CZ20013771A3 - Způsob diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií a souprava k jeho provádění - Google Patents

Způsob diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií a souprava k jeho provádění Download PDF

Info

Publication number
CZ20013771A3
CZ20013771A3 CZ20013771A CZ20013771A CZ20013771A3 CZ 20013771 A3 CZ20013771 A3 CZ 20013771A3 CZ 20013771 A CZ20013771 A CZ 20013771A CZ 20013771 A CZ20013771 A CZ 20013771A CZ 20013771 A3 CZ20013771 A3 CZ 20013771A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
marker protein
test kit
diagnostic test
bovine
ifnγ
Prior art date
Application number
CZ20013771A
Other languages
English (en)
Inventor
Matthias Giese
Mark Stephen Rogers
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Publication of CZ20013771A3 publication Critical patent/CZ20013771A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu diagnostiky přenosných spongiformních ecefalopatií a diagnostického testovacího kitu využívajícího protilátek specifických pro prionový protein a lamininový receptor. Vynález se také týká použití tohoto způsobu nebo testovacího kitu pro diagnostiku přenosných spongiformních ecefalopatií.
Dosavadní stav techniky
Před více než 250 lety bylo objeveno onemocnění ovcí, které je doprovázeno nervozitou, svěděním a ataxií, a nakonec vede k paralýze a smrti. Toto onemocnění je nyní známé v anglicky mluvících zemích jako „scrapie“ (protože zvířata se drbají o ohrady a stromy, aby ulevila svědění), ve Francií jako „la tremblante“ a v Německu jako „Traberkrankheit“. Tyto názvy odrážejí různost příznaků. „Scrapie“ byla zkoumána jako prototyp skupiny onemocnění, která postihují nejen zvířata, ale také lidi: přenosné spongiformní encefalopatie (transmissible spongiform encephalopathies = TSE). TSE jsou smrtelná neurodegenerativní onemocněni, která mohou napadat celou řadu savců.
Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) je neurodegenerativní onemocnění hovězího dobytka a je příbuzné onemocnění scrapie u ovcí a koz a Creutzfeldt-Jakobově nemoci u lidí. Při patogenezi těchto onemocnění hraje klíčovou úlohu hostitelem kódovaný, s membránou asociovaný glykoprotein neznámé funkce, tzv. prionový protein (prion protein) PrP. Tato buněčná isoforma je exprimována zvláště silně na neuronálních buňkách, ale může být také s různou •4 · · 44 · · »· * • 4 * • ···· 4
4·44 četností detekována na buňkách jiných než nervových. Tento membránový protein je citlivý (PrP-sen) na štěpení specifickými enzymy (proteázami). Rozpustná maligní forma PrP (PrP-res) je však na proteázy rezistentní a hromadí se v mozcích zvířat infikovaných BSE za vytváření amyloidních plaků. Tato forma PrP-res je spojena výlučně se všemi onemocněními TSE včetně BSE a může být extrahována z mozkové tkáně infikované TSE/BSE.
Neobvyklé vlastnosti patogenu scrapie/BSE umožnily v počátcích vznik spekulací, že patogen se skládá výlučně z nukleové kyseliny nebo proteinů, nebo neobsahuje ani nukleovou kyselinu ani proteiny, a jde o polysacharid nebo fragment membrány. Scénáře, o kterých se diskutuje v současnosti nejvíce, jsou hypotéza nazývaná „protein only“ a hypotéza virus/virino:
Hypotéza „protein only“ je založena na infekčním prionu PrP-res, který neobsahuje nukleovou kyselinu a má samoreplikační vlastnosti. Uvažuje se o tom, že PrP-res se váže na PrP-sen a převádí jej tak do maligní isoformy. Konformace této maligní isoformy se vyznačuje strukturami beta-skládaného listu, zatímco v buněčné isoformě převažují alfa-šroubovice. Hypotéza virus/virino je založena na infekčním agens, které se skládá z virové nukleové kyseliny (možná RNA), přičemž prionový protein tvoří obal virového genomu. Hostitelský původ prionového obalu by také vysvětloval nepřítomnost imunologických a zánětlivých reakcí. Existence nukleové kyseliny by navíc vysvětlovala 20 poněkud odlišných kmenů myší s chorobou scrapie, které byly dosud popsány.
Buněčná isoforma PrP-sen je glykosylována na dvou polohách asparaginu, má molekulovou hmotnost 33 až 35 000 je ukotvena na vnější povrch plasmatické membrány fosfatidyl-inositolovým glykolipidem, který je fixován na své karboxykoncové aminokyselině. Nejvyšší míra exprese glykoproteinu PrP-sen se naměří v mozku, ale tento gen je také exprimován v jiné než neuronální embryonální
-3· · ·· · · · · ·« • · * · «··· • ···· · · · · · · * • · · · « « · ··· · ··· ···· ·· ··· a dospělé tkáni. Biologická funkce tohoto proteinu není dnes stále ještě jasná. Mimo jiné se předpokládá, že PrP by mohl být receptor pro neurotropní diferenciační faktory. Tento protein byl také spojován s rytmem spánku/probouzení. PrP by však také mohl fungovat jako receptor pro neurotropní viry.
Normální buněčná isoforma (PrP-sen) tohoto proteinu je úplně degradována proteázamí. Maligní isoforma (PrP-res) je na druhé straně degradována proteázamí na fragment s molekulovou hmotností 27 až 30 000, který má stále ještě úplnou schopnost vyvolat infekci (PrP-res). PrP-res postrádá prvních 67 aminokyselin zralého proteinu PrP-sen. Posttranskripční proces souvisí s konverzí PrP-sen na PrP-res a existuje podezření, že jediným rozdílem mezi PrP-sen a PrP-res je rozdíl ve trojrozměrné struktuře. Zdá se, že neexistuje žádný biochemický rozdíl mezi normální a abnormální formou tohoto proteinu. To také vysvětluje, proč tyto dvě ísoformy nevykazují žádný rozdíl z hlediska antigenních vlastností. Navíc mají PrP-sen a PrP-res společnou aminokyselinovou sekvenci. PrP je kódován jedinou kopií chromosomálního genu a u savců je vysoce konzervovaný. Celá sekvence kódující PrP je obsažena v jediném exonu.
Narozdíl od PrP-sen, který je exprimován na povrchu, se PrP-res hromadí v cytoplasmatických váčcích, z nichž mnohé jsou sekundární lysozomy.
Onemocnění TSE jsou charakterizována dlouhou inkubační periodou, v jejímž průběhu nejsou pozorovány žádné klinické příznaky. Toto období je následováno krátkou klinickou fází, která nevyhnutelně vede ke smrti.
Scrapie a BSE byly dosud diagnostikovány použitím histopatologických, klinických a epidemiologických metod, protože přirozeně infikovaná zvířata pravděpodobně sérologicky nereagují na PrP-res a stanovení diagnózy naočkováním do laboratorních zvířat může trvat až 18 měsíců. Klinická diagnostika se provádí po smrti
-4 • tt histopatologickým vyšetřením mozku. Stav z hlediska BSE se dělí na: BSE-pozitivní, BSE-negativní a BSE-suspektní. Zvířata, která jsou podezřelá z onemocnění BSE, mají stejné klinické příznaky jako BSEpozitivní zvířata. V době vyšetření je však histopatologický důkaz BSE (ještě) negativní. Tento „BSE-suspektní“ stav může však být „pre-BSEpozitivní“ stav, ačkoli v některých případech se určí jiná diagnóza nebo zvíře nemusí mít BSE,
Komplexní diagnostické metody uvedené výše zahrnují mikroskopické vyšetření například BSE-specifických vakuol v neuronech a neuropilech, vyšetření na astrocytózu, úbytek neuronů a ukládání abnormálních nahromadění PrP-res, známých také pod označením „fibrily související se scrapií“ (scrapie-assocíated fibrils, SAF). SAF mohou být detekovány in šitu imunohistochemickou analýzou histologických přenosů a ve zpracovaných extraktech postiženého mozku metodou westernového přenosu, tečkového přenosu (dot blot) nebo jako typické akumulace fibril negativním barvením při transmisní elektronové mikroskopii.
Další přístup pro nepřímou diagnostiku BSE je analýza cerebrospinální tekutiny. Neurologická onemocnění jsou spojena s kvalitativními a kvantitativními změnami metabolismu proteinů v rámci centrálního nervového systému (CNS) a tyto změny se odrážejí ve změněném složení cerebrospinální tekutiny (CSF). Použitím dvojrozměrné gelové elektroforózy je možné najít markerové proteiny, které jsou v korelaci s onemocněním. Možné markéry tohoto druhu (jde pouze o nepřímé známky možné přítomnosti BSE) byly nejprve detekovány v pozdním stadiu inkubační doby experimentální BSE. Jak je však známo ze srovnávacích experimentů se vzorky pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou, tento markér se také může nalézt u pacientů s Alzheimerovou chorobou. Alzheimerova choroba je považována za nepřenosnou spongiformní encefalopatii.
• · 4 »t » l 4*44 • · 4 · ···»
5· ·· ·· 4 4 4 44 4 4 • · ·· 4·4 ··· »«« 4444 4« 444
I v případě, že by byly vyvinuty pro detekci jednodušší metody, je nepravděpodobné, že by byly takové testy použitelné pro diagnostiku předklinické BSE.
V dosavadním stavu techniky se popisují způsoby výroby syntetických polypeptidů obsahujících antigenní determinanty prionového proteinu (WO 93/11155, WO 93/23432), protilátky specifické pro nativní prionový protein scrapie (WO 97/10505), a způsoby detekce scrapie u ovcí (WO 97/37227). Korth a další (1997, Nátuře 390: 74 - 77) popisují monoklonální protilátku získanou z myší, která je schopná rozlišit mezi buněčnou isoformou (PrPc) a isoformou scrapie (PrPsc).
Cílem předkládaného vynálezu je poskytnuti způsobu diagnostiky předklinických nebo klinických přenosných spongiformních encefalopatií.
Tohoto cíle bylo podle předkládaného vynálezu dosaženo v rámci popisu a nároků poskytnutím způsobu diagnostiky předklinických nebo klinických přenosných spongiformních encefalopatií.
Podstata vynálezu
Podle vynálezu se tento způsob vyznačuje tím, že se
a) odebere živému savci vzorek krve,
b) z tohoto vzorku krve se zakoncentrují buňky, které se označují jako cílové buňky,
c) v těchto cílových buňkách se zjistí exprese markerového proteinu pro přenosné spongiformní encefalopatie,
d) získaný výsledek se porovná s kontrolní hodnotou.
-6- .
* «·«» · · · · • 9 · · 9 · 9
49999 9 4 99 · · • · · · · · ♦ ··« Φ··· ·· ···
V konkrétním provedení tohoto způsobu podle vynálezu se cílové buňky homogenizují.
Předklinická fáze přenosných spongiformních encefalopatií je dlouhá inkubační doba po infekcí prionovým proteinem, ve které se nevyskytují žádné vnější klinické příznaky. Předkládaný vynález umožňuje zvláště diagnostiku přenosných spongiformních encefalopatií během této fáze bez přítomnosti vnějších klinických příznaků. Předkládaný vynález tedy také zvláště umožňuje určit diagnózu u savců, u kterých je podezření na přenosné spongiformní encefalopatie, ale u kterých jsou v době testu (stále ještě) negativní histopatologické nálezy (TSE-suspektní, srovnej také popis BSE výše). Klinická fáze je krátká fáze klinických příznaků, která následuje po předklinické fázi a dosud vedla nevyhnutelně ke smrti infikovaných savců v důsledku neexistence jakéhokoli léčení. Přenosné spongiformní encefalopatie mohou být s využitím technických poznatků předkládaného vynálezu diagnostikovány také v průběhu této fáze. Přenosné spongiformní encefalopatie (TSE) zahrnují zvláště onemocnění scrapie u ovcí, bovinní spongiformní encefalopatií (BSE) u hovězího dobytka, a onemocnění kuru-kuru a Creutzfeldt-Jakobovu nemoc u lidí.
Stanovení exprese markerového proteinu znamená, že uvedený markerový protein má prokazatelně zvýšenou nebo zvýšenou hladinu ve srovnání s kontrolou. Výraz „prokazatelně“ znamená například to, že markerový protein je exprimován o 50 až 100 % více nebo méně než v kontrole, nebo je jeho hladina statisticky významně zvýšená nebo snížená. Kontrolní hodnotu nebo standardní hodnotu je možno zjistit například použitím buněk z neinfikovaných zvířat, a taková hodnota se používá pro kalibraci způsobu podle vynálezu. Způsoby provádění těchto postupů jsou odborníkům v oboru známy.
Markerové proteiny mohou být jakékoli proteiny známé odborníkům v oboru, které mají prokazatelně zvýšené nebo snížené
-7···· e
hladiny při předklinickém nebo klinickém stadiu přenosných spongiformních encefalopatíí. Tak je tomu například v případě, jestliže markerový protein je v kontrole nedetekovatelný, a může být jasně identifikován použitím dále popsaných způsobů u infikovaných savců nebo savců s podezřením na přenosnou spongiformní encefalopatíí.
V jednom zvláštním provedení je způsob podle vynálezu charakterizován tím, že markerovým proteinem je prionový protein PrP-sen. Prionový protein PrP-sen podle vynálezu je buněčná isoforma prionového proteinu, která se často označuje jako PrPc. Protein PrP-sen (sen = sensitivní) je úplně degradován proteázami.
V jednom konkrétním provedení je způsob charakterizován tím, že markerovým proteinem je interferon gama (lFNy). V ještě dalším konkrétním provedení je způsob charakterizován tím, že markerovým proteinem je bovinní interferon gama (IFNy). IFNy (např. Vilcek, J. a Oliveira, L. C., Int. Arch. Allergy Immunol. 1994, 104: 311 - 316) a bovinní IFNy (Keefe, R. G. a další, Vet. Immunol. Immunopathol., 1997, 56: 39 - 51) jsou odborníkům v oboru známy.
Další konkrétní provedení způsobu se vyznačuje tím, že markerovým proteinem je lamininový receptor (LR) nebo prekurzor lamininového receptoru (LPR). Lamininový receptor (například Grosso, L. E. a další, Biochemistry, 1991, 30: 3346 - 3350) a prekurzor lamininového receptoru (například Castronovo, V. a další, J. Biol. Chem. 1991, 266: 20440 - 20446) jsou odborníkům v oboru známé. V dalším, ještě konkrétnějším provedení vynálezu, je způsob charakterizován tím, že markerovým proteinem je bovinní lamininový receptor (LR) nebo prekurzor bovinního lamininového receptoru (LRP).
Uvedené markerové proteiny mohou být detekovány pomocí jakýchkoli způsobů známých odborníkům s průměrnou zkušeností v oboru.
Ve výhodném provedení je markerový protein zjišťován imunologickým testem. Imunologický test využívá monoklonálních fc « • · · • · fcfcfcfc · • fcfcfcfc fc fcfc fcfcfc •fc·*** fcfc «fcfc protilátek nebo polyklonálních antisér specifických pro markerový protein, které jsou v oboru dostupné. Pro markerový protein PrPsen (Harmeyer S. a další, J. Gen. Virol. 1998, 79, 937 - 945, viz obr. 1) mohou být například použity monoklonální protilátka 13 nebo monoklonální protilátka 142. Imunologické testy zahrnují způsoby detekce známé v oboru jako je test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) nebo tzv. sendvičový test ELISA, tečkové přenosy, imunologické přenosy, radioimunologické testy (radioimmunoassay, RIA), Ouchterlonyho test založený na difúzi, nebo raketové ímunofluorescenční testy. Další imunologický test je tzv. westernový přenos (známý pod názvy Western transfer proceduře nebo Western blotting). Účelem westernového přenosu je převést proteiny nebo polypeptidy rozdělené elektroforézou na polyakrylamidovém gelu na nitrocelulózový filtr nebo jiný vhodný nosič a současně zachovat relativní polohy proteinů nebo polypeptidů získané z gelové elektroforézy. Nosič westernového přenosu se potom inkubuje s protilátkou, která se specificky váže na sledovaný polypeptid nebo protein. Tyto způsoby detekce může používat odborník s průměrnou zkušeností v oboru pro prováděni předkládaného vynálezu. Literární odkazy, ve kterých může odborník v oboru nalézt výše uvedené metody a jiné způsoby detekce, jsou: Introduction to
Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Nizozemí (1986); Bullock a další, Techniques in immunocytochemistry, Academie Press, Orlando, díl 1 (1982), díl 2 (1983), díl 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme tmmunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Nizozemí (1985).
V dalším, nejkonkrétnějším provedení vynálezu, se cílové buňky inkubují s protilátkami, které jsou specifické pro markerový protein, a stanoví se takto vytvořený komplex antigen/protilátka.
Ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu se zjišťuje změněná exprese markerového proteinu pro přenosné •· · ·· · · * *· • * · · · « * ♦
Λ · ··»· · « « « « » ·
- y - · · · · · · « *·· · ·*· ···· «· ··· spongiformní encefalopatie metodami molekulární biologie. Metody molekulární biologie, které mohou být v předkládaném vynálezu používány, jsou metody detekce zahrnující například polymerázovou řetězovou reakci (PCR), nebo může jít o metody northernových nebo Southernových přenosů, které může odborník v oboru nalézt ve standardních publikacích (například Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York a Bertram, S. a Gassen, H. G., Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991).
V dalším výhodném provedení způsobu podle předkládaného vynálezu se markerový protein pro přenosné spongiformní encefalopatie zjišťuje polymerázovou řetězovou reakcí s reverzní transkriptázou (RT-PCR). Pří této zvláštní formě poiymerázové řetězové reakce (PCR) se nejprve izoluje veškerá celková RNA, ta se zpětně přepíše použitím enzymu „reverzní transkriptázy“ do cDNA, se kterou se potom provádí reakce PCR. Tato metoda detekce je odborníkům v oboru známá a je publikována ve standardních referenčních příručkách (například Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York a Bertram, S. a Gassen, H. G., Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991).
Příklady „živých savců“ jsou odborníkům s průměrnou zkušeností v oboru známé, a zahrnují například člověka stejně jako ovce, kozy, vepře, hovězí dobytek, vysokou zvěř, králíky, křečky, krysy a myši.
V jednom z konkrétních provedení vynálezu je způsob charakterizován tím, že živý savec patří do skupiny bovidae, nejvýhodněji jde o krávu nebo ovci. Ačkoli se přihláška týká zvláště způsobu diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií
-10u hovězího dobytka, technické principy jsou stejně použitelné na jakéhokoli živočicha, který může být postižen patogenem uvedených encefalopatií a je proto zahrnut do předkládaného vynálezu.
Buňky obsažené ve vzorku krve zahrnují všechny krevní buňky získané z hematopoetických kmenových buněk, například lymfocyty, trombocyty, krevní destičky nebo erythrocyty.
V dalším konkrétním provedení se předkládaný způsob vyznačuje tím, že cílovými buňkami jsou leukocyty. Termín leukocyty zahrnuje například polymorfonuleární a mononukleární leukocyty, žírné buňky, B-buňky nebo B-lymfocyty, T-buňky nebo T-lymfocyty a buňky přirozené zabíječe (buňky NK).
V nejkonkrétnějším provedení je předkládaný způsob charakterizován tím, že cílovými buňkami jsou mononukleární leukocyty. Termín mononukleární leukocyty označuje zvláště monocyty a makrofágy, dendritické buňky a Langerhansovy buňky.
V dalším zvláštním provedení se způsob vyznačuje tím, že cílovými buňkami jsou polymorfonukleární leukocyty. Mezi polymorfonukleární leukocyty patří eosinofilní, neutrofilni a basofilní granulocyty.
Vynález se dále týká diagnostického testovacího kitu (soupravy) pro detekci spongiformních encefalopatií, který obsahuje všechny prvky nutné pro detekci změněné exprese markerového proteinu přenosných spongiformních encefalopatií použitím způsobu podle vynálezu.
Předkládaný vynález se dále týká zvláště diagnostického testovacího kitu, který obsahuje protilátky specifické pro markerový protein přenosných spongiformních encefalopatií.
Vynález se dále týká zvláště diagnostického testovacího kitu, který se vyznačuje tím, že protilátky podle vynálezu jsou polyklonální.
-11 ·· » • · » • ··♦ ·· fc fc fc ·« • » · fc · « · · · fc « ♦ » · fc · fcfcfc «··» fcfc fcfcfc
Vynález se dále konkrétně týká diagnostického testovacího kitu, který se vyznačuje tím, že protilátky podle vynálezu jsou monoklonální.
Vynález dále zahrnuje diagnostický testovací kit podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu PrP-sen způsobem podle vynálezu.
Vynález dále zahrnuje diagnostický testovací kit podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu IFNy způsobem podle vynálezu.
Vynález dále zahrnuje diagnostický testovací kit podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu bovinního IFNy způsobem podle vynálezu.
Vynález dále zahrnuje diagnostický testovací kit podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu lamininového receptoru (LR) nebo markerového proteinu prekurzoru lamininového receptoru (LRP) způsobem podle vynálezu.
Vynález dále zahrnuje diagnostický testovací kit podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu bovinního lamininového receptoru (LR) nebo markerového proteinu prekurzoru bovinního lamininového receptoru (LRP) způsobem podle vynálezu.
Vynález se také konkrétně týká diagnostického testovacího kitu, který je vhodný pro provádění imunitního testu in šitu.
Diagnostický testovací kit je soubor všech složek pro způsob diagnostiky podle vynálezu. Mezi některé příklady (seznam není vyčerpávající) dalších prvků pro provádění způsobu podle vynálezu patří nádobky jako jsou 96-jamkové destičky nebo mikrotitrační • 0 0
- 120 0» • 0 0 0 0 0
0··· 0 0 00000 · 0 0 0 0
00· 000» 00 00 0 destičky, zkumavky, jiné vhodné nádobky, povrchy a substráty, membrány jako nitrocelulózové filtry, promývací reakční činidla a pufry. Diagnostický testovací kit může také obsahovat reakční činidla, která mohou detekovat navázané protilátky, jako jsou například značené sekundární protilátky, chromofory, enzymy (například konjugované s protilátkami) a jejich substráty nebo jiné látky, které se mohou navázat na protilátky.
Vynález se tako týká diagnostického testovacího kitu pro detekci přenosných spongiformních encefalopatií, který obsahuje oligonukleotidy schopné hybridizovat za stringentních podmínek s nukleovou kyselinou kódující markerový protein přenosných spongiformních encefalopatií, a dalších prvků nezbytných pro provádění způsobu podíe vynálezu.
Vynález se dále týká diagnostického testovacího kitu podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro provádění polymerázové řetězové reakce s reverzní transkriptázou (RT-PCR). Takový kit může navíc bez omezení obsahovat zkumavky nebo 96-jamkové destičky nebo mikrotitrační destičky, jiné vhodné nádobky, povrchy a substráty, membrány jako jsou nitrocelulózové filtry, reakční činidla pro promývání a reakční pufry (které se mohou lišit hodnotami pH a koncentracemi hořčíku), sterilní voda, minerální olej, BSA (bovinní sérový albumin), MgCL, (NhUhSO^ DMSO (dimethylsulfoxid), merkaptoethanol, nukleotidy (dNTP), enzymy jako je Tag-polymeráza a reverzní transkriptáza, a jako matrici DNA sekvenci DNA markerového proteinu nebo jeho částí, oligonukleotidy specifické pro markerový protein podle vynálezu, kontrolní templát, DEPC-vodu, DNázu, RNázu a další sloučeniny známé odborníkovi v oboru.
Oligonukleotidy podle vynálezu jsou krátké molekuly nukleových kyselin o délce od přibližně 15 do přibližně 100 nukleotidů, které se za stringentních podmínek vážou na sekvenci nukleové kyseliny, která je * ·· · ·· · · · » ·· • · · · · « · · · · « • · ♦ · 4 ··· ···· ·· ··» • · ··<*
-13 komplementární s markerovým proteinem. Pod stringentními podmínkami odborník v oboru rozumí podmínky, které umožní selekci na více než 85%, s výhodou více než 90% homologii (srovnej Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York a Bertram, S. a Gassen, H. G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991).
Vynález se dále týká diagnostického testovacího kitu podle vynálezu, který obsahuje olígonukleotidy schopné za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující glykoprotein PrP-sen.
Vynález se dále týká diagnostického testovacího křtu podle vynálezu, který obsahuje olígonukleotidy schopné za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující IFNy.
Vynález se dále týká diagnostického testovacího kitu podle vynálezu, který obsahuje olígonukleotidy schopné za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující bovinní IFNy.
Vynález se dále týká diagnostického testovacího kitu podle vynálezu, který obsahuje olígonukleotidy schopné za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující lamininový receptor (LR) nebo prekurzor lamininového receptorů (LRP).
Další provedení předkládaného vynálezu se týká použití protilátky, která je při způsobu podle vynálezu specifická pro PrP-sen.
Další provedení předkládaného vynálezu se týká použití protilátky, která je při způsobu podle vynálezu specifická pro IFNy.
Další provedení předkládaného vynálezu se týká použití protilátky, která je při způsobu podle vynálezu specifická pro bovinní IFNy.
Další provedení předkládaného vynálezu se týká použití protilátky, která je při způsobu podle vynálezu specifická pro
v « v v w V
• *4 * 4 4 4 • 4
* 4 4 • *
4*44 4 * • 4 ·
• 4 4 4
44 • ··· 44 4 4 44 44
laminínový receptor (LR) nebo prekurzor lamininového receptoru (LRP).
Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká použití oligonukleotidů, které jsou schopné za stringentních podmínek hybridizovat při způsobu podle vynálezu s nukleovou kyselinou kódující PrP-sen.
Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká použití oligonukleotidů, které jsou schopné za stringentních podmínek hybridizovat při způsobu podle vynálezu s nukleovou kyselinou kódující IFNy.
Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká použití oligonukleotidů, které jsou schopné za stringentních podmínek hybridizovat při způsobu podle vynálezu s nukleovou kyselinou kódující bovinní IFNy.
Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká použití oligonukleotidů, které jsou schopné za stringentních podmínek hybridizovat při způsobu podle vynálezu s nukleovou kyselinou kódující lamininový receptor (LR) nebo prekurzor lamininového receptoru (LRP).
Další výhodné provedení vynálezu je použití diagnostického testovacího kitu podle vynálezu pro detekci přenosných spongiformních encefalopatií při diagnóze spongiformních encefalopatií lidí a zvířat, nebo pro epidemiologická kontrolní opatření pro endemickou BSE nebo onemocnění scrapie.
·· « • · I
-15-: ··;· · ·*· · · • ··♦· • · ·· • · · • · · · • · · ♦ · ♦♦·
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1
Určení markerového proteinu PrPsen westernovým přenosem
Obrázek ukazuje určení markerového proteinu PrPsen v mononukleárních (MN) leukocytech hovězího dobytka infikovaného BSE a BSE-negativních kontrolních zvířat použitím westernového přenosu a monoklonálních protilátek 142.
Buňky byly homogenizovány ve 2% sarkosylu. Homogenizovaný preparát byl nanesen na gel v koncentraci 60 pg/jamku.
Dráha 1: markér molekulové hmotnosti
Dráha 2: mozek BSE (BSE-pozitivní, pozitivní kontrola)
Dráha 3: kráva No. 058193 (BSE-pozitivní)
Dráha 4: kráva No. 5061 (BSE-pozitivní)
Dráha 5: kráva No. 2819 (BSE-pozitivní)
Dráha 6: kráva No. 279046 (BSE-negativní, negativní kontrola) Dráha 7: kráva No. 4751 (BSE-pozitivní)
Všechny vzorky mononukleárních leukocytů se získávají z hovězího dobytka infikovaného BSE kromě krávy No. 279046. Exprese proteinu PrPsen je pozitivní ve všech zvířatech infikovaných BSE v porovnání s negativní kontrolou. U krávy No. 5061 (dráha 4) dochází k expresi proteinu PrPsen s menší intenzitou, ale výsledek je významně vyšší než u negativní kontroly.
- 16 ···· « * • ♦ ·▼ ·· • · · · ♦ * * • 9 * · • 9 9
9999 99 9
Obr. 2
Určení markerového proteinu IFN-γ metodou RT-PCR
Obrázek ukazuje určení markerového proteinu IFN-γ metodou RT-PCR u hovězího dobytka infikovaného BSE a BSE-negativních kontrolních zvířat.
Dráha 1: kontrola GAPDH, kráva No. 4372 (BSE-pozitivní)
Dráha 2: IFN-γ, kráva No. 3472 (BSE-pozitivní)
Dráha 3: kontrola GAPDH, kráva No. 441 (BSE-negativní)
Dráha 4: IFN-γ, kráva No. 441 (BSE-negativní)
Obr. 3
Určení markerového proteinu lamininového receptoru metodou RTPCR
Tento obrázek ukazuje měření markerového proteinu lamininového receptoru (LR) metodou RT-PCR u hovězího dobytka infikovaného BSE, podezřelého na BSE a BSE-negativních kontrolních zvířat.
Část A:
Dráha 1: kráva No. 4471 (BSE-pozitivní
Dráha 2: kráva No. 58193 (BSE-pozitivní)
Dráha 3: kráva No. 462 (negativní kontrola)
Dráha 4: kráva No. 5621 (podezření na BSE)
Dráha 5: kráva No. 5054 (podezření na BSE)
Dráha 6: kontrola cílová DNA
Dráha 7: prázdná
« 4 W W w 44 4 4 • 4 44
• 4 * 4 4 4 4
• 4444 · 4 4 4 4 4
• 4 4 4 4 4
• 4 4 444 44*4 <4 44
Dráha 8: markér molekulových hmotností
Část B:
Pro každou dráhu v části A existuje odpovídající RT-PCR D-glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) jako kontrola pro odlišnou aktivitu reverzní transkriptázy.
Vynález bude podrobněji popsán na následujících příkladech.
Příklady proveden? vynálezu
Příklad 1
Diagnostika BSE pomocí zvýšené exprese specifických markerovych proteinů v izolovaných leukocytech
Následující příklad popisuje diagnostiku BSE u hovězího dobytka zjištěním zvýšené exprese markerových proteinů PrPsen nebo IFN-γ nebo lamininového receptoru (prekurzoru) (LR(P)) v izolovaných mononukleárních (MN) nebo polymorfonukleárních (PMN) leukocytech.
Izolace mononukleárních (MN) a polymorfonukleárních (PMN) leukocytů z úplné krve hovězího dobytka
Tyto zvláštní krevní buňky se izolují ve dvou krocích centrifugace, přičemž druhý krok je centrifugace v hustotním gradientu pro získání tzv. „buffy“ (utvořeného ze sražených leukocytů) povlaku leukocytů s následnou lyží erythrocytů.
Krok 1: Vzorky krve
Vzorky krve (objem přibližně 400 ml) se odeberou zvířatům a vloží přímo do speciálního zásobníku. V tomto zásobníku je již přítomna směs glukózy a citrátu: 68 mM glukóza, 37,4 mM citrát * 44 4 4 4 4 44
4 4 4 «444 • 4444 « 4 44444
4 4 4 «44
444 4 444 444> ·4 444
-18trisodný, 17,4 mM kyselina citrónová, pH upraveno na 7,3, jako antikoagulační prostředek. Krev a antikoagulant jsou v poměru 6:1.
Vzorky krve se posílají ihned do laboratoře pro izolaci buněk.
Krok 2: Zakoncentrování leukocytů
První centrifugace
Přesně 40 ml úplné hovězí krve zpracované působením antikoagulantu se vloží do uzavíratelné sterilní 50 ml centrifugační kyvety a centrifuguje při 800 x g 20 min při laboratorní teplotě v rotační centrifuze bez brzdy. Centrifugace by měla být prodloužena o 5 min na každou hodinu (až do 3 hod), po kterou byly vzorky krve po odběru uchovávány.
První centrifugace vede k vytvoření tří oddělených pásů: horní pás - sérum střední pás - leukocyty (tzv. „buffy“) dolní pás - erythrocyty
Médium pro hustotní centrifugaci:
Pro izolaci leukocytů může být použito standardní komerční médium. Autoři vynálezu používali přípravek NYCOMED Lymphoprep™, hustota 1,077 g/ml.
Sérum se opatrně oddělí a hluboce zmrazí pro další analýzu při -20 °C. Vrstva leukocytů se odebere a vloží do nové centrifugační kyvety.
·· · ·
-19-: :·:· ·
4 * * >
• · ff • · * · • · · • ·**· »* e
Druhá centrifugace
Přesně 15 ml leukocytů z první centrifugace se vloží na 35 ml prostředku NYCOMED Lymphoprep™, hustota 1,077 g/ml, v uzavíratelné sterilní 50 ml centrifugační kyvetě.
Centrifugace: 800 x g/20 min, laboratorní teplota, v rotační centrifuze bez brzdy.
Centrifugace by měla být prodloužena o 5 min na každou hodinu (až do tří hodin), po které byly vzorky krve po odběru uchovávány.
Tato druhá centrifugace vede k vytvoření čtyř oddělených pásů:
Shora dolů:
První pás - (zbytkové) sérum
Druhý pás - mononukleární leukocyty (monocyty a lymfocyty = „buffy“)
Třetí pás - střední rozhraní
Čtvrtý pás - polymorfonukleární leukocyty a (zbytkové) erythrocyty
Krok 3: Separace mononukleárních (MN) leukocytů
Pás 2 obsahuje monocyty a lymfocyty a opatrně se odsaje použitím sterilní Pasteurovy pipety a přenese do sterilní 50 ml centrifugační kyvety. Buňky se dvakrát promyjí stejným objemem sterilního PBS (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem a centrifugují při 600 x g/15 min/10 °C. Usazené odstředěné buňky se resuspendují v HBSS (Hanksův vyvážený fyziologický roztok s NaHCCb, bez fenolčervent). Vitalita a počet buněk se zjišťují trypanovou modří.
• * V ··
• 4 »· » » 4 4 4 4
• · 0 • · • ·
• ···· « • · • 4 ·
• · • · 4 ·
«· * ·«·« »4 ·*
Krok 4: Separace polymorfonukleárních (PMN) leukocytů
Po odpipetování druhého pásu se odsátím odstraní také pásy 1 a 3. Směs PMN/erythrocyty se potom třikrát zředí sterilním pufrem pro lyži erythrocytů (ELB, 8,9 mM KHCOs, 154,9 mM NH4CI a 0,01 mM EDTA), opatrně smíchá a inkubuje 10 min při laboratorní teplotě.
Centrifugace: 800 x g/10 min/10 °C
Supernatant se odlije a usazený materiál se resuspenduje ve 20 ml pufru ELB, zamíchá, inkubuje a znovu centrifuguje.
Centrifugace: 800 x g/10 min/10 °C
Supernatant se odlije a usazený materiál se promyje 20 ml HBSS (jako výše, ale s přídavkem 1 mM MgCÍ2).
Centrifugace: 800 x g/8 min/10 °C
Supernatant se odlije a buňky se resuspendují v HBSS. Vitalita a počet buněk se zjišťují trypanovou modří.
Výsledky: Příklady počtů buněk
Typ buněk Počet buněk/ml krve Vitalita
1. MN 2,25 x 106 > 93 %
2. PMN 4,03 x 10® > 98 %
Následující měření byla prováděna izolovanými MN- a PMNleukocyty u zvířat infikovaných BSE:
I. Zvýšená exprese ceiulární isoformy prionového proteinu, prpsen
Zvýšená exprese proteinu interferonu gama, IFN-γ
* 9 • · 9 · • ·
« · · • · • ·
9 « • · ♦ · «
9 · • « • ·
«· · 9 · · · · · • * • ·
III. Zvýšená exprese lamininového receptoru (prekurzoru) L(P)R
I. Zvýšená exprese celulární isoformy PrPsen
Míra exprese proteinu PrPsen v izolovaných leukocytech z kontrolních zvířat a zvířat infikovaných BSE se měří analýzou westernovým přenosem (Harmeyer S. a další, J. Gen Virol. 1998, 79, 937 - 945). Použije se chromogenního vyvíjení.
Otevírání buněk:
Izolované leukocyty se homogenizují ve 2% roztoku sarkosylu (Sigma, St. Louis, USA) 10 min/4 °C. Homogenizovaný preparát získaný tímto postupem se potom centrifuguje při 15 000 x g/40 min/ 4 °C. Supernatant se zfiltruje odsátím a uchovává při -20 °C. Byla zjištěna koncentrace proteinů homogenizovaného preparátu a ve všech vzorcích byla koncentrace upravena na standardních 6 mg/ml proteinu. Do každé jamky bylo nanášeno přesně 60 pg homogenátu.
Detekce se provádí použitím buď monoklonální protilátky 13 nebo monoklonální protilátky 142. Protilátky se podrobně popisují ve výše uvedené publikaci. Zředění protilátek je ve všech případech 1 : 10.
Jako sekundární protilátky byly v tomto příkladu použity protilátky konjugované s AP v ředění 1 : 3000,
Výsledky:
Bylo ukázáno, že exprese proteinu PrPsen je podstatně zvýšená jak v MN-, tak i PMN-leukocytech zvířat infikovaných BSE ve srovnání se zdravými kontrolními zvířaty (srovnej také westernový přenos na obr. 1 se vzorky jiných zvířat).
Případ No./vzorek Stav BSE Zvýšení exprese pj.psen
4372 pozitivní ano
4471 pozitivní ano
4401 suspektní negativní ano
Kontrola negativní negativní ne
II, Zvýšená exprese IFN-γ
Zvýšená exprese se měří dvěma způsoby:
- měření proteinu metodou ELISA
- měření specifické mRNA metodou RT-PCR
1, Měření IFN-γ metodou ELISA
Použije se komerční souprava ELISA vyráběná firmou CSL Veterinary Ltd., Melbourne, Austrálie.
Výsledky:
Stav BSE Počet zvířat IFN-γ (pg/ml)
BSE pozitivní 9 314,0 ±78,2
BSE suspektní 9 504,0 ± 109,7
BSE negativní 13 0,0 ±0,0
« * ····
-232. Měření mRNA IFN-γ metodou RT-PCR
Izolace RNA (z frakce celkových leukocytů) a následná RT-PCR se provádějí standardními metodami (Yi-Jun Shi a Jing-Zhlong Liu, Genet. Anal. Tech. Appl., 1992, 9, 149 - 150; Izraeli S. a další, Nucl. Acid. Res. 1991, 21, 6051; Michel U. a další, Anal. Biochem., 1997, 249, 246 - 247) s dále popsanými modifikacemi.
Izolace RNA:
Pro izolaci celkové RNA se použije soupravy Promega System (katalogové číslo G3191).
cDNA (reakce RT):
Reverzní transkripce izolovaných vzorků RNA se provede pomocí soupravy Reverse Transcription System firmy Promega (katalogové číslo A3500).
Reakce PCR:
Pro stanovení specifické mRNA se použije dvojitá polymerázová řetězová reakce („nested PCR“).
Používá se následujících primerů IFN-y:
FW1 (IFNF1) 5’GGAGTATTTTAATGCAAGTAGCCC 3’
FW2 (IFNF2) 5’GTAGCTAAGGGTGGGCCTCT 3’
RV IFNR1) 5’GCTCTCCGGGCCTCGAAAGAGATT 3’
Očekávaný produkt PCR by měl mít délku 357 párů bází (bp).
-24 « · * · · ♦ · ·«« · ·· ··*· ·♦ ···
Výsledky:
Metodou RT-PCR jsou jasně potvrzeny výsledky pro IFNy zjištěné metodou ELISA, tj. u zvířat infikovaných BSE je významně zvýšená koncentrace IFNy.
Obr. 2 ukazuje RT-PCR mRNA z celkových leukocytů v úplné krvi pro vzorky zvířat No. 4372 a 441.
lil. Zvýšená exprese lamininového receptoru (prekurzoru), LR (P)
Exprese byla měřena metodou RT-PCR. Tato reakce také zahrnuje detekci LRP stejně jako LR.
Bovinní sekvence LRP nebo LR dosud nebyla popsána. Tento protein je však u savců vysoce konzervovaný. Porovnávají se proto publikované údaje o sekvencích lidských a myších LR. Na základě analýzy těchto údajů se vytvoří následující sekvence primerů:
Primery
Směrem vpřed: 5’AAGAGGACCTGGGAGAAGCT 3’
Směrem vzad: 5'CCTTCTCAGCAGCAGCCCTGC 3’
Velikost očekávaného produktu: 517 bp
Izolace RNA
Izolace se provádí podle popisu v bodu II.2.
cDNA (reakce RT)
Provádí se podle popisu v bodu II.2.
Reakce PCR
Jednoduchá reakce odpovídající standardním metodám.
-25 • ··*· fc fc
Výsledky:
Případ No./vzorek Stav BSE Zvýšená exprese LRP/LR
4471 pozitivní ano
58193 pozitivní ano
5621 suspektní (ano)
5054 suspektní ano
Kontrola (462) negativní ne
Tyto výsledky jsou ukázány na obr. 3.
IV. Klonování a exprese bovinního lamininového receptoru (prekurzoru), LR(P), pro vytvoření specifických protilátek proti LR
Vytvoření primerů pro LR
Příměry pro bovinní LR jsou navrženy pro amplifikaci úplného genu LR (přístupové číslo genové banky S 37431). Primery byly navrženy na základě genu bovinního proteinu C10 (přístupové číslo genové banky M 64923).
U primerů LR definovaných dále se jejich restrikční místa objevují v rámečku. Na základě těchto restrikčních míst je možné přímé klonování do E. coli.
Primery navržené pro LR se budou používat pro amplifikaci LR z úplné buněčné RNA izolované z úplné hovězí krve.
Sekvence těchto tří primerů je možno vidět dále:
LRPF1 5'ATTTICTCGAGITGTCCGGAGCCCTTGATGTCC 3’
LRPR1 5’ATTGIAATTCCITTACGACCACTCGGTGGTGGT 3’
-26LRPR2 5'ATTT|TCTAGAIAACGACCACTCGGTGGTTCC 3’
Restrikční místa: primer LRPF1 může být štěpen enzymem Xho, primer LRPR1 může být štěpen Eco R1, a primer LRPR2 může být štěpen Xba 1.
RT-PCR a klonování bovinního genu LR
Primery LR se resuspendují ve sterilní vodě na konečnou koncentraci 50 ng/ml.
Z celkových leukocytových frakcí úplné hovězí krve se izoluje hovězí leukocytární RNA.
pg RNA se štěpí DNázou (Gibco BRL) a reverzní transkripce se provádí s použitím soupravy Reverse Transcription Kit (Promega, katalogové číslo A3500). polymerázové řetězové reakce (PCR) se provádějí použitím LRPF1, LRPR1 a LRPR2.
PCR: 35 cyklů, teplotní hybridizace při teplotě 50 °C.
Ampiifikované fragmenty získané PCR se dělí na 1% agarózovém gelu pro zjištění velikosti fragmentů. Získané pruhy se čistí gelem, znovu se zkontroluje jejich velikost a fragmenty se vyjmou z agarózy a resuspendují v 10 pl sterilní vody.
Ampiifikované fragmenty se vloží do vektoru pGEM-7 (Boehringer Mannheim Ligation Kit).
Všechny klony se sekvenují a bylo ukázáno, že jsou geny LR.
Bylo provedeno subklonování do expresních vektorů pBADgw a pTrcHis (oba získány od firmy Invitrogen Ltd.) a klony se v současnosti testují na přítomnost insertů.
-27 fc·* fcfc · fc fcfcfc· • fcfc · fcfcfcfc • fcfcfcfc* fc fc fcfc * · fcfc fcfc fcfcfc •fcfc fc fcfcfcfc·»» ·· fcfcfc
Návrh peptidů pro vyvinutí protilátek proti LR
Pro použití při vývoji protilátek proti lamininovému receptorů (LR) byly navrženy čtyři peptidy. Tyto peptidy jsou navrženy použitím bovinního proteinu C10 (přístupové číslo genové banky: M 64923; protein Id. AAA62713.1).
Pro navrhování peptidů se používá počítačový program (Antheprot), který předpovídá strukturu, hydrofobní, hydrofilní a antigenní místa proteinů.
Hlavní parametry se koncentrují na volbu dvou z těchto peptidů na základě hydrofilních a antigenních vlastností, dva další peptidy se vybírají pro své umístění v C- a N-koncových oblastech proteinu.
Peptid 1141 MSGALDVLQMKEEDVLKFLAGC (Aminokoncový); odpovídá aminokyselinovým zbytkům 1 až 20, vybraným z aminokoncové oblasti proteinu.
Isoelektrický bod (pl) 4,32.
Peptid 1142 RLLWTDPRADHQPLTEASYGC (Antigenní); odpovídá aminokyselinovým zbytkům 120 až 140, vybraným z antigenní oblasti proteinu.
Isoelektrický bod (pl) 5,38.
Peptid 1143 KEEQAAEKAVTKEEFQGEWGC (Hydrofilní a antigenní); odpovídá aminokyselinovým zbytkům 212 až 231 zvoleným z hydrofilní a antigenní oblasti proteinu.
Isoelektrický bod (pl) 4,48.
Peptid 1144
FTAAQPEVADWSEGVQVPSVGC
-28• * ··· (Karboxykoncový); odpovídá aminokyselinovým zbytkům 238 až 257 zvoleným z karboxykoncové oblasti proteinu.
Isoelektrický bod (pl) 3,58.
Každý peptid je konjugován na proteinový preparát Imject™ Maleimide Activated Ovalbumin Carrier Protein (Pierce Warner Ltd.) následujícím způsobem:
Peptidy se rozpustí na konečnou koncentraci 10 mg/ml ve 100 mM Na2HPO4 (pH 7,2).
Materiál Imject® Maleimide Activated Ovalbumin se rozpustí na konečnou koncentraci 10 mg/ml ve sterilní vodě.
Peptid a ovalbumin se ponechají konjugovat 2 hod při laboratorní teplotě.
Po konjugaci se roztok konjugovaného proteinu dialyzuje v 500násobném objemu PBS (pH 7,4) a uchovává při 20 °C až do upotřebení.
Produkce polyklonálních a monoklonálních protilátek
Produkce polyklonálních a monoklonálních protilátek se provádí podobným způsobem jak se popisuje například v Harmeyer S. a další, J. Gen Virol, 1998.
Stručný popis
Den 0: Před injekcí se odeberou predimunizační vzorky krve pro vyšetření na anti-LR protilátky.
Den 0: Podkožně se vstříkne 0,5 ml konjugovaného peptidu suspendovaného ve Freundovu úplném adjuvans (Sigma-Aldrich, katalogové číslo: F-5881).
* 4
-29* ····
Den 14: Provede se první zesilující (booster) injekce 0,5 ml konjugovaného peptidu ve Freundovu neúplném adjuvans (SigmaAldrich, katalogové číslo: F-5506).
Den 21; Provede se druhá zesilující injekce 1,0 ml konjugovaného peptidu bez přítomnosti adjuvans.
Den 31: Provede se testovací odběr pro kontrolu vytvořených protilátek.
Systém ELISA pro měření markerových proteinů
Technologie ELISA je zvláště vhodná pro měření markerových proteinů BSE. V tomto případě se bude provádět separace zvláštních krevních buněk, které na povrchu nesou tyto markéry.
Postup separace buněk
Další dělení podtříd MN a PMN leukocytů (cílové buňky) se bude provádět zachycením na imunomagnetických kuličkách (Dynabeads®). Kuličky se budou potahovat protilátkami specifickými proti typům buněk bovinnich leukocytů.
Stručný popis
- Kuličky Dynabeads specifické pro buňky se přidají ke vzorku krve.
- Provede se imunologické zachycení cílových buněk.
- Provede se magnetická separace cílových buněk.
- Provede se promytí a zakoncentrování čistých cílových buněk.
Měření markerových proteinů metodou ELISA
Zvolí se systém ELISA na základě izolace cílových buněk s použitím zachytávacích protilátek specifických pro cílové buňky:
-30»· · ·« » * · ··««·· · · · · · * • · * · * · · ··« · ·«·*··· «« ···
Mikrotitrační destičky se potáhnou primární zachytávací protilátkou specifickou pro povrchový markér cílových buněk.
Provede se inkubace s buňkami exprimujícími povrchový markér cílových buněk. Provede se navázání na primární zachytávací protilátku.
Po zachycení buněk se provede inkubace s biotinytovanou sekundární protilátkou proti markerovému proteinu BSE.
Provede se inkubace s detekčním proteinem konjugovaným s enzymem, přidání substrátu a měření na čtecím zařízení pro ELISA.
Zastupuje:

Claims (31)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob diagnostiky předklinických nebo klinických přenosných spongiformních encefalopatii, vyznačující se tím, že se:
    a) ze vzorku krve živého savce se zakoncentrují buňky, které se označují jako cílové buňky, přičemž uvedené cílové buňky jsou polymorfonukleární buňky PMN;
    b) v cílových buňkách se stanoví exprese markerového proteinu pro přenosné spongiformní encefalopatie, kde uvedený markerový protein se volí ze skupiny PrPsen, interferon gama IFNy, nebo lamininový receptor LR nebo prekurzor lamininového receptoru LRP;
    c) získaná hodnota se porovná s kontrolní hodnotou.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e cílové buňky se homogenizují.
  3. 3. Způsob podle některého z nároků 1a 2, vyznačující se tím, že markerovým proteinem je bovinní interferon gama IFNy.
  4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že markerovým proteinem je bovinní lamininový receptor LR, nebo prekurzor bovinního lamininového receptoru LRP.
    φ» φ
    -32• · • · • φφ
  5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že markerový protein se stanovuje imunologickým testem.
  6. 6. Způsob podle některého z nároků 1až5, vyznačující se tím, že cílové buňky se inkubují s protilátkami, které jsou specifické pro markerový protein, a stanoví se takto vytvořený komplex antigen/protilátka.
  7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že změněná exprese markerového proteinu pro přenosných spongiformních encefalopatií se stanoví metodami molekulární biologie.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, ž e změněná exprese markerového proteinu pro přenosné spongiformní encefalopatie se stanoví polymerázovou řetězovou reakcí s reverzní transkriptázou, RT-PCR.
  9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že živým savcem je kráva.
  10. 10. Diagnostický testovací kit pro detekci přenosných spongiformních encefalopatií, vyznačující se tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu pro přenosné spongiformní encefalopatie způsobem podle některého z nároků 1 až 9.
    • ♦ • t · · » fc • fc • * « fc t » • • fcfcfcfc fc • · • t fc • · • ♦ • • · · • fcfc fcfcfcfc • fc • fc
    11. Diagnostický testovací kit podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, ž e < obsahuje protilátky specifické pro markerový protein pro přenosné spongiformní encefalopatie. 12. Diagnostický testovací kit podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m , ž e protilátky jsou polyklonální. 13. Diagnostický testovací kit podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m ž e protilátky jsou
    monoklonální.
  11. 14. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu PrPsen způsobem podle některého z nároků 1 až 9.
  12. 15. Diagnostický testovací kít podle některého z nároků 10 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu IFNy způsobem podle některého z nároků 1 až 9.
  13. 16. Diagnostický testovací kit podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu bovinního IFNy způsobem podle některého z nároků 1 až 9.
    • a • 4 4 44 4*’· 4 4 «4 • 4 4 4 4 4 * • 4444 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 444 4 444 4444 44 44
  14. 17. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 10 až 16, vyznačující se tím, že obsahuje všechny nezbytné prvky pro detekci změněné exprese markerového proteinu lamininového receptoru LR nebo markerového proteinu prekurzoru lamininového receptoru LRP způsobem podle některého z nároků 1 až 9.
  15. 18. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 10 až 17, vyznačující se tím, že tento testovací kit je vhodný pro provádění imunologického testu in šitu.
  16. 19. Diagnostický testovací kit pro detekci přenosných spongiformních encefalopatii, vyznačující se tím, že obsahuje oligonukieotidy, které jsou schopné hybridízovat za stringentních podmínek s nukleovou kyselinou kódující markerový protein pro přenosné spongiformní encefalopatie stejně jako další nezbytné prvky pro provádění způsobu podle některého z nároků 1 až 4 a 7 až 9.
  17. 20. Diagnostický testovací kit podle nároku 19, vyznačující se tím, že tento testovací kit obsahuje všechny nezbytné prvky pro provádění polymerázové řetězové reakce s reverzní transkriptázou RT-PCR.
  18. 21. Diagnostický testovací kit podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že markerovým proteinem je PrPsen.
    • v « » ·· * « • · ·· • t · • » • ♦ • ···· · • » 9 4 4 • · » · 4 · ··« ···· ·· 44
  19. 22. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 19 až 21, vyznačující se tím, že markerovým proteinem je IFNy.
  20. 23. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 19 až 22, vyznačující se tím, že markerovým proteinem je bovinní IFNy.
  21. 24. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 19 až 23, vyznačující se tím, že markerovým proteinem je lamininový receptor LR nebo prekurzor lamininového receptoru LRP.
  22. 25. Diagnostický testovací kit podle některého z nároků 19 až 24, ''/fc· vyznačující se tím, že markerovým proteinem je bovinní lamininový receptor LR nebo prekurzor bovinního lamininového receptoru LRP.
  23. 26. Použití protilátky, která je specifická pro PrPsen, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  24. 27. Použití protilátky, která je specifická pro IFNy, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  25. 28. Použití protilátky, která je specifická pro bovinní IFNy, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9,
    • v 4 4 4 · 44 · * 4 4 4 4 • 4 · 4 4 4 4 • ···♦ · 4 4 4 4 4 9 * 4 4 4 · 4 4 · 444 444· 4« 44
  26. 29. Použití protilátky, která je specifická pro lamininový receptor LR nebo prekurzor lamininového receptorů LRP, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  27. 30. Použití oligonukleoticů, které jsou schopny za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující PrPsen, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  28. 31. Použití oligonukleotidů, které jsou schopny za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující IFNy, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  29. 32. Použití oligonukleoticů, které jsou schopny za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující bovinní IFNy, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  30. 33. Použití oligonukleoticů, které jsou schopny za stringentních podmínek hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující lamininový receptor LR nebo prekurzor lamininového receptorů LRP, při způsobu podle některého z nároků 1 až 9.
  31. 34. Použití testovacího kitu pro detekci přenosných spongiformních encefalopatií podle některého z nároků 10 až 25 pro diagnostiku spongiformních encefalopatií u lidí a zvířat nebo pro epidemiologická regulační opatření pro endemickou BSE nebo onemocnění scrapie.
CZ20013771A 1999-04-21 2000-04-20 Způsob diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií a souprava k jeho provádění CZ20013771A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19918141A DE19918141A1 (de) 1999-04-21 1999-04-21 Verfahren zur Diagnose von übertragbaren Spongiformen Enzephalopathien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013771A3 true CZ20013771A3 (cs) 2002-03-13

Family

ID=7905394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013771A CZ20013771A3 (cs) 1999-04-21 2000-04-20 Způsob diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií a souprava k jeho provádění

Country Status (26)

Country Link
US (2) US20030064424A1 (cs)
EP (1) EP1093585A1 (cs)
JP (1) JP2002543389A (cs)
KR (1) KR20020021774A (cs)
CN (1) CN1347501A (cs)
AR (1) AR023553A1 (cs)
AU (1) AU4297400A (cs)
BG (1) BG106021A (cs)
BR (1) BR0009843A (cs)
CA (1) CA2367696A1 (cs)
CO (1) CO5170446A1 (cs)
CZ (1) CZ20013771A3 (cs)
DE (1) DE19918141A1 (cs)
EA (1) EA200101021A1 (cs)
EE (1) EE200100547A (cs)
HK (1) HK1043188A1 (cs)
HU (1) HUP0200777A2 (cs)
ID (1) ID30392A (cs)
IL (1) IL145253A0 (cs)
MX (1) MXPA01010546A (cs)
NO (1) NO20015094L (cs)
PL (1) PL350985A1 (cs)
SK (1) SK15032001A3 (cs)
TR (1) TR200103011T2 (cs)
UY (1) UY26109A1 (cs)
WO (1) WO2000065357A1 (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0026604D0 (en) 2000-10-31 2000-12-13 Roslin Inst Edinburgh Diagnostic method
DE10108099A1 (de) * 2001-02-19 2002-09-12 Cenas Ag Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine und Verwendung
CA2440960A1 (en) * 2001-03-21 2002-09-26 Exonhit Therapeutics S.A. An early pre-symptomatic prion diagnostic blood test for encephalopathies
WO2002079511A1 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Chronix Biomedical, Inc. Diagnostic detection of nucleic acids
GB0110172D0 (en) * 2001-04-25 2001-06-20 Pa Consulting Services Improved analytical test approach for blood
WO2002097440A2 (de) * 2001-05-29 2002-12-05 Reinhold Kiehl Verfahren zur bestimmung von peptiden/proteinen, massenspektrometrie für metalle und leitfähigkeitsfeststellung
JP4093736B2 (ja) 2001-06-28 2008-06-04 株式会社日立メディコ 核磁気共鳴診断装置および診断システム
GB2379737A (en) * 2001-09-05 2003-03-19 Univ Geneve Diagnostic method for spongiform encephalopathy disease
KR20020033126A (ko) * 2002-03-08 2002-05-04 김용선 병원성 프리온 단백의 n말단의 비효소적 당화반응 최종산물의 검출에 의한 프리온 질환의 진단
WO2004050908A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Exonhit Therapeutics S.A. An early pre-symptomatic prion diagnostic blood test for encephalopathies
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
ES2246113B1 (es) * 2003-10-31 2007-04-01 Consejo Sup. De Invest. Cientificas Procedimiento de deteccion ante-mortem de proteinas prionicas por espectroscopia infrarroja y su uso en el diagnostico de encefalopatias espongiformes transmisibles.
CA2573164A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-26 Chronix Biomedical Detection of nucleic acids to assess risk for bovine spongiform encephalopathy
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
EP1749892B1 (en) * 2005-08-02 2008-03-19 Roche Diagnostics GmbH Nucleotide sequence for assessing TSE
US7798645B2 (en) 2006-05-16 2010-09-21 Mark Costin Roser Visual and memory stimulating retina self-monitoring system

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6008435A (en) * 1994-05-13 1999-12-28 The Regents Of The University Of California Detecting cow, sheep and human prions in a sample and transgenic mice used for same
US5789655A (en) * 1994-05-13 1998-08-04 The Regents Of The University Of California Transgenic animals expressing artificial epitope-tagged proteins
AU707484B2 (en) * 1995-09-14 1999-07-08 Regents Of The University Of California, The Antibodies specific for native PrPsc
US6972177B1 (en) * 1996-04-03 2005-12-06 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Method for the detection of prion diseases
US5834593A (en) * 1996-11-05 1998-11-10 The Regents Of The University Of California Soluble form of PrPSC which is insoluble in native form
DE19648599C1 (de) * 1996-11-23 1998-02-19 Tavira Holdings Ltd Wirkdruckgeber eines Durchflußmessers
EP0861900A1 (en) * 1997-02-21 1998-09-02 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Immunological detection of prions
US6221614B1 (en) * 1997-02-21 2001-04-24 The Regents Of The University Of California Removal of prions from blood, plasma and other liquids
US5891641A (en) * 1997-02-21 1999-04-06 The Regents Of The University Of California Assay for disease related conformation of a protein
CA2291720A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Ernst-Ludwig Winnacker Pharmaceutical compositions comprising a soluble laminin receptor precursor of a compound which blocks the interaction of the laminin receptor precursor and prpsc or prpc
US6165784A (en) * 1997-10-14 2000-12-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Antibodies for the detection of prion protein as an indication of transmissible spongiform encephalopathies
US5977324A (en) * 1998-02-20 1999-11-02 The Regents Of The University Of California Process for concentrating protein with disease-related conformation
US6528269B1 (en) * 1998-06-22 2003-03-04 Case Western Reserve University Immunological agents specific for prion protein (PRP)
US6166187A (en) * 1999-03-05 2000-12-26 The Regents Of The University Of California Method of concentrating prion proteins in blood samples
GB0119339D0 (en) * 2001-08-08 2001-10-03 Medical Res Council Method

Also Published As

Publication number Publication date
BG106021A (en) 2002-06-28
KR20020021774A (ko) 2002-03-22
WO2000065357A1 (en) 2000-11-02
NO20015094D0 (no) 2001-10-19
JP2002543389A (ja) 2002-12-17
SK15032001A3 (sk) 2002-02-05
CO5170446A1 (es) 2002-06-27
HUP0200777A2 (en) 2002-06-29
AR023553A1 (es) 2002-09-04
BR0009843A (pt) 2002-02-13
CN1347501A (zh) 2002-05-01
IL145253A0 (en) 2002-06-30
UY26109A1 (es) 2000-12-29
CA2367696A1 (en) 2000-11-02
DE19918141A1 (de) 2000-10-26
TR200103011T2 (tr) 2002-02-21
US20030129667A1 (en) 2003-07-10
EA200101021A1 (ru) 2002-04-25
ID30392A (id) 2001-11-29
EE200100547A (et) 2003-02-17
NO20015094L (no) 2001-12-17
US20030064424A1 (en) 2003-04-03
PL350985A1 (en) 2003-02-24
EP1093585A1 (en) 2001-04-25
MXPA01010546A (es) 2002-06-04
HK1043188A1 (zh) 2002-09-06
AU4297400A (en) 2000-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20013771A3 (cs) Způsob diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií a souprava k jeho provádění
US8435733B2 (en) Screening methods for transfusion related acute lung injury
US7413865B2 (en) Diagnostic method for a transmissible spongiform encephalopathy or prion disease
Wu et al. Approaching biomarkers of membranous nephropathy from a murine model to human disease
JPH06502916A (ja) 糖尿病自己抗体の検出方法
EP1843781B1 (en) Composition for prevention, treatment and diagnosis of chronic inflammatory airway diseases
JP2005527235A (ja) デフェンシン：抗ウイルス剤の使用
Ogata et al. Absence of measles virus receptor (CD46) in lesions of subacute sclerosing panencephalitis brains
EP2156183B1 (en) Prognostic assay for determining t cell response to hla antigens and use thereof in field of tissue transplantation
EP1861718B1 (en) Use of xcri for diagnosing or monitoring of immune tolerance
AU2002210740A1 (en) Method of diagnosing a transmissible spongiform encephalopathy
US7981619B2 (en) Composition for prevention, treatment, and diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)
US9068990B2 (en) Methods of predicting and decreasing the risk of pregnancy loss
EP1848997A1 (en) Composition for prevention, treatment, and diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease (copd)
JP2000197483A (ja) ＲｅｃＱＤＮＡヘリカ―ゼファミリ―遺伝子の変異に起因する疾患の検査方法
KR20060079750A (ko) 만성염증성기도질환의 예방, 치료 및 진단용 조성물