JP2004537538A - 胃疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、胃疾患の治療に有用な多糖化合物を開示する。本発明で開示する多糖化合物は、潰瘍化物質に対する胃腸器系粘液層の安定化およびヒトの胃に存在するオリゴ糖レセプターへのヘリコバクター ピロリの付着の阻害を目的としたものである。オリゴ糖レセプターとは、糖タンパク質や糖脂質などの天然の糖結合体に提示された特定のオリゴ糖配列である。本発明の特定の態様においては、多糖化合物をレセプター類似体および/または胃のpHを制御する薬物と共に用いる方法について説明する。
【背景技術】
【0002】
動物細胞は、細胞表面に対する結合を阻害するために、細胞表面のグリコシル化、特に糖鎖の末端のグリコシル化の変化を試みる。本発明においては、いくつかの末端グリカン部が酸加水分解により切り離され、ヘリコバクター ピロリに対するレセプターを形成する病理過程を示す。本発明は、胃の上皮および粘膜を化学的分解や胃の病原体であるヘリコバクター ピロリの結合から保護する特定の多糖組成物も開示する。多糖組成物は、ヘリコバクター ピロリに対するレセプターの類似体および/または胃のpHを制御する薬物も含むことが好ましい。
【0003】
中性であり且つ比較的希少な数種のオリゴ糖配列が動物およびヒトの糖結合体に提示されている。アシアロGM1グリコスフィンゴ脂質(Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer)およびアシアロGM2グリコスフィンゴ脂質(GalNAcβ4Galβ4GlcβCer)の糖配列は、多くの病原体、例えば、肺に存在する多くの病原性細菌や、ロタウイルスといったウイルス、に対する公知のレセプターである。
【0004】
Krivanらの米国特許第5,386,027号(1995年1月)および第5,217,715号(1993年6月)は、アシアロGM1およびアシアロGM2を病原性細菌の阻害に用いることを開示している。また、これらの特許出願は、インフルエンザウイルスのシアリダーゼ酵素による脱シアリル化が未置換のレセプターであるGalNAcβ4Galを生成する病原メカニズムも示唆している。しかし、このような構造体においてGalNAcがシアリル化されることは知られておらず、Galがα3位でシアリル化された場合には、この構造は立体障害性によって大部分のシアリダーゼに対して耐性となる。他の構造体の脱シアリル化、例えば、GM1b(NeuNAcα3Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer)の末端Galの脱シアリル化の方が起こる可能性が高い。これらの特許出願は、マウスの気管を0.1M塩酸で脱シアリル化して、肺の病原体に対する潜在的なレセプターを作成するin vitroの実験も示している。しかしながら、これらの特許出願は、そのような加水分解が起こりうる天然の条件やそれを阻害する方法について何ら記載していない。
【0005】
ラクトシルセラミドも病原性細菌に対する一般的なレセプターであり、病原性酵母に提示されている細胞表面多糖に結合することが証明されている。ヒトインフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルスおよび狂犬病ウイルスなどの数種のウイルスは、ラクトシルセラミドであるGlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer、Galα3/4Galβ4Glcβ1CerおよびGalβ3/4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cerに対するセンダイウイルスの結合(Karlssonらの米国特許第4,859,769号, 1989年8月)に例示されるように、四糖までのオリゴ糖の配列を含む糖脂質に結合する。Jimenezらの米国特許第5,242,800号(1993年9月)は、ラクトシルセラミドが病原性真菌に対するレセプターであることを開示している。オリゴ糖配列であるGalα-、GalNAcα-またはβ-およびGlcNAcβ-3Galβ4GlcNAcは、Clostridium difficile由来のトキシンAに対するレセプターである(Teneberg et al., 1996)。糖鎖であるGlcNAcβ3Galβ、Galβ3GlcNAc、Galβ3/4GlcNAcβ3Galβ4GlcおよびGalβ4Glcβは、Streptococcus pneumoniaeに対する潜在的なレセプターとして知られている(Andersson et al., 1986)。本願の優先権証明書として添付した特許出願は、C. difficileに対するレセプターに類似した糖配列を有する、ヘリコバクター ピロリに対する新規な中性オリゴ糖レセプターを開示している。ヘリコバクター ピロリはラクトシルセラミド、アシアロ−GM1−ガングリオシドおよびアシアロ−GM2−ガングリオシドに結合することも知られている。しかし、上述の研究は、いずれも多糖の使用と何ら関連がない。
【0006】
ヘリコバクター ピロリは、慢性胃炎、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)関連胃疾患、胃や十二指腸の潰瘍、胃MALT悪性リンパ腫および胃腺癌を含む、様々な消化器系やその他の臓器に見られる疾患との関連が知られている(Axon, 1993; Blaser, 1992; DeCross と Marshall, 1993; Dooley, 1993; Dunn et al., 1997; Lin et al., 1993; Nomura と Stemmermann, 1993; Parsonnet et al. 1994; Sung et al., 2000; Wotherspoon et al., 1993)。全体的にまたは部分的に胃腸疾患ではない疾患としては、乳幼児突然死症候群(Kerr et al., 2000 および米国特許第6,083,756号)、自己免疫性胃炎や悪性貧血などの自己免疫疾患(Appelmelk et al., 1998; Chmiela et al, 1998; Clayes et al., 1998; Jassel et al., 1999; Steininger et al., 1998)、ある種の皮膚病(Rebora et al., 1995)、膵臓病(Correa et al., 1990)、腺癌を含む肝臓病(Nilsson et al., 2000; Avenaud et al., 2000)およびじゅく状硬化症などの心臓病(Farsak et al., 2000)が挙げられる。ヘリコバクター ピロリが原因であるかまたは関連する様々な疾患について検討されている(Pakodi et al., 2000)。細菌のコロニー形成および感染において最も興味深い事柄は、細菌が胃粘膜の上皮細胞表面に付着するメカニズムである。
【0007】
糖脂質および糖タンパクを含む糖結合体、例えば、シアリル化糖結合体(Evans et al., 1988)、サルファチドおよびGM3(Saitoh et al., 1991)、Leb決定基(Boren et al., 1993)、ポリグリコシルセラミド類(Miller-Podraza et al., 1996; 1997a)、ラクトシルセラミド(Angstrom et al., 1998)およびガングリオテトラオシルセラミド(Lingwood et al., 1992; Angstrom et al., 1998)などは、上記微生物を結合するレセプターとして機能することが報告されている。ヘリコバクター ピロリに対するその他の潜在的なレセプターには、リン脂質ホスファチジルエタノールアミン(Lingwood et al., 1992)も含まれる。
【0008】
Zopfらの米国特許第5,883,079号(1999年3月)、第5,753,630号(1998年5月)および第5,514,660号(1996年5月)には、ヘリコバクター ピロリの結合を阻害する物質としてNeu5Acα6Gal-を含有する化合物が記載されている。シアリル−ラクトース分子はヒト胃腸器系細胞株に対するヘリコバクター ピロリの結合を阻害し(Simon et al., 1999)、アカゲザルの感染モデルにおいても効果を示した(Mysore et al., 2000)。この化合物は臨床試験中である。しかしながら、これらの特許には、アミン多糖とシアリル化糖との結合体に関する記載はない。
【0009】
Krivanらの米国特許第5,446,681号(1995年11月)は、細菌のレセプターと抗生物質の結合体であって、アシアロガングリオシドとペニシリン系抗生物質との結合体を含むものを開示している。特にこの特許では、アモキシシリン−アシアロGM1結合体によるヘリコバクター ピロリの処置を請求している。この発明で開示されるオリゴ糖配列/糖脂質はガングリオ系列の糖脂質には属していない。しかしながら、上記特許発明は、中性レセプターの形成阻害や多糖の使用には関連していない。
【0010】
数多くの薬物が胃疾患を治療するために開発されている。このような薬物には、オメプラゾールなどの種々のプロトンポンプ阻害薬や、緩衝能を有し、胃粘膜との複合体を形成することが可能な分子であるスクラルファートなどが含まれる。
【0011】
キトサン−多糖結合体は、ヒトの胃への薬物運搬体として使用されている。米国特許第5,283,064号および第5,468,503号に記載されているように、薬物運搬形態にあるキトサンは、一般的に、胃腸器系においてある種の薬物分子の所望の状態での放出を制御することを目的とした堅固な加圧微小球である。本発明は、ヒト粘液との有効な相互作用を達成するための、可溶性または液状のキトサンの使用について説明する。
【0012】
いくつかのキトサン製剤については、ラットの実験的胃炎に対する潜在的な正の効果が報告されている。ここでは大量のキトサンが必要であった(最大の効果は1 g/kgを投与して得られた)が、これは溶解度の高い中性の形態または適当な塩の形態にキトサンがなかったためである(Ito, M. et al. 2000)。不溶性であり、おそらくアルカリ性のキトサンの懸濁液を用いた他の研究においては、キトサンは潰瘍に対して望ましい効果を示していたが、キトサン製剤の分子量やその由来に関する記載がない(Hillyard, I.W. et al., 1964)。また、実験的ラット疾病とヒトの病態との関連性は知られていない。
【0013】
マウスの実験的ヘリコバクター ピロリ感染を治療するために、酸性多糖デキストラン硫酸は、ヒスタミンH2レセプター拮抗剤またはプロトンポンプ阻害薬剤と共に使用されている(Icatlo, F.C.jr. et al., 2000)。しかしながら、この治療とヒト疾病との関連性は知られていない。デキストラン硫酸も、静脈に投与した際にラットモデルに望ましい効果をもたらした(Rudick, J., et al., 1968)。米国特許第5,679,375号(1997年)は、高分子量硫酸化多糖による胃潰瘍および十二指腸潰瘍の治療について記載している。イヌモデルにおけるカラゲナンおよび硫酸化アミロペクチン(SN-263, 脱ペプシン化済)(Ellis, C.M. et. al., 1970)、ならびにラットモデルにおけるトチャカ(カラゲナン)、コンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびデキストラン硫酸(Barnes, W.A. et al., 1967)は、抗潰瘍効果を示し、この効果は、上記物質のタンパク質分解酵素阻害活性によるものであると考えられる。先行技術には、アミン多糖と酸性多糖との組み合わせを胃疾患の治療に用いることに関する記載はない。本発明は、ヒトに特異的な胃疾患、特に胃病原体であるヘリコバクター ピロリによって生じる胃疾患に関連する。この病原体はヒトと共存していくように適応したヒトに特異的な病原体であるが、他の霊長類や猫がある種の菌株に感染していることが時折見られることもある。ヘリコバクター ピロリはいくつかのオリゴ糖への結合特異性を有し、胃疾患や病原性に関連するヒト型グリコシル化産物を有効に認識することができる。
【0014】
本願明細書に記載する新規な組み合わせ治療は、ヘリコバクター ピロリが存在しない場合であっても、ヒトにおける胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含むいくつかの他の胃疾患の治療法として有効である。オリゴ糖からなる阻害剤は非反応性分子であり、ヒトの母乳の天然成分や、ヒト天然グリカンの一部として存在する。このオリゴ糖からなる阻害剤は親水性炭水化物であり、通常、胃腸器系の循環血液にはまったく吸着されないかごく少量しか吸着されない。この糖配列は、他の病原体からの保護や胃腸器系の正常な細菌叢の安定化といったいくつかの望ましい効果を発揮しうる。したがって、オリゴ糖配列は安全に使用することができ、ヘリコバクター ピロリの存在が確認されない場合であっても、一般的な胃の治療において望ましい効果を発揮する。本発明によると、レセプターオリゴ糖配列またはそれらを模倣する配列(mimics)はある種の多糖または多糖結合体に存在する。レセプター活性を有する配列が多価で存在するために、このような多糖はヘリコバクター ピロリの阻害に対して非常に有用である。例えば非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)またはアルコールといった多くの因子は、ヘリコバクター ピロリと共にまたは単独で胃炎や胃潰瘍または十二指腸潰瘍を誘発することが知られている。アルコール誘発性胃疾患は米国特許第5,204,118号で論じられており、アルコールの負の影響はエタノール濃度約10%から始まり、エタノール濃度が約40%以上では刺激性がかなり高く、炎症が生じ、びらん性の胃炎も生じうる。
【0015】
皮膚の創傷の治療に用いるための多糖組成物がいくつか知られている。本発明は、同様の組成物を、特にヘリコバクター ピロリレセプターに対する阻害剤および/または他の胃保護薬と組み合わせて、胃潰瘍に対して使用する方法を開示する。
【0016】
発明の概要
本発明は、ヘリコバクター ピロリに対するレセプター活性を有する多糖を含む組成物であって、更に所望により、ヘリコバクター ピロリに対するオリゴ糖レセプターあるいはその類似体または誘導体および/または胃上皮保護化合物も含む、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療または予防に用いる組成物に関する。
【0017】
また、本発明は、下記式(II):
[Galβy]pHex(NAc) rα/βzGalβ4Glc(NAc)u (II)
(式中、p、rおよびuは各々独立に0または1の整数であり、yは3位または4位の結合位置を表し、zは3位または4位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、但し、
pが1であり、且つ、yが3である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、rは1であり、;
pが1であり、且つ、yが4である場合には、HexはGlcβであり、rは1であり;そして、
pが0である場合には、zが4であり、HexはGalであり、rは1である。)
で表される末端オリゴ糖配列を含むことを特徴とする、糖鎖繰り返し単位から構成される多糖化合物に関する。
【0018】
発明の詳細の説明
本発明は、ヘリコバクター ピロリに対するレセプターとして機能しうる、動物およびヒトの細胞のオリゴ糖レセプター配列に関する。全てでなくとも大部分の病原体は動物細胞表面の特定のオリゴ糖配列に結合する。本願明細書には、発病の際には中性のヘリコバクター ピロリレセプターエピトープが酸加水分解によって露呈されることが教示されている。形成されたレセプターは特定の発病状態に関連しているので、レセプターの形成を阻害することは有益である。更に本発明は、胃の上皮および粘膜を化学的分解や胃の病原体であるヘリコバクター ピロリの結合から保護する、特定の多糖組成物を開示する。このような組成物は、ヘリコバクター ピロリに対するレセプター類似体および/または胃のpHを安定化する薬物も含むことが好ましい。
【0019】
ヘリコバクター ピロリに対するレセプターの糖配列
中性のコア型レセプターオリゴ糖配列: 特定のクラスに分類されるヘリコバクター ピロリに対するレセプターは中性であり、ヒトまたは動物の糖結合体の酸加水分解によって形成される。この中性レセプターは、グリコスフィンゴ脂質のコア領域または一般的なポリ−N−アセチルラクトサミンの主鎖に存在するか、血液型のA型抗原またはB型抗原の脱フコシル化体として存在する。病原体がグリコシル化反応における保存領域をその結合のターゲットとすることは有益であると考えられる。多くの糖結合体は、シアル酸による酸性の修飾を含むか、フコシル化されており、おそらく病原体による進化的な圧力のために、これらの修飾はより最終的なものであり且つ多様である。このような酸性糖配列またはフコシル化配列、およびこれらの配列に対する病原体の特異的な結合メカニズムは、本発明の特定の態様に含まれる。上述のフコースやシアル酸からなるおとりは、コアとなる中性グリカンエピトープを病原性因子の結合から保護することを進化において意図されたものであると考えられるが、特に胃における酸に対する不安定性がこの保護機構の弱点である。
【0020】
シアル酸またはN−アセチルノイアミン酸およびフコース残基を哺乳類およびヒトの糖結合体から放出させるためのいくつかの方法が本願実施例に記載されている。その条件は、0.1M塩酸からなると考えられる胃酸の強さに匹敵する。より強い酸で処理することで、ガラクトースおよび/またはN−アセチルグルコサミンを糖結合体から放出させることもできる。本発明者らは酸加水分解法を用いて、ヘリコバクター ピロリが本来結合しない糖脂質の脱フコシル化体および脱シアリル化体を作成した。そのような中性グリカンレセプターはヘリコバクター ピロリに対する良好なレセプターとなることが示された。胃上皮の酸性状態の防止または胃酸の中和は患者におけるこのような構造の形成を防止する。
【0021】
健康な人間における正常状態では、粘膜タンパク質層が胃上皮ならびにその糖タンパク質および糖脂質を0.1M塩酸に相当する胃酸から保護しているので、上皮細胞との接触に至るヘリコバクター ピロリはほとんどなく、ピロリ菌は主に粘膜層に生息する。胃上皮上のpHは中性に近いが、粘膜層を挟んで逆側の胃酸のpHは1〜2になりうる。発病の開始に伴い、粘膜層が薄く脆弱になり、胃酸は上皮に漏れてヘリコバクター ピロリに対する中性オリゴ糖レセプターが形成される。顆粒球またはリンパ球といった他の標的細胞も、粘膜保護が脆弱な上皮上では酸加水分解を受ける場合がある。
【0022】
本発明は、ヘリコバクター ピロリに結合する特定の新規なオリゴ糖配列のファミリーにも関する。これらの新規な中性オリゴ糖レセプター、その類似体およびそれらの用途については同じ出願人によって出願中の特許出願「ヘリコバクター ピロリに対する新規受容体およびその用途」に記載されている。そこに記載されているレセプターのうち、
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3Galβ4GlcNAc、
Galβ3Galβ4GlcNAcおよびGalα3Galβ4GlcNAcを含む天然のレセプターは、長いオリゴ糖構造が分解されて作製されたレセプターであり、特に本発明で注目しているものである。
【0023】
レセプターは次の配列を有する糖脂質として特徴付けられている:
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、
GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよびGalα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer。しかし、類似の配列も糖タンパク質に提示されている。結合エピトープは、活性を有する五糖からなる糖脂質の末端三糖エレメントを含むことが示され、少なくとも大きな繰り返しN−アセチルラクトサミンにおいては、結合エピトープは糖鎖の中央に存在してもよい。本発明者らは、結合エピトープが多様な形で天然のまたは生合成された糖結合体やオリゴ糖(例えば、糖タンパク質においてO−結合またはN−結合を有するグリカン中のオリゴ糖)あるいはポリ−N−アセチルラクトサミンオリゴ糖に提示されうることを見出した。エピトープの類似性は糖脂質の分子モデリングによって判明した。
【0024】
ヒトの胃または胃腸器系で酸加水分解によって形成されうるヘリコバクター ピロリに対するレセプターには、
アシアロGM1(Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer)、
アシアロGM2(GalNAcβ4Galβ4GlcβCer)、
脱シアリル化CADエピトープ類(例えばGalNAcβ4Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer)および
ラクトシルセラミド(Galβ4GlcβCer)も含まれる。ラクトテトラオシルセラミド(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer)もヘリコバクター ピロリに対する、潜在的な病原関連レセプターである。脱シアリル化CAD−エピトープ類および1型ラクトサミン類(Galβ3GlcNAcβ3)も酸加水分解後の糖タンパク質に提示される。病原関連ヘリコバクターに対する多くの他のレセプターが糖タンパク質および糖脂質に含まれるオリゴ糖鎖から形成されうることが知られている。
【0025】
必須のラクトース/ラクトサミン型レセプターを集合的に示すと、下記式(I)で表されるオリゴ糖配列となる。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u (I)
(式中、p、r、sおよびuは各々独立に0または1の整数であり、yは3位または4位の結合位置を表し、zは3位または4位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
pが1であり、且つ、yが3である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、rは1であり;
pが1であり、且つ、yが4である場合には、HexはGlcβであり、rは1であり(上記のいずれかの条件の場合、末端Galはβ3-またはβ4-結合でGlcNAcβに結合するか、末端Galはβ3-結合でGalNAcβに結合する);
pが0であり、且つ、zが4である場合には、HexはGalβであり、rは1であり(末端の単糖の構造はGalNAcβ4である);そして
pが0であり、且つzが3である(配列の末端はHexNAc/Hexα/β3である)。)
ラクトサミン/ラクトース型レセプターの活性は中性オリゴ糖配列に起因することが好ましい。
【0026】
他の一つの態様において、ラクトサミン/ラクトース型レセプター活性は糖脂質型オリゴ糖配列に起因する。ヘリコバクター ピロリに対するこのようなタイプのレセプターオリゴ糖配列は動物のグリコスフィンゴ脂質に提示される配列に属するものである。
【0027】
ヘリコバクター ピロリに対する他のレセプターであって、本発明で使用するアミン多糖類と共に組み合わせて用いることのできるものとしては、ルイスb糖、その類似体(Boren et al., 1993)およびシアリル化ヘリコバクター ピロリレセプター、特にはNeuNAcα3GalおよびNeuNAcα6Gal(Evans et al., 1988; Miller-Podraza et al., 1996; 1997a)が挙げられる。レセプターとアミン多糖類は共有結合していても、していなくてもよい。
【0028】
多糖
本発明で使用する多糖配列は、中性レセプター配列と相同性を有することが好ましい。相同性が高くなくとも、エピトープの多価性が多糖とヘリコバクター ピロリとの接触を促進すると考えられる。糖脂質レセプターは、例えば、ラクトシル(Galβ4Glc)配列およびN−アセチルラクトサミニル(Galβ4GlcNAcおよび末端N−アセチルグルコサミンを有するGlcNAcβ3Galβ4GlcNAc)配列を含む。これらの配列と同一または類似の天然の配列が細菌の細胞外多糖類(exopolysaccharides)に見出されている。例えば、B型ストレプトコッカス由来の夾膜多糖はα2-3シアリル化異型を含み、Streptococcus pneumoniaeはレセプター活性を有する配列(Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc)の中性異型を含む。多糖は、例えば乳酸菌といった非病原性微生物によって産生されたものであることが好ましい。大量生産されている、非病原性細菌によって産生されたヘリコバクター ピロリ結合性の多糖の例としては、Zooglea ramigera由来の細胞外多糖を実施例で示した。この多糖は、上記の中性レセプターに類似するエピトープをいくつか有し、Galの3位または4位の結合位置に修飾のあるラクトースエピトープを含むことが報告されている(Ikeda et al., 1982; FranzenとNorberg, 1984)。多糖キトサンもラクトース(アミン)配列に類似した構造を有する。グルコサミンは、種々の度合いにアセチル化されており、ラクトースに類似した -GlcN(Ac)0-1β4GlcN(Ac)0-1β4GlcN(Ac)0-1-、およびN−アセチルラクトサミンを有し、いくつかの部分アセチル化異型はGalNAcβ4Galβ4Glc/GlcNAcを有する。ヘリコバクター ピロリと、キトサンおよび酸性多糖を含むキトサンの結合体との結合も本願の実施例に示した。
【0029】
多糖であるフコイダンはフコシル化ルイス型抗原(例えばヘリコバクター ピロリに対するルイスbレセプター)との相同性を有し、硫酸化されている。コンドロイチン/コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸はラクトサミン型多糖と相同性を有する。本発明は、酸性多糖をアミン多糖(例えばキトサン)と共に共有結合型か非共有結合型の結合体として用いる方法について説明する。
【0030】
多糖レセプターと、レセプター活性を有するオリゴ糖または多糖との相同性を高めるために、レセプター活性を有する炭水化物を多糖骨格に化学的に結合させることができる。このような結合は安定な化学結合により直接行うことが好ましい。アミド基を結合している炭水化物を製造するための方法としては、還元的にアミノ化したオリゴ糖を多糖に結合させる方法など、その他の糖結合法が当業者には多数知られている。本発明の特定の態様においては、オリゴ糖残基はスペーサー分子を介して連結されている。好ましい態様においては、グリコシルアミン ケミストリーを用いて結合させる。
【0031】
キトサンをラットの胃潰瘍に対して使用することが報告されている(Ito, M. et al., 2000)。しかしながら、ここで用いた製剤には次のようないくつかの問題がある。(1)0.5%酢酸溶液として投与されるので、製剤は酸性であり、胃に損傷を与える可能性がある。キトサン酢酸は等量を超える量の遊離の酸を結合することができるので、酸による望ましくない影響を受ける恐れがある。(2)製剤の溶解性および活性が低いので、胃疾患に対して適度な効果を得るためには、250〜1000mg/kgといった多量の製剤をかなりの容量の水に溶解しなければならない。本発明は、キトサン塩を中性(pH6.5〜7.5)および中性近傍(pH6.0〜6.5またはpH7.5〜8.0)の製剤に用いる方法を開示する。特定の態様においては、わずかにアルカリ性である低分子量の製剤を用いる。このような製剤のpHは8.0〜9.0、好ましくは8.0〜8.5である。キトサン塩も水溶性である。他の一つの態様においては、キトサン塩製剤の平均分子量は25,000以下であり、好ましくは10,000〜20,000であり、さらに好ましくは2,000〜10,000である。他の一つの態様は、二糖〜約十糖、好ましくは四糖〜約十糖からなるオリゴ糖を単独または混合物として含む遊離のキトサンオリゴ糖に関する。可溶性の中性キトサン塩の製造については、米国特許第5,061,792号および第4,574,150号ならびに国際公開公報第8,707,618号に記載されている。低分子量キトサンおよびキトサンオリゴ糖は、例えば、酸加水分解やキトサン分解酵素を用いて当業者に知られた方法で製造することが可能である。
【0032】
特定の態様においては、オリゴ糖または炭水化物はキトサン骨格に結合しており、もとのキトサン分子よりも高い水溶性を持つ結合体を形成していることが好ましい。ヘリコバクター ピロリに対する上記レセプターオリゴ糖配列が特に好ましく、最も好ましくはヘリコバクター ピロリに対する次のような中性レセプターオリゴ糖配列である:
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(NAc)0-1、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(NAc)0-1、
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3Galβ4GlcNAc、
Galβ3Galβ4GlcNAc、Galα3Galβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAcと類似の
GlcNAcα/β3Galβ4GlcNAc、GlcNAcα3Galβ4GlcNAc、
フィンランド国特許願第20010118号に記載の[Hex(NAc)0-1α/β3] 0-1Galβ4Glc(NAc)0-1で表されるラクトース類似体、ならびに
PCT/SE/00/02567に記載のラクトテトラオシルサッカライド(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc)またはガングリオシドテトラオシルサッカライド(Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc)とその誘導体および類似体。
【0033】
ヘリコバクター ピロリに対する作用の発揮に加えて、中性または可溶性のキトサンはヒト粘液との有効な相互作用を達成するために用いることができる。そのような相互作用は、粘液の分泌量を増加させることが知られている。典型的な胃疾患は粘液層の損傷と共に始まるが、粘液層は胃上皮を胃酸、病原体および分解酵素から保護している。キトサンまたは本発明の他の多糖の使用には、粘液バリアを回復する作用がある。粘液バリアの回復は、粘膜分泌の増加、強いバリアを作るための粘膜糖タンパク質のイオン性架橋および多糖の緩衝作用により達成される。さらなる望ましい効果は創傷治癒活性を有する多糖の使用によっても得られる。特定の態様においては、他のアニオン性多糖を、β1-4グルコサミン多糖であるキトサンの代わりに用いる。アニオン性多糖の例としては、修飾したり、共有結合で架橋したキトサン、アミノ基を有するキトサン類似体およびα1-4ガラクトサミンのポリマーといった他のヘキソサミン多糖が挙げられる。キトサン、キトサンオリゴ糖またはそれらの類似体の製剤は、グルコサミンのみを含んでいてもよいし、部分的にN−アセチル化されていてもよい。
【0034】
胃上皮の保護を目的とした、ヘリコバクター ピロリに対する潜在的な活性を有する酸性多糖には、グリコサミノグリカン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラゲナン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、フコシル化コンドロイチン、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸;類似の硫酸化化合物、例えばヘパリノイド、デキストラン硫酸、硫酸セルロース、硫酸澱粉、硫酸アミロペクチン、フコイダン、酸性のまたはグルクロン酸含有の細菌性多糖(例えば、Streptococcus pneumonia由来III型多糖およびE. coliやStreptococcusの特定の菌株に見出されるグリコサミノグリカン類似多糖)が含まれる。酸性多糖またはその断片は、キトサンまたは類似のアミン含有多糖との共有結合型または非共有結合型の結合体として用いることができる。
【0035】
本発明によると、胃上皮に対する胃酸の作用を阻害する化合物(胃のpHを安定化させる薬物、即ち、胃上皮のpHを自然のほぼ中性のpHに安定化させることが可能な化合物)と共にヘリコバクター ピロリに対する多糖−オリゴ糖からなる阻害剤を組み合わせて使用することは特に有用である。ヘリコバクター ピロリに対するいくつかの中性オリゴ糖からなる阻害剤は、フィンランド国特許願第20010118号およびPCT/SE00/02567に記載されている。本願の特定の態様においては、胃のpHを安定化させる薬物は上記のような多糖であり、多糖はヘリコバクター ピロリに対する中性オリゴ糖からなる阻害剤と共有結合している。多価結合体は、多糖や溶解性粘液物に結合した多糖と共に遊離されたヘリコバクター ピロリに効率的に結合する。
【0036】
ヘリコバクター ピロリが結合するターゲット細胞は主としてターゲット組織(特に胃腸器系)の上皮細胞である。ターゲット組織のグリコシル化は病原体による感染によって変化すると考えられる。ターゲット細胞はターゲット組織の悪性細胞、形質転換細胞または癌化/腫瘍細胞でもよい。形質転換細胞または組織は異なる形のグリコシル化反応を発現し、細菌に対するレセプターを提供する場合がある。レクチンまたは糖類が糖タンパクまたは糖脂質からなるレセプターの糖質と結合すること(炭水化物−炭水化物間相互作用)によって細胞が活性化され、癌化/悪性細胞の場合には、これは癌の増殖または転移につながる。本願に記載のオリゴ糖エピトープのいくつか、例えば、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(Hu, J. et al., 1994)、Galα3Galβ4GlcNAc(Castronovo et al., 1989)ならびに悪性細胞由来の中性ポリラクトサミン(Stroud et al., 1996)は、癌関連抗原または癌抗原として報告されている。ヘリコバクター ピロリは胃リンパ腫とも関連する。深部胃粘膜由来のGlcNAcβ3Galβ4GlcNAc配列も抗原結合性の潜在的な癌関連構造として記載されている(Hanisch, F.-G. et al., 1993)。本願の多糖化合物はヘリコバクター ピロリの前癌状態または悪性の細胞に対する結合および癌の増殖および転移を防止するために用いることができる。結合阻害は胃がん、特にリンパ腫を治療する可能性がある。
【0037】
胃のpHを制御する化合物または胃上皮保護化合物とは、胃のpHを中和するか高めるか、胃上皮を胃酸から保護することが可能ないかなる薬物をも意味する。胃のpHを制御する薬物には、特定のプロトンポンプ阻害剤であるオメプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール、パントプラゾール等、他のpH調節剤であるヒスタミンH2レセプター拮抗剤(例えば、シメチジン、ファモチジンおよびラニチジン)、ならびに胃上皮に保護層を形成させるための合成または被覆活性を有する薬剤であるスクラルファート(ショ糖ポリ硫酸アルミニウム塩)、緩衝塩組成物および胃のpHの上昇や胃上皮の保護粘膜を増加させる炎症軽減性化合物(例えばカルベノキソロン)が含まれる。本発明で使用する胃のpHを制御する薬物の中で特に有用なものは、胃上皮を胃のpHから保護する層を形成する分子であり、胃のpHを制御する薬物としてより好ましいものは炭水化物であり、さらに好ましくは硫酸基またはカルボン酸基を含む多糖またはオリゴ糖である。本発明の多糖またはその類似体、あるいは本発明の多糖に関連した多糖またはその類似体は、胃上皮または残余粘膜への結合活性の程度が異なり、胃のpHを緩衝化することができる。同様に、保護するにあたって、多糖の混合物、架橋性多糖の混合物、または多糖とオリゴ糖の混合物を使用することができる。
【0038】
ターゲット細胞には血液細胞、特に白血球が含まれる。消化性潰瘍と関連するヘリコバクター ピロリ株、例えば、本発明で主として用いた株は、オプソニン作用を受けていないにもかかわらず、顆粒球による炎症反応を刺激した(Rautelin et al., 1994a,b)。細菌の食作用において最初に起こる事柄は特定のレクチン様相互作用を含み、その結果、顆粒球の凝集が生じる(OfekとSharon, 1988)。食作用に続いて酸化的バースト反応が生じるが、これはヘリコバクター ピロリ関連疾患の病因を導くものとも考えられる(Babior, 1978)。
【0039】
ヘリコバクター ピロリは種々のオリゴ糖配列に結合することが知られている。特定の株による特異性はより共生的な相互作用であり、癌や重度の病態に進行することはない。癌型糖エピトープへの結合に関する本願のデータは、本発明の多糖化合物が病原性の相互作用も防止することが可能であり、その際、他のレセプター構造に結合した病原性の低いヘリコバクター ピロリ株の中には影響を受けないものもあることを示した。従って、細菌の完全な除去はヘリコバクター ピロリ関連疾患の予防には必ずしも必要ない。病原性の低い細菌は、消化管に存在する病原性ヘリコバクター ピロリ株の定着を防止することができるので、プロバイオティックな効果を発揮することも考えられる。
【0040】
本発明の1つの態様においては、本発明の多糖化合物を医薬組成物に使用するために担体に導入することができる。このような医薬組成物は、胃疾患によって生じる病態、特に患者の胃腸器系にヘリコバクター ピロリが存在することによって生じる病態の治療に有用である。更に、本発明の多糖化合物は、このような病態の治療方法に有用である。本発明によって治療することのできる病態の具体例としては、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、ヒトの胃における非ホジキンリンパ腫、胃腺癌、膵臓、皮膚、肝臓または心臓におけるある種の疾患、乳幼児突然死症候群、自己免疫性胃炎を含む自己免疫疾患、悪性貧血、ヘリコバクター ピロリにも関連する非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)関連胃疾患が挙げられる。
【0041】
多糖化合物は胃上皮保護活性を有し、この活性ゆえに、ヘリコバクター ピロリが存在しない場合であっても、胃疾患(例えば胃炎、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍および非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)関連胃疾患)やアルコール誘発性胃疾患(例えば、胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍)の治療に有用である。
【0042】
本発明による多糖および/またはレセプターオリゴ糖をそれら以外の胃のpHを制御する薬物と共に用いることは特に有用である。このような治療においては、病原関連レセプターの形成が阻害され、形成されてしまったレセプターに対する結合は付着阻害性炭水化物あるいはその類似体または誘導体によって妨げられる。付着阻害性レセプターオリゴ糖ならびにその誘導体および類似体の一部は、本願と関連のある特許出願(発明の名称:ヘリコバクター ピロリに対する新規受容体およびその用途;フィンランド国特許願第20010118号)に記載されている。胃のpHを制御する薬物は、長期使用の際に副作用を生じる。胃のpHを制御する薬物を付着阻害性の多糖や多糖結合体と共に使用すると、必要な薬物の量が減り、副作用が弱くなる。レセプターの欠損のために病原性細菌が減少すれば、有害な種類のヘリコバクター ピロリを全て除去しなくとも、患者を治癒することが可能である。胃リンパ腫などの重度の疾患においてヘリコバクター ピロリを根絶するために、胃のpHを制御する薬物とオリゴ糖レセプターまたはその類似体を、さらに一種又は数種、一般的には二種または三種の抗生物質(例えば、アモキシリン、クラリスロマイシン、メトロニダゾールおよびリファブチン)あるいはビスマス化合物と共に用いることもできる。
【0043】
本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。
【0044】
本発明の化合物または医薬組成物は、適当な方法で投与すればよく、経口投与が好ましい。
【0045】
好ましい医薬組成物においては、ヘリコバクター ピロリに対するレセプター活性は細菌または他の微生物に由来する多糖か修飾多糖によっても発揮されている。より好ましくは、多糖はヒトに対して非病原性の細菌に由来するものである。
【0046】
本発明の他の医薬組成物においては、ヘリコバクター ピロリに対するレセプター活性は修飾多糖によって発揮されており、レセプター活性を有するオリゴ糖配列は多糖に化学的に結合している。ラクトース(アミン)オリゴ糖配列がアミン含有多糖に化学的に結合していることがより好ましい。他の好ましい態様においては、ヘリコバクター ピロリに対する酸性レセプター多糖またはその断片は、キトサンなどのアミン含有多糖に化学的に結合している。
【0047】
多くの多糖類、特に細菌由来の多糖類には、グリコシル基転移酵素により修飾可能な糖配列がを含まれていることに注目すべきである。多糖中の一つ又は複数の単糖を転移して、レセプター活性を有するオリゴ糖配列を多糖中に形成することができる。グリコシル基転移酵素としては、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびトランスグリコシル化酵素が挙げられる。好ましい態様においては、末端受容配列はグリコシルトランスフェラーゼまたはトランスグリコシル化酵素によって修飾される。特に次のような反応が好ましい:1)末端Glcをβ4−ガラクトシルトランスフェラーゼで修飾する;2)末端GlcNAc残基をβ3−またはβ4−ガラクトシルトランスフェラーゼで修飾する;3)末端LacまたはLacNAc残基をβ3−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β3−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β4−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα3−ガラクトシルトランスフェラーゼで修飾する;および4)末端GalNAcβ4Galをβ3−ガラクトシルトランスフェラーゼで修飾する。
【0048】
本発明の他の一つの好ましい態様は、下記式(II)で表される末端オリゴ糖配列をいくつか含む糖鎖繰り返し単位から構成される多糖化合物に関する。
[Galβy]pHex(NAc)rα/βzGalβ4Glc(NAc)u (II)
(式中、p、rおよびuは各々独立に0または1の整数であり、yは3位または4位の結合位置を表し、zは3位または4位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、但し、
pが1であり、且つ、yが3である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、rは1であり、;
pが1であり、且つ、yが4である場合には、HexはGlcβであり、rは1であり、;そして
pが0である場合には、zは4であり、HexはGalであり、rは1であるか、あるいはzは3である。)
【0049】
糖鎖繰り返し単位から構成される多糖化合物とは、微生物由来多糖、細菌由来多糖または末端オリゴ糖配列を含むように修飾された他の糖鎖繰り返し単位から構成される多糖を特に意味する。「末端配列」という表現は、単糖残基が他の単糖残基によって還元末端以外では修飾されていないことを意味する。糖鎖繰り返し単位から構成される多糖化合物の分子量は2,000Daを超えることが好ましく、10,000Daを超えることがさらに好ましい。
【0050】
オリゴ糖レセプターに関する特異的な病因論を利用した治療方法や医薬組成物は、ヘリコバクター ピロリの病原性株に対して特に有用である。
【0051】
本発明の好ましい食品は乳幼児用ミルクである。好ましい飲料はエタノール濃度が少なくとも10%のアルコール飲料であり、さらに好ましくはエタノール濃度が少なくとも30%のアルコール飲料である。本発明の多糖組成物は、ヘリコバクター ピロリによって感染されうる動物、例えばブタや猫、のための医薬や飼料にも用いることができる。本願で例示した炭水化物を包含する組成物が好ましい。本発明の組成物は、胃上皮を保護することによってヘリコバクター ピロリなどが存在しない場合であっても、動物の胃の健康に好ましい効果を発揮する。
【0052】
本発明で開示する多糖組成物は、胃における他の薬物の有害な副作用を防止するための医薬組成物に用いることができる。例えば、胃の炎症、胃炎および胃潰瘍がアスピリンなどの市販薬によって生じる。他の薬物は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)に分類されるものであることが好ましい。
【0053】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。グリコシダーゼ酵素の阻害剤を他の薬物、例えば病原性因子となる細菌、ウイルスまたは真菌に対して使用されている公知の抗生物質、と共に投与することができる。
【0054】
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするヒトまたはヒト以外の哺乳類である。
【0055】
また、本発明の多糖化合物を栄養補助組成物、例えば食品や飲料組成物、の一部として用いることができる。本発明の多糖化合物を機能性食品または機能化食品の一部として用いることが好ましい。機能性食品は、ヘリコバクター ピロリがターゲット細胞または組織に結合するのを阻害するか防止することでヒトまたは動物の健康に対して好ましい効果を示す。本発明の多糖化合物は既に知られている食品や機能性食品組成物の一部として用いてもよい。機能性食品は、専門機関、例えば米国FDA、によって許可されている他の許容される食品材料を包含してもよい。本発明の多糖化合物は食品添加剤、好ましくは食品添加剤として機能性食品を製造するために用いることができる。
【0056】
糖脂質および炭水化物の命名は、IUPAC−IUB生化学命名委員会の推奨する命名法(Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29)に従った。
【0057】
Gal、Glc、GlcNAc および Neu5AcはD型であり、FucはL型であり、全ての単糖残基はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNまたはGlcNH2と示し、ガラクトサミンはGalNまたはGalNH2と示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、Neu5Ac-残基のα3およびα6結合はそれぞれα2−3およびα2−6結合と同じである。他の単糖残基については、α1−3、β1−3、β1−4およびβ1−6結合はそれぞれα3、β3、β4およびβ6と略すことができる。ラクトサミンはN−アセチルラクトサミン(Galβ4GlcNAc)を示し、シアル酸はN−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)、N−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)またはその他の天然のシアル酸を示す。本願においてグリカンという用語は、ヒトまたは動物に存在する糖結合体、特に糖脂質または糖タンパクに含まれるオリゴ糖や多糖鎖を広く包含する。脂肪酸と塩基の略記命名法においては、コロンの前の数字が分子の炭素数の長さを示し、コロンの後の数字が分子の二重結合の合計を示す。
【0058】
本発明者らは、グルクロン酸を含むオリゴ糖配列およびいくつかのその誘導体がヘリコバクター ピロリに結合することを見出した。新規な結合性オリゴ糖配列はGlcAβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを含む。本発明の一つの態様は、下記式で表されるオリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含む化合物またはヘリコバクター ピロリに結合するレセプターを用いてヘリコバクター ピロリに対する結合活性または阻害活性を有する組成物を製造する方法であって、該類似体または誘導体はヘリコバクター ピロリに対する結合活性を有することを特徴とする方法に関する。
[Gal(A)q(NAc)r /Glc(A)q(NAc)r α3/β3]s [Galβ4GlcNAcβ3]t Galβ4Glc(NAc)u
(式中、q、r、s、tおよびuは各々独立に0または1の整数であり、
但し、
tが0であり、且つuが0である場合には、オリゴ糖配列は多価の担体に結合しているか高濃度の遊離オリゴ糖として存在する)。
【0059】
上記オリゴ糖配列中の「A」は、ウロン酸の単糖残基またはその6位の炭素の誘導体を表し、最も好ましくは、6位の炭素の誘導体はウロン酸のアミドである。
【0060】
ヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列である、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAcがヒト胃粘膜について報告されている。この粘膜性エピトープおよび類似したO−グリカン型糖構造体はヒトの胃に存在するヘリコバクター ピロリに対する天然の高親和性レセプターである可能性が非常に高い。これはネオグリコ脂質である類似配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAcがヘリコバクター ピロリに高い親和性で結合し、同様のアッセイにおいてGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Galがヘリコバクター ピロリに対していくらかの結合親和性を示したことによって明示された。従って、好ましいオリゴ糖配列には、O-グリカン類やGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc/GalNAc/Gal、
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc/GalNAc/GalαSer/Thr、
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6(Gal/GlcNAcβ3)GlcNAc/GalNAc/GalαSer/Thr等のO−グリカン類の類似体、ならびに糖ペプチドやO−グリカン配列を含む糖ペプチドの類似体が含まれる。非還元末端GlcNAcを欠いた配列でさえもいくらかの活性を有する。このような知見に基づき、その他の全てのヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列(OS)、特に三糖エピトープは、還元末端に結合して以下の構造を形成していることが特に好ましい:OSβ6Gal(NAc)0-1、OSβ6Glc(NAc)0-1、OSβ6Gal(NAc)0-1αSer/Thrまたは
OSβ6Glc(NAc)0-1αSer/Thr。SerまたはThr化合物あるいはそれらの類似体あるいは還元オリゴ糖は、多価の担体に結合しているものが特に好ましい。還元オリゴ糖は多価担体に還元的に結合することができる。
【0061】
オリゴ糖配列を含むウロン酸およびβ6−結合オリゴ糖も、本発明の組成物および多糖結合体において好ましい。
【0062】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0063】
材料と方法
材料 − TLCシリカゲル60(アルミニウム)プレートはMerck製(ドイツ国、ダルムシュタット)である。実験に用いた全てのグリコスフィンゴ脂質は我々の研究室で得たものである。β−ガラクトシダーゼ(Escherichia coli)はBoehringer Mannheim社(ドイツ国)、ハムのF12培地はGibco社(英国)、35S−メチオニンはAmersham社(英国)、そしてFCS(ウシ胎児血清)はSera-Lab社(英国)より購入した。β4−ガラクトシダーゼ(Streptococcus pneumoniae)、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ(Streptococcus pneumoniae)およびシアリダーゼ(Arthrobacter ureafaciens)はOxford GlycoSystems(英国、アビントン)のものである。ヘリコバクター ピロリ臨床単離株(002株および032株)はそれぞれ胃潰瘍および十二指腸潰瘍の患者から単離したものであり、スウェーデン国、エレブル医学センター(Orebro Medical Center)のD. Danielsson博士によって寄贈されたものである。基準株である17874株および17875株はゲーテボルグ大学カルチャーコレクション(CCUG)のものである。Zooglea ramigera由来の多糖は、Sigma社(米国、セントルイス)より購入し、濃度が0.6mg/mlとなるように水に溶解した。ヒアルロン酸(製造番号:385 908)およびコンドロイチン硫酸A(製造番号:230 687)はCalbiochem社(米国、カルフォルニア州、ラ ホーヤ)より購入し、いずれも3mg/ml水溶液として使用した。キトサンアベレージ(低分子量)はFluka社(スイス国、ブークス)より購入した。キトサン濃度が3mg/mlの50%酢酸溶液を得るために、加温(約20分間、75℃)および超音波処理を用いた。得られたキトサンの酢酸溶液は−20℃で保存したが、溶液の一部は真空遠心機で2.5時間乾燥させて中和し、フィルム状の残渣をもとの体積(200μl)に戻るように溶解した(pHは6.0〜6.5)。クロマトグラム上のスポットC10には50%酢酸溶液を用いたが、余分な酸はプレートを室温で一晩乾燥させる際に除去された。64個の1級アミン基を有するStarburstTMデンドリマーはAldrich社から購入し、濃度2mg/mlで使用した。
【0064】
グリコスフィンゴ脂質類 − 図7に示した実験に用いた純粋なグリコスフィンゴ脂質は、(Karlsson, 1987)の記載に従って、表2に示した原料の全酸性画分または全非酸性画分から得た。一般的に、個々のグリコスフィンゴ脂質は全グリコスフィンゴ脂質画分のアセチル化(Handa, 1963)によって得られ、シリル酸カラムクロマトグラフィを繰り返すことで分離し、次いでマススペクトル分析(Samuelsson et al., 1990)、NMR(Falk et al., 1979a,b,c; Koerner Jr et al., 1983)および分解的手法(degradative procedures)(Yang Hakomori, 1971; Stellner et al., 1973)によって特徴付けた。ウサギ胸腺由来の糖脂質については後述する。
【0065】
糖脂質類の精製 − 酸性グリコスフィンゴ脂質類はウサギ胸腺のアセトン粉末(米国、アーカンソー州、ノースアーカンソー、Pel-Freeze Biological Inc.製)1000gから単離した。アセトン粉末はSoxhlet装置(Soxhlet Apparatus)によって、クロロフォルム/メタノール 2/1(特に記載がない限り容量比)を用いて24時間抽出し、さらにクロロフォルム/メタノール/水 8/1/1で36時間抽出した。抽出した脂質240gはフォルチ分配(Folch et al., 1957)に付し、回収した親水性相はDE23セルロース(DEAE)(英国、メイドストン、Whatman製)によるイオン交換ゲルクロマトグラフィに付した。単離工程によって2.5gの酸性グリコスフィンゴ脂質が得られた。ガングリオシドはシアル酸の数に基づいて、イオン交換ゲルを用いたガラス製カラム(内径50mm)によるオープン管状クロマトグラフィで分離した。カラムは、凹状のグラジエント(予めプログラムされているグラジエントno.4)を調製するHPLCポンプ(米国、カリフォルニア州、System Gold Chromatographic Software および Beckman Instruments Inc.製)につなぎ、グラジエントはメタノールで開始して、0.5M CH3COONH4のメタノール溶液で終了した。流速は4ml/分で各8mlの画分を200個回収した。300〜400mgのガングリオシド混合物をそれぞれ500gのDEAE Sepharose(CL6、ベッド高さ:約130mm)(スウェーデン国、ウプサラ、Pharmacia社)にアプライした。モノシアル化ガングリオシドはさらにシリカカラム(SH-044-10、300mmx22mm(内径)、孔径:120Å、粒子径:10μm)(日本国、京都府、Yamamura Ltd.製)を用いたHPLCで分離した。約150mgのモノシアル化ガングリオシドをそれぞれアプライし、直線的な溶出グラジエント(クロロフォルム/メタノール/水を60/35/8〜10/10/3、4ml/分、240画分)を用いた。
【0066】
部分酸加水分解 − ガングリオシドの脱シアル化は、100℃の1.5% CH3COOH水溶液中で行い、その後、得られた産物をNaOHで中和し、窒素下で乾燥した。炭水化物骨格の部分分解には、沸騰水浴中で0.5M HClを用いて7分間加水分解を行った。その後、得られた産物を中和し、C/M/H2O,(8:4:3,v/v)2で分配した。下相を回収し、窒素下で蒸発し、回収した糖脂質を分析に用いた。
【0067】
酵素加水分解による、ヘキサグリコシルセラミドからのペンタグリコシルセラミドの調製 − ヘプタグリコシルセラミド(4mg、ウサギ胸腺由来)(構造1、表1)の酸性脱シアリル化(上記参照)によって得られたヘキサグリコシルセラミド(構造2、表1)をC/M(2:1)に再溶解し、小さなシリカゲルカラム(0.4x5cm)にアプライした。このカラムはC/M/H2O(60:35:8,v/v)で溶出した。1本が約0.2mlの画分を複数回収し、炭水化物の存在を試験した。回収したヘキサグリコシルセラミド(2.0mg)は1.5mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.2(1.5mg/mlタウロデオキシコレートナトリウム、0.001M MgCl2およびβ−ガラクトシダーゼ(E. coli、2−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシドを基質として測定した活性が500U)を含有)に溶解し、サンプルを37℃で一晩インキュベートした。次に、C/M/H2O(10:5:3)を用いて分画し、下相に含まれる糖脂質をシリカゲルクロマトグラフィ(0.4x5cmのカラム)を用いてヘキサグリコシルセラミドについて上述した方法で精製した。混入している界面活性剤を全て除去するために、クロマトグラフィを2回繰り返した。最終的に回収したペンタグリコシルセラミドは0.7mgであった。
【0068】
糖脂質のエンドグリコシルセラミダーゼによる消化( Ito と Yamagata, 1989 ) − 反応混合物は、200μgの糖脂質、80μgのタウロデオキシコレートナトリウムおよび0.8mUの酵素を160μlの50mM酢酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものだった。サンプルは37℃で一晩インキュベートし、その後、水(140μl)とC/M(2:1,容量比,1500μl)を加え、振とうした後、遠心分離に付した。上相は窒素下で乾燥し、少量の水に再度溶解し、水で飽和させたSephadex G-25カラム(0.4x10cm)を用い、水で溶出することで脱塩した。1本が約0.1mlの画分を複数回収し、そこに含まれる糖の存在を試験した。
【0069】
糖質のパーメチル化 − パーメチル化はLarson et al., 1987に従って行った。NeedsとSelvendran 1993にて推奨されているように、ヨウ化メチルを加える前に水酸化ナトリウムをサンプルに加えた。いくつかの実験においては、糖質はメチル化の前にNaBH4で還元した。この場合、ヨウ化メチルの終濃度がDMSO(ジメチルスルフォキシド)/ヨウ化メチルが1:1となるようにヨウ化メチルの量を増加した(HanssonとKarlsson, 1990)。
【0070】
ガスクロマトグラフィー/マススペクトル分析 − ガスクロマトグラフィーはon−カラム(on-column)インジェクターとフレームイオン化検出器を設置したHewlett-Packard 5890AシリーズIIガスクロマトグラフィー装置で行った。パーメチル化オリゴ糖は、架橋PS264(フィルム厚:0.03μm)でコートされた溶融シリカキャピラリーカラム(11mx0.25mm(内径))(Fluka製)を用いて分析した。サンプルは酢酸エチルに溶解し、on−カラムに80℃で注入した。温度は80℃から390℃に10℃/分で昇温し、390℃に2分維持するようにプログラムされていた。パーメチル化オリゴ糖のガスクロマトグラフィー/マススペクトル分析はJEOL SX-102マススペクトルに接続されたHewlett-Packard 5890AシリーズIIガスクロマトグラフィー装置を用いて行った(HanssonとKarlsson, 1990)。FAB-MS分析はJEOL SX-102マススペクトルで行った。陰イオンFABスペクトルはXe原子砲撃(10 kV)およびマトリックスとしてトリエタノールアミンを用いて得た。
【0071】
NMRスペクトル分析 − プロトンNMRスペクトルは11.75TでJeol Alpha 500(日本国、東京、日本電子製)を用いて記録した。サンプルは分析前に重水素で置換しておき、スペクトルは30℃において、デジタル解像度が0.35Hz/ptの条件下で記録した。化学シフトは内部溶液シグナルを用いてTMS(テトラメチルシラン)に対する相対値として示した。
【0072】
分析的酵素試験 − Oxford GlycoSystemsの酵素試験を、終濃度が0.3%となるようにTriton X-100を各インキュベーション混合物に加える以外は製造者の推奨する方法に従って行った。シアリダーゼとβ4−ガラクトシダーゼの混合物を消化に用いる場合には、β4−ガラクトシダーゼキットのインキュベーション用緩衝液を用いた。β-ヘキソサミニダーゼが消化混合物に含まれる場合には、この酵素キットの緩衝液を用いた。インキュベーション混合物の酵素濃度は以下の通りである:Hexβ4HexNAc−ガラクトシダーゼ(S. pneumoniae)は80mU/ml、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ(S. pneumoniae)は120mU/ml、シアリダーゼ(Arthrobacter ureafaciens)は1U/ml。基質の濃度は約20μMだった。酵素消化は37℃で一晩行った。消化後のサンプルは乾燥し、C/M/H2O(60:30:4.5、容量比)で飽和させた小さなSephadex G-25カラム(0.3g)で脱塩した(WellsとDittmer, 1963)。各サンプルは同じ溶媒2mlに溶解したものをカラムにアプライし、2.5mlのC/M/H20(60:30:4.5)および2.5mlのC/M(2:1)で溶出した。アプライした溶液および洗浄液を回収し、窒素下で蒸発させた。
【0073】
その他の分析方法 − ヘキソースはDubois et al. 1956に従って検出した。
【0074】
脱−N−アセチル化 − GlcNAc/GalNAc残基のアセトアミド成分のアミンへの変換は、公知の記載(Angstrom et al., 1998)に従って、種々のグリコスフィンゴ脂質を無水ヒドラジンで処理することで行った。
【0075】
細菌の培養 − ヘリコバクター ピロリは15%(容量比)のグリセロールを含有するトリプシン ソイブロス中で−80℃で保存した。細菌は初めにGAB−CAMPアガー(Soltesz et al., 1988)中で湿度98%の微好気条件下(O2:5〜7%、CO2:8〜10%およびN2:83〜87%)、37℃で48〜72時間培養した。標識する際には、コロニーをGAB−CAMPアガーに接種したが、図1に示した結果を得る際には代わりにブルセラアガー(ミシガン州、デトロイト、Difco製)を用いた。0.5mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、pH7.3で希釈した50μCiの35S−メチオニン(英国、Amersham製)をプレートの上から振り掛けた。37℃の微好気条件下で12〜24時間インキュベートした後、細胞をそぎ取り、PBSで3回洗浄し、1x108CFU/mlとなるようにPBSに再懸濁した。この方法の代わりに、10%熱不活化ウシ胎児血清(Sera-Lab製)を添加したハムF12培地(英国、Gibco BRL製)にコロニーを接種した。標識には、培地10ml当たり50μCiの35S−メチオニンを添加し、振とうしながら微好気条件下で24時間インキュベートした。細菌を遠心分離で回収し、培養物の純度と球状細胞が低濃度であることは位相差顕微鏡で確認した。PBSで2回洗浄した後、1x108CFU/mlとなるようにPBSに再懸濁した。いずれの標識方法で得られる懸濁液も、比活性がヘリコバクター ピロリ100体あたり約1cpmとなった。
【0076】
TLCバクテリアオーバーレイアッセイ − クロロフォルム/メタノール/水 60:35:8(容量比)の溶媒系を用い、ガラスまたはアルミで裏打ちされたシリカゲル60HPTLCプレート(ドイツ国、ダルムシュタット、Merck製)で薄層クロマトグラフィを行った。化学的検出はアニサアルデヒド染色(Waldi, 1962)で行った。バクテリアオーバーレイアッセイは公知の方法(Hansson et al., 1985)で行った。グリコスフィンゴ脂質(1〜4μg/レーン、または図の判例に示した濃度)をアルミで裏打ちされたシリカゲルプレートによるクロマトグラフィに付し、ジエチルエーテル/n−ヘキサン1:3(容量比)を用いた0.3〜0.5%ポリイソブチルメチルメタクリレート溶液で1分間処理し、乾燥した後、2%ウシ血清アルブミンと0.1%Tween20を含有するPBSに2時間浸漬した。放射線標識された細菌(PBSで1x108CFU/ml、且つ1〜5x106cpm/mlとなるように希釈したもの)をクロマトグラムに振り掛けて2時間インキュベートし、次いで、PBSで繰り返し濯いだ。クロマトグラムを乾燥させた後、XAR-5X線フィルム(米国、ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak Co.,製)に12〜100時間露光した。
【0077】
結果
ヘプタグリコシルセラミドであるNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerはウサギ胸腺より上述した方法に従ってHPLCで精製した。構造は、NMRおよびマススペクトルで特徴付けた(データは示していない)。七糖ガングリオシドは、本願発明者らの試験した大部分の単離ヘリコバクター ピロリ株(約60株)に結合した。
【0078】
ヘプタグリコシルセラミド材料中に存在する可能性のある微量の異性体成分を検出するために、ガングリオシドを脱シアル化し、エンドグリコセラミダーゼで処理し、その後、放出されたオリゴ糖をパーメチル化し、ガスクロマトグラフィおよびEI/MSで分析した(図1)。予想される炭水化物配列Hex-HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hexを有する2つの糖質を六糖領域から同定し、それらをm/z219、464、668、913および1118のフラグメントイオンによって確認した。メチル化の前に(NaBH4による還元によって)炭水化物がアルジトールに変換された場合には、既に記載されているイオンの他に、はっきりとしたフラグメントイオンがm/z235、684および1133に検出された(データは示さない)。全材料の90%以上を占めた主要な糖質(ピークB、図1)は、m/z 182に見られる強いフラグメントイオンによって特徴付けられ、β4GlcNAc(ネオラクト系列、2型炭水化物鎖)の存在を証明した。小さな糖質(ピークA、図1)は1型鎖(ラクト系列)の典型的なスペクトルを示し、m/z 182の非常に弱いフラグメントイオンとm/z 228の強いフラグメントイオンが検出された。調製物は、さらにトレース量のその他の糖陽性の物質を含んでおり、これは同じ系列の四糖含有糖類および五糖含有糖類である可能性がある。フコース含有糖類は混合物に存在しなかった。アシアロガングリオシドの純度はFAB/MSおよびNMRスペクトロスコピーで試験した。ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンFAB/MS(図2A)は予想した炭水化物配列を証明し、セラミド類は主としてスフィンゴシンとC16:0脂肪酸(m/z 536.5)からなることを示した。ヘキサグリコシルセラミドに対して得られたNMRスペクトル(図3A)はβ−カップリングを有するアノマー領域(J〜8Hz)に対して4つの主要なダブレットを示した。これらの強度比は2:2:1:1であった。4.655ppm(GlcNAcβ3)、4.256ppm(内部Galβ4)、4.203ppm(末端Galβ4)および4.166ppm(Glcβ)は既にnLcOse6-Cerについて報告されている結果(Clausen et al., 1986)と符合していた。さらに小さなダブレットが4.804ppmに検出され、これは1.81ppmの小さなメチルシグナル(大きな2型メチル共鳴の肩に見られるもの)と共に1型鎖の小さな画分の存在を示した。4.15〜4.25ppmの領域における重なりのために、この1型結合の位置と分布を決定することはできなかった。1型結合の全量は約10%だった。ヘキサグリコシルセラミドをβ−ガラクトシダーゼで消化して得たペンタグリコシルセラミドに含まれる1型鎖も約5%(図3B)であり、1型結合は糖鎖内部領域および外部領域において均等に分布されている、即ち、糖脂質の約5%が1型−1型であると考えられる。
【0079】
糖脂質の結合活性が主要なネオラクト(2型)構造と関連しているかを調べるためにアシアロ−糖脂質をβ4−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼで処理し、処理産物をTLCおよびオーバーレイ試験によって検討した(図4)。予想した通り、最初の酵素はヘキサグリコシルセラミドをペンタグリコシルセラミドに変換し(A、レーン3)、2つの酵素の混合物はラクトシルセラミドに分解した(B、レーン6)。TLCプレートを目視で観察したところ、いずれの反応も完全またはほぼ完全であった。同様の結果がシアリダーゼ処理産物および酸処理産物についても得られた。ヘキサグリコシルセラミドのβ4−ガラクトシダーゼ分解は、TLCプレート上の糖脂質の対応領域のヘリコバクター ピロリ結合活性の消失を伴い、同時にペンタグリコシルセラミド中の領域における強い活性の出現が見られた(C、レーン3)。更なるペンタグリコシルセラミドの酵素分解の結果、この領域における結合活性は消失した。四糖領域における結合活性の出現は見られなかった。TLCプレートの化学染色に対する感度は、全てのトレース量の物質を視覚化するには低かった。
【0080】
別の実験において、親ガングリオシドを部分酸分解に付し、放出された糖脂質のヘリコバクター ピロリ結合活性を検討した。図5は加水分解物のTLC(A)と35Sで標識したヘリコバクター ピロリを加水分解物にオーバーレイしたオートラジオグラム(B)を示す。ヘキサ−、ペンタ−、テトラ−およびジ−グリコシルセラミド領域に位置する糖脂質は結合活性を示したが、トリグリコシルセラミドは不活性であった。
【0081】
少なくとも3種のヘリコバクター ピロリ株(17875株、002株と032株)で試験したヘキサ−、ペンタ−およびテトラ−グリコシルセラミドの結合活性は同等であった。
【0082】
ヘキサグリコシルセラミドから末端ガラクトースを外し、シリカゲルクロマトグラフィで精製した強い結合を示すペンタグリコシルセラミドについて詳細に検討した。この糖脂質の陰イオンFAB/MSスペクトルから炭水化物配列がHexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex-であることが確認され、ヘキサグリコシルセラミドと同じセラミド組成物が見られた(図2B)。ペンタグリコシルセラミドより得られたプロトンNMRスペクトル(図3B)にはアノマー領域中に5つの主要なβ−ダブレット、即ち、4.653ppm(内部GlcNAcβ3)、4.615ppm(末端GlcNAcβ3)、4.261ppm(2倍強度、内部Galβ4)および4.166ppm(Glcβ)が検出された。これらはGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerと符合し、末端Galβを失った六糖化合物とも一致した。さらに小さなβ−ダブレットが、3置換GlcNAcβ(1型鎖)に対応する4.787ppmに検出された。予想したメチルシグナルはより大きな1.82ppmのメチルシグナルの肩に見られたが、ピークの重なりがこれらシグナルの定量を妨げた。アノマープロトンの積分値から計算したところ、糖脂質の約6%が1型鎖であった。従って、2型と1型炭水化物鎖の相対比は六糖糖脂質のそれと同様であった。ヘキサグリコシル画分およびペンタグリコシル画分の両方についてTLCプレートに見られる2つのスポットは、β4−ガラクトシダーゼに対する感受性から判断して、糖鎖の組成による差ではなくセラミドの多様性を反映していた。上方のペンタ領域のスポットは、アシアロガングリオシドの非選択的加水分解およびアシアロ産物からの4−結合ガラクトース選択的開裂の両方の場合に出現した。さらに、上方のクロマトグラフィ副画分を有するヘキサグリコシルセラミドをβ4−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼで分解した場合には、得られるラクトシルセラミドは2つの明確なクロマトグラフィ上のバンドを示した。クロマトグラフィ上では相同なヘキサグリコシルセラミドは1つのラクトシルセラミドバンドについてのみ得られた。ペンタ領域の上方および下方の副画分はいずれもオーバーレイ試験で高い活性を示した。
【0083】
ネオラクト系列の六糖、五糖または四糖のグリコスフィンゴ脂質(構造2、4と5、表1)は、TLCオーバーレイ法による準定量試験によって試験した。糖脂質の希釈系列をシリカゲルプレートにアプライし、ヘリコバクター ピロリに対する結合を標識した細菌のオーバーレイおよびオートラジオグラフィ後に目視で評価した(図6)。最も活性の高い種はペンタグリコシルセラミドであり、少なくとも0.039nmol/スポット(7回の実験の平均値、標準偏差はδn-1=0.016nmol)の陽性反応をTLCプレート上で示した。ヘキサ−およびテトラ−グリコシルセラミドはそれぞれ約0.2と0.3nmolの糖脂質/スポットのヘリコバクター ピロリを結合した。
【0084】
試験した系列において、高次糖脂質類に対するヘリコバクター ピロリの結合は非常に再現性が高かった。ペンタグリコシルおよびヘキサグリコシルセラミドに対して記録されたヘリコバクター ピロリ032株の結合頻度は〜90%(プレートの合計数は約100)だった。
【0085】
イソレセプターの存在と結合特異性を明示した結合アッセイ(図7)
ウサギ胸腺由来のネオラクトコアを有する七糖グリコスフィンゴ脂質であるNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよびそこから誘導したテトラ〜ヘキサグリコシルセラミドの他に、ネオラクト系列の他の糖脂質類に対しても結合特異性は存在した。
【0086】
薄層プレートで分離した精製グリコスフィンゴ脂質に対するヘリコバクター ピロリ(032株)の結合をオーバーレイアッセイで検出した結果を図7に示した。これらの結果は、他の精製グリコスフィンゴ脂質に関する結果と共に表2にまとめた。ヘリコバクター ピロリのネオラクトテトラオシルセラミドに対する結合(レーン1)ならびにNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerから誘導した五糖および六糖グリコスフィンゴ脂質に対する結合(レーン5と6)は、上記の結果と同一であった。しかし、予想に反し、結合はGalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(x2グリコスフィンゴ脂質、レーン7)および脱フコシル化A6-2グリコスフィンゴ脂質GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(no.12、表2)にも見られた。Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(B5グリコスフィンゴ脂質、レーン2)も結合活性を有するという結果と合わせて、これらの結果は、各グリコスフィンゴ脂質にそれぞれ特異的な付着因子が複数存在するのではなく、交差結合の可能性を示した(下記参照)。さらに、上述した異なるグリコスフィンゴ脂質含有五糖の伸長物の中で細菌付着因子によって許容されたものはGalβ4が胸腺由来GlcNAcβ3−末端化合物に結合したものだけだった(レーン6)。従って、その他の伸長構造であるNeu5Ac-x2(レーン8)とGalNAcβ3-B5(no.25、表2)は結合を示さなかった。B5の内部GlcNAcβ3のアセトアミド基は結合に必須であり、この成分の無水ヒドラジンによる脱−N−アセチル化は結合の完全な消失を招いた(レーン3)。これはネオラクトテトラオシルセラミドを同様に処理した場合と同じであった(no.6、表2)。
【0087】
上述したように、4種の結合活性を有する五糖グリコスフィンゴ脂質(no.10〜13、表2)が存在し、いずれもネオラクトコアを有することは、分析結果の裏に潜んだ理由が同じ付着部位に対する交差結合であることを示唆した。
【0088】
ネオラクト結合エピトープの脱線状化 ウサギ胸腺の七糖化合物を化学的および酵素学的に分解して得た構造体(no.1、5、10と21、表2)の相対結合強度は、三糖配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3が最小結合配列を構成する可能性を示唆した。従って、六糖化合物においては、末端Galβ4による阻害効果が予想され、ネオラクトテトラオシルセラミドにおいては、エピトープの3つの糖のうち2つしか存在しないので、末端GlcNAcβ3の欠失は結合強度を低下させると考えられる。内部GlcNAcβ3の必要性は、アセトアミド基を脱−N−アセチル化してアミンにしたネオラクトテトラオシルセラミドおよびB5(no.6と14、表2)が共に細菌に対する結合を失ったことによって明示される。この結合性の欠失は、付着因子とアセトアミド成分との好ましい相互作用の欠失および/またはこれらグリコスフィンゴ脂質の好ましい立体配座の変化によって生じると考えられる。しかし、内部Galβ4の配置の変化によって結合エピトープに対する接触に立体障害が生じる状況を描くことは難しい。従って、最小結合配列がGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3配列を含まなければならないことを確立したので、今度は、P1、H5-2および2つのシアリルパラグロボシド構造(no.15、18〜20、表2)が結合性を欠く理由は、これら伸長物が提案した結合エピトープに直接干渉するという考えによって合理化するのは容易である。さらに、ウシ バターミルク由来のグリコスフィンゴ脂質(Teneberg et al., 1994)、即ちネオラクトテトラオシルセラミドの内部Galβ4にβ6−結合した側鎖Galβ4GlcNAcβ(no.26、表2)は、結合エピトープへの接触がブロックされているために結合しない。
【0089】
表2の種々の結合活性五糖配列の伸長物は、胸腺由来構造においてはGalβ4の付加のみが許容されることを示し、これは4−OHの位置が赤道配座でも軸配座でもよく、それに続く立体障害による結合親和性の欠失を示した。Neu5Acα3のx2への付加や、GalNAcβ3のB5への付加の結果、結合は完全に失われる(no.24と25、表2)。さらに、H5-2におけるFucα2単位の負の影響は、ヘリコバクター ピロリがA6−2とB6−2(no.22と23、表2)の両方に結合しないことによって確認された。B5と同じ三糖が末端にある伸長構造(no.28、表2)については、2つ目の内部結合エピトープが存在するにもかかわらず、B5と同様に、この末端三糖が観察された結合を担っていた。しかし、五糖配列に関してウサギ胸腺由来六糖化合物に観察された結合強度と同様に、最後から2番目のGalβ4が結合強度を低下させることが予想されるので、内部エピトープに対する結合は排除される可能性が高い。ウサギ胸腺由来七糖化合物のシアル酸残基は本願で用いた細菌株による結合に影響を与えないので、この結果から、エピトープ領域外に存在するはずであることを指摘しておく。シアル酸依存性または非依存性のヘリコバクター ピロリの結合が得られるかどうかは、バクテリアの株と培養条件の両方に依存する(Miller-Podraza et al., 1996,1997a,b)。
【0090】
以上をまとめると、ネオラクト系列のグリコスフィンゴ脂質の結合エピトープは、最大活性を得るためには三糖配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3を含まなければならない。本願で用いた潜在的なイソレセプターの結合パターンの比較から演繹されることは、重要ではない末端GlcNAcβ3のアセトアミド基と同じ残基の4-OHを除けば、大部分の三糖は結合を生じるために重要である。結合特異性を立証する分子モデリングの結果は、別件として発表する。
【0091】
β3ガラクトシダーゼを用いたレセプターアナログの製造方法の一例
六糖であるGalβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(1mg)(英国、Dextra labs製)を400mUのβ3/6ガラクトシダーゼ(米国、カリフォルニア州、Calbiochem製)で製造者の推奨する方法に従って一晩処理した。HPLC精製工程後に0.6mgの五糖を得た。この糖をマススペクトルで分析したところ、純度は98%を超えていた。五糖の一部およびマルトへプタオース(米国、セントルイス、Sigma製)をシアノボロハイドライドを用いて4−ヘキサアデシニルアニリン(HDAと略す、スウエーデン国、ストックホルム、Aldrich製)で還元的にアミン化した(Halina Miller-Podraza, いずれ発行される)。産物をマススペクトルで特徴づけ、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA および マルトへプタオース(red)-HDA[“(red)-”は糖質の還元末端グルコースおよびヘキサアデシニルアニリン(HDA)のアミン基の還元的アミン化によって得られたアミン結合構造である]ことが確認された。化合物GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDAは、上述したTLCオーバーレイアッセイにおいてヘリコバクター ピロリに対して観察可能な結合活性を示したが、一方、マルトへプタオース(red)-HDAは全く不活性であった。この例は四糖であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galがヘリコバクター ピロリに結合する構造であることを示す。還元によってGlc-残基のピラノース環構造が壊れるので還元末端Glc-残基は結合には必要ないと考えられる。
【0092】
病原性因子に対するグリカンレセプターを生じる反応の例
a)Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、
Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよび
Neu5Acα3Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCerを0.1M HClで酸加水分解して、グリコスフィンゴ脂質である
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよび
Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCerをそれぞれ形成する。
b)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerから
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerを形成する。
c)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerから
Galβ4GlcβCerを形成する。
d)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerから
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerを合成する。
e)血液型のB型抗原(Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ-)を含むヒト赤血球から
Galα3Galβ4GlcNAcβ-を形成する。
【0093】
ヘリコバクター ピロリと多糖組成物との結合に関する例
多糖組成物を薄層プレートにスポットし、放射線標識された細菌を用いたオーバーレイアッセイを図8に示すように行った。使用した多糖はZooglea ramigera由来多糖、キトサン、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸であった。アミン含有分子、例えばキトサンおよび星型デンドリマー(64個の1級アミノ基を有する)はTLCプレートに強固に結合することが知られており、実験中に部分的に放出させることが可能な酸性多糖の混合物としても用いた。キトサンに対する結合は単なる非特異的電荷依存現象ではないことを示すための対照としてもデンドリマーを用いた。17874株細菌および17875株細菌のそれぞれを用いることで、二つの独立した実験を行った。ヘリコバクター ピロリは量依存的にZooglea ramigera由来多糖に結合し(スポットA1およびスポットB5)、キトサンとの結合体(C9)にも結合し、おそらく弱い結合でデンドリマーとの結合体にも結合した(図8A、スポットD13)。ヘリコバクター ピロリは中性キトサン酢酸塩にも強固にそして量依存的に結合した(スポットA2、スポットB6およびスポットC10)。ヒアルロン酸の場合には、キトサンとの結合体以外のものとの結合は非常に弱く、おそらくヒアルロン酸の一部がスポットから拡散し、結合が弱まったためであると考えられる。はっきりとしているが、始めの二つの多糖よりも弱い結合がコンドロイチン硫酸およびコンドロイチン硫酸とキトサンとの結合体についても観察され(スポットA4およびスポットC12)、スポットの拡散によって結合が弱められたとも考えられる。ここで用いた実験条件では、アミンデンドリマーに対する結合は観察できなかった。
【0094】
【表1】
【0095】
【表2】
【0096】
表2の脚注
a グリコスフィンゴ脂質の略記命名法は近年推奨されている方法(Nomenclature of glycolproteins, 1988)に従った。
b グリコスフィンゴ脂質の原料は、次の略語を用いて示した:RT、ウサギ胸腺;HE、ヒト赤血球;RE、ウサギ赤血球;HM、ヒト胎便;RCC、ラット結腸癌;BB、ウシ バターミルク;DSI、イヌ小腸。
c 結合強度は以下のように定義した:「+」はグリコスフィンゴ脂質を4μgアプライしたTLCプレートのオートラジオグラムが有意に黒くなったことを示し;「−」は結合がないことを示し;「(+)」は「+」と「−」の中間程度にオートラジオグラムが黒くなったことを示す。
d No.27を穏やかな酸加水分解に付し、続いてβ−ガラクトシダーゼで処理してNo.10を調製した。
e グリコスフィンゴ脂質No.3、6、8および14は、無水ヒドラジンを用いた処理により、それぞれNo.2、5、7および13から調製した。
f No.19のノイラミニダーゼ処理により調製した。
g ヒト脳由来GM1ガングリオシドの穏やかな酸加水分解により調製した。
h No.22を0.05M HCl中、80℃で2時間インキュベートすることにより調製した。
【0097】
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【図面の簡単な説明】
【0098】
【図1A】ヘキサグリコシルセラミドをエンドグリコセラミダーゼで消化して得たパーメチル化オリゴ糖のEI/MS。上の図はオリゴ糖のガスクロマトグラムであり、下の図はガスクロマトグラムのピークAのEI/MSスペクトルである。
【図1B】図1Aに示したガスクロマトグラムのピークBのEI/MSスペクトルである。
【図2A】ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンFABマススペクトルである。
【図2B】ペンタグリコシルセラミドの陰イオンFABマススペクトルである。
【図3A】六糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンNMRスペクトルであり、微量な1型成分に対して良好なシグナル/ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図3B】五糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンNMRスペクトルであり、微量な1型成分に対して良好なシグナル/ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図4】ウサギ胸腺グリコスフィンゴ脂質の酵素分解を示す。シリカゲルの薄層プレートはC/M/H2O(容量比は60:35:8)で展開した。AとBは4−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Cは35Sでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン1:ヘプタグリコシルセラミド(構造1、表1)、レーン2:脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド(酸処理後に得たもの)、レーン3:β4−ガラクトシダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン4:シアリダーゼおよびβ4−ガラクトシダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド、レーン5:ヒト赤血球由来の参照用グリコスフィンゴ脂質類(ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミドおよびグロボシド)、レーン6:β4−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン7:シアリダーゼ、β4−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド。
【図5】ウサギ胸腺ヘプタグリコシルセラミド(構造1、表1)の部分酸加水分解後に得たTLC産物を示す。展開溶媒は図4と同じである。Aは4−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Bは35Sでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン1:ヘプタグリコシルセラミド、レーン2:脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド(酸処理後)、レーン3:ペンタグリコシルセラミド、レーン4:加水分解物、レーン5:参照用グリコスフィンゴ脂質類(図4と同じ)。
【図6A】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。TLCプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図4と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ヘキサグリコシルセラミドおよびペンタグリコシルセラミド(構造2と3、表1)を用い、各糖脂質の量(pmol)はレーン1:1280、レーン2:640、レーン3:320、レーン4:160、レーン5:80、レーン6:40、レーン7:20とした。
【図6B】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。TLCプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図4と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ペンタグリコシルセラミドおよびテトラグリコシルセラミド(構造2と3、表1)を用い、各糖脂質の量(pmol)はレーン1:1280、レーン2:640、レーン3:320、レーン4:160、レーン5:80、レーン6:40、レーン7:20とした。
【図7】Aは4−アニサアルデヒドで検出した分離グリコスフィンゴ脂質を示す薄層クロマトグラムであり、Bはそこに放射線標識したヘリコバクター ピロリ032株を結合させた分離グリコスフィンゴ脂質を示すオートラジオグラムである。アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル60HPTLCプレート(Merck製)上で、クロロフォルム/メタノール/水の容量比が60:35:8の溶媒系を用いてグリコスフィンゴ脂質を分離した。結合アッセイは、「材料と方法」の欄で記載したように行った。オートラジオグラフィは72時間行った。各レーンは以下のグリコスフィンゴ脂質を含んでいた: レーン1:Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(ネオラクトテトラオシルセラミド)、4μg; レーン2:Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(B5グリコスフィンゴ脂質)、4μg; レーン3:Galα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer、4μg; レーン4:Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(B6 2型 グリコスフィンゴ脂質)、4μg; レーン5:GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、4μg; レーン6:Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、4μg; レーン7:GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(x2グリコスフィンゴ脂質)、4μg; レーン8:Neu5Acα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Neu5Ac-x2)、4μg; レーン9:Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(H5 2型 グリコスフィンゴ脂質)、4μg;そして レーン10:Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(シアリルネオラクトテトラオシルセラミド)、4μg。グリコスフィンゴ脂質の材料は表2と同じである。
【図8】多糖に対するヘリコバクター ピロリの結合を検討するための薄層クロマトグラムであり、Aは放射線標識したヘリコバクター ピロリ17875株を結合させた後のオートラジオグラムであり、Bは放射線標識したヘリコバクター ピロリ17874株を結合させた後のオートラジオグラムである。結合アッセイは糖脂質の場合と実質的に同様に行ったが、多糖はプレート上にスポットしただけであり、溶媒を用いたクロマトグラフィは行っていない。オートラジオグラフィは90時間行った。スポットは以下の多糖を含んでいた: スポットA1:Zooglea ramigera由来多糖、3μg; スポットA2:キトサン、3μg; スポットA3:ヒアルロン酸、3μg; スポットA4:コンドロイチン硫酸、3μg; スポットB5:Zooglea ramigera由来多糖、0.6μg; スポットB6:キトサン、0.6μg; スポットB7:ヒアルロン酸、1.5μg; スポットB8:コンドロイチン硫酸、0.6μg; スポットC9:Zooglea ramigera由来多糖、2μg + キトサン、2μg; スポットC10:キトサン、2μg; スポットC11:ヒアルロン酸、2μg + キトサン、2μg; スポットC12:コンドロイチン硫酸、2μg + キトサン、2μg; スポットD13:Zooglea ramigera由来多糖、2μg + デンドリマー、2μg; スポットD14:デンドリマー、2μg; スポットD15:ヒアルロン酸、2μg + デンドリマー、2μg;そして スポットD16:コンドロイチン硫酸、2μg + デンドリマー、2μg。
Claims (36)
- ヘリコバクター ピロリに対するレセプター活性を有する多糖を含む組成物であって、更に所望により、ヘリコバクター ピロリに対するオリゴ糖レセプターあるいはその類似体または誘導体および/または胃上皮保護化合物も含む、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療または予防に用いる組成物。
- 該レセプター活性を有する多糖が、キトサン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、フコシル化コンドロイチンまたはヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 該レセプター活性を有する多糖が微生物由来多糖であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 該オリゴ糖レセプターが、下記式(I)で表されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u (I)
(式中、p、r、sおよびuは各々独立に0または1の整数であり、yは3位または4位の結合位置を表し、zは3位または4位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
pが1であり、且つ、yが3である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、rは1であり;
pが1であり、且つ、yが4である場合には、HexはGlcβであり、rは1であり;そして
pが0であり、且つ、zが4である場合には、HexはGalβであり、rは1である。) - 該レセプター活性を有する多糖が、多糖と、ヘリコバクター ピロリに対するオリゴ糖レセプターあるいはその類似体または誘導体とを含む結合体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 該結合体が、請求項4で定義したオリゴ糖レセプターを含み、該オリゴ糖レセプターがスペーサー分子を介して多糖に共有結合していることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
- 該レセプター活性を有する多糖が、アミン含有多糖と、酸性多糖またはその断片とを含む結合体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 該アミン含有多糖が、キトサンであることを特徴とする、請求項7に記載の組成物。
- 該オリゴ糖レセプターが、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
Galβ4Glc, GalNAcβ4Galβ4GlcNAc,
GalNAcβ4Galβ4Glc, Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc,
Galβ3GlcNAc, Galβ4GlcNAc, Galα3Galβ4GlcNAc, Galβ3Galβ4GlcNAc,
Galα3Galβ4Glc, Galβ3Galβ4Glc, GalNAcα3Galβ4GlcNAc,
GalNAcβ3Galβ4GlcNAc, GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc,
Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(NAc)0-1, Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(NAc)0-1,
Glc(NAc)0-1α3Galβ4Glc(NAc)0-1, Glc(NAc)0-1β3Galβ4Glc(NAc)0-1,
Galβ4Glc(NAc)0-1β, Galβ3GlcNAcβ, Galα3Galβ4GlcNAcβ,
GalNAcαGalβ4GlcNAcβ, GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ, そして
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ 。 - 該オリゴ糖レセプターが、ルイスb糖配列、NeuNAcα3GalまたはNeuNAcα6Galであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- ヘリコバクター ピロリに対する該オリゴ糖レセプターが、糖脂質または糖タンパク質の一部であることを特徴とする、請求項1〜6および9〜10のいずれかに記載の組成物。
- 該胃上皮保護化合物が、酸性多糖またはアミン含有多糖であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の組成物。
- 該酸性多糖が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパリノイド、カラゲナン、デキストラン硫酸、硫酸セルロース、硫酸澱粉、硫酸化アミロペクチン、フコイダンあるいは酸性のまたはグルクロン酸含有の細菌性多糖であることを特徴とする、請求項12に記載の組成物。
- 該胃上皮保護化合物が胃のpHを制御する薬物であり、該薬物は、胃のpHを緩衝化または中和する化合物、胃酸から胃上皮を保護する化合物、またはプロトンポンプを阻害する化合物を含有することを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の組成物。
- 該胃のpHを制御する薬物が、オメプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、ヒスタミンレセプター拮抗剤またはスクラルファートであることを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
- ヘリコバクター ピロリに対する該オリゴ糖レセプターが、該レセプター活性を有する多糖に共有結合していることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 該レセプター活性を有する多糖と共に該オリゴ糖レセプターを含むことを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の組成物。
- 該レセプター活性を有する多糖と共に該胃上皮保護化合物を含むことを特徴とする、請求項1〜3および12〜15のいずれかに記載の組成物。
- キトサンと共に酸性多糖またはその断片を含むことを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
- 下記式(II):
[Galβy]pHex(NAc) rα/βzGalβ4Glc(NAc)u (II)
(式中、p、rおよびuは各々独立に0または1の整数であり、yは3位または4位の結合位置を表し、zは3位または4位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、但し、
pが1であり、且つ、yが3である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、rは1であり、;
pが1であり、且つ、yが4である場合には、HexはGlcβであり、rは1であり;そして
pが0である場合には、zは4であり、HexはGalであり、rは1である。)
で表される末端オリゴ糖配列を含むことを特徴とする、糖鎖繰り返し単位から構成される多糖化合物。 - 該末端オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項20に記載の多糖化合物。
GalNAcβ4Galβ4GlcNAc, GalNAcβ4Galβ4Glc, Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcNAc,
Galα3Galβ4GlcNAc, Galβ3Galβ4GlcNAc, Galα3Galβ4Glc,
Galβ3Galβ4Glc, GalNAcα3Galβ4Glc(NAc)0-1,
Glc(NAc)0-1β3Galβ4Glc(NAc)0-1, そして Glc(NAc)0-1α3Galβ4Glc(NAc)0-1 。 - 請求項1〜21のいずれかの組成物または多糖化合物を、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療用薬物の製造に用いる方法。
- 慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、ヒトの胃における非ホジキンリンパ腫、胃腺癌、膵臓、皮膚、肝臓または心臓におけるある種の疾患、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)関連胃疾患、自己免疫性胃炎、悪性貧血、胃腺癌、MALTリンパ腫、薬物の副作用として誘発された胃疾患および乳幼児突然死症候群の治療に用いることを特徴とする、請求項1〜21のいずれかに記載の組成物または多糖化合物。
- 請求項1〜21のいずれかの組成物または多糖化合物を含む栄養補助剤、食品または飲料である食物。
- 該栄養補助剤が乳幼児食品用であることを特徴とする、請求項24に記載の食物。
- 医薬に用いることを特徴とする、請求項1〜21のいずれかに記載の組成物または多糖化合物。
- 副作用として胃疾患を誘発する薬物を包含し、請求項1〜21のいずれかの組成物または多糖化合物を更に包含する医薬組成物。
- 胃上皮の保護に用いることを特徴とする、請求項1〜21のいずれかに記載の組成物または多糖化合物。
- ヘリコバクター ピロリの結合に用いることを特徴とする、請求項1〜21のいずれかに記載の組成物または多糖化合物。
- ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療方法であって、医薬的効果を生じる量の請求項1〜21および28〜29のいずれかの組成物または多糖化合物を、治療の必要な対象物に投与する方法。
- ヘリコバクター ピロリに対するレセプター活性を有する多糖を製造する方法であって、多糖に1つまたは複数の単糖を転移するか、あるいは多糖から1つまたは複数の単糖残基をグリコシル基転移酵素を用いて除去することによって、レセプター活性を有するオリゴ糖配列を多糖鎖中に形成することを特徴とする方法。
- 該グリコシル基転移酵素が、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはトランスグリコシル化酵素であることを特徴とする、請求項31に記載の方法。
- 下記式:
[Gal(A)q(NAc)r /Glc(A)q(NAc)r α3/β3]s [Galβ4GlcNAcβ3]t Galβ4Glc(NAc)u
(式中、q、r、s、tおよびuは各々独立に0または1の整数である。)
で表されるオリゴ糖配列をオリゴ糖レセプターとして含む請求項1に記載の組成物または請求項5〜7のいずれかに記載の結合体、あるいは上記オリゴ糖配列を末端オリゴ糖配列として含む請求項21または22に記載の多糖化合物。 - 該オリゴ糖レセプターが、下記式のいずれかで表されるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物または請求項5〜7のいずれかに記載の結合体。
GalANAcβ3Galβ4GlcNAc, GalANAcα3Galβ4GlcNAc, GalAβ3Galβ4GlcNAc,
GalAα3Galβ4GlcNAc, GalANAcβ3Galβ4Glc, GalANAcα3Galβ4Glc,
GalAβ3Galβ4Glc, GalAα3Galβ4Glc,
GlcANAcβ3Galβ4GlcNAc, GlcANAcα3Galβ4GlcNAc, GlcAβ3Galβ4GlcNAc,
GlcAα3Galβ4GlcNAc, GlcANAcβ3Galβ4Glc, GlcANAcα3Galβ4Glc,
GlcAβ3Galβ4Glc, GlcAα3Galβ4Glc 。 - 該オリゴ糖レセプターが、下記式で表されるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物または請求項5〜7のいずれかに記載の結合体。
OSβ6Hex(NAc)n
(式中、nは0または1の整数であり、OSは本発明で開示したヘリコバクター ピロリに対するオリゴ糖レセプターである。) - 式中のOSが三糖エピトープであることを特徴とする、請求項35に記載の組成物。
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