CZ2000660A3 - Tkáňové lepidlo a jeho použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká tkáňového lepidla na basi fibrinogenu, které obsahuje přidaný inhibitor elastasy. Dále se týká použití tkáňového lepidla pro výrobu preparátů pro využití v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou.

Description

Vynález se týká tkáňového lepidla na basi fibrinogenu a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Tkáňová lepidla na basi fibrinogenu, která jsou také označovaná jako fibrinová lepidla, imitují při svém lepícím účinku poslední fázi srážení krve. Při tom se fibrinogen působením thrombinu, který se při lepícím postupu většinou přidává do roztoku fibrinogenu, ale také je přítomen v každé ráně, štěpí na fibrinové monomery. Fibrinové monomery se ukládaj í spontáně s uspořádanými vláknitými strukturami, které se označují jako fibrin. Tento agregát fibrinových monomerů se potom za působení faktoru XIIla kovalentním příčným zesítěním dále stabilisuje. Při tom se vytváří mezi specifickými glutaminovými a lysinovými postranními řetězci fibrinových monomerů transamidisační reakcí peptidové vazby. Faktor XIIla, který je rovněž štěpen thrombinem z inaktivního faktoru XIII , je aktivní transamidasa a na základě svého účinku je označován také jako fibrinstabilisující faktor.

Ačkoliv při použití tkáňového lepidla probíhají principielně ty samé procesy, jako při přirozeném srážení krve, tak jsou u tkáňového lepidla v něm přítomné komponenty a faktory přece jen mnohem koncentrovanější než v krvi. Tim • fe fefefefe ·· ·· 91 99 fefe · · · · fe fefefefe • fe fefe fe fefefefe • fefefefe fefefe fefefe • fefe «fefe fefefefe ···· fefe fefe fefefefe fefe fefe probíhá srážení krve také mnohem rychleji a dosažené slepení tkáně nebo vytvořená krevní sraženina je podstatně bezpečnější a také stabilnější.

Předpokladem pro prosazení fibrinových lepidel na konci sedmdesátých let byly pokroky ve frakcionaci a čištění krevních srážecích faktorů. Teprve tím bylo umožněno vyrobit přírodní srážecí faktory tak čisté a koncentrované, jak je nutné pro eficientní lepení tkání. První komerčně dostupná tkáňová lepidla přišla na trh koncem sedmdesátých let a měla od té doby mnohé aplikační možnosti; například v oblastech, ve kterých s dosavadními chirurgickými technikami stále dochází ke značným problémům, například při silném krvácení, při slepování nervů nebo při prasknutí vnitřních orgánů, jako jsou játra a slezina.

Další výhoda fibrinového lepidla proti šití jehlou a vláknem spočívá v tom, že se zpracovávaná tkáň nebo orgán ještě dodatečně nepoškozuje procesem šití, přičemž použití tkáňových lepidel na basi fibrinogenu se vyskytuje mnohem méně komplikací a dosáhne se méně nápadných j izev než u dosavadních chirurgických švů. Vedle optimálního lepivého účinku, který zahrnuje vysokou zatížitelnost a vysokou vnitřní pevnost slepení, jakož i dobrou schopnost přilnavosti lepidla na povrch rány, popřípadě tkáně, jsou také pro optimalisaci slepení tkáně podstatné procesy, následující bezprostředně po slepení (viz AT-B-359 652 a AT-B-359 653).

K tomu patří řízení a kontrola pevnosti slepení v těle, jakož i resorbovatelnost a vlastností lepidla, podporujících léčení rány.

Proto má pro tkáňové lepidlo rozhodující význam nejen rychlý a bezpečný lepivý účinek, ale také to, že se vzniklé

4 · · *

4 4 4 4 4

44 4 · · 4444

4444 44 44 4444 ¢4 *4 slepení, popřípadě vznillá krevní sraženina, v průběhu určitého časového období v těle opět rozpustí a rána se v důsledku úplné resorpce vzniklé sraženiny opět zacelí.

Při tom je nutné tělu vlastní proces rozpouštění vzniklé krevní sraženiny, fibrinolysu, rovněž řídit optimalisací tkáňového lepidla.

Při fibrinolyse se ve vzniklé krevní sraženině přítomný fibrin odbourává, popřípadě odstraňuje, a tím se krevní sraženina rozpouští. Při tom se nejprve za působení vlastních nebo cizích plasminogen-aktivátorů, jako jsou faktory srážlivosti krve XI a XII, prekallikrein, urokinasa nebo t-PA, tvoří z inaktivního plasminogenu fibrinolyticky účinný plasmin, který vedle fibrinu štěpí také fibrinogen a krevní srážecí faktory V a VIII.

Vzhledem k tomu, že tělu vlastní procesy fibrinolysy nastávaj í většinou bezprostředně po vzniku sraženiny a z tohoto důvodu je nebezpečí, že vzniklé slepení tkáně nezůstane dostatečně pevné, popřípadě že vzniklá sraženina bude předčasně destabilisována, předpokládá de při lepení tkání zpravidla přídavek plasmininhibitoru nebo inhibitoru aktivátoru plasminogenu, aby se přímo nebo nepřímo inhiboval účinek plasminu a aby se tak vyvarovalo v počáteční fázi lepení před předčasnou fibrinolysou. Koncentrací inhibitoru se dají cíleně řídit doby rozpouštěni (doby lyse) vzniklé sraženiny, popřípadě slepení. Čím více se použije inhibitoru, tím stabilnější je sraženina vůči fibrinolyse, tím déle tedy zůstane tato sraženina stabilní a tím déle také trvá, než se lepidlo úplně resorbuje.

Platí tedy při použití inhibitoru fibrinolysy naleze- 4 tttt 99 ní optimální střední cesty mezi podpořením brzké fibrinolysy a pokud možno rychlého procesu léčení rány.

Jako inhibitor plasminu se v komerčně dostupných tkáňových lepidlech používá aprotinin, který je označován také jako boviní basický pankreatický trypsin-inhibitor. Aprotinin je polyvalentni proteasový-(kallikrein)-inhibitor a inhibuje srážecí faktory Xlla, Xla, Vlila, jakož 1 především plasmin a aktivátory plasminu, ale také trypsin, chymotripsin a kaliikrein.

Aprotinin se dříve vyráběl především z telat. Se zřetelem na problematiku použití boviního materiálu v léčivech, která se používají u lidí, se ale stále častěji používá rekombinantně vyrobený aprotinin.

Aprotinin se při slepování tkání používá zpravidla v množství 20 až 3000 kallikrein-inaktivátorových-jednotek (KIE)/ml tkáňového lepidla, přičež optimální koncentrace závisí na fibrinolytické aktivitě odpovídající tkáně.

Ukázalo se ale, že především v tkáních s vysokou fibrinolytickou aktivitou je účinek aprotininu, inhibující fibrinolysu, přes použití vysokých koncentraci aprotininu pouze velmi omezeně řiditelný a může proto docházet k nežádoucím předčasným procesům lyse.

Úkolem předloženého vynálezu tedy je dát k disposici tkáňové lepidlo, pomocí kterého by se překonaly nevýhody stavu techniky a pomocí kterého by se především při slepování tkání v ranách s vysokou plasminovou aktivitou zaručila uspokojivá a bezpečná ochrana proti předčasné fibrinolyse, přičemž nesmí být nijak negativně ovlivněna kvalita • 9 9 9 99 99 » 9 9 9999 9999 ·9 * 9999

9 9 9 9 «9999 9

9« 999 9999

9999 99 »9 9999 99 99 slepení .

Podstata vynálezu

Výše uvedený úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen tkáňovým lepidlem na basi fibrinogenu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje přidaný inhibitor elastasy. Překvapivě se totiž ukázalo, že proces fibrinolysy se může potlačit nejen inhibicí plasminu, popřípadě inhibici aktivace plasminogenu na plasmin, ale také inhibitory elastasy, popřípadě inhibitory, jejichž fibrinolysu inhibující účinek spočívá převážně na neplasminovém mechanismu fibrinolysy. Pro účely předloženého vynálezu se takovéto neplasminogenní inhibitory fibrinolysy pro jednoduchost zahrnují pod výraz inhibitor elastasy. Sice se spekulovalo, že vedle plasminem zprostředkované fibrinolysy by mohly probíhat ještě další procesy fibrinolysy, které nespočívají na plasminu (tedy proces, probíhající lysosomálně; viz Simon a kol., Blood 82 (8)(1993), str. 2414 až 2422), a které nemohou být podstatně inhibovány aprotininem, ukázalo se však, že tento non-plasmin fibrinolytic pathway” by také nemohl být inhibován specifickými elastasu inhibujícími peptidy, jako je N-methoxy-sukcinyl-L-alanyl-L-prolyl-L-valanylchlormethylketon (AAPVCK) (viz Simon a kol.) Tím překvapivější bylo, že podle předloženého vynálezu mohlo být zjištěno, že inhibitory, které nevykazují žádné (podstatné) plasmin inhibující nebo plasminogen-aktivátor inhibující účinky, tedy inhibitory elastasy podle předloženého vynálezu, mohou zaručit u fibrinových lepidel jak in vitro, tak také in vivo velmi dobře kontrolovatelný proces lyse vytvořené sraženiny. Toto se jeví jako obzvláště výhodné u tkáni se zvýšenou fibrinolytickou aktivitou, ve kterých tyto • ft ftft*· ftft · · · · · · • ft · · · ♦ « ftftftft ftft ft* · ftftftft — · ftftft······· • · · · · · ftftftft • ftftft ftft ftft ftftftft ftft ftft mohou j iž v moderátních koncentracích potlačit předčasnou lysí.

Předčasná lyse hraje u tkání s vysokou fibrinolytickou aktivitou především také roli během první fáze po slepení , neboť při předčasné lysí může docházet k (částečnému) rozpuštění slepení a tím k obnovenému procesu krvácení (rebleeding).

Dále se ukázalo, že inhibitor elastasy, použitý podle předloženého vynálezu ve tkáňovém lepidle, vykazuje fibrinolytický účinek nejen v kombinaci s dosavadními, na plasmin působícími inhibitory, ale že může být inhibitorem elastasy samotným zaručena také celková inhibice fibrinolysy. Zvláštní forma provedení předloženého vynálezu spočívá tedy v tom, že tkáňové, lepidlo neobsahuje kromě fibrinogenu, inhibitoru elastasy a popřípadě faktoru XIII žádné další aktivní komponenty.

Koncentrace fibrinogenu v lepidle podle předloženého vynálezu odpovídá známému tkáňovému lepidlu a měla by být zpravidla alespoň přes 50 mg, obzvláště přes 70 až 80 mg fibrinogenu/ml, tedy jedná se o alespoň asi dvacetinásobnou koncentraci fibrinogenu, jaká jev krvi (2 až 4 mg/ml). Výhodně se fibrinogen vyskytuje ve vůči kryoprecipitaci dále čištěné formě.

Výhodné inhibitory elastasy jsou v rámci předloženého vynálezu zvolené ze skupiny zahrnující eglin, inhibitor elastasa-α-^-proteasy, a-^-antiproteasa, elafin, inhibitor leukocytové proteasy, obzvláště frakce leukocytů, výhodně frakce odvozená od granulocytů, nebo inhibitor humání sekretorické leukoproteasy, nebo jejich směsi. Jak frakce ·· 4444 ·· 44 44 44 • 4 4 4444 4444

44 4 4444

4*44 444 44 4

44 444 4444

4444 44 44 4444 44 44 leukocytů se může použít například buněčný lysát, obzvláště lysát, odvozený od humánich buněk. Další inhibitory elastasy nebo jiné ne na plasmin působící inhibitory fibrinolysy mohou odborníci zkoušet jednoduchým způsobem pomocí testovacích systémů uvedených v příkladech se zřetelem na jejich působení ve tkáňovém lepidle podle předloženého vynálezu nebo za použití elastasových inhibičních testů, známých ze stavu techniky. K výhodným inhibitorům elastasy se počítají také různé deriváty inhibitorů elastasy podle předloženého vynálezu, například fragmenty nebo chemicky nebo pomocí protein-design (rekombinantní) modifikované formy těchto inhibitorů, přičemž tyto deriváty však samozřejmě vždy musí mít kvalitativní vlastnosti inhibitoru elastasy základního inhibitoru.

Výhodně sestává tkáňové lepidlo výhradně z lidských proteinů, přišemž pod lidskými proteiny se rozumí také rekombinantně vyrobené humání proteiny. Výhodně se tedy proteiny, používané ve tkáňovém lepidle, buď vyrábějí z krve, plasmy nebo kryoprecipitátu, nebo z rekombinantní buněčné kultury.

Obzvláště výhodné tkáňové lepidlo se vyznačuje tím, že je výhradně složené z lidské krve nebo z plasmových proteinů .

Poměr množství inhibitoru elastasy k mg fibrinogenu činí výhodně 1 : 100 až 1 ; 150 000, obzvláště 1 : 500 až 1 : 110 000 . Vyjádřeno v jednotkách inhibitoru ke g fibrinogenu se do tkáňového lepidla přidává výhodně alespoň 10E/g fibrinogenu. Obzvláště výhodné je rozmezí mezi 10“3 a 10 E/g fibrinogenu. Množství přidaného inhibitoru ve tkáňovém lepidle podle předloženého vynálezu, přičemž tento • fe fefefe ♦ • fe fefe fefe • fe · fefefefe fefefefe • fe fefe fe fefefefe • fefefefe ······ fefefe fefefe fefefefe fefefefe fefe ·· fefefefe fefe fefe inhibitor může být obsažený také přirozeně v krvi, popřípadě plasmě, je výhodně alespoň dvacetkrát, obzvláště alespoň padesátkrát vyšší, než je jeho fyziologická koncentrace v krvi, popřípadě plasmě. Tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu může být například složené následovně : 75 až 115 mg/ml srážitelného proteinu, z toho 50 až 110 mg/ml, výhodně 70 až 110 mg/ml fibrinogenu; popřípadě 1 až 50, výhodně 10 až 50 IE faktoru XIII/ml. Jako inhibitor se může přidat například eglin v množství v rozmezí 1 až 100 pg/ml nebo α-^-antiproteasa s 0,01 až 1 E/ml . Zpravidla je dostačující přidávat inhibitor elastasy v množství, které odpovídá fibrinolysu inhibujícimu účinku aprotininu ve známých tkáňových lepidlech.

Lepidlo podle předloženého vynálezu může vždy podle účelu lepení obsahovat plasminogen nebo může být prosté plasminogenu. Když je obsažen plasminogen, měl by být obsažen v množství alespoň 0,0001 mg/mg fibrinogenu, výhodně více než 0,001 , obzvláště více než 0,01 mg/mg fibrinogenu. S přítomností plasminogenu ve tkáňovém lepidle je na základě jeho aktivace na plasmin rovněž dána možnost ještě zřetelněji definovat fibrinolytické flastnosti tkáňového lepidla.

Na druhé straně neobsahuje tkáňové lepidlo v další výhodné formě provedení prakticky žádný plasminogen, nebo ho obsahuje pouze v nepatrném množství.

Jak bylo uvažováno, postačuje přítomnost inhibitoru elastasy jako jediného inhibitoru fibrinolysy ve tkáňovém lepidle překvapivě pro funkčnost lepidla podle předloženého vynálezu. Výhodně se ovšem vedle inhibitoru elastasy používá také inhibitor plasminu nebo inhibitor aktivátoru · 4 44 44

4 4 4444 4444

44 4 4444

O - 4 444 4 * 4 4 4 4 4

S · * 4 4 4 4 4444

4444 44 44 44·4 44 44

4444 plasminu, což rovněž přispívá k lepší kontrole lyse resorpce a tímk léčení rány. Výhodné plasmin-inhibitory nebo inhibitory aktivátoru plasminogenu jsou především aprotinin, nebo také c^-makroglobulin, α^-antitrypsin, kyselina epsilon-aminokapronová, kyselina tranexamová nebo směsi těchto látek. Ačkoliv někteří autoři připisovali také například α-^-antitrypsinu určité účinky na elastasu, jsou tyto zde uvažované látky považovány za aktivátory plasminu, popřípadě plasminogenu, neboť toto je primární aktivita, kterou tyto látky v uvedené oblasti vykazuj í. Toto platí tedy samozřejmě také pro účely předloženého vynálezu. Dále mohou být obsažené také antiadhesivní přísady, například kyselina hyaluronová.

Další výhodná forma provedení tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že se v lepidle počítá s antibiotikem, jak již bylo navrženo v AT-B-369 990 . Obzvláště výhodná antibiotika jsou při tom zvolená ze skupiny aminoglykosidů, β-laktamů, polypeptidů, fosfomycinu, tetracyklinů nebo jejich směsí. Při výhodné formě provedení se antibiotikum vyskytuje ve formě těžko rozpustného derivátu.

Výhodně se v tkáňovém lepidle podle předloženého vynálezu vyskytuje také faktor XIII , takže je positivně ovlivněna vnitřní pevnost sraženiny a pevnost a trvanlivost slepení. Faktor XIII se pro to používá výhodně v množství 1 až 50 jednotek/ml, výhodně okolo 10 jednotek/ml. Ve vztahu k fibrinogenu se vyskytuje faktor XIII výhodně v minimální koncentraci 0,001 E/mg fibrinogenu, obzvláště alespoň 0,1 E/mg fibrinogenu. Vždy podle druhu slepení nebo typu tkáně může být ale optimální koncentrace faktoru XIII každým odborníkem lehce optimalisována. Pokud je

4

4 4444 *444

4 4 4 · 44*·

444 4 444 *4 4 • 44 4 4 4 4 4 4 4

4444 44 4· 4··· 44 44 v tkáňovém lepidle přítomné antibiotikum, tak se doporučuje zásadně použít více faktoru XIII (viz AT-B-369 990).

Výhodně je tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu prosté kininogenních proteinů (jako je například kallikrein a podobně) , čímž mohou být rušivé vedlejší reakce předem znemožněny.

Podle další výhodné formy provedení se tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu používá s pevným povrchem jako vláknina, čímž se především u velkoplošných ran dosáhne optimálního uzavřeni rány a optimálního překryti. Příklady takovýchto vláknin jsou uvedené v AT-B-374 367. Pevný povrch vlákniny je proto výhodně povrch kollagenu, želatiny nebo polysacharidu, přičemž se mohou použít také další medicínsky vhodné povrchy, které také mohou být popřípadě impregnované pro specielní účely použití.

Ukázalo se, že se podle předloženého vynálezu s tkáňovým lepidlem, obsahujícím inhibitor elastasy, dokonce v prostředí s vysokou fibrinolytickou aktivitou, může dosáhnout v časovém období alespoň 10 hodin, výhodně 15 hodin, oddolnosti vůči lysi. Oddolnost vůči lysi znamená podle předloženého vynálezu to, že se odpovídající fibrinová sraženina během určitého časového období neodbourává, tedy zůstává jako taková. Stanovení oddolnosti vůči lysi se provádí například fotometrickým měřením v závislostí na čase. Výhodné tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu vykazuje proto oddolnost vůči lysi alespoň 10 hodin, výhodně alespoň 15 hodin, v prostředí vysoké fibrinolytické aktivity. Pod pojmem vysoká fibrinolytická aktivita se rozumí například plasminová aktivita, která leží nad fyziologickým plasminovým potenciálem. Fibrinolytický potenciál může být

0 ·

0 0 0

0 0

0 0000

0 0 0 0 0 0 •0 0000 ·· ·· například vyjádřen koncentraci plasminogenu (viz například Henriksson a kol., Thrombosis Research 16 : 301 až 312;

1979). Tuto vlastnost oddolnosti vůči lysí může každý odborník přezkoušet pomoci jednoduchého testu, jak je popsáno v příkladech provedení.

Při aplikaci se používá tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu výhodně v roztoku, pro skladování se však doporučuje buď hluboké zmrazení roztoku, takže se tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu vyskytuje ve hluboko zmrazené formě, nebo lyofilisace lepidla, tedy výskyt v lyofilisované formě. Pod pojmem lyofilisovaná forma se rozumí samozřejmě pouze preparáty tkáňových lepidel, upravené lyofilisací do trvanlivých forem preparátů tkáňových lepidel, které se při následující rekonstituci mohou prakticky úplně (to znamená z alespoň 80 %) rekonstituovat v průběhu několika málo minut při teplotě 37 °C

Tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu se výhodně vyskytuje ve formě, zabezpečené proti virům.

Toto inaktivační zpracování se zajišťuje výhodně zpracováním tensidy a/nebo teplem, například tepelným zpracováním v pevném stavu, obzvláště zpracováním parou podle EP-0 159 311 , EP-0 519 901 nebo EP-0 674 531.

Další zpracování proti virům zahrnuj í také zpracování pomocí chemických nebo fyzikálně chemických metod, například pomoci chaotropních látek podle VO 94/13 329 , DE-44 34 538 nebo EP-0 131 740 (rozpouštědlo) nebo zpracování fotoaktivací.

Nanofiltrace představuje rovněž výhodný způsob odΦΦ φφφφ

ΦΦ φφφφ

ΦΦ ΦΦ ► φ φ ’ » φ φ « φφφφ ΦΦ stranění virů v rámci předloženého vynálezu.

Podle předloženého vynálezu přidávané inhibitory elastasy mohou být podle jedné výhodné formy provedení také rekombinantního původu.

Předložený vynález se také týká dále systému tkáňových lepidel, který jako jednu komponentu zahrnuje tkáňové lepidlo podle předloženého vynálezu, obsahující inhibitor elastasy.

Systém tkáňových lepidel podle předloženého vynálezu obsahuje zpravidla jako další komponentu thrombinovou komponentu, ve které se thrombin vyskytuje v kapalné formě nebo jako rekonstituovatelný lyofilisát, přičemž thrombinová komponenta může být při použití lepidla vždy podle oblasti použití různě koncentrovaná.

Systém tkáňového lepidla, který rovněž spadá pod předložený vynález, se vyznačuje tím, že zahrnuje fibrinogenovou komponentu a od ní oddělenou komponentu, která obsahuje inhibitor elastasy. Zpravidla je však vhodné komponentu inhibitoru fibrinolysy mít ve fibrinogenové komponentě (viz AT-B-359 652). Vhodným aplikačním uspořádáním je možno ale přivádět inhibitorovou komponentu také odděleně od fibrinogenové komponenty. Výhodně obsahuje komponenta, která obsahuje inhibitor elastasy, také současně thrombin, přičemž tato komponenta se opět může dávat k disposici buď jako lyofilisát nebo jako roztok (popřípadě hluboce zmražený).

Systémy lepidel podle předloženého vynálezu zahrnuj i dále vhodná aplikační zařízení pro komponenty systému (n). Obzvláště se při tom osvědčily dvoustříkačkové systémy, po- 13 psané v EP O 037 393 , EP O 210 160 nebo EP 0 292 472 , nebo také aplikační zařízení, jaká jsou popsaná v EP 0 315 322 nebo EP 0 669 100 . Pomocí těchto specielních aplikačních zařízení mohou také takové formy provedení, u kterých je inhibitor aplikován v thrombinové komponentě, poskytovat spolehlivé výsledky lepení.

Lepidlo podle předloženého vynálezu je vhodné pro všechny známé aplikační možnosti fibrinových lepidel. Osvědčilo se však obzvláště při lepení v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou. Předmětem předloženého vynálezu je tedy také použití tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu, popřípadě systému tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu, pro výrobu preparátu, popřípadě aplikačního zařízení, pro použití v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou, obzvláště v urologii. Předmětem předloženého vynálezu je dále použití tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu nebo systému tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu, v chirurgii v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou, obzvláště v urologii.

Přehled obrázků na výkresech

Přiložené obrázky slouží k bližšímu objasnění vynálezu. Tyto obrázky představují :

Obr. 1 : Úbytek extinkce odpovídající přibývající lysi sraženiny

a) fibrinové lepidlo bez aprotininu

b) fibrinové lepidlo s aprotininem (1000 U/ml)

c) fibrinové lepidlo s alfal-PI (0,01 U/ml

9999

9999

d) fibrinové lepidlo s alfal-PI (0,001 U/ml)

e) fibrinové lepidlo s alfal-PI (0,0001 U/ml) ;

Obr. 2 : Úbytek extinkce odpovídající přibývající lysí sraženiny

a) fibrinové lepidlo s aprotininem (1000 U/ml)

b) fibrinové lepidlo s eglinem (1 gg/ml)

c) fibrinové lepidlo bez aprotininu ;

Obr. 3 : Míra opětovného krvácení (rebleeding), vyjádřená přírůstkem hmotnosti předem zváženého vzorku v hyperfibrinolytickém mediu, který byl indukován infusí t-PA

Obr. 4 : Míra opětovného krvácení (rebleeding), vyjádřená přírůstkem hmotnosti předem zváženého vzorku v mediu s normální fibrinolytickou aktivitou, tedy bez infuse t-PA.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález je dále blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení, na které by však neměl být omezován.

Příklad 1

In vitro test pro zkoušku fibrinolysu inhibujícího účinku tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu (současně podle názoru přihlašovatele nej lepší cesta pro provedení vynálezu)

V tomto příkladě se ukazuje blokáda lyse sraženiny • 0

tkáňového lepidla pomocí eglinu nebo α-^-antiproteasy. Při tom se tkáňové lepidlo STIM3 (Immuno AG, Vien, AT), obsahující 70 mg fibrinogenu/ml, rozpustí ve vodě a potom se zředí 0,9 M roztokem chloridu sodného 1:6.

Tento roztok tkáňového lepidla se smísí s roztokem thrombinu, rozpuštěným ve 40 mM CaCl2 a potom zředěným 40 mM roztoku CaC^/0,9 M NaCl (1 : 5) na 0,1 E/ml v poměru 1:1 a naplpetuje se na mikrotitrační destičku, přičemž se použije 100 μΐ/misku.

Do tkáňového lepidla se přidávají různé koncentrace inhibitorů v množství vždy 5 μΐ (eglin 1 až 100 μg/ml, a^-antiproteasa 0,01 až 1 E/ml).

Pro vytvrzení lepidla se mikrotitrační destička inkubuje po dobu asi 1,5 hodiny při teplotě 37 °C . Odpovídající reagencie pro lysi (a: bezbuněčný supernatant z homogenátu leukocytů (3x zmrazený/roztátý) 500000 leukocytů/μΐ; b: t-PA 2 mg/ml jako positivní kontrola; NaCl 0,9% jako negativní kontrola) se napipetují na sraženinu (100 μΐ/misku). Potom se mikrotitrační misky měří deskovým fotometrem při teplotě 37 °C při vlnové délce 405 nm kineticky přes noc 60 x 900 s ve fotometru SLT 340 ATTC . Výsledky jsou uvedené v obr. 1 a 2 , přičemž úbytek extinkce odpovídá přibývající lysi sraženiny.

Ukázalo se, že jak s 1 μ eglinu/ml , tak také s > 0,01 E α-^-antiproteasy/ml je možné v pokusu v průběhu 15 hodin probíhající lysi fibrinové sraženiny potlačit, z čehož se dá jednak usoudit na centrální roli leukocytových proteas pro odbourávání fibrinové sraženiny a ukazuje se výborný účinek inhibitorů elastasy podle předloženého vyná4 4 «··· 4» » · « · « · 4 V***· • « 4 4 4 4«·« • «4·· 444 44 · • » · 4 4 · 4444

4444 44 4* 4*44 ·· ·«

- 16 lezu na potlačení této lyse.

Příklad 2

In vivo účinek inhibitorů elastasy, použitých podle předloženého vynálezu

Pro zjištění významu leukocytových proteas, obzvláště inhibitorů elastasy, v rámci předloženého vynálezu, se pro názorné vysvětlení zastavení krvácení pomocí tkáňového lepidla testuje jak účinek lepidla podle předloženého vynálezu v hyperfibrinolytickém systému, tak také při normální fibrinolytické aktivitě a srovnává se s lepidly bez inhibitorů, popřípadě s lepidlem, které obsahuje pouze aprotinin jako plasminový inhibitor.

Příklad 2a

Hyperfibrinolysa

Anestesovaní králíci (2 až 3 kg) se heparinisují (4000 E/kg). Půl hodiny potom se zasvorkuje část pravého laloku jater a parcielně distálně se od svorky resekuje. Krvácení z větčích cév se zastaví pomocí elektrokoagulace a zbytkové difusní krvácení se zastaví nanesením tkáňového lepidla (maximálně 4 ml) v průběhu 200 s . 10 minut potom se začne s infusí t-PA (700 E/kg/h) a po dobu 2 hodin se zjišťuje míra opětovného krváceni (rebleeding), vyjádřená přírůstkem hmotnosti předem zváženého vzorku .

Při tom se testují tři různá tkáňová lepidla.

a) Tkáňové lepidlo (STIM3) s aprotininem (3000 E/ml) jako negativní kontrola

b) tkáňové lepidlo (STIM3) bez aprotininu jako positivní kontrola

c) tkáňové lepidlo (STIM3) bez aprotininu s eglinem (10 pg/ml) jako lepidlo podle předloženého vynálezu.

Tato lepidla se promísí a aplikují se pomocí stříkačky Duploject^ (firma Imunno, Vien, AT).

Získané výsledky jsou znázorněné na obr. 3 .

Příklad 2b

Normální fibrinolytická aktivita

Dodatečně k hyperfibrinolysnímu modelu se provedou ještě stejné pokusy bez t-PA-infuse, avšak s prodlouženou dobou pozorování 4 hodiny. Získané výsledky jsou znázorněné na obr. 4 .

Ukázalo se, že jak v modelu hyperfibrinolysy, tak také při normální fibrinolyse je ve srovnání s dosavadními lepidly umožněno snížení opětovného krvácení, přičemž lepidlo má především při delších dobách lyse také vůči aprotininu zlepšené vlastnosti.

Tyto výsledky dokládají výborné účinky tkáňového lepidla podle předloženého vynálezu, pomocí kterých se může potlačit předčasná lyse fibrinového lepidla, čímž se může zamezit obnovenému krvácení také v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou.

Claims (28)

1. Tkáňové lepidlo na basi fibrinogenu, vyznačující se tím, že obsahuje přidaný inhibitor elastasy.

2. Tkáňové lepidlo podle nároku 1 , vyznačující se tim.že inhibitor elastasy je zvolený ze skupiny zahrnující eglin, inhibitor elastasa-α-^-proteinasy, α^-antiproteasa, inhibitor leukocytové proteasy, elafin nebo jejich směsi.

3. Tkáňové lepidlo podle nároku 2 , vyznačující se tím, že inhibitor leukocytové proteasy je k disposici jako frakce leukocytů, obzvláště jako frakce odvozená od granulocytů.

4. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 3 , vyznačující se tím, že je složeno výhradně z lidských proteinů.

5. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že je složeno výhradně z lidských krevních nebo plasmových proteinů.

6. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 5 , vyznačující se tím, že inhibitor elastasy je obsažen v poměru množství 1 : 100 až 1 : 150000, výhodně 1 : 500 až 1 : 110000 , vztaženo na jeden mg fibrinogenu .

7.

Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 6 ,

9 «

99 99

9 9 9 9

9 9 ·

9 9 9

9 9 9 • » 99·· vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 10jednotek inhibitoru elastasy na jeden gram fibrinogenu, výhodně mezi 10až 10 jednotek/g fibrinogenu.

8. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že obsahuje plasminogen v množství alespoň 0,0001 mg/mg fibrinogenu, výhodně alespoň 0,001 mg/mg a obzvláště více než 0,01 mg/mg fibrinogenu.

9. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že neobsahuje žádný plasminogen.

10. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 9 , vyznačující se tím, že obsahuje dále inhibitor plasminu nebo inhibitor aktivátoru plasminu, který je výhodně zvolen ze skupiny zahrnující aprotinin, c^-makroglobulin, α-^-antitrypsin, kyselinu epsilon-aminokapronovou, kyselinu tranexamovou nebo jejich směsi.

11. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 10 , vyznačující se tím, že obsahuje antibiotikum, které je výhodně zvolené ze skupiny zahrnující aminoglykosidy, β-laktamy, polypeptidy, fosfomycin, tetracykliny nebo jejich směsi.

12. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 11 , vyznačující se tím, že obsahuje faktor XIII , výhodně v množství alespoň 0,001 U/mg fibrinogenu, obzvláště výhodně alespoň 0,1 U/mg fibrinogenu.

13.

Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 12 , • · • · · · · * ···· · · · · · *·· vyznačující se tím, že je prosté kininogenních proteinů.

14. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 13 , vyznačující se tím, že se vyskytuje v kombinaci s pevným povrchem jako vláknina.

15. Tkáňové lepidlo podle nároku 14 , vyznačující se tím, že pevným povrchem je povrch kollagenu, želatiny nebo polysacharidů.

16. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 15 , vyznačující se tím,žejev mediu s vysokou fibrinolytickou aktivitou oddolné lysí po časové období alespoň 10 hodin, výhodně alespoň 15 hodin.

17. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 16 , vyznačující se tím, že je lyofilisované.

18. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 16 , vyznačující se tím, že se vyskytuje v roztoku.

19. Tkáňové lepidlo podle nároku 18 , vyznačující se tím, že roztok je hluboce zmražený.

20. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 19 , vyznačující se tím, že se vyskytuj e ve virově inaktivované formě.

21. Tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 20 , vyznačující se tím, že inhibitor elastasy je rekombinantnlho původu.

22. Systém tkáňového lepidla, vyznačující se tím, že jako jednu komponentu obsahuje tkáňové lepidlo podle některého z nároků 1 až 21 .

23. Systém tkáňového lepidla podle nároku 22 , vyznačující se tím, že dále obsahuje komponentu, obsahující thrombin a popřípadě vápník.

24. Systém tkáňového lepidla, vyznačující se tím, že obsahuje fibrinogenovou komponentu a komponentu, obsahující inhibitor elastasy.

25. Systém tkáňového lepidla podle nároku 24 , vyznačující se tím, že komponenta, obsahující inhibitor elastasy, obsahuje thrombin.

26. Systém tkáňového lepidla podle některého z nároků 22 až 25,vyznačuj ící se tím, že dále zahrnuje aplikační zařízení pro komponenty systému, obzvláště systém dvojité stříkačky.

27. Použití tkáňového lepidla podle některého z nároků 1 až 19 pro výrobu preparátů pro využití v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou, obzvláště v urologii.

28. Použití systému tkáňového lepidla podle některého z nároků 22 až 26 pro výrobu aplikačního zařízení pro využití v oblastech s vysokou fibrinolytickou aktivitou, obzvláště v urologii.