAcb3GalÉ4GlcNAc, GalANAca3GalB4GlcNAc, renú redukčnou amináciou na redukujúcom zakončení glukóz v sacharidoch a amínovú skupinu hexadecylanilínu (HDA)]. Pri hodnotení TLC prekrývacou metódou sa zistilo, že zlúčeniny GAla3GalB4GlcNAcb3GalE4Glc(red)-HDA a

   GlcNAcL3Gal54GlcNAcL3Galb4Glc(red)-HDA majú jasnú väzobnú aktivitu a GlcNAcL3GalL4GlcNAcL6GlcNAc(red)-HDA má silnú väzobnú aktivitu voči Helicobacter pylori, kým

   GlcNAcB3Galň4GlcNAc(red)-HDA a maltoheptaóza(red)-HDA viazali velmi slabo, alebo boli inaktívne. Príklady ukazujú, že tetrasacharid GlcNAcb3Galh4GlcNAcĎ3Gal je štruktúra, ktorá sa viaže na Helicobacter pylori. Redukujúci koniec Glc-zvyšku nie je pravdepodobne potrebný pre väzbu, nakoľko redukcia ruší pyranózovú kruhovú štruktúru na Glc-zvyšku. Naproti tomu intaktná kruhová štruktúra redukujúceho konca GlcNAc je potrebná pre dobrú väzbu trisacharidu GlcNAcE3GalE4GlcNAc.

   TLC prekrývacou metódou boli testované biosyntetické prekurzory analógu NHK-1 glykolipidu

   GlcAcb3GalB4GlcNAc53GalE4GlcňCer a nových glykolipidov GlcE3Gal54GlcNAcE3GalE4GlcECer a Glc(A-metylamid)L3GalB4GlcNAcB3GalE4GlcBCer. Zistilo sa, že sa aktívne viažu na Helicobacter pylori. Glc(A-metylamid) znamená derivát glukurónovej kyseliny, kde karboxylová skupina kyseliny je amidovaná metylamínom. Štruktúra

   GlcE3Gal54GlcNAc53GalB4GlcbCer má silnú väzbu na H. pylori a Glc(A-metylamid)53GalB4GlcNAcB3GalB4GlcECer má velmi silnú väzbu na H. pylori.

   Tvorba GlcAH3GalíS4Glc (NAc) transglykozyláciou

   Akceptorový sacharid GalE4Glc alebo Gal34GlcNAc (asi 1020 mM) bol za miešania inkubovaný s 10-násobným molárnym nadbytkom paranitrofenyl-beta-glukurónovej kyseliny, β-glukuronidázou z hovädzej pečene (20 000 U, Sigma) v pufri pH asi

   5,0 pri teplote 37 °C dva dni. Produkt bol prečistený HPLC.

   GalAE3Galh4GlcNAc, GalAa3Galh4GlcNAc, GalANAcň3Galh4Glc, GalANAca3GalE4Glc, GalAB3Galh4Glc, GalAct3Galh4Glc, GlcANAch3GalB4GlcNAc, GlcANAca3Galh4GlcNAc,

   GlcAh3Galh4GicNAc, GlcAa3GalB4GlcNAc, GlcANAch3Galh4Glc, GlcANAcoc3Galb4Glc, GlcAh3Galh4Glc, GlcAa3Galh4Glc, GalE4GlcNAch3Galh4GlcNAcb3Galh4Glc, a ich polyvalentné konjugáty s redukovaným zakončením.
4. 4. Použitie podía nároku 1, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka obsahuje jednu alebo niekoľko nasledujúcich oligosacharidových sekvencii:

   GalNAca3GalE4Glc, GalNAcb3Galh4Glc, GlcNAca3GalE4Glc,

   G1 cNAch3Ga 1β4G1 c, Galh3Galh4Glc, Glcoc3Galh4Glc Glch3Galh4Glc, a ich polyvalentné konjugáty s redukovaným zakončením.
5. 5. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka obsahuje jednu alebo niekoľko nasledujúcich oligosacharidových sekvencii:

   Galh4GlcNAch3Galh4Glc(lakto-N-neotetraóza),

   GalE4GlcNAch3GalE4GlcNAcft3GalE4Glc(para-lakto-N-neohexaóza) a ich polyvalentné konjugáty s redukovaným zakončením.
6. 6. Použitie podľa nárokov 1 až 5, vyznačuj úce sa t ý m, že uvedená látka je konjugovaná na polysacharid, výhodne na polylaktozamínový reťazec alebo jeho konjugát.
7. 7. Použitie podľa nárokov 1 až 5, vyznačuj úce sa t ý m, že uvedená látka je glykolipid.
8. 8. Použitie podľa nárokov 1 až 5, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka je oligomérna molekula obsahujúca najmenej dva alebo tri oligosacharidové reťazce.
9. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka je micela obsahujúca jednu alebo viac látok definovaných v nárokoch 1 až 8.
10. 10. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka (látky) je (sú) konjugovaná(é) na nosič.
11. 11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúce sa tým, že uvedená látka je kovalentne konjugovaná s antibiotikom účinným voči Helicobacter pylori, výhodne antibiotikom penicilínového typu.
12. 12. Použitie podľa nároku 10, vyznačujúce sa tým, že poloha Cl na redukujúcom zakončení koncového Glc alebo GlcNAc v uvedenej polysacharidovej sekvencií (OS) je kyslík (-O-) naviazaný na oligovalentný alebo polyvalentný nosič (Z) cez skupinu spacera (Y) a prípadne cez monosacharidový alebo oligosacharidový zvyšok (X) za vytvorenia štruktúry [OS-O-(X)_n-Y]_m-Z kde čísla m a n majú hodnoty m>l, a n je nezávisle 0 alebo 1;

    X je výhodne laktozyl-, laktozaminyl, alebo časť oligosacharidovej sekvencie, galaktozyl-, poly-N-acetylO-glykanu alebo N-glykan

    Y je skupina spacera alebo koncový konjugát v keramidovej lipidovej časti alebo väzba na Z; alebo derivát látky uvedenej štruktúry, ktorá vykazuje väzobnú aktivitu voči Helicobacter pylori.
13. 13. Použitie látky podľa nárokov 1 až 12 pre prípravu farmaceutickej kompozície pre liečenie alebo profilaxiu akéhokoľvek stavu spôsobeného prítomnosťou Helicohacter pylori.
14. 14. Použitie podľa nároku 13, vyznačujúce sa tým, že uvedená farmaceutická kompozícia je určená pre liečenie chronickej superficiálnej gastritídy, žalúdočného vredu, vredu dvanástnika, adenokarcinómu žalúdka, ľudského lymfómu žalúdka neHodgkinovho typu, chorôb pečene, pankreasu, kože, srdca, alebo autoimúnnych ochorení, vrátane autoimúnnej gastritídy a pernicióznej anémie, ochorenia žalúdka spôsobeného nesteroidnými protizápalovými liekmi (NSAID), alebo pre prevenciu syndrómu náhleho úmrtia dojčiat.
15. 15. Použitie látky podľa nárokov 1 až 12 pre diagnózu stavov spôsobených infekciou Helicohacter pylori.
16. 16. Použitie látky podľa nárokov 1 až 12, pre prípravu výživového doplnku alebo kompozície pre liečenie alebo profilaxiu akéhokoľvek stavu v dôsledku prítomnosti Helicohacter pylori.
17. 17. Použitie podľa nároku 16, vyznačujúce sa tým, že uvedený doplnok výživy alebo kompozícia je pre detskú výživu.
18. 18. Použitie látky podía nárokov 1 až 12 pre identifikáciu bakteriálneho adhezínu.
19. 19. Použitie látok podľa nárokov 1 až 12 alebo látky identifikovanej v nároku 18, pre prípravu vakcíny voči Helicobacter pylori.
20. 20. Použitie látky podlá nárokov 1 až 12 pre typizáciu Helicobacter pylori.
21. 21. Použitie látky podľa nárokov 1 až 12 pre väzobné stanovenie Helicobacter pylori.
22. 22. Helicobacter pylori viažuca látka obsahuje oligosacharidovú sekvenciu

    Glc(A)q (NAc) _ra3/b3GalE4Glc(NAc)_u kde q, r a u sú nezávisle 0 alebo 1, s tým, že uvedená polysacharidová sekvencia obsahuje E3 väzbu; q a r sú 0 alebo 1; alebo

    GalA (NAc) _ra3/B3GalE4Glc (NAc) _u kde r a u sú nezávisle 0 alebo 1, a ich analógy a deriváty viažuce Helicobacter pylori.
23. 23. Helicobacter pylori viažuca nekyslá polyvalentná látka obsahuje oligosacharidovú sekvenciu ako je definované v nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedená oligosacharidová sekvencia (OS) je časťou štruktúry [OS-O-(X)„-Y]_m-Z ako je definované v nároku 12, Y je hydrófilný spacer, výhodnejšie flexibilný hydrofilný spacer, a jej analógy a deriváty viažuce Helicobacter pylori.
24. 24. Helicobacter pylori viažuca nekyslá polyvalentná látka podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že štruktúra linkera Y je [OS-O- (X) n-Li-CH (H/ {CH1-2OH}_pl) - {CHlOH}_p2- {CH (NH-R) }_p3- {CHiOH}_p4-L₂] _m-Z kde Li a L₂ sú väzobné skupiny obsahujúce nezávisle väzobný atóm kyslíka, dusíka, síry alebo uhlíka, alebo dva väzobné atómy skupiny tvoriacej väzby ako sú -0-, -S-, -CH₂-, -N-, -N(COCH₃)-, amidové skupiny -CO-NH- alebo -NH-CO- alebo -N-N(derivát hydrazínu) alebo amino oxy-väzby -0-N- a -N-0-; Li je väzba od uhlíka 1 na redukujúcom zakončení monosacharidu X, alebo keď n=0, Li nahrádza -0- a viaže sa priamo z redukujúceho zakončenia Cl v OS; pl, p2, p3 a p4 sú nezávisle čísla 0 až 7 s tým, že najmenej jeden pl, p2, p3 a p4 je najmenej 1; CHi_₂OH v {CHi_₂OH}_pi znamená, že koncová skupina reťazca je CH₂OH a keď pl je viac ako 1, sú prítomné sekundárne alkoholové skupiny -CHOH-, ktoré viažu koncovú skupinu na zvyšok spacera; R je výhodne acetylová skupina (-COCH3) , alebo R je alternatívne väzba na Z, a potom L₂ je jeden alebo dva atómy koncovej skupiny reťazca. V inom uskutočnení je R analógom acylovej skupiny C1-14 tvoriacej amidovú štruktúru, alebo H alebo C1-14 alkyl tvoriaci amín; m>l a Z je polyvalentný nosič; OS a X sú definované v nároku 12.
25. 25. Helicobacter pylori viažuca látka obsahuje oligosacharidovú sekvenciu

    Gal (A) _q (NAc) _r/Glc (A) _q (NAc) _ra3/L3GalE4Glc (NAc) _u kde q, r a u sú každé nezávisle 0 alebo 0 s tým, že uvedená oligosacharidová sekvencia nie je Gala3GalL4Glc/GlcNAc, v neredukujúcom zakončení koncovej sekvencie, a jej analógy a deriváty viažuce Helicobacter pylori.
26. 26. Použitie látky podía ktoréhokoľvek z nárokov 22 až 25 pre väzbu baktérií, toxínov alebo vírusov.
27. 27. Použitie látky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 22 až 25 ako lieku.
28. 28. Spôsob liečenia stavov spôsobených prítomnosťou Helicobacter pylori, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický účinné množstvo látky, definované v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 12, alebo 22 až 25, je podané jedincovi, ktorý potrebuje takéto liečenie.
29. 29. Spôsob podľa nároku 28, keď uvedený stav je spôsobený prítomnosťou Helicobacter pylori v gastrointestinálnom trakte pacienta.
30. 30. Spôsob liečenia podľa nároku 28 pre liečenie chronickej superficiálnej gastritídy, žalúdočného vredu, vredu dvanástnika, adenokarcinómu žalúdka, ľudského lymfómu žalúdka neHodgkinovho typu, chorôb pečene, pankreasu, kože, srdca, alebo autoimúnnych ochorení, vrátane autoimúnnej gastritídy a pernicióznej anémie, ochorenia žalúdka spôsobeného nesteroidnými protizápalovými liekmi (NSAID), alebo pre prevenciu syndrómu náhleho úmrtia dojčiat.
31. 31. Spôsob pre liečenie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 30, vyznačujúci sa tým, že uvedená látka je výživový doplnok alebo časť výživovej kompozície.
32. 32. Látka podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že uvedený toxín je toxín Clostridium difficile.
33. 33. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že oligosacharidová sekvencia je β1-6 naviazaná z redukujúceho zakončenia na GalNAc, GlcNAc, Gal alebo Glc.
34. 34. Použitie podľa nároku 2, vyznačujúce sa tým, že oligosacharidová sekvencia je

    Glc (A) _q (NAc) _rL3GalĎ4GlcNAc, q a r sú definované v nároku 1.