CZ20011468A3

CZ20011468A3 - Farmaceutická kompozice a léčiva pro léčení migrény

Info

Publication number: CZ20011468A3
Application number: CZ20011468A
Authority: CZ
Inventors: George Harry Sande
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2002-04-17
Also published as: IL141957A0; MA26702A1; TW524692B; BR9914901A; WO2000025778A1; IS5898A; BG105534A; KR20010089363A; CA2348543A1; JP2002528497A; TNSN99203A1; US20010020036A1; EA200100284A1; SK5522001A3; AP2001002129A0; TR200101174T2; HRP20010298A2; CO4950530A1; HUP0104696A3; NO20012013L

Description

Farmaceutická kompozice a léčiva pro léčení migrény

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu léčby migrény savců včetně člověka podáváním agonisty receptoru 5HTi v kombinaci s metoklopramidem danému savci. Vynález rovněž zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující farmaceuticky přijatelný nosič, agonistu receptoru 5HTi a metoklopramid. Příklady agonistů receptoru 5HTi zahrnují agonisty jednoho nebo více receptorů ze skupiny zahrnující 5HT_1A, 5HT_1B, 5HT_1C, 5HTi_D, 5HT_XEa 5HT1F.

Dosavadní stav techniky

Kombinované použití metoklopramidu a agonistů 5HTi (například eletriptanu, rizatriptanu, naratriptanu, sumatriptanu ale s vyloučením zolmitriptanu) pro akutní léčbu migrény nabízí zvýšenou účinnost a snížení nevolnosti ve srovnání s obvykle používanými terapiemi.

V roce 1975 zjistil Volans, že metoklopramid pomáhá mírnit gastrické stáze provázející záchvaty migrény. (Viz Volans G.N., British Journal of Pharmacology, únor 1975, 2(1), 67-73; a Volans G.N., Clinical Pharmacokinetics, červenec 1978, 3(4), 313-318). Uvedený autor tento jev studoval a prokázal, že hladiny aspirinu a acetaminofenu (paracetamol) v krvi při jejich orálním podání pacientům prodělávajícím migrénový záchvat klesají a v období mezi záchváty se vracejí na normální hodnoty. Použitím metoklopramidu s aspirinem nebo s acetaminofenem zvyšuje hladiny uvedených léčiv v krvi a umožňuje tak jejich účinnější využití při léčbě migrény.

Předpokládá se, že agonisté 5ΗΤχ budou vést při léčbě migrény kombinovaným podáváním s metoklopramidem k významně vyšší účinnosti léčby vyvolané zvýšenými hladinami orálně podaných agonistů 5ΗΤχ v krvi spojené s antiemetickým a antimigrenickým účinkem metoklopramidu.

Metoklopramid je derivát benzamidu a i když má blízký vztah k léčivům s neuroleptickým účinkem nemá žádné antipsychotické nebo sedativní účinky. Metoklopramid je antagista dopaminového a 5HT3 receptorů a zároveň vykazuje určité agonistické účinky na 5HT₄. Účinky metoklopramidu zahrnují antaganistické účinky na zvracení indukované apomorfinem nebo ergotaminem. Zahrnují rovněž indukci hyperprolaktinémii, charakteristickou vlastnost dopaminergní blokády. Metoklopramid má relativně nízkou afinitu na dopamin2(D2)receptor.

Je popsané, že kombinace metoklopramidu s některými agonisty 5ΗΤχ jako je zolmitriptan, nemá buď žádný účinek nebo dochází ke snížení farmakokinetické účinnosti zolmitriptanu. Seaber E.J. a sp., European Journal of Clinical Pharmacology, (1997) 53(3-4), a Roian P, Cephelalgia (říjen 1997), 17 Suppl. 18, 21-7.

Podstata vynálezu

Vynález se týká farmaceutických kompozic pro léčbu migrény savců včetně člověka, obsahujících metoklopramid; agonistů receptorů 5ΗΤχ nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl s vyloučením zolmitriptanu; a farmaceuticky přijatelný nosič.

změněný list

Vynález se rovněž vztahuje na způsob léčby migrény savců včetně člověka, kde uvedený způsob zahrnuje podávání farmaceutické kompozice obsahující metoklopramid; agonistu receptoru 5HTi nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl kromě zolmitriptanu; a farmaceuticky přijatelný nosič; danému savci, v dávce kompozice účinné pro léčbu migrény.

Vynález rovněž zahrnuje způsob léčby migrény savců včetně člověka, kde uvedený způsob zahrnuje podávání metoklopramidu; agonisty 5HTi receptoru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli s vyloučením zolmitriptanu; danému savci v množstvích umožňujících, aby uvedená kombinace obou léčivých látek byla účinná pro léčbu nebo pro prevenci migrény.

Výhodná provedení vynálezu zahrnují farmaceutické kompozice pro léčbu migrény a způsoby léčby migrény jak je uvedeno výše, kde uvedený agonista. receptoru 5HTi se zvolí ze skupiny zahrnující eletriptan, naratriptan, rizatriptan, sumatriptan, almotriptan, avitriptan, frovatriptan, alniditan, LY 334370, LY 306258, BMS-180048 a BMS-181855. Nejvýhodnější je farmaceutická kombinace eletriptanu a metoklopramidu, kde se rovněž předpokládá zlepšení farmakokinetických vlastností eletriptanu.

Další provedení vynálezu zahrnují farmaceutické kompozice pro léčbu migrény a způsoby léčby migrény jak .je popsané výše, kde uvedený agonista receptoru 5HTi je sloučenina obecného vzorce (I)

změněný list kde R³, R⁴ a Z znamenají skupinu nezávisle zvolenou ze skupiny zahrnující vodík, halogen (např. chlor, fluor, brom nebo jod), (C1-C4)alkyl případně substituovaný jedním až třemi atomy fluoru, (C1-C4) alkoxyskupinu případně substituovanou jedním až třemi atomy fluoru, a (C1-C4) alkoxy- (C1-C4) alkyl kde každá z alkylových částí skupiny může být případně substituovaná jedním až třemi atomy fluoru;

W znamená skupinu -CH₂-O- (Ci~C₆)alkyl, kde alkylová část může mít přímý nebo rozvětvený řetězec;

nebo W znamená -CH₂NR¹R², kde R¹ a R² každý nezávisle znamená skupinu zvolenou ze skupiny zahrnující vodík a (CiCď)alkylovou skupinu s přímým nebo s rozvětveným řetězcem;

nebo R¹ a R² společně s atomem dusíku ke kterému jsou připojené tvoří nasycený čtyřčlenný monocyklický kruh nebo nasycený nebo nenasycený nearomatický pětičlenný až sedmičlenný monocyklický kruh, nebo nasycený nebo nenasycený nearomatický sedmičlenný až desetičlenný bicyklický kruh, který může případně obsahovat kromě atomu dusíku skupiny NR¹R²obsahovat další jeden nebo dva heteroatomy nezávisle zvolené ze skupiny zahrnující kyslík, dusík a síru, a kde jeden až tři kruhové atomy uhlíku nebo jeden z kruhových atomů dusíku může být případně a nezávisle substituovaný skupinou ze skupiny zahrnující (C1-C4)alkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem, (Ci-C₆)alkoxy s přímým nebo s rozvětveným řetězcem, skupinou (C1-C3) alkyl-(C3-C7) cykloalkyl s přímou nebo s rozvětvenou alkylovou skupinou, hydroxy, amino, kyan, aryl-(alkyl (C1-C3) s přímým nebo s rozvětveným řetězcem) nebo heteroaryl-( alkyl(C1-C3) s přímým nebo s rozvětveným řetězcem), kde uvedený aryl znamená skupinu zvolenou ze skupiny zahrnující fenyl a

naftyl a uvedený heteroaryl znamená skupinu ze skupiny zahrnující oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, furyl, pyrazolyl, pyrrolyl, tetrazolyl, triazolyl, thienyl, imidazolyl, pyrazinyl, pyrazolyl, indolyl, isoindolyl, pyrazinyl, cinnolinyl, pyridyl a pyrimidinyl;

s výhradou, že pro jakýkoliv kruh vzniklý z NR^XR² platí: a) nemůže obsahovat více než jeden kruhový atom kyslíku; b) žádná ze skupin ze skupiny zahrnující hydroxy, alkoxy, alkoxyalkyl, kyan, amino nebo alkylamino není přímo navázaná na kterýkoliv z kruhových atomů dusíku; a c) žádný z kruhových atomů uhlíku který je spojený dvojnou vazbou s dalším kruhovým atom uhlíku a který není součástí aromatického kruhového systému nemůže být navázán na kruhový atom kyslíku nebo na kruhový atom dusíku;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Podrobný popis vynálezu

Příklady agonistů 5HTi které lze použít ve farmaceutických kompozicích a způsobech podle vynálezu a jejich způsoby přípravy jsou uvedené v následujících patentech a patentových přihláškách: U.S.patent 5,545,644 vydaný 13. srpna 1996; Evropský patent 776,323 udělený 11. února 1998; U.S.patent 5,618,834 vydaný 8.dubna 1997; světová patentová přihláška PCT/EP98/04176 designovaná pro USA podaná 1.července 1998; Evropský patent 503,440 udělený 18.června 1998; U.S.patent 4,816,470 vydaný 28.března 1989, Japonský patent 9,423,197, udělený 30.března 1994; Kanadský patent 1,241,004, udělený 23.srpna 1988; Evropský patent 497,512 udělený 24.září 1997; U.S.patent 5,300,506 vydaný 15.dubna 1994; Evropská patentová přihláška 711,769 zveřejněná 15.května 1996; světová patentová ···· přihláška WO 94/2460 zveřejněná 3.února 1994; U.S.patent 5,541,180 vydaný 30.července 1996; Evropská patentová přihláška 591,280 zveřejněná 13.dubna 1994; Evropský patent 639,192 udělený 15.května 1996; Evropská patentová přihláška 674,621 zveřejněná 4.října 1995 a Evropský patent 486,666 udělený 13.srpna 1997. Výše uvedené patenty a patentové přihlášky jsou plně včleněny do tohoto popisu odkazem.

Následující odkazy zahrnují práce popisující farmakologické vlastnosti určitých agonistů 5HTi uvedených výše vhodných pro použití ve výhodných provedení vynálezu: Robert a sp., Cephalagia 18(6):406, červenec/srpen 1998; Marathe a sp., Biopharm Drug.Dispos. 19(6):381-94, záři 1998; Saxena a sp., Eur.J.Pharmacol. 351(3):329-39, 26.červen 1998; Goldstein a sp., Cephalagia 18(6):410, červenec/srpen 1998; Buchán a sp., Cephalagia 18(6):410, červenec/srpen 1998; Block a sp., Cephalagia 18(6):409-10, červenec/srpen 1998; a Sheftell a sp., Cephalagia 18(6):403-4, červenec/srpen 1998; Perry a sp., Drugs (Nový Zéland) 55(6):889-922, červen 1998; Bomhof a sp., Cephalagia (Norsko) 18(1):33-7, leden 1998; Klasson a sp., Headaches (USA) 37(10):640-5, listopad/prosinec 1997;

Goldstein a sp., Cephalagia (Norsko) 16(7):497-502, listopad 1996; Parsons a sp., J.Cardiovasc.Pharmacol (USA) 32(2):220-4, srpen 1998; a Schoenen J., Curr.Opin.Neurol. 10(3):237-43, červen 1997. Uvedené práce jsou do tohoto popisu plně včleněné odkazem.

Výraz léčení použitý v tomto textu se vztahuje na zpomalení nebo na reverzi vývoje nebo na zmírnění nebo prevenci buď choroby nebo stavu ke kterému se výraz léčeni vztahuje nebo na jeden nebo více symptomů^uvedené choroby nebo stavu. Výraz léčba použitý v tomto textu se vztahuje • · k provedeni léčení choroby nebo stavu tak jak je výraz léčeni popsaný výše.

Vynález se vztahuje jak na způsoby léčení migrény ve kterých se metoklopramid a agonista 5ΗΤχ receptorů podávají společně jako součást jedné farmaceutické kompozice, tak na způsoby, ve kterých se uvedené dvě účinné složky podávají odděleně podle dávkovacího schématu navrženého.dosažení úspěšné kombinační terapie. V uvedeném dávkovacím schématu je množství každé podané dávky a intervaly mezi dávkami účinných složek závislé na použitém agonistovi 5HTi, druhu použité lékové formy, vlastnostech subjektu léčby a závažnosti léčené migrény. Obecně se při aplikaci způsobů podle vynálezu orálně podává agonista 5ΗΤ_Χ receptorů průměrnému dospělému člověku o hmotnosti 70 kg v množství v rozmezí od asi 1 do asi 400 mg denně, v jedné nebo v rozdělených dávkách, a metoklopramid se podává v množství od asi 5 do asi 125 mg denně v jedné nebo v rozdělených dávkách. Metoklopramid se obecně podává v množství v rozmezí od asi 20 do asi 80 mg denně, v závislosti na stupni bolesti hlavy a na způsobu podání. Metoklopramid lze podávat orálně, intranasálně, intravenózně, pro rektální podání ve formě čípků nebo ve flash formě (tj. lékové formě umožňující medikaci rozpuštěním přípravku v ústech bez nutnosti použití vody).

V níže uvedené tabulce jsou uvedené příklady výhodných rozmezí dávek určitých specifických agonistů 5HTi a metoklopramidu při jejich kombinovaném vzájemném použití.

5 HTi agonista	dávkové rozmezí pro zvolenou medikaci	dávkové rozmezí metoklopramidu
eletriptan	20 až 80 mg	5 až 20 mg
rizatriptan	5 až 10 mg	5 až 20 mg
sumatriptan	25 až 100 mg	5 až 20 mg
naratriptan	1 až 5 mg	5 až 20 mg

Agonisty receptorů 5ΗΤχ které se používají ve farmaceutických kompozicích a ve způsobech podle vynálezu, a jejich farmaceuticky přijatelné sole, lze podávat samotné nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly. Je možné je formulovat obvyklým způsobem s jedním nebo s více farmaceuticky přijatelnými nosiči, Uvedené sloučeniny lze podávat orálně, bukálně, intranasálně, parenterálně (např. intravenózně, intramuskulárně nebo subkutánně) nebo rektálně nebo ve formě vhodné pro podáni inhalaci nebo insulfací.

Pro orální podání mohou, být farmaceutické kompozice například ve formě tablet nebo tobolek připravených obvyklými způsoby s farmaceuticky přijatelnými přísadami jako jsou pojivá (např. pregelatizovaný kukuřičný škrob, polyvinylpyrrolidon nebo hydroxypropylmethylcelulosa); plniva (např. laktosa, mikrokrystalická celulosa nebo fosforečnan vápenatý), kluzné prostředky (např. stearan hořečnatý, talek nebo oxid křemičitý); prostředky ovlivňující rozpadavost (např. bramborový škrob nebo sodná sůl glykolátu škrobu); nebo smáčecí prostředky (např. laurylsíran sodný). Tablety je možné potahovat způsoby v oboru dobře známými. Tekuté přípravky pro orální podání mohou být ve formě například roztoků, sirupů nebo suspenzí, nebo mohou být ve formě suchého produktu, který • ·· · ·♦

se před použitím rozpustí ve vodě nebo jiném vhodném vehikulu. Uvedené tekuté přípravky je možné připravit obvyklými způsoby s použitím farmaceuticky přijatelných aditiv jako jsou suspendační prostředky (např. sorbitolový sirup, methylcelulosa nebo hydrogenované jedlé tuky); emulgační prostředky (např. lecitin nebo arabská guma); nevodná vehikula (např. mandlový olej, olejové estery nebo ethylalkohol); a konzervační prostředky (např. methyl- nebo propyl-p-hydroxybenzoáty nebo kyselina sorbová).

Pro bukální podání může kompozice být ve formě tablet nebo pastilek připravených obvyklým způsobem.

Agonisty 5HTi podle vynálezu a jejich soli je možné zpracovat do parenterálních přípravků vhodných pro injekční podání zahrnujících obvyklé způsoby kateterizace nebo infúze. Injekční přípravky mohou být ve formě jednodávkových přípravků například ve formě ampulí, nebo ve vícedávkové formě v nádobce s přídavkem konzervačního prostředku. Uvedené kompozice mohou rovněž být ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí, v olejovém nebo ve vodném vehikulu, které mohou obsahovat pomocné prostředky jako jsou suspendační, stabilizační a/nebo dispergační prostředky.

Alternativně může být účinná složka ve formě prášku určeného před použitím k rekonstituci s vhodným vehikulem, například s apyrogenní vodou.

Agonisty 5ΗΤ_Χ podle vynálezu a jejich soli je také možné zpracovat do kompozic pro rektální podání jako jsou čípky nebo retenční klystýry, například s použitím obvyklých čípkových základů jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

···· ·· φ ·

·.,··..* .ί· ’.......

Pro intranasální podáni nebo podáni inhalaci je možné účinné sloučeniny podle vynálezu zpracovat do formy roztoku nebo suspenze obsažené v tlakovém zásobníku pro rozprašování, kde uvedený roztok pacient rozprašuje tlačením nebo pumpováním, nebo do formy aerosolového spreje obsaženého v tlakovém zásobníku nebo rozprašovači s použitím vhodného hnacího plynu, například dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého nebo jiného vhodného plynu. V případě tlakového aerosolového přípravku je možné zajistit dávkovou jednotku tak, že nádobka se opatří dávkovačům ventilem poskytujícím odměřené množství přípravku. Tlaková nádobka nebo rozprašovač mohou obsahovat roztok nebo suspenzi aktivní sloučeniny. Také je možné připravit tobolky nebo zásobníky.(vyrobené například z želatiny) pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru, které obsahují práškovitou směs sloučeniny podle vynálezu a vhodného prášku jako základu, jako je laktosa nebo škrob.

Aerosolové přípravky pro léčbu migrény průměrného dospělého člověka se výhodně vyrobí tak, aby jednotlivá odměřené dávka nebo vypuštěná dávka aerosolu obsahovala 20 pg až 1000 pg sloučeniny podle vynálezu. Celková denní dávka při použití aerosolového přípravku je obvykle v rozmezí od asi 100 pg do 10 mg. Přípravek je možné podávat několikrát denně, například 2, 3, 4, nebo 8-krát denně pokaždé po 1, 2 nebo 3 dávkách.

Aktivitu agonisty 5-HTi receptoru nebo jeho soli lze stanovit v in vitro stanoveních vazby popsaných pro receptor

5-ΗΤι_Α, s použitím krysí mozkové kůry jako zdroje receptoru a [³H]8-OH-DPAT jako radioligandu (D.Hoyer a sp.,

Europ.J.Pharmacol., 1985; 118:13) a stanoveních popsaných pro

5-HTio s použitím hovězí kaudy jako zdroje receptoru a [³H]5-HT jako radioligandu (R.E.Heuring a S.J.Peroutka, J. Neuroscience,

1987; 7:894) .

Aktivitu sloučeniny in vitro na 5-HTi_d vazebné místo lze stanovit následujícím způsobem. Tkáň hovězí kaudy se homogenizuje a suspenduje se ve 20 objemech pufru obsahujícího 50 mM tris-hydrochloridu (tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid) o pH 7,7. Homogenát se pak odstřeďuje při 45 000 G 10 minut. Supernatant se pak odstraní a získaná peleta se resuspenduje v asi 20 objemech tris-hydrochloridového pufru o pH 7,7. Získaná suspenze se pak preinkubuje 15 minut při 37 °C načež se suspenze opět odstřeďuje 10 minut při 45 000 G a supernatant se odstraní. Získaná peleta (asi 1 gram) se pak resuspenduje ve 150 ml pufru 15 mM tris-hydrochloridu obsahujícího 0,01 % kyseliny askorbové o konečném pH 7,7 a současně obsahujícího 10 mM pargylinu a 4 mM chloridu vápenatého (CaCl₂) . Získaná suspenze se před použitím uchovává nejméně 30 minut v ledu.

Inkubace s inhibitorem, kontrolním vzorkem nebo vehikulem se provede následujícím způsobem. K 50 ml roztoku 20 % dimethylsulfoxid/80 % destilovaná voda se přidá 200 ml tritiovaného 5-hydroxytryptaminu (2 nM) v pufru obsahujícím 50 mM tris-hydrochloridu obsahujícího 0,01 % kyseliny askorbové při pH 7,7 a dále obsahujícího 10 mM pargylinu, 4 mM chloridu vápenatého, a 100 nM 8-hydroxy-DPAT (dipropylaminotetralin) a 100 nM mesulerginu. K této směsi se přidá 750 ml tkáně z hovězí kaudy a získaná suspenze se vortexuje aby suspenze byla homogenní. Získaná suspenze se pak inkubuje na třepačce s vodní lázní 30 minut při 25 °C. Po skončení inkubace se suspenze zfiltruje přes filtr ze skleněných vláken (např. Whatman GF/B). Získaná peleta se potom třikrát promyje 4 ml pufru obsahujícího 50 mM tris-hydrochloridu o pH 7,7. Pak se • · ·· • · · z *í •••li • · · · ·· ' · · ·· .· ·· ··· peleta vnese do scintilační nádobky obsahující 5 ml tekutého scintilátoru (aquasol 2) a ponechá se přes noc. Pro každou dávku hodnocené sloučeniny se pak vypočte procento inhibice. Z hodnot procent inhibice se pak vypočte hodnota IC50.

Schopnost sloučeniny nebo její soli vázat se na 5-HTi_arecpetory je možné stanovit následujícím způsobem. Tkáň mozkové kůry krysy se zhomogenizuje a rozdělí se na 1 gramové podíly, které se zředí 10 objemy 0,32 M roztoku sacharosy. Získaná suspenze se pak odstřeďuje 10 minut při 900 G, supernatant se oddělí a opět se odstřeďuje 15 minut při 70 000 G. Supernatant se odstraní a získaná peleta se resuspenduje v 10 objemech 15 mM tris-hydrochloridu o pH 7,5. Pak se suspenze inkubuje 15 minut při 37 °C. Po skončení preinkubace se suspenze odstřeďuje 15 minut při 75 000 G a supernatant se odstraní. Získaná peleta obsahující zpracovanou tkáň se pak resuspenduje v pufru obsahujícím 50 mM tris-hydrochloridu o pH

7,7 a dále obsahujícím 4 mM chloridu vápenatého a 0,01 % kyseliny askorbové. Získaná tkáň se pak uchovává při -70 °C až do přípravy před pokusem. Bezprostředně před použitím se tkáň rozmrazí, zředí se 10 mM pargylinu a uchovává se v ledu.

Potom se tkáň inkubuje následujícím způsobem. Připraví se po padesáti mikrolitrech kontrolního vzorku, inhibitoru nebo vehikula (konečná koncentrace je 1 % v DMSO) o různých koncentracích. K tomuto roztoku se přidá přidá 200 ml tritiovaného DPAT o koncentraci 1,5 nM v pufru obsahujícím 50 mM tris-hydrochloridu o pH 7,7 obsahujícího 4 mM chloridu vápenatého, 0,01 % kyseliny askorbové a pargylin. K tomuto roztoku se přidá 750 ml tkáně a získaná suspenze se vortexuje aby suspenze byla homogenní. Získaná suspenze se pak inkubuje na třepačce s vodní lázní 30 minut při 37 °C. Pak se suspenze zfiltruje, dvakrát se promyje 4 ml pufru obsahujícího 10 mM • · • · • ·

·· tris-hydrochloridu o pH 7,5 obsahujícího 154 mM chloridu sodného. Pro každou dávku hodnocené sloučeniny, kontrolního vzorku nebo vehikula se pak vypočte procento inhibice. Z hodnot procent inhibice se pak vypočte hodnota IC₅o·

Agonistickou a antagonistickou aktivitu sloučenin vůči receptorům 5-HTi_A a 5-HT_1D je možné stanovit s použitím jedné saturační koncentrace následujícím způsobem. Samci morčat Hartley se dekapitují a pro získání receptorů 5-HT_XA se použije hippokampus, zatímco receptory 5-HT_iD se získají z řezů 350 mM, připravených pomocí Mcllwainova nože na řezání tkání a vynětím substantia nigra z vhodných řezů. Jednotlivé druhy tkáně se pak homogenizují v 5 mM HEPES pufru obsahujícím 1 mM EGTA (pH 7,5) s použitím ručního sklo-Teflonového® homogenizátoru a odstřeďují se 10 minut při 35 000 x g při 4 °C. Pelety se resuspendují ve 100 mM HEPES pufru obsahujícím 1 mM EGTA (pH 7,5) na konečnou koncentraci 20 mg (hippokampus) nebo 5 mg (substantia nigra) proteinu ve zkumavce. Pak se přidají nálsedující složky v takovém množství, aby každá zkumavka obsahovala 2,0 mM MgCl₂, 0,5 mM ATP, 1,0 mM cAMP, 0,5 mM IBMX, 10 mM fosfokreatinu, 0,31 mg/ml kreatinfosfokinasy, 100 mM GTP a 0,5-1 mikrocurie [32PJ-ATP (30 Ci/mmol; NEG-003- New England Nuclear). Inkubace se zahájí přídavkem tkáně do silikonované mikrozkumavky pro odstřeďovaní (tři paralelní stanovení), a probíhá 15 minut při 30 °C. Do každé zkumavky se vnese 20 ml tkáně, 10 ml léčiva nebo pufru ( 10X konečná koncentrace), 10 ml 32 nM agonisty nebo pufru (10X konečná koncentrace), 20 ml forskolinu (3 mM konečné koncentrace) a 40 ml výše uvedené reakční směsi. Inkubace se ukončí přídavkem 100 ml 2% SDS, 1,3 mM cAMP, 45 mM roztoku ATP obsahujícího 40 000 dpm [³H]-cAMP (30 ci/mmol; NET-275-New England Nuclear) pro sledování výtěžku cAMP ze sloupců. Separace [³²P]-ATP a [³²P]-cAMP se provede způsobem popsaným autory Salomon a sp., Analytical • ♦ ·

Biochemistry, 1974, 58, 541-548. Radioaktivita se stanoví scintilačně s tekutým scintilátorem. Maximální inhibice se definuje 10 mM (R)-8-OH-DPAT pro receptory 5-ΗΤχ_Α, a 320 nM 5-HT pro 5-HTid receptory. Procentuální inhibice testovaných sloučenin se pak vypočte podle inhibičního účinku na (R)-8-OHDPAT pro receptory 5-ΗΤχ_Α nebo na 5-HT pro receptory 5-HTi_D. Opačná agonistem indukovaná inhibice forskolinem stimulované aktivity adenylátcyklasy se vypočte z agonistického účinku při koncentraci agonisty 32 nM.

Uvedené sloučeniny je také možné hodnotit z hlediska jejich antagonistické aktivity in vivo vůči agonistem 5-HTi_Dindukované hypotermii morčat následujícím způsobem.

Použijí se samci morčat Hartley, Charles River, o hmotnosti 250-275 g při dodání a o hmotnosti 300-600 g při zařazení do pokusu. Morčata se ustájí za standardních laboratorních podmínek s režimem osvětlení od 7 do 19 hodin na nejméně sedm dní před pokusem. Až do doby zahájení pokusu mají vodu a potravu k dispozici dle libosti.

Sloučeniny podle vynálezu je možné podávat ve formě roztoků v objemu 1 ml/kg. Volba vehikula závisí na rozpustnosti sloučeniny. Hodnocené sloučeniny se obvykle podávají buď orálním podáním (p.o) šedesát minut před podáním agonisty nebo subkutánně (s.c.) 0 minut před podáním agonisty

5-HTio jako je [3-(l-methylpyrrolidin-2-ylmethyl)-lH-indol-5-yl]-(3-nitropyridin-3-yl)amin, který je možné připravit způsobem popsaným v PCT publikaci WO93/111 06 zveřejněné 10.června 1993, a který se podává s.c. v dávce 5,6 mg/kg. Před prvním odečtením se morče umístí do boxu z průhledné plastické hmoty s podložkou obsahující dřevěné piliny a mřížovanou kovovou podlahu a nechá se aklimatizovat na okolní prostřední minut. Při každém odečtu teploty se pak zvířata umísťují do stejného boxu. Před každým odečtem teploty se zvíře pevně přidrží jednou rukou na 30 sekund. Pro měření teploty se použije digitální teploměr v malé sondě pro měření teploty zvířat. Sonda je vyrobená ze semiflexibilního nylonu s epoxidovou špičkou. Teplota se měří zavedením do rekta v délce 6 cm a ponechá se v rektu po dobu 30 sekund nebo až do stabilní hodnoty odečítané teploty. Zaznamenají se zjištěné teploty.

Při hodnocení s p.o. podáním se v čase -90 minut odečte bazální teplota před podáním léčiva, testovaná sloučenina se podá v čase -60 minut a v čase -30 minut se provede další odečet teploty. V čase 0 minut se podá agonista 5-HTi_D a v čase 30, 60, 120 a 240 minut se provedou další odečty teploty.

Při hodnocení s použitím subkutánního podání se bazální teplota před podáním léčiva odečte v čase -30 minut. Hodnocená sloučenina a 5-HTi_D agonista se podají současně a teploty se odečítají v čase 30, 60, 120 a 240 minut.

Výsledky se analyzují dvousměrnou analýzou proměnných s opakovaným hodnocením pomocí Newman-Keulsovy post hoc analýzy.

Agonistickou aktivitu pro 5-HT_x lze stanovit stanovením vazby na receptor in vitro jak je popsané pro stanovení vazby na receptor 5-ΗΤχ_Α s použitím krysí mozkové kůry jako zdroje receptoru a [³H]-8-OH-DPAT jako radioligandu (D.Hoyer a sp., Eur.J.Pharm., 118, 13 (1985)) a s použitím způsobu popsaného pro stanovení vazby na 5-HT_1D receptor s použitím hovězí kaudy jako zdroje receptoru a [3H]serotoninu jako radioligandu (R.E.Heuring a S. J. Peroutka, J.Neuroscience, Ί_, 894 (1987)).

···· •	·· • ·	• · * *	• · • · 9 9	• * · •
• •	♦ · • · ·	• <· * • · ·	• · · • ♦	• •
• · ·«	• ·	• · * · ·	• ·	99 9

Všechny hodnocené účinné sloučeniny vykazuji hodnotu IC₅₀ v každém z uvedených stavení 1 mM nebo menší.

Uvedené sloučeniny a jejich soli lze rovněž hodnotit na jejich antimigrenickou účinnost zkouškou ve které se hodnotí účinky podobné účinkům sumatriptanu na kontrakci izolovaného proužku psí saphena véna (P.P.A. Humprey a sp.,

Br.J.Pharmacol., 1988, 94:1128). Tento jev je možné blokovat pomoci methiothepinu, což je známý antagonista serotoninu. Sumatriptan je známý prostředek pro léčbu migrény, a poskytuje selektivní zvýšení vaskulární rezistence karotidy u anestezovaných psů. Předpokládá se, že tato vlastnost je základem jeho účinnosti (viz Fenwick a sp., British Journal of Pharmacology, 1989, 96:83.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice pro léčení migrény, vyznačující se tím, že obsahuje eletriptan, metoklopramid a farmaceuticky přijatelný nosič.
2. Použití farmaceutické kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení migrény u savce.
3. Použití a) metoklopramidu pro výrobu prvního léčiva a b) eletriptanu pro výrobu druhého léčiva, v obou případech pro léčení migrény u savce.
4. Použití podle nároku 3, kde první léčivo obsahující metoklopramid a druhé léčivo obsahující eletriptan se podávají odděleně podle dávkovacího režimu, který umožňuje, aby kombinace těchto samostatně podávaných účinných složek byla účinná pro léčení migrény.
5. Použití podle nároku 3, kde druhé léčivo dodává savci asi 1 až asi 400 mg eletriptanu za den a první léčivo dodává savci asi 5 až asi 125 mg metoklopramidu za den..
6. Použití a) agonisty receptoru 5HTi s vyloučením zolmitriptanu, nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu prvního léčiva a b) metoklopramidu pro výrobu druhého léčiva, v obou případech pro léčení migrény u savce, přičemž první léčivo obsahující agonistu receptoru 5HTi nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl se podává perorálně a druhé léčivo obsahující metoklopramid se podává intravenózně.
7. Použití eletriptanu spolu s metoklopramidem pro výrobu léčiva pro zvýšení farmakokinetity eletriptanu při léčení migrény u savce.