CZ2000632A3

CZ2000632A3 - Deriváty 4-kyano-4 deformylsordarinu, způsob jejich přípravy a farmaceutický a agrochemický prostředek zahrnující tyto deriváty

Info

Publication number: CZ2000632A3
Application number: CZ2000632A
Authority: CZ
Inventors: Jennifer Nielsen-Kahn; Bruno Tse
Original assignee: Merck And Co., Inc.
Priority date: 1998-08-18
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2000-08-16

Abstract

Deriváty 4-kyano-4-deformylsordarinujsou fungicidní činidla vhodná pro léčbu a/nebo prevenci lidských a živočišných plísňových infekcí a pro kontrolu fytopatogenních plísní zemědělských plodin.

Description

Derivát^. 4-kyano-4-deformylsordarinu₍ / a agrochemický prostředek zahrnující tyto » · · « ·· ·· fepůsob-výroby| farmaceutický a deriváty

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů 4-kyano-4-deformylsordarinu, které jsou silnými fungicidními činidly se širokým spektrem účinků a zvýšenou stabilitou, způsobů výroby těchto derivátů, farmaceutických a zemědělských prostředků obsahujících tyto sloučeniny a způsobů kontroly plísňových infekcí u lidí, zvířat a rostlinných materiálů pomocí těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Sordarin je fungicidní antibiotikum izolované z plísně Sordaria araneosa (viz. britský patent GB 1162027 a Helvetica Chimica Acta, 1971, 51, 119-120). Jsou známa i jiná fungicidní činidla mající stejný strukturní základ jako sordarin. V Kokai J62040292 je popsána sloučenina s označením zofimarin, která byla izolována ze Zofiela marina sp.; v Kokai J06157582 je popsána sloučenina označovaná jako BE-31405, která byla | izolována z Penicillium sp.; a v J. Antibiotics, 1995, 48,

1171-1172 je popsána sloučenina s označením SCH57404. Ve &

zveřejněných PCT přihláškách WO96/14326 a WO96/14327 jsou 'w popsány semisyntetické deriváty sordarinu.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález se týká sloučenin obecného vzorce (I):

(I)

kde Z je tetrahydropy.ranová skupina vybraná ze skupiny zahrnující sloučeniny obecných vzorců (a) až (f):

(a) (b) (c)

í, t

a jejich solí a solvátů (např. hydrátů) nebo jejich metabolicky labilních derivátů, kde

R^a je skupina C(O)CH₃ nebo methylová skupina;

R¹ je atom vodíku, atom halogenu, hydroxylová skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo acyloxyskupina;

R² a R³ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkylová skupina • · · · • ·

• · • · • · • · v

obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituovaná alkoxyskupinou obsahující 1 až. 4 atomy uhlíku, nebo

R² a R³ spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=0), thiokarbonylová skupina (C=S) nebo cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku;

R⁴ je atom vodíku nebo skupina CH2R⁷ (kde R⁷ je atom vodíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo skupina OCOR⁸, ve které R⁸ je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo arylová skupina);

R⁵ a R⁶ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituovaná alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, nebo

R⁵ a R⁶ spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=0), thiokarbonylová skupina (C=S) nebo cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku;

n je nula nebo 1;

X a Y jsou každý nezávisle atom kyslíku, atom síry nebo skupina CR⁹R¹⁰ (kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů vodíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituovaná alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; nebo R⁹ a R¹⁰ spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=0), thiokarbonylová skupina (C=S), cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo skupina C=CHR , kde R je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku) ; nebo pokud X nebo Y je atom kyslíku a n=0, mohou skupiny -Y-CR²R³ respektive -X-CR²R³ být také skupina -N=CR³nebo skupina -NR¹²-CR²R³- (kde CR² a R³ jsou karbonylová skupina (C=0) a R¹² je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, • · ♦ · • » · ·

I í * » • » Mí • · * • « · · « · * * » * • * * í » » * * • · · · » * » • » » · · β · · * • # * * * * » » * • t · · k-

acylová skupina COR¹³, kde R¹³ je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku) nebo pokud Y je atom kyslíku a n=0, může X být skupina CR¹¹ (kde R¹¹ má výše uvedený význam), která je vázána dvojnou vazbou k pyranovému kruhu;

R¹⁵ je atom vodíku, atom halogenu, azidoskupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, hydroxyskupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku (případně substituovaná 1 nebo 2 hydroxyskupinami nebo jejich ketalem nebo 1 nebo 2 alkoxyskupinami obsahujícími 1 až 3 atomy uhlíku), arylovou skupinou substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkenyloxyskupina obsahující až 6 atomů uhlíku, skupina OCOR¹⁸ (kde R¹⁸ je arylovou skupinou substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku případně obsahující jednu nebo dvě dvojné vazby) nebo alkoxykarbonylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a R¹⁶je atom vodíku nebo R¹⁵ R¹⁶ spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=O) nebo skupina C=CH₂;

R¹⁷ je skupina CH₂R¹⁹, kde R¹⁹ je atom vodíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 14 atomů uhlíku nebo skupina OCOR²⁰, ve které R²⁰ je alkylová skupina obsahující 1 až atomy uhlíku; a

W je atom kyslíku, atom síry nebo skupina CH₂; a tečkovaná čára ve skupině (a) vyjadřuje případnou přítomnost další vazby;

R^la je atom vodíku, atom halogenu, hydroxylová skupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku

R^2a je atom vodíku, atom halogenu, hydroxylová skupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, alkylthioskupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, alkoxylovou

• · · skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylovou skupinou substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, arylovou skupinou substituovaná alkenyloxyskupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, azidoskupina, skupina NR^5aCOR^5a (kde každý substituent R^5a je nezávisle atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku), skupina 0R^5a (kde substituent R^6a je cyklický ether obsahující 4 až 8 atomů vázaných k atomu kyslíku uhlíkovým atomem tohoto cyklického etheru, který sousedí s atomem kyslíku) nebo skupina Y^aC (=0) -X^a-R^7a, kde Y^a je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NH, X^a je buď vazba, atom kyslíku nebo skupina NR⁸, ve které substituent R^8a je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku a R^7a je alkylová skupina, obsahující 1 až 10 atomů uhlíku případně obsahující jednu nebo dvě dvojné vazby, arylová skupina, arylovou skupinou substituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylovou skupinou substituovaná alkenylová skupina obsahující 2 až 4 atomy uhlíku, haloalkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkoxyskupínou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku substituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a R^3a je atom vodíku nebo _R2a _{a R}3a _Spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylové skupina (C=0) nebo skupina C=NOR^9a (kde R^9a je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku); a

R^4a je hydroxylová skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo skupina OC (=0)R^7a (kde R^7a má výše definovaný význam).

Předmětný vynález zahrnuje rovněž sloučeninu obecného vzorce (I), kde Z je • · • · • · • ·

Dalším aspektem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek, který zahrnuje fungicidně účinné množství sloučeniny obecného vzorce (I) a z farmaceutického hlediska přijatelný nosič. Vynález se rovněž týká farmaceutického prostředku, který je vyroben kombinací sloučeniny obecného vzorce (I) a z farmaceutického hlediska přijatelného nosiče.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je také zemědělský prostředek, který zahrnuje fungicidně účinné množství sloučeniny obecného vzorce (I) a ze zemědělského hlediska přijatelný nosič. Vynález se rovněž týká zemědělského prostředku, který je vyroben kombinací sloučeniny obecného vzorce (I) a ze zemědělského hlediska přijatelného nosiče.

Předmětný vynález se dále týká způsobu léčby plísňové infekce u živočichů (včetně lidí), který zahrnuje podávání fungicidně účinného množství sloučeniny obecného vzorce (I) těm živočichům, kteří takovou léčbu potřebují.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob kontroly fytopatogenních plísní rostlin, který zahrnuje aplikaci fungicidně účinného množství sloučeniny obecného vzorce (I) na uvedené rostliny.

Pokud není uvedeno jinak, mají pojmy použité v tomto popisu vynálezu následující význam:

Pojem „kontrola nebo „kontrolování zahrnuje profylaktické použití (tj . ochrana proti infekci) a léčebné použití (tj. vyhubení infekce).

Pojem „rostliny zahrnuje celé živé rostliny nebo jejich části, listí, květy, semena, plody a jiný rostlinný materiál. Díky možnosti aplikovat aktivní složku do půdy zahrnuje pojem rovněž kořeny rostliny.

Pojem „prostředek je zemědělský nebo agrochemický prostředek, který zahrnuje výrobek zahrnující aktivní ·♦ • · 0 · • · · · • 0 000 • · «

00 • 0 *··0

složku(y), inertní složku(y) vytvářející nosič a jakýkoli produkt vzniklý, přímo nebo nepřímo, kombinací, komplexací nebo seskupením jakýchkoli dvou nebo více složek nebo vzniklý rozptýlením jedné nebo více složek nebo jinými reakcemi nebo interakcemi jedné nebo více složek. V souladu s tímto prostředek podle předmětného vynálezu zahrnuje jakýkoli prostředek vyrobený smícháním sloučeniny podle tohoto vynálezu a ze zemědělského hlediska přijatelného nosiče.

Pojem „alkylová skupina použitý samostatně jako část označení skupiny zahrnuje lineární nebo rozvětvený alkylový řetězec jako je methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina, n-butylová skupina, isopropylová skupina, sek. butylová skupina, terč.-butylová skupina, n-hexylová skupina a n-oktylová skupina.

Pojem „arylová skupina použitý samostatně jako část označení skupiny zahrnuje fenylovou skupinu nebo heteroarylovou skupinu, přičemž obě tyto skupiny mohou případně být substituovány jednou až třemi skupinami nezávisle vybranými se skupiny zahrnující atom halogenu, hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, alkoxyskupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkoxykarbonylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku v postranním řetězci. Heteroaromatickou skupinou může být pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh obsahující jeden nebo více heteroatomů vybraných ze skupiny zahrnující atom dusíku, atom kyslíku a atom síry. Jako příklad vhodné heteroaromatické skupiny je možné uvést pyridylovou skupinu, furylovou skupinu, thienylovou skupinu a pyrrolylovou skupinu.

„Atom halogenu nebo „halogen znamená atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu.

9 « ♦ 9 9

9

999 9 <

Pokud je R¹ acyloxyskupina, může jí být například skupina OCOR¹³, ve které má R¹³ výše definovaný význam.

Skupina vhodných solí sloučeniny obecného vzorce (I) zahrnuje bazické anorganické soli jako jsou alkalické soli (např. sodné nebo draselné soli), amonné soli a organické bazické soli. Skupina vhodných bazických organických solí zahrnuje soli aminů jako trialkylaminu (např. triethylaminu), nebo soli dialkylaminů (např. dicyklohexylaminu), soli libovolně substituovaného benzylaminu (např. fenylbenzylaminu nebo p-brombenzylaminu), soli ethanolaminu, diethanolaminu, N-methylglukosaminu, N-methylpiperidinu, pyridinu a substituovaného pyridinu (např. kolidinu, lutidinu, 4-methylamínopyridinu), soli tri(hydroxymethyl)methylaminu a soli aminokyselin (např. lysinu nebo arganinu).

Metabolicky labilní deriváty sloučeniny obecného vzorce (I) jsou sloučeniny, které jsou v léčeném objektu (kterým může být živočich, rostlina (včetně listí, květů, plodů, semen a ostatních částí nebo plodů rostliny) nebo půda) přeměněny na sloučeninu obecného vzorce (I). Příklady takových derivátů zahrnují běžně metabolicky labilní estery vytvořené karboxylovými skupinami v molekule.

Příprava sloučenin

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být připraveny ze sordarinu a jeho derivátů, sordaricinu a ostatních sloučenin sordarinového typu, které jsou všechny popsány v odborné literatuře.

Sordarin je kyselina [IR- (la, 3a£, 4β, 4a3, 7β, 7aa, 8ap) ]-8a[(6-deoxy-4-0-methyl-3-D-altropyranosyloxy)methyl]-4-formyl4, 4a, 5,6,7,7a,8,8a-oktahydro-7-methyl-3-(1-methylethyl)-1,4methano-s-indacen-3a(1H)-karboxylová vzorce (II):

• ftftftft ft* ···· » · · ft ft · · · • ft ftft » ftft <

► ftft « » · · <

» · · «

MeO

(II)

Sordarin je možné získat kultivací Sordaria araneosa NRRL 3196 (rovněž uloženého v ATCC pod označením ATCC 36386) způsobem popsaným v britském patentu GB 1162027 nebo ve zveřejněné PCT přihlášce WO96/14326. Sordarin je možné získat také fermentací Rosellinia subiculata a neidentifikované plísně označené jako ATCC 74387 níže popsaným způsobem.

Zofimarin je možné získat fermentací živné půdy Zofiela marina SANK 21274 (ATCC 34456) způsobem popsaným v Kokai 62040292. Jak je popsáno v Kokai 06157582, je sloučenina vzorce I, kde A je (f) a R^a je acetylová skupina, označovaná jako BE31405 produktem Penicillium sp. F31405. Jak bylo uvedeno v J. Antibiotics, 1995, 48(10), 1171-1172, je sloučenina vzorce (I), kde A je (f) a R^a je methylová skupina, označovaná jako SCH57404 produktem plísně označované ve sbírce kultur firmy Schering označením SCF1082A.

Ve zveřejněné PCT přihlášce WO96/14326 je popsán výchozí materiál pro přípravu derivátů sordarinu vzorce (I), kde Z je (a) nebo (b) a ve zveřejněné PCT přihlášce WO96/14327 je popsán výchozí materiál pro přípravu derivátů sordarinu vzorce (I), kde Z je (c).

Sordaricin je kyselina [IR-(Ια,3ββ,4β,4ap,7β,7aa,8ap)]-4formyl-8a-(hydroxymethyl)-4,4a,5,6,7,7a,8,8a-oktahydro-7methyl-3-(1-methylethyl)-1,4-methano-s-indacen3a(1H)karboxylová vzorce (VI):

•0 00»· 0 0 ·· : :: . · ··· » 0 000 0 ·· · · 0« 00*

(VI)

Sordaricin je možné připravit ze sordarinu reakcí s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Jak je popsáno ve zveřejněné PCT přihlášce WO96/14326, je možné sordaricin získat také fermentací mutantu odvozeného od Sordaria araneosa NRRL 3196 a biotransformací sordarinu pomocí Koryneformů.

Jak bylo uvedeno výše, byly nalezeny další dva organismy produkující sordarin.

Jedním z kmenů plísní produkujících sordarin je neidentifikovaná sterilní plíseň GB3109, která byla izolována z vnitřních tkání kořenů mangrovníkového keře Conocarpus erectus (Combretacěae), která je uložená ve sbírce Manglar de Río Rincón, Península de Osa, Provincia de Puntarenas, Kostarika a která je označovaná jako MF6232 ve sbírce kultur firmy Merck & Co., lne., Rahway, New Jersey. Tato kultura byla dne 27. srpna 1996 uložena ve sbírce kultur American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,

Maryland 20852, USA podle podmínek Budapešťské mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů patentového řízení a označena jako ATCC 74387.

Tato plíseň byla kultivována na různých mykologických médiích za různých světelných režimů a na listech a filtračním papíře, ale ve všech nepodařilo získat reproduktivní struktury, takže nebylo možné tuto plíseň identifikovat.

Rockville, smlouvy o pro účely sterilovaných případech se • fe fefefefe fe « • · · • fefe • · • · • fe • fe «

fefefe « • · · fe fefefefe fe · • · fefe fefefe • fe ·· • fefe · fe fefe « fe fefe · • · · * fefe ··

Kolonie této plísně měly při kultivaci na agaru následující morfologii:

Kolonie na ovesném agaru (Difco) při teplotě 23 °C a 12 hodinové fotoperiodě rostly mírně rychle a po 14 dnech dosahovaly velikosti 85-90 milimetrů. Kolonie měly přisedlou zónu postupu, byly ploché, tmavě pruhované, silně radiálně zbrázděné, s přisedlým vlhkým myceliem v centru, hedvábné na okrajích s vycházejícími plazivými hyfálními svazky nebo vlákny. Kolonie byly průsvitné až narůžovělé (jejich barva se blížila odstínům označovaným podle knihy Ridgway, R: Color Standards and Nomenclature, Washington, DC, 1912 jako Pale Ochraceous Salmon, Light Ochraceous Salmon), růžovošedé (označované jako Avellaneous, Cínnamon-Drab), nebo bílé v oblastech nejvrchnějšího vzdušného mycelia. Rub kolonií byl růžovošedý. Výskyt exudátů nebyl pozorován a vůně kolonií byla neutrální. Při teplotě 37 °C nebyl na ovesném agaru pozorován růst.

Kolonie na agaru připraveném ze šťávy V8 (viz. Stevens, R. B. : Mycology Guidebook, University of Washington Press, Seattle, 1981, str. 665) při teplotě 23 °C a 12 hodinové fotoperiodě rostly pomalu a po 14 dnech dosahovaly velikosti 37-42 milimetrů. Okraje kolonií byly ponořeny a mycelium bylo většinou přisedlé s omezeným vločkovitým vzdušným myceliem směrem k vnější třetině. Kolonie byly pruhované, průsvitné až slabě šedorůžové, zbarvené podobně jako při kultivaci na ovesném agaru, rub kolonií byl průhledný až slabě červenohnědý (blízko odstínům označovaným ve výše zmíněné publikaci jako Wood Brown, Fawn Color).

Kolonie na kukuřičném agaru (Difco) při teplotě 25 °C a 12 hodinové fotoperiodě rostly pomalu a po 14 dnech dosahovaly • 9 ···♦ • 9

9*9

9«

99 «9 9

9 9 9

9 · 9 • 9 9 9 • 9 99 velikosti 33-34 milimetrů. Okraje kolonií byly ponořeny a kolonie, ze kterých se uvolňovaly vzdušné hyfy, byly pruhované a průsvitné.

Mycelium bylo tvořeno vysoce rozvětveným, jednoduše přepaženým kmenem hyaline hyphae.

Druhým z kmenů plísní (označeným jako GB3719) produkujících sordarin je kmen Rosellinia subiculata (Ascomycotina, Xylariaceae) označený jako MF6239 ve sbírce kultur firmy Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. Tato kultura byla dne 27. srpna 1996 uložena ve stálé sbírce kultur American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA podle po.dmínek Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účely patentového řízení a označena jako ATCC 74386.

Askomáty Rosellinia subiculata (GB3719) byly nalezeny na odkorněných větvích z tvrdého dřeva na březích řeky Navesink, Monmouth Co. v New Jersey. Pomocí sterilizovaného mikrotomového břitu byly v laboratoři vyjmuty všechny kusy několika askomát, vřecka, parafýzy a askospory z jejich center byly vyjmuty pomocí špendlíku pro připevňování hmyzu a naočkovány vrypem na agar ze sladového kvasného extraktu. Askospory byly inkubovány přes noc dokud nevyklíčily a pro založení čistých kolonií byly přeneseny na agar ze sladového kvasného extraktu.

Morfologie Rosellinia subiculata (GB3719) obecně potvrzovala popisy uváděné v literatuře (Ellis, J. B. a Everhart, Β. M. The North American Pyrenomycetes, vydané autory, Newfield, New Jersey, 1892, str. 165-166; Petřini, L.

E. Rosellinia species of- the temperate zone. Sydowia, 1991, 44, 169-281). Klíčové rysy, které vedly k určení, že se jedná o Rosellinia subiculata byly: stromatické askomáty vyskytující se ojediněle, ale shluklé nebo spečené do malých klastrů na ···· ·· ’ • ··· * * · • · · · · • · · 4 ·· ··· ·· ¹ ·* ·· • » 4 * » • · · · · • · ··· · · « · · • 4 ·· myceliálním podloží na hemisferické, papilární, podhoubí bylo černé; tenké odkorněném dřevu; jemné, lesklé, myceliální podloží bylo matné, nažloutlé nebo se někdy jevilo pouze jako světle zbarvené odbarvené dřevo přilehlé k podhoubí; vřecka byly válcovité se škrobovitou apikální zátkou; askospory byly hnědošedé, široce elipsovité až mírně ledvinovité, jemné bez přívěsků nebo povlaků, s přímou, spodní štěrbinou klíčku a měly rozměry 10-12 x 5-6 mikrometrů.

Kolonie této plísně měly při kultivaci na agaru následující morfologii:

Kolonie na ovesném agaru při teplotě 23 °C a 12 hodinové fotoperiodě rostly mírně rychle a po 14 dnech dosahovaly velikosti 73-75 milimetrů. Kolonie měly přisedlou zónu postupu, byly ploché, tmavě pruhované, vnitřní třetina mycelia byla bílá sametová až vločkovitá, vnější dvě třetiny mycelia byly vlhké a přisedlé. Kolonie byly průsvitné až bílé nebo narůžovělé, na rubu slabě vínově růžové (blízko odstínu označovaného ve výše zmíněné publikaci jako Light Vinaceous Cinnamon). Výskyt exudátů nebyl pozorován a kolonie slabě zapáchaly. Při teplotě 37 °C nebyl na ovesném agaru pozorován růst.

Kolonie na agaru připraveném ze šťávy V8 při teplotě 23 °C a 12 hodinové fotoperiodě rostly pomalu a po 14 dnech dosahovaly velikosti 25-35 milimetrů. Okraje kolonií byly ponořeny a mycelium bylo většinou vločkovitým vzdušným myceliem směrem Kolonie byly pruhované, průsvitné (Vinaceous Cinnamon), rub kolonií byl průhledný až skořicový (blízko odstínům označovaným ve výše zmíněné publikaci jako přisedlé s omezeným k vnitřní třetině, až slabě šedorůžové

44 * · · · • · · · • · 444

4444

4 4

4 44* · · *

4· · ·»* »4 44

4 4

44

Orange-Cinnamon, Cinnamon), nebo slabě červenohnědé (Russet, Fawn Color), zapáchající.

Kolonie na kukuřičném agaru při teplotě 25 °C a 12 hodinové fotoperiodě rostly pomalu a po 14 dnech dosahovaly velikosti 29-34 milimetrů. Okraje kolonií byly ponořeny a z kolonie, ze kterých se uvolňovaly vzdušné hyfy, byly pruhované a průsvitné nebo měly zmenšené bílé mycelium v bodě naočkování, rub kolonií byl bezbarvý.

Při prvním pěstování v kultuře v srpnu 1993 produkoval kmen jen omezené množství konidioforů a konidie Geniculosporium anamorfně podobné těm, které popsal v roce 1993 Petřini. Avšak nebyla již patrná sporulace, nejpravděpodobněji díky prodlouženému skladování a opakovaných přenosech. Alespoň v jednom případě došlo po pětitýdenním pěstování na ovesném agaru k vytvoření zralého perithecia se stejnými vřecky a askospory jaké je možné pozorovat v přírodě. Po inkubaci askosporů na agaru vytvořeném ze sladového kvasného extraktu při teplotě místnosti došlo přes noc k jejich vyklíčení. Mycelium bylo tvořeno vysoce rozvětveným, odděleným hyaline hyphae.

Sordarin je získáván kultivací kmene Rosellinia subiculata nebo neidentifikované plísně MF6232 (ATCC74387) schopné produkovat uvedenou sloučeninu na běžném pevném médiu nebo v běžných kapalných médiích. Organismus je pěstován v živném médiu, které obsahuje známé zdroje výživy pro podobné plísně, tj. asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku a případně anorganické soli a další známá růstová činidla. Při kultivacích podle tohoto vynálezu je možné aplikovat obecně používané způsoby kultivací podobných plísní.

0000

Živné médium by mělo obsahovat vhodný asimilovatelný zdroj uhlíku jako je ribosa, glukosa, sacharosa, cellobiosa nebo fruktosa. Zdroj dusíku, kterým může být chlorid amonný, síran amonný, močovina, dusičnan amonný, dusičnan sodný, atd., může být použit buď samotný nebo v kombinaci s organickými zdroji dusíku jako je pepton, extrakt z rybí moučky, kvasný extrakt, “ kukuřičný výluh, sojový prášek, mouka ze semen bavlníku, atd.

V případě potřeby mohou být do média rovněž přidány živné anorganické soli sloužící jako zdroje sodíku, draslíku, vápníku, amonných kationtů, fosforečnanových aniontů, síranových aniontů, chloridových aniontů, bromidových aniontů, uhličitanových aniontů, zinku, hořčíku, manganu, kobaltu, železa apod.

Sordarin je možné získávat při jakékoli teplotě vhodné pro uspokojivý růst produkčního organismu, např. při teplotě 20 až 30 °C. Obvykle je optimální produkce požadované sloučeniny dosahováno v třepaných baňkách po 7 až 21 dnech inkubace. Aerace v třepaných baňkách je dosahováno třepáním, např. třepáním na rotační třepačce. Pokud má být fermentace prováděna v tankových fermentorech, je žádoucí v živné půdě naočkováním této živné půdy šikmou kulturou, lyofilizovanou

I kulturou nebo zmrzlou kulturou připravit vegetativní inokulum.

Po získání aktivního inokula popsaným způsobem, je toto inokulum za aseptických podmínek přeneseno do média ve fermentačním tanku. Produkce požadované sloučeniny v tankových . fermentorech je obvykle dosaženo optimálně po 7 až 21 dnech inkubace. Promíchávání směsi v tankovém fermentoru je prováděno mícháním a aeraci lze provádět zaváděním vzduchu nebo kyslíku do promíchávané směsi. Produkce sloučeniny může být monitorována chromatografickými nebo spektroskopickými metodami nebo běžným biologickým testem.

• · • · • ·

• « · • · ·

Sordarin je z fermentační půdy snadno izolován extrakcí surové živné půdy organickým rozpouštědlem jako je methylethylketon. Získané sloučeniny je možné přečistit standardními dobře známými způsoby jako je gelová filtrační chromatografie, chromatografie na tenké vrstvě, vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) , zahušťování, vysrážení a/nebo krystalizace nebo kombinacemi těchto způsobů. Podle jiného způsobu je možné surovou živnou půdu nebo její organický extrakt sprejově usušit nebo lyofilizovat a dále přečistit shora uvedenými postupy.

Sloučenina podle předmětného vynálezu (sloučenina obecného vzorce I) může být vyrobena dále uvedenými způsoby. Uvedené podmínky jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

Jak znázorňuje schéma 1, sloučeninu obecného vzorce (I), kde Z je (a) nebo (b) je možné připravit z výchozí sloučeniny popsané v PCT přihlášce WO96/14326 nebo,v případě sloučenin obecného vzorce (I), kde Z je (c), z výchozí sloučeniny popsané v PCT přihlášce WO96/14327. Karboxylová skupina ve výchozí sloučenině je nejprve ochráněna vhodnou chránící skupinou (ve schématech označovanou obecně PG) , tj . např.

benzylovou skupinou nebo p-methoxybenzylovou skupinou, a následnou reakcí s hydrochloridem hydroxylaminu v alkoholovém rozpouštědle obsahujícím pyridin dojde k vytvoření aldoxímu. Vzniklý aldoxim je dále vhodným dehydratačním činidlem (tj . vnitřní solí (methoxykarbonylsulfamoyl)triethyíamoniumhydroxidu nebo chlo-ridem kyseliny kyanurové) převeden. na nitril a po odstranění chránící skupiny je získána sloučenina obecného vzorce (I).

• 0

Schéma 1

(I)

P/OH je rozpouštědlo, kterým je nižší alkohol;

PG je chránící skupina karboxylové skupiny;

Z je výše definovaná skupina nebo její vhodně ochráněný derivát

Schéma 2 znázorňuje přípravu látky vzorce I(d). Sordarin je chráněn vhodnou chránící skupinou a aldehydická skupina je reakcí s hydrochloridem hydroxylaminu v alkoholovém rozpouštědle obsahujícím pyridin převedena na příslušný aldoxim, který je následně dehydratován dehydratačním činidlem jako je vnitřní sůl (methoxykarbonylsulfamoyl)triethylamoniumhydroxidu za vzniku nitrilové sloučeniny (IV) . Po odstranění chránící skupiny je získána sloučenina vzorce I(d).

9 9 9 • · • · 9 9 9 9

9 9 9 9 • 9 9 9 9

9 99999 9

9 9 9 9

99 99 999

Schéma 2 co₂pg

(IV)

Schéma 3 znázorňuje mikrobiální demethylaci 4'-methoxyskupiny ve sloučenině I (d) za vzniku sloučeniny (V). Demethylace je dosaženo kontaktováním sloučeniny vzorce I (d) s kulturou kmene Streptomyces avermitilis ve fermentačním médiu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku; a izolací sloučeniny vzorce (V) z tohoto fermentačního média. Skupina vhodných kmenů Streptomyces avermitilis zahrnuje kmen MA4848 uložený v americké sbírce kmenů American Type Culture Collection, Rockville, MD pod označením ATCC 31272. Sloučenina vzorce (V) může být použita při přípravě sloučeniny vzorce (I) .

99 9 • 000 · · 9 9 9 9 9 • 99 9 9 0 0 0 0 9 99 9 • 999999 9 999 99 9 • · 9 ·· 9 9 9 9 9 ·· 9 9 9 · 0 0 0 0 0 00

Schéma 3 co₂h

mikrobiální demethylace

(i)

Jak dále ukazuje schéma 4 je možné sordaricin vzorce (VI) použít jako výchozí sloučeninu pro syntézu sloučenin obecného vzorce (I). Chránění karboxylové skupiny vhodnou chránící skupinou a následné ochránění primární hydroxylové skupiny umožňuje syntézu nitril-aglykonové sloučeniny vzorce (VII), a to reakcí s hydrochloridem hydroxylaminu, následnou dehydratací vzniklého produktu a odstraněním chránící skupiny hydroxylové skupiny. Navázáním vhodného sacharidového nebo modifikovaného sacharidového substrátu dobře známými způsoby dojde ke vzniku sloučeniny obecného vzorce (I).

• · · 1 • · • ··· * « • · • · • ·

(VI) (I)

Sloučeniny obecného vzorce (I) jsou fungicidními činidly, které jsou užitečné pro výrobu léčebných prostředků určených pro lidi a ostatní živočichy. Sloučeniny obecného vzorce (I) jsou také vhodné jako činidla pro ochranu zemědělských .plodin.

Sloučeniny obecného vzorce (I) jsou velmi aktivní fungicidy použitelné při ničení plísňových infekcí u živočichů, včetně lidí. Je možné je použít například při léčbě plísňových infekcí způsobených organismy jako jsou různé druhy kmene Candida (např. Candida albicans, Candida glabrata, (Torulopsis glabrata) _r Candida tropicalis a Candida pseudotropicalis), Cryptococcus neoformans, Pneumocystis carinii, Sp. (např. Aspergillus flavus a Aspergillus Coccidioides (Coccidioides immitis), Para(např. Paracoccidioides brasiliensis) , HistoHistoplasma capsulatum) nebo Blastomyces (např.

Blastomyces dermatitidis) . Tyto sloučeniny je rovněž možné použít pro léčbu jiných plísňových infekcí způsobených druhy

Aspergillus fumigatus) , coccidioides plasma (např ·· ·· ·· ♦ · fe · · • fefefe · • ··· kmene Trichophyton, Microsporum nebo Epidermophyton (např. Trichophyton mentographytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis nebo Epidermophyton floccosum) nebo pro léčbu slizničních infekcí způsobených Candida albicans.

Sloučeniny obecného vzorce (I) je dále možné použít pro léčbu jiných infekcí způsobených různými druhy vláknitých plísní jako je Geotrichum (např. Geotrichum clavatum), Trichosporon (např. Trichosporon beigelii), Blastoschizomyces (např. Blastoschizomyces capitatus) , Sporothrix (např. Sporothrix schenckíi), Scedosporíum (např. Scedosporium apiosperum), Cladosporium (např. Cladosporium carrionii) a Pityrosporum ovále.

Sloučeniny obecného vzorce (I) je možné použít i pro léčbu infekcí způsobených prvoky jako je Toxoplasma, Cryptosporidium, Leishmania, Tripanosoma, Giardia a Tríchomonas.

Stanovení in vitro fungicidní aktivity sloučenin podle předmětného vynálezu bylo prováděno na kapalném nebo pevném médiu fungicidním dvojnásobně sériově zřeďovacím způsobem stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) fungicidního činidla, při které došlo po 24 až 48 hodinách inkubace při teplotě 35 °C k inhibici růstu. Prakticky bylo stanovení provedeno tak, že série destiček agaru nebo mikrozřeďovacích panelů živné půdy obsahujících dvojnásobně naředěné testované fungicidní činidlo byly naočkovány standardní kulturou klinicky relevantního patogenu jako je například Candida albicans. Poté byly destičky agaru nebo mikrozřeďovací panely živné půdy testovány, zda dochází nebo nedochází k růstu plísně a byly zaznamenávány příslušné minimální inhibiční koncentrace (MIC). K vizualizaci koncových bodů byl použit živý kmen Almar Blue.

• · • · · · · · · • · · · · · · · · • · ····· ·

Stanovení in vivo fungicidní aktivity sloučenin obecného vzorce (I) je možné provést sérií různých dávek podávaných (např. podkožně, orálně, intraperitoneálně nebo nitrožilně) myším, které byly nitrožilně naočkovány kmenem Candida spp. Z testovaných zvířat je možné vyjmout ledviny a stanovit obsah životaschopného kmene Candida spp. a snížení infekce je možné stanovit relativně k neléčené kontrolní skupině zvířat.

Z hlediska fungicidní aktivity jsou sloučeniny obecného vzorce (I) užitečné pro léčbu a/nebo prevenci různých plísňových onemocnění u lidí a ostatních živočichů. Takové infekce zahrnují povrchové, kožní, podkožní a systémové mykotické infekce jako jsou infekce dýchacích cest, infekce trávicího traktu, kardiovaskulární infekce, infekce močových cest, infekce centrálního nervového systému, kandidóza a chronická mukokandidóza (například aftózní kandidóza a vaginální kandidóza) a kožní infekce způsobené plísněmi, kožní a mukokožní kandidóza, dermatofytózy včetně kroužkového lišeje a infekcí dermatofytózy tinea, dermatofytózy nohou, zánětu nehtového lůžka, pityriasis versicolor, erytrazma, opruzeniny, plísňová plošná vyrážka, candida vulvitis, candida balanitis a zánět zvukovodu. Dále mohou být sloučeniny obecného vzorce (I) používány jako profylaktické látky pro prevencí systémových a topických plísňových infekcí. Použití těchto sloučenin jako profylaktických činidel může být vhodné například při dietě pro selektivní dekontaminaci střev při prevenci infekce u pacientů se sníženou imunitou (např. u pacientů trpících AIDS, u pacientů léčících se na rakovinu nebo u pacientů po transplantaci). V případě některých chorobných syndromů nebo iatrogenních stavů může být rovněž žádoucí prevence nadměrného růstu plísně během léčby antibiotiky.

• 999

9 • · 999 · 9

Sloučeniny obecného vzorce (I) mají také široké spektrum použití jako činidla pro ochranu zemědělských plodin a jsou účinné proti širokému spektru fytopatogenních plísní, zejména pak plísním ze skupiny zahrnující deuteromycety (např. Botritis spp., Septoria spp., Pyricularia spp., Stagnospora spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp., Cercospora spp., Rynchosporíum spp., Pseudocercosporella spp. a Alternaria spp.); basidiomycety (např. Puccinia spp., Rhizoctonia spp. a Hemileia); askomycety (např. Venturia spp., Podospharera spp., Erysiphe spp., Monilinia spp. a Uncinula spp.); a oomycety (např. Phytophthora spp., Pemospora spp., Bremia spp., Pythíum spp. a Plasmopara spp.). Předchozí seznam uvádí příklady fytopatogenních plísní, proti kterým vykazují sloučeniny podle tohoto vynálezu fungicidní účinky a není nijak omezující v jakémkoli smyslu. Sloučeniny podle předmětného vynálezu mají velmi výhodné léčivé a preventivní fungicidní vlastnosti vhodné pro ochranu rostlin a je možné je použít pro inhibici nebo likvidaci mikroorganismů vyskytujících se na rostlinách nebo částech rostlin (plodech, květech, listech, stoncích, hlízách nebo kořenech) nebo na různých plodinách užitkových rostlin, přičemž jsou současně proti takovým mikroorganismům chráněny také ty časti rostlin, které vyrostou později. Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možné použít také jako přísadu při ošetřování růstového materiálu rostlin, zvláště pak semen (plodů, hlíz, zrní) a rostlinných řízků (například rýže) pro zajištění ochrany proti plísňovým infekcím a proti fytopatogenním plísním vyskytujících se v půdě. Sloučeniny obecného vzorce (I) podle tohoto vynálezu jsou charakteristické skutečností, že jsou zvlášť dobře snášeny rostlinami a navíc jsou šetrné k životnímu prostředí.

ft* ft* *· ftftftft ftft ftft ftftftft ftftft ftftftft ftftftft ftft ··· ft ftft · • · ··· ftft · ftftft ftft · • ft · ftft ft ftftftft ftftftft ftft ftftft ftft ftft

Stanovení použitelnosti sloučenin obecného vzorce (I) v zemědělství je možné provést pomocí následujících testů:

1. Účinnost proti Erypsiphe gramínis na pšenici

a) Po jednotýdenní kultivaci byly rostliny pšenice ošetřovány postřikem, který obsahoval 200 ppm aktivní složky, 20 % acetonu a 0,25 % Tritonu X155, až do jeho spotřebování. Po 2 hodinách byly ošetřené rostliny infikovány askosporami vytřepanýmí z očkovací rostliny. Pro stanovení míry ochrany poskytnuté testovanou sloučeninou bylo po osmidenní inkubaci při teplotě 22 °C a 50 % relativní vlhkosti vyhodnocováno napadení plísní.

b) Po jednotýdenní kultivaci byly rostliny pšenice infikovány askosporami vytřepanýmí z očkovací rostliny. Po uplynutí 24 hodin byly rostliny pšenice ošetřeny postřikem, který obsahoval 200 ppm aktivní složky, 20 % acetonu a 0,25 % Tritonu X155. Pro stanovení léčebného účinku poskytnutého testovanou sloučeninou bylo po osmidenní inkubaci při teplotě 22 °C a 50 % relativní vlhkosti vyhodnocováno napadení plísní.

c) Po jednotýdenní kultivaci byly rostliny pšenice infikovány askosporami vytřepanýmí z očkovací rostliny. Za 24 hodin byla půda, ve které byly pěstovány rostliny, zalita zálivkou obsahující 200 ppm aktivní složky, 20 % acetonu a 0,25 % Tritonu X155. Pro stanovení léčebného účinku poskytnutého testovanou sloučeninou bylo po osmidenní inkubaci při teplotě 22 °C a 50 % relativní vlhkosti vyhodnocováno napadení plísní.

2. Účinnost proti Puccinia recondita na pšenici

a) Po jednotýdenní kultivaci byly rostliny pšenice ošetřovány postřikem, který obsahoval 200 ppm aktivní složky, •444 · · 4 4 4 4 4 •444 44 444 4 444

444444 4 444 44 4

4 44 4 4444

44 44 444 44 44 % acetonu a 0,25 % Tritonu X155, až do jeho spotřebování. Po 2 hodinách byly ošetřené rostliny infikovány sporami. Pro stanovení míry ochrany poskytnuté testovanou sloučeninou bylo po jednodenní inkubaci při teplotě 20 °C a 95-100 % relativní vlhkosti následované sedmidenní inkubací při teplotě 25 °C a 50 % relativní vlhkosti vyhodnocováno napadení plísní.

b) Po jednotýdenní kultivaci byly rostliny pšenice infikovány suspenzí obsahující spory. Po uplynutí 24 hodin byly rostliny pšenice ošetřovány postřikem, který obsahoval 200 ppm aktivní složky, 20 % acetonu a 0,25 % Tritonu X155 až do jeho spotřebování. Pro stanovení léčebného účinku poskytnutého testovanou sloučeninou bylo po jednodenní inkubaci při teplotě 20 °C a 95-100 % relativní vlhkosti následované sedmidenní inkubací při teplotě 25 °C a 50 % relativní vlhkosti vyhodnocováno napadení plísní.

c) Po jednotýdenní kultivaci byly rostliny pšenice infikovány suspenzí obsahující spory. Za 24 hodin byla půda, ve které byly pěstovány rostliny, zalita zálivkou obsahující 200 ppm aktivní složky, 20 % acetonu a 0,25 % Tritonu X155. Pro stanovení léčebného účinku poskytnutého testovanou sloučeninou bylo po jednodenní inkubaci při teplotě 20 °C a 95-100 % relativní vlhkosti následované sedmidenní inkubací při teplotě 25 °C a 50 % relativní vlhkosti vyhodnocováno napadení plísní.

Na základě rozsahu účinků je možné sloučeniny podle předmětného vynálezu použít pro ochranu nebo léčbu rostlin před napadením nebo již napadených fytogenními plísněmi, které napadají různé zemědělské plodiny. Následující seznam zahrnuje ty druhy rostlin, které jsou vhodné pro aplikace sloučenin podle tohoto vynálezu popsané v předmětu tohoto vynálezu: cereálie ( pšenice, žito, oves, ječmen, rýže, čirok a příbuzné ·· φ* Φ· φφφφ ·φ ·* •φφφ φφφ φ φ φ « • · · · · · ΦΦΦ · 9 9 9

9 999 9 9 Φ ΦΦΦ 9 9 Φ • · Φ ΦΦ Φ ΦΦΦΦ ·· ·· ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ φφ plodiny); řepa (cukrová řepa nebo krmná řepa); malvicové, peckové a měkké ovoce (např. jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny a ostružiny); luštěniny (např. fazole, hrách, čočka a sója); olejnaté rostliny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokosový ořech, rostliny produkující ricinový olej, kakaové boby a podzemnice olejná); dýňovité rostliny (např. okurka, tykev a meloun); textilní rostliny (např. bavlník, len, konopí a jutovník); citrusové plody (např. pomeranče, citrony, mandarinky a grapefruity); zeleninu (např. salát, zelí, špenát, mrkev, chřest, paprika, cibule, rajská jablka a brambory); rostliny z čeledi vavřínovitých (avokado, skořicovník a kafr); nebo rostliny jako kukuřice, tabák, ořechy, kávovník, cukrová třtina, čajovník,·· vinná réva, chmel, banánovník a kaučukovník stejně jako okrasné rostliny (květiny, keře, listnaté stromy a stálozelené rostliny jako jsou jehličnany). Avšak všechny tyto uvedené druhy rostlin netvoří omezující seznam rostlin s ohledem na spektrum účinku sloučenin podle tohoto vynálezu.

Sloučeniny obecného vzorce (I) jsou zvlášť vhodné pro léčbu následujících rostlinných chorob:

Erysiphe graminis u cereálií, Erysiphe cichoracearum a Sphaerotheca fuliginea u dýní, Podasphaera leucotricha u jablek, Uncinula necator u vinných rév, Puccinia . sp. u cereálií, Rhizoctonia solani u bavlníku, Ustilago sp. u cereálií a cukrové třtiny, Venturia inaequalis (strupovitost) u jablek, Helminthosporíum sp. u cereálií, Septoria nodorum u pšenice, Botrytis cinerea (šedá forma) u jahod a hroznů, Cercospora arachidicola u podzemnice olejně, Pseudocercosporella herpotrichoides u pšenice a ječmene, Pyricularia oryzae u rýže, Phytophtora infestans u brambor a rajských jablek, Fusarium sp. a Verticillium sp. u různých rostlin,

0000

Plasmopara viticola

04 • · · · · • · · 4 0 · 000 0 ·

0 00

04 * 4 • 044 • 0 004

0 00

0·1

0 4 ( • 0 0 0 1

0 4 4

04 hroznů, Alternaria sp.

ovoce zeleniny. Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být rovněž použity pro ochranu různých materiálů (např. pro ochranu dřevěné suroviny před Paecilomyces variotii) .

Farmaceutické prostředky

Ačkoli je principiálně možné, aby sloučeniny podle předmětného vynálezu byly terapeuticky podávány samotné, tedy jako surový materiál, je upřednostňováno podávání aktivní složky ve formě farmaceutického prostředku. Proto se vynález dále týká i farmaceutického prostředku, sloučeninu obecného vzorce (I) , nebo který zahrnuje z farmaceutického hlediska akceptovatelnou sůl sloučeniny obecného vzorce (I), spolu s jedním akceptovatelnými případně jinými nebo více z farmaceutického hlediska nosiči sloučeniny obecného vzorce (I) a léčebnými a/nebo profylaktickými složkami.

Nosič (e) musí být akceptovatelné v tom smyslu, že jsou slučitelné s ostatními složkami uvedeného farmaceutického prostředku a nejsou škodlivé pro jejich příjemce.

Farmaceutické prostředky podle předmětného vynálezu zahrnují farmaceutické prostředky určené pro orální, bukální, parenterální, implantační, rektální, topické, oftalmické nebo genito-urinární podáváni, nebo ve formě vhodné pro podávání ve formě implantátů nebo ve formě vhodné pro inhalační nebo insuflační podávání.

Tablety a kapsle pro orální podávání mohou obsahovat běžná vehikula jako jsou pojivá, například sirup, arabskou gumu, želatinu, sorbitol, tragant, klíh na bázi škrobu nebo polyvinylpyrrolidon; pinidla, například laktosu, cukr, mikrokrystalickou celulosu, kukuřičný škrob, fosforečnan vápenatý nebo sorbitol; lubrikanty, například magnesiumstearát, kyše29 ·· 4· 4444 44 44 • 444 4 4 4 4 4 4 4 • · 4 · · · 444 · 4 4 4

4 444 4 4 4 444 4 4 4

4 44 4 4444

44 4· 444 44 44 linu stearovou, mastek, polyethylenglykol nebo oxid křemičitý; dezintegrační činidla, například bramborový škrob nebo sodnou sůl glykolátu škrobu nebo sodnou sůl zkřížené karamelosy; nebo smáčecí činidla jako je sodná sůl laurylsulfátu. Tablety, které zahrnují žvýkací, rozpustné a šumivé tablety mohou být potaženy podle dobře známých způsobů. Orální kapalné prostředky mohou mít formu, například vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů nebo léčebných nápojů nebo může ' mít formu suchého produktu pro rozdělání ve vodě nebo jiném vhodném vehikulu těsně před použitím. Takové kapalné farmaceutické prostředky mohou obsahovat běžná aditiva jako jsou suspendační činidla, například sorbitolový sirup, methylcelulosu, glukosový/cukerný sirup, želatinu, hydroxyethylcelulosu, karboxymethylcelulosu, gel aluminiumstearátu nebo ztužené tuky; emulgační činidla, například lecithin, sorban monooleát nebo arabskou gumu; nevodná vehikula (která mohou zahrnovat jedlé oleje), například mandlový olej, frakcionalizovaný kokosový olej, olejovité estery, propylenglykol nebo ethylalkohol; a konzervační činidla, například methyl- nebo propyl-p-hydroxybenzoáty nebo kyselinu sorbovou.

Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu pro bukální podávání může mít podobu tablet nebo pastilek formulovaných běžnými způsoby.

Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu pro parenterální podávání může být formulován pro podávání injekcí nebo kontinuální infúzí. Farmaceutické prostředky pro injekční podávání mohou mít formu jednotlivých dávek v ampulích nebo zásobních lahví obsahujících mnoho dávek a přidané konzervační činidlo. Tyto farmaceutické prostředky mohou mít takové formy jako je suspenze, roztoky nebo emulze v olejovitých nebo • 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9·· · *

9 9 9 • 9 99

9

9 « 9 9 · 9 9 vodných vehikulech a mohou obsahovat formulační činidla jako jsou suspendační činidla, stabilizační činidla a/nebo dispergační činidla. Dále může mít aktivní složka formu prášku pro rozdělání ve vhodném vehikulu, např. apyrogenní vodě, těsně před použitím.

Pro inhalační podávání jsou bez obtíží podávány ve formě aerosolového spreje z tlakových balení pomocí vhodného pohonného plynu, např. dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého nebo ostatních vhodných plynů nebo z rozprašovače. V případě použití tlakového aerosolu, je možné stanovit jednotlivou dávku tím, že se umožní, aby ventil mohl dodávat odměřené množství aerosolu.

Další možností pro inhalační podávání farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu je, že tento farmaceutický prostředek má formu suchého práškového prostředku, například práškové směsi sloučeniny podle tohoto vynálezu a vhodného práškového základu, jako je laktosa nebo škrob, nebo modifikované fyzikální formy samotné léčivé substance. Práškový prostředek může být dodáván ve formě jednotlivých dávek, např. v kapslích nebo patronách např. ze želatiny nebo v blistrových baleních, ze kterých je možné prášek podávat pomocí inhalátoru nebo insuflátoru.

Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu může mít podobu čípku zahrnujícího např. běžný čípkový základ, nebo může mít prostředek formu pesaru zahrnujícího např. běžný pesarový základ.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu mohou být také formulovány pro topické podávání ve formě mastí, krémů, gelů, pleťových mlék, šamponů, pudrů (včetně sprejových pudrů), pesarů, tamponu, sprejů, léčebných lázní, aerosolů, • 0 ·· 00 0000 «0 00 0000 *00 0004

00 0 0 0000 0 00 1 0 0000 *0 0 * * * 0* « 00 0 00 0 000«

00 00 000 00 00 vehikulum zahrnovat kapek (např. oční kapky, ušní kapky nebo nosní kapky) nebo přelivových roztoků. Masti a krémy mohou být formulovány například pomocí vodného nebo olej ovitého základu s přídavkem vhodného zahušťovacího nebo želatinačního činidla. Masti pro podávání do oka mohou být vyráběny za sterilních podmínek pomocí sterilních složek. Přelivové roztoky mohou být formulovány například pro veterinární použití v organických rozpouštědlech obsahujících oleje, případně formulační činidla jako např. stabilizační činidla a solubilizátory. Pesary a tampony pro vložení do vagíny mohou být formulovány běžnými způsoby a tam, kde je to vhodné, mohou obsahovat efervescentní Takové farmaceutické prostředky mohou také jiné aktivní složky jako jsou vhodné kortikosteroidy, antibiotika nebo antiparazitika.

Kapalné prostředky pro intranasální užívání mohou mít formu roztoků nebo suspenzí a mohou zahrnovat běžná vehikula jako jsou činidla upravující tonus, například chlorid sodný, dextrosu nebo mannitol; konzervační činidla, například benzalkoniumchlorid, thiomersal, fenylethylalkohol; a ostatní formulační činidla jako jsou suspendační činidla, pufrovací činidla, stabilizační činidla, dispergační činidla a ochucovací činidla.

Transdermální podávání může být ovlivněno vytvořením vhodného systému, který podporuje absorpci aktivní sloučeniny skrz kůži a obecně sestává ze základního prostředku uzavřeného v adhesivní náplasti zahrnující nosné fólie, membrány a uvolňovací vazače. Takové systémy mohou zahrnovat činidla zvyšující absorpci jako jsou alkoholy nebo mohou fungovat na bázi podpory iontoforézy.

Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu může být rovněž formulován jako depotní přípravek. Takové dlouho32 • · · »· · · • · · · • · · 9 • · ««· ·

působící prostředky mohou být podávány implantací (například pod kůži nebo do svalu) nebo intramuskulární injekcí. Sloučenina podle předmětného vynálezu tak může být formulována například s vhodnými polymerními nebo hydrofobními materiály (například jako emulze ve farmaceuticky přijatelném oleji) nebo iontomšničovými pryskyřicemi nebo jako téměř nerozpustné deriváty, např. jako téměř nerozpustná sůl.

Pokud farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu obsahuje jednotlivé dávky, každá dávka obsahuje výhodně od 0,001 miligramu do 1000 miligramů, výhodně pak od 0,01 miligramu do 400 miligramů, aktivní složky v případech, že sloučenina podle předmětného vynálezu má být podávána orálně. Používaná denní dávka pro léčbu dospělých lidí je výhodně od 0,001 miligramu do 5000 miligramů aktivní složky, výhodněji od 0,01 miligramu do 2000 miligramů aktivní složky. Tato dávka může být podávána například v 1 až 4 dávkách, v závislosti na způsobu podávání a stavu pacienta a nemoci, která má být léčena.

Sloučenina podle tohoto vynálezu může být podávána například nitrožilní infúzí v dávce až 50 miligramů aktivní složky/kilogram/den. Doba trvání léčby je určována spíše rychlostí odezvy než předem určeným počtem dní.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu je rovněž možné použít v kombinaci s jinými terapeutickými činidly a proto jsou dalším aspektem vynálezu i takové kombinace, které zahrnují sloučeninu podle tohoto vynálezu spolu s jiným terapeuticky aktivním činidlem.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu tak mohou být použity například v kombinaci s jedním nebo více fungicidy, jako je polyenový derivát (např. amphotericin B, nystatin, lipidová formulace amphotericinu B); azolový derivát (např. flukonazol, ft · • ft ·· «· ftftftft • · · · ftftft • · · · ft · ftftft • · ftftft * · < · • · · · · · ft· ftft ftft ftftft ftft ftft • · · • ft · • ft · • ftft · ft· ftft intrakonazol, ketokonazol, mikonazol, klotrimazol, ZD-08070, UK-109496, SCH56592), 5-fluorcytosin, derivát pneumokandinu nebo echinokandinu jako je cilofungin, LY-303366, L-733560, L-743872 nebo jiné sloučeniny působící na buněčné stěny jako je nikkomycin Z a/nebo jedna nebo více sloučenin snižujících imunitu jako je interferon např. (IFN-), interleukin např. (IL-1, IL-2, IL-3 a IL-8) a činidla stimulující buňky, [(G)-CSF, (M)-CSF a (GM)-CSF] a defensiny. Zvláště vhodnými sloučeninami pro použití se sloučeninami podle, předmětného vynálezu jsou intrakonazol, flucytosin, flukonazol nebo amphotericin B.

Pokud jsou sloučeniny podle tohoto vynálezu podávány v kombinaci s jinou fungicidní sloučeninou, sloučenina podle tohoto vynálezu a jiný fungicid, mohou být podávány v doporučených maximálních klinických dávkách nebo v dávkách nižších.

Výše uvedené kombinace mohou být určeny pro použití ve formě farmaceutických prostředků a proto farmaceutické prostředky zahrnující výše popsané kombinace spolu s farmaceuticky akceptovatelným nosičem této kombinace jsou dalším aspektem tohoto vynálezu. Samostatné složky takového farmaceutického prostředku mohou být podávány buď sekvenčně nebo simultánně v oddělených nebo kombinovaných farmaceutických prostředcích.

Pokud je sloučenina podle tohoto vynálezu používána v kombinací s druhým léčivem pro stejnou indikaci, mohou se dávky jednotlivých sloučenin lišit od případu, kdy je každá ze sloučenin používána samostatně. Vhodné dávky snadno . určí odborník v dané oblasti.

• · ·« • · • · ·· • ·

Agrochemické prostředky

Sloučeniny obecného vzorce (I) je možné používat buď v nezměněné formě nebo výhodně spolu s pomocnými látkami, které jsou běžně používané v oblasti agrochemických prostředků a jsou z hlediska účelu jejich použití známé hlavně jako: emulgovatelné koncentráty, natíratelné pasty, přímo sprejově rozprašovatelné nebo ředitelné roztoky, zředěné roztoky, suspenze (včetně vodných, olej ovitých nebo jiných suspenzí s vysokým procentovým obsahem vody), disperze, olej ovité disperze, šířicí činidla, smáčecí prášky, rozpustné prášky, prachy, granule a opouzdřené prostředky. Agrochemické prostředky podle tohoto vynálezu jsou vyráběny známými způsoby, např. homogenním smísením a/nebo mletím aktivních složek s přídavnými složkami, např. rozpouštědly, pevnými nosiči a, tam kde je to vhodné, povrchově aktivními látkami. Prášky, prachy a šířicí činidla je možné vyrobit smísením nebo mletím aktivních složek s pevným nosičem. Granule, např. potahované granule, impregnované granule nebo homogenní granule, je možné vyrobit navázáním aktivních složek na pevné nosiče.

Skupina vhodných rozpouštědel zahrnuje: aromatické uhlovodíky, výhodně frakce obsahující 8 až 12 atomů uhlíku, jako jsou směsi xylenů nebo substituované naftaleny, chlorované aromáty jako jsou chlorbenzeny, ftaláty, jako je dibutyl- nebo dioktylftalát, alifatické uhlovodíky, jako je cyklohexan nebo parafiny, alkoholy a glykoly a jejich ethery a estery, jako je ethanol, ethylenglykol, ethylenglykolmonomethylether nebo ethylenglykolmonoethylether, ketony, jako je cyklohexanon, aminy, jako je ethanolamin, silně polární rozpouštědla, jako je N-methyl-2-pyrrolidon, dimethylsulfoxid nebo N,N-dimethylformamid a rostlinné oleje nebo epoxidované

9 • ·· · • ·

rostlinné oleje, jako je epoxidovaný kokosový olej nebo sójový olej a vodu.

Jako příklady povrchově aktivních činidel je možné uvést: solí aromatických sulfonových kyselin obsahující alkalické kovy, kovy alkalických zemin a ammonné kationty, např. ligninsulfonová kyselina, fenolsulfonová kyselina, naftalensulfonová kyselina a dibutylnaftalensulfonová kyselina a stejné soli mastných kyselin, alkyl- a alkylarylsulfonátů a alkyllaurylether a sulfáty mastných alkoholů a soli sulfonovaných hexadekanolů, heptadekanolů a oktadekanolů, soli glykoletherů mastných alkoholů, produkty kondenzací derivátů sulfonovaného naftalenů s formaldehydehydem, produkty kondenzací naftalenů nebo derivátů naftalensulfonové kyseliny s fenolem a formaldehydem, polyoxyethylenoktylfenolethery, ethoxylovaný isooktylfenol, a ethoxylovaný nonylfenol, alkylfenolpolyglykolethery, tributylfenylpolyglykolethery, alkylarylpolyetheralkoholy, isotridecylalkohol, kondenzáty mastných alkoholů s ethylenoxidem, ethoxylovaný ricinový olej, polyoxyethylenalkylethery, ethoxylovaný polyoxypropyelen, acetal laurylalkoholpolyglykoletheru, estery sorbítolu, odpadní louh ligninsulfitu a methylcelulosu.

Jako příklad pevných nosičů je možné uvést minerální zeminy jako kyseliny křemičité, silikagely, silikáty, mastek, kaolin, atapulgit, vápenec, vápno, křída, kmen, spraš, jíl, dolomit, křemelina, síran hlinito-vápenatý, síran hořečnatý, oxid hořečnatý, rozemleté plasty, hnojivá jako je síran amonný, fosforečnan amonný, dusičnan amonný a močovina a její deriváty a rostlinné produkty jako je celozrnná mouka, rozemletá kůra nebo rozemleté dřevo a rozemleté ořechové skořápky, celulosovité prášky atd.

• · · · ·

Sloučeniny obecného vzorce (I) je možné smísit a aplikovat » * · <

► · · <

» · · 1 » · · 4 ·· ·· spolu s jinými aktivními insekticidy, baktericidy, složkami, například herbicidy, nematocidy, prostředky proti měkkýšům, regulátory růstu, mikronutrienty a hnojivý. Ostatní složky mohou zahrnovat rovněž jeden nebo více fungicidů náležejících, ale ne omezených pouze na následující třídy fungicidů: karboxamidy, benzimidoazoly, triazoly, hydroxypyridiny, dikarboxamidy, fenylamidy, thiadiazoly, karbamáty, kyanooximy, deriváty kyseliny skořicové, morfoliny, imidazoly, B-methoxyakryláty a pyridiny/pyrimidiny. Dále mohou být tyto další aktivní složky používány jako směsi několika agrochemických prostředků podle tohoto vynálezu a, pokud je to žádoucí, spolu s dalšími v této oblasti obvykle používanými pomocnými látkami usnadňující aplikaci prostředku. Vhodné nosiče nebo pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a korespondují se substancemi, které se obecně používají postupech pro tvorbu těchto prostředků nebo regenerované minerální sloučeniny, rozpouštědla, dispergační činidla a smáčecí činidla).

Následující seznam fungicidů, se kterými mohou být kombinovány sloučeniny obecného vzorce (I) je uváděn pouze pro ilustraci možných kombinací bez jakéhokoli omezení vzhledem k dalším možným kombinacím. Jako příklad fungicidů, které lze kombinovat se sloučeninami obecného vzorce (I) je možné uvést: síru, dithiokarbamáty a jejich deriváty jako je dimethyldithiokarbamát železitý, dimethyldithiokarbamát zinečnatý, ethylenbisdithiokarbamát zinečnatý, mangan obsahující ethylenbisdithiokarbamát, mangan a zinek obsahující ethylenbisdithiokarbamát, tetramethylthiuramdisulfidy, amonný komplex N,N'-ethylenbisdithiokarbamátu zinečnatého, amonný komplex N,N'-propylenbisdithiokarbamátu zinečnatého, N,N'-propylenbisv technologických (např. přírodní • 4 · · · 4 · 4 · · · *

44 4 4 4444 4 44 4

4 444 44 4 44 4-44 4

44 44444 44 44 dithiokarbamát zinečnatý, N,N'-polypropylenbis(thiokarbamyl)disulfid; nitroderiváty, jako je dinitro(1-methylheptyl)fenylkrotonát, 2-sek.-butyl-4,6-dínitrofenyl-3,3-dimethylakrylát, 2-sek.-butyl-4,6-dinitrofenylisopropylkarbonát a diisopropyl-5-nitroisoftalát; heterocyklické sloučeniny, jako je 2-heptadecylimidazol-2-ylacetát, 2,4-dichlor-6-(o-chloranilino)-s-triazin, 0,O-diethylftalimidofosfonothioát, 5-amino-l[bis(dimethylamino)fosfinyl]-3-fenyl-l,2,4-triazol, 2,3-dikyano-1,4-dithioanthrachinon, 2-thio-l, 3-dithio[4,5-b]chínoxalin, methyl-1-(butylkarbamoyl)-2-benzimidazolkarbamát, 2-methoxykarbonylaminobenzimidazol, 2-(fur-2-yl)benzimidazol, 2-(thiazol-4-yl)benzimidazol, N- (1,1,2,2-tetrachlorethylthio)tetrahydroftalimid, N-trichlormethylthiotetrahydroftalimid, N-trichlormethylthioftalimid, N-dichlorfluormethylthio-N',N'-dimethyl-N-fenylsulfondiamid, 5-ethoxy-3-trichlormethyl-l,2,3thiadiazol, 2-thiokyanomethylthiobenzthiazol, 1,4-dichlor-2,5di-methoxybenzen, 4-(2-chlorfenylhydrazono)-3-methyl-5-isoxazolon, 2-thiopyridin-l-oxid, 8-hydroxychinolin a jeho sůl obsahující měď, 2,3-dihydro-5-karboxanilido-6-methyl-l,4oxathiyn, 2,3-díhydro-5-karboxanilido-6-methyl-l,4-oxathiyn4,4-dioxid, 2-methyl-5,6-dihydro-4H-pyran-3-karboxanilid, 2-methylfuran-3-karboxanilid, 2,5-dimethylfuran-3-karboxanilid, 2,4,5-trimethylfuran-3-karboxanilid, 2,5-dimethyl-Ncyklo-hexylfuran-3-karboxanilid, N-cyklohexyl-N-methoxy-2,5diethyl-furan-3-karboxanilid, 2-methylbenzanilid, 2-jodbenzanilid, N-formyl-N-morfolin-2,2,2-trichlorethylacetal, piperazin-1,4-diylbis(1-(2,2,2-trichlorethyl)formamid),

1-(3,4-dichloranilin)-l-formylamino-2,2,2, -trichlorethan,

2,6-dimethyl-N-tri-decylmorfolin a jeho soli, 2,6-dimethyl-Ncyklododecylmorfolin a jeho soli, N-[3-(p-terc. butylfenyl)-2methylpropyl]-cis-2,6-dimethyl-morfolin, N-[3-(p-terc. butyl38 fenyl)-2-methyl-propyl]piperidin, 1-[2-(2,4-dichlorfenyl)-4ethyl-1,3-dioxolan-2-yl-ethyl]-1H-1,2,4-triazol, 1-[2-(2,4dichlorfenyl)-4-n-propyl-l,3-díoxolan-2-yl-ethyl]-1H-1,2,4triazol, N-(n-propyl)-N-(2,4,β-trichlorfenoxyethyl)-N-imidazolmočovina, 1-(4-chlorfenoxy)-3,3-dimethyl-l-(1H-1,2,4-triazol -1-yl)butan-2-on, 1- (4-chlorfenoxy)-3,3-dimethyl-l-(1H1,2,4-triazol-l-yl) butan-2-ol, a-(2-chlorfenyl)-a-(4-chlorfenyl) -5-pyrimidin-methanol, 5-butyl-(2-dimethylamino-4-hydroxy-6-methylpyrimi-din, bis(p-chlorfenyl)-3-pyridinmethanol,

1,2-bis(3-ethoxy-karbonyl-2-thioureido)benzen, l,2-bis(3methoxykarbonyl-2-thioureido)benzen a různé fungicidy jako je dodecylguanidínacetát, 3-[3-(3,5-dimethyl-2-oxycyklohexyl)-2hydroxyethyl]glutaramid, hexachlorbenzen, DL-methyl-N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(fur-2-yl)alanát, methyl DL-N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(2-methoxyacetyl)alanát, N-(2,β-dimethylfenyl)-Nchloracetyl-DL-2-aminobutyrolakton, methyl DL-N-(2,6-dimethylfenyl)-N-(fenylacetyl)alanát, 5-methyl-5-vinyl-3-(3,5-dichlorfenyl)-2,4-dioxo-l,3-oxazolidin, 3-[3,5-dichlorfenyl]-5methyl-5-methoxymethyl-l,3-oxazolidin-2,4-dion, 3-(3,5-dichlorfenyl) -1-isopropylkarbamoylhydantoin, N-(3,5-dichlorfenyl)-1,2-dimethylcyklopropan-l,2-dikarboximid, 2-kyano-[N(ethylaminokarbonyl)-2-methoximino]acetamid, 1-[2-(2,4-dichlorfenyl)pentyl]-1H-1,2,4-triazol, 2,4-difluor-a-(1H-1,2,4triazol-l-ylmethyl)benzhydrylalkohol, N-(3-chlor-2,6-dinitro4-trifluoromethylfenyl)-5-trifluoromethyl-3-chlor-2-aminopyridín a 1-((bis(4-fluorfenyl)methylsilyl)methyl-lH-l,2,4-triazol .

Podle povahy agrochemického prostředku podle předmětného vynálezu a podle objektů, na které má být prostředek aplikován a podle převládajících podmínek je volen způsob aplikace jako je sprejové rozprašování, jemné rozstřikování, rozprašování, • · 0 0 0*

0 · · » ♦ · 0

I · · · ► · 0 0 0 «· *· » » » 4 » · · <

» · 0 <

rozptylováni, potahování, obalování a zalévání. Jedním ze způsobů aplikace aktivní složky nebo agrochemického prostředku obsahujícího alespoň jednu z uvedených sloučenin je aplikace na rostliny (tj . aplikace na listy); Avšak, aktivní složka může proniknout do rostliny kořeny skrz půdu (tj. půdní aplikací). Tato aplikace může být prováděna buď aplikací kapaliny do půdy (napájením) nebo aplikací granulí obsahujících aktivní složku(y).

Aktivní složka podle tohoto vynálezu může být rovněž aplikována na růstový materiál rostlin, jako jsou semena (plody, hlízy nebo zrní) nebo rostlinné řízky, a to buď v kapalné formě (potahování) nebo v pevné formě (obalování). Například semena mohou být obalena před vysetím. Sloučeniny podle předmětného vynálezu je rovněž možné aplikovat na zrní, a to buď impregnací zrn kapalnou formou nebo potažením zrn pevnou formou agrochemického prostředku podle tohoto vynálezu. Agrochemický prostředek je rovněž možné aplikovat přímo na místě, kde jsou pěstovány rostliny, například do secích brázd během setí.

Obvyklé výhodně používané množství prostředku je od 10 gramů do 50 kilogramů aktivní složky na jeden hektar, výhodně 100 gramů až 2 kilogramy aktivní složky na hektar, výhodněji 100 až 600 gramů na hektar. Aktivní složky uvedených sloučenin jsou obecně používány ve formě agrochemických prostředků a mohou být aplikovány na rostliny nebo časti rostlin buď simultánně nebo ve sledu s ostatními aktivními složkami. Tyto další aktivní složky mohou být hnojivá, další mikronutrienty nebo jiné sloučeniny ovlivňující růst rostlin. Avšak mohou jimi být také selektivní herbicidy, insekticidy, baktericidy, nematocidy a látky proti měkkýšům stejně jako ostatní fungicidy.

• 9 99 99 9999

9999 999 9999

99 9 9 9999 9 99 ·

999999 9 999 99 9

9 99 9 9999

99 99 999 99 99

Příprava výchozího materiálu

Fermentační produkce sordarinu

Pro kultivaci Rosellinia subiculata (ATCC 74386) a

ATCC 74387 při produkci sordarinu byla použita následující média:

Očkovací médium 1

Složka

Kvasný extrakt Sladový extrakt Glukosa

Junlon gram/litr

4,0

8,0

4,0

1,5

Médium bylo připraveno v destilované vodě, před sterilizací bylo pH upraveno na hodnotu 7,0 a následně bylo médium rozděleno po 50 mililitrech do nekrytých Erlenmeyerových baněk o objemu 250 mililitrů. Baňky byly uzavřeny vatovými uzávěry a následná sterilizace probíhala 20 minut při teplotě 121 °C.

Očkovací médium 2

Složka gram/litr

Kukuřičný výluh (sušený) 2,5

Rajčatová pasta 40,0

Ovesná mouka 10,0

Glukosa 10,0

Roztok stopových prvků 10,0 ml/1

·· • fefefe fe fefe fe fe • · • ·

Roztok stopových prvků

Složka

FeSO₄.7 H₂0 MnSO₄.4 H₂0 CuC1₂.2 H₂0 CaCl₂.H₂0

H3BO3 (NH₄) _sMo0₂₄.4 H₂0 ZnSO₄.7 H₂0 gram/litr

1,0

0,025

0,1

0,056

0,019

0,2

Roztok stopových prvků byl připraven v 0,6 N kyselině chlorovodíkové

Médium bylo připraveno v destilované vodě, před sterilizací bylo pH upraveno na hodnotu 6,8 a následně bylo médium rozděleno po 50 mililitrech do nekrytých Erlenmeyerových baněk o objemu 250 mililitrů. Baňky byly uzavřeny vatovými uzávěry a následná sterilizace probíhala 20 minut při teplotě 121 °C.

Pevné produkční médium 1

1. Pevná část

Do válcové láhve o objemu 2 litry bylo odměřeno 675 mililitrů vermikulitu. Láhev byla uzavřena latexovou zátkou a umístěna na 60 minut do autoklávu a následně sušena po dobu 30 minut.

2. Kapalná část

Do láhve o objemu 500 mililitrů bylo odměřeno 220 mililitrů následující směsi:

0

0 0 0 • 00 0 0

0 0 0 • 0 • 000

00 « 0 1

0 «

	Složka	gram/litr
	Glukosa	150,0
	Glycerol	20,0
	Kvasný extrakt	4,0
	NaNO₃	1,0
	Glutaman sodný	3,0
«	Na₂HPO₄	0,5
*	MgSO₄.7 H₂O	1,0
	K-prvky	1,0 ml/1
	CaCO₃	8,0
	K-prvky
	Složka	gram/litr
	FeCl₃.6 H₂O	5,8
	MnSO₄.H₂O	0,1
	CoC1₂.6 H₂0	0,02
	CuSO₄.5 H₂O	0,015
	Na₂Mo0₄.2 H₂O	0,012
	ZnCl₂	0,02
	SnCl₂.2 H₂0	0,005
I	h₃bo₃	0,01
	KC1	0,02
I	HCI (koncentrovaná)	2,0 ml/1

Médium bylo připraveno v destilované vodě, před sterilizací bylo pH upraveno na hodnotu 7,0, médium rozděleno do lahví o objemu 500 mililitrů a následně tepelně zpracováváno v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 °C. Glukosa byla tepelně zpracovávána v autoklávu odděleně od ostatních složek.

·

0*0 4

44 4 4 ♦ · 4 ·

0 0 «

0 4 « • 4 4 4

4« 44

Kapalné produkční médium 1

Složka	gram/litr
Glyceról	75,0
Glukosa	75, 0
Rajčatová pasta	5,0
NZ amin typ A	4,0
Ardamin PH	5,0
K₂HPG₄	0,5
MgSO₄.7 H₂O	0,25
KCI	0,25
ZnSO₄.7 H₂O	0,5
CaCO₃	10,0

Médium bylo připraveno v destilované vodě, před sterilizací bylo pH upraveno na hodnotu 7,0, médium bylo rozděleno po 50 mililitrech do nekrytých Erlenmeyerových baněk o objemu 250 mililitrů. Baňky byly uzavřeny vatovými uzávěry a následná sterilizace probíhala 20 minut při teplotě 121 °C.

Pevné produkční médium 2

1. Pevná část

2. Kapalná část

Μ 44 • 4 4 4 ·

4 4 4 4 • 4 ·44 4 4

4 4 · *4 4 4 4 4 ♦ 44

44

4 ♦ 4

4 • 4

4

Složka	gram/litr
Sacharosa	60,0
Glukosa	80,0
Glycerol	60,0
Kyselina citrónová	15, 0
NZ amin typ A	5,0
NaNO₃	1,0
kh₂po₄	0,5
MgSCú. 7 H₂O	0,5
CaCO₃	0,5
K-prvky	1 ml/1

K-prvky

Složka	gram/litr
FeCl₃.6 H₂0	5,8
MnSO₄.H₂O	0,1
CoCl₂.6 H₂0	0,02
CuSO₄.5 H₂O	0,015
Na₂Mo0₄.2 H₂0	0,012
ZnCl₂	0,02
SnCl₂.2 H₂O	0,005
h₃bo₃	0,01
KC1	0,02
HCl (koncentrovaná)	2,0 ml/1

Médium bylo připraveno v destilované vodě, před sterilizací bylo pH upraveno na hodnotu 1,0, médium bylo rozděleno po 220 mililitrech do lahví o objemu 500 mililitrů a tepelně zpracováváno v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 °C.

• · ·

» · * · ♦ ·

·· *· • · · ·

Kapalné produkční médium 2

Složení bylo shodné s kapalnou částí pevného produkčního média 1. Médium bylo připraveno v destilované vodě, před sterilizací bylo pH upraveno na hodnotu 7,0. Médium bylo rozděleno po 50 mililitrech do nekrytých Erlenmeyerových baněk o objemu 250 mililitrů. Baňky byly uzavřeny vatovými uzávěry a tepelně zpracovávány v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Glukosa byla tepelně zpracovávána v autoklávu odděleně od ostatních složek.

Produkce sordarinu fermentací Rosellina subiculata (MF6239, ATCC 74386)

1. Kultura:

Šikmý řez agaru obsahujícího kulturu byl asepticky přenesen do očkovacího média 1 (50 mililitrů v nekryté baňce o objemu 250 mililitrů). Pro získání biomasy byla směs inkubována ve výkyvné kuželové třepačce (průměr kuželů byl přibližně 5,1 centimetrů(2 palce)) 5 dní při rychlosti 220 otáček za minutu, teplotě 25 °C a relativní vlhkosti 85 %. Biomasa byla rozdělena, přenesena do sterilních ampulí obsahujících glycerol a zmrazená (v dalším textu bude tato směs označována jako zmrazené vegetativní mycélium (FVM)). Tato mycélia s výslednou koncentrací glycerolu 10-15 % byla udržována při teplotě -75 °C. Sekundární zmrazená vegetativní mycélia (FVM) byla připravena přenesením 1,0 mililitru rozmraženého primárního zmrazeného vegetativního mycélia (FVM) do očkovacího média 2, inkubací po dobu 7 dní při teplotě 25 °C a rychlosti 220 otáček za minutu a následným zmrazením výše popsaným způsobem.

9999

9

999

99

9 9 9 9

9 9 9 9 · 9*9 9 9

9 9 9 9

99 9·

99 ♦ 9 «

9 9

9« 9»

2. Inokulum:

Obsah zmrazené ampule (FVM) MF6239 byl po rozmražení a ohřátí na teplotu místnosti použit pro inokulaci očkovacích kultur v množství 1,0 mililitr na 50 mililitrů očkovacího média 2. Vzniklá směs byla 7 dnů pěstována ve výkyvné kuželové třepačce při rychlosti 220 otáček za minutu, teplotě 25 °C a relativní vlhkosti 85 %.

3. Produkce:

Na pevném produkčním médiu

Alikvotní podíl (10-12 mililitrů) inokula bylo přidáno do 220 mililitrů kapalné části pevného produkčního média 1. Pro dispergaci biomasy byla baňka intenzivně protřepána. Obsah každé baňky byl vylit do válcové kultivační nádoby o objemu 2 litry, která obsahovala 675 mililitrů hrubozrnného vermikulitu. Pro zajištění homogenní inokulace a homogenního pokrytí vermikulitu byl obsah kultivační nádoby protřepán/promíchán. Inkubace kultivační nádoby probíhala 17 dnů v horizontální poloze s otáčením rychlostí přibližně 4 otáčky za minutu na přístroji firmy Wheaton při teplotě 22 °C a relativní vlhkosti 70 %.

V kapalném produkčním médiu

Inokulace očkovacích kultur byla provedena shora uvedeným způsobem. Inokulace 250 mililitrů, která produkčního média 1, (1,5 mililitru) inokula, každé produkční baňky o objemu obsahovala 50 mililitrů kapalného byla provedena alikvotním podílem Baňky byly 7-21 dnů inkubovány ve výkyvné kuželové třepačce při rychlosti 220 otáček za minutu, teplotě 25 °C a relativní vlhkosti 50-85 %.

00 00 ··*· 00 0» 0*00 0 ♦» 0 0 0 0 • 0 · · « 0 0 00 « * · «

0 000 000 000000 0# 0 00 0 0000 00 00 00 000 04 00

Produkce sordarinu fermentací MF6232 (ATCC 74387)

1. Kultura:

Šikmý řez agaru obsahujícího MF6232 byl asepticky přenesen do očkovacího média 1 (50 mililitrů v nekryté baňce o objemu

250 mililitrů). Pro získání biomasy byla směs inkubována ve výkyvné kuželové třepačce 3 dny při rychlosti 220 otáček za minutu, teplotě 25 °C a relativní vlhkosti 85 %. Biomasa byla rozdělena, přenesena do sterilních ampulí obsahujících glycerol a zmrazená (v dalším textu bude tato směs označována jako zmrazené vegetativní mycélium (FVM)). Tato mycélia s výslednou koncentrací glycerolu 10-15 % byla .udržována při teplotě -75 °C. Sekundární zmrazená vegetativní mycélia (FVM) byla připravena přenesením 1,0 mililitru rozmraženého primárního zmrazeného vegetativního mycélia (FVM) do očkovacího média 2, jehož složení je uvedeno níže, inkubací po dobu 7 dní při teplotě 25 °C a rychlosti 220 otáček za minutu a následným zmrazením výše popsaným způsobem.

2. Inokulum:

Obsah zmrazené ampule (FVM) MF6232 byl po rozmražení a ohřátí na teplotu místnosti použit pro inokulaci očkovacích kultur v množství 1,0 mililitr na 50 mililitrů očkovacího média 2. Vzniklá směs byla 7 dnů pěstována ve výkyvné kuželové třepačce při rychlosti 220 otáček za minutu, teplotě 25 °C a relativní vlhkosti 85 %.

3. Produkce:

Na pevném produkčním médiu

Alikvotní podíl (10-12 mililitrů) inokula bylo přidáno do 220 mililitrů kapalné části pevného produkčního média 2. Pro fe *

fe fe · • · fe · fefe fefe fefe fefefefe fefe fefe • fefefe fefefefe • fefe fefefe fe fefe fe fe*· ·· · fefefe 4 fe · • ·· · ···· • fe »···· ·.· ·· dispergaci biomasy byla baňka intenzivně protřepána. Obsah každé baňky byl vylit do válcové kultivační nádoby o objemu 2 litry, která obsahovala 675 mililitrů hrubozrnného vermikulitu. Pro zajištění homogenní inokulace a homogenního pokrytí vermikulitu byl obsah kultivační nádoby protřepán/promíchán. Inkubace kultivační nádoby probíhala 17 dnů v horizontální poloze s otáčením rychlostí přibližně 4 otáčky za minutu na přístroji firmy Wheaton při teplotě 22 °C a relativní vlhkosti 70 %.

V kapalném produkčním médiu

Inokulace očkovacích kultur byla provedena shora uvedeným způsobem. Inokulace 250 mililitrů, která produkčního média 2, (1,5 mililitru) inokula.

každé produkční baňky o objemu obsahovala 50 mililitrů kapalného byla provedena alikvotním podílem Baňky byly 7-21 dnů inkubovány ve výkyvné kuželové třepačce při rychlosti 220 otáček za minutu, teplotě 25 °C a relativní vlhkosti 50-85 %.

Produkce sordarinu MF6232 (ATCC 74387) ve velkém měřítku

Kapalná část pevného produkčního média 1 byla použita jak v očkovacím, tak v produkčním fermentoru. Do obou fermentorů byla po sterilizaci přidána cerelosa, a to v množství 30 gramů/litr v případě očkovacího fermentoru a 150 gramů/litr v případě produkčního fermentoru. Očkovací fermentory byly inokulovány 2 litry kultury vypěstované v třepacích baňkách. Poté byly tyto fermentory ponechány růst při teplotě 25 °C po dobu 30 hodin, dokud absorpce kyslíku nebyla přibližně 3 milimoly/litr za hodinu. Po 30 hodinách bylo 25 litrů inokula přemístěno do produkčního fermentoru.

dosáhl po • ft ftft • ftft · • · » · • ftftftft ♦ · · • ft ftft • ft ftftftft • ftft • ftftftft ft ft ft ftft · • ft ftftft ·· ftft

I ftft · » ftft ♦ ft ftft · » ftftft ftft ftft hodinách na konci

Růst v produkčním fermentoru absorpce kyslíku 8-10 milimolů/litr za hodinu a kultivace klesla tato absorpce na 5-7 milimolů/litr za hodinu. Rozpouštění kyslíku bylo prováděno zvýšeným mícháním směsi. Hodnota pH živné půdy nebyla regulována a obecně došlo po 200 hodinách k jejímu poklesu na 5,3. Proces byl prováděn při teplotě 25 °C.

Po 280 hodinách růstu byla fermentace ukončena a byla zahájena příprava izolace. Hodnota pH byla upravena hydroxidem sodným na 12 a směs byla ponechána odstát 20 hodin při teplotě fermentace. Poté byla, před přenesením směsi do válců pro další zpracování, upravena hodnota pH kyselinou sírovou na 6,0.

Izolace sordarinu

Izolace I

Methylethylketonový extrakt z fermentace kultury MF6232 (ATCC 74387) odpovídající 64 mililitrům surové živné půdy byl ve vakuu odpařen do sucha. Získaný zbytek o hmotnosti 365 miligramů byl rozpuštěn v takovém množství směsi methanol/dichlormethan (2:98), aby objem roztoku byl 4,6 mililitru. Z tohoto roztoku bylo odebráno 4,3 mililitru, tj. podíl obsahující 341 miligramů rozpuštěného zbytku, a tento podíl byl nanesen na chromatografickou kolonu pro mžikovou chromatografií naplněnou 60 mililitry silikagelu 60 (0,040-0,0630 milimetrů, 230-400 mesh, E. Merck) a ekvilibrovanou 2 procentním roztokem methanolu v dichlormethanu. Kolona byla eluována skokovou gradientovou elucí a byla promývána postupně 2, 5, 10 a 30 procentním roztokem methanolu v dichlormethanu, přičemž bylo použito vždy • · • 4 44 4 44 4 44 44

4444 444 40*4 • 04 4 0 0 440 4 4 0 0

040040 0 000 14»

0 00 0 0000 00 00 04 044 0· 04

240 mililitrů příslušného roztoku, a nakonec byla kolona promyta 120 mililitry samotného methanolu. Pro každou soustavu bylo odebráno 16 frakcí o objemu 15 mililitrů. Biologickým testem bylo stanoveno, že frakce číslo 39-56 obsahovaly velký podíl produktu.

Spojené frakce byly odpařeny ve vakuu do sucha a bylo získáno 103,1 miligramu vzorku, ze kterého byl odebrán podíl o hmotnosti 34,4 miligramu, který byl dále purifikován pomocí HPLC (byla použita kolona o rozměrech 9,4 x 250 milimetrů naplněná pevnou fází Zorbax Rx-C8, 5 mikrometrů, která byla eluována mobilní fází sestávající z 20 % acetonitrilu a 80 % 0,01 molárního vodného roztoku K₂HPO₄, jejíž pH bylo pomocí koncentrované H₃PO₄ upraveno na hodnotu 6,9. Rychlost promývání byla nastavena na 4 mililitry za minutu při 40 °C. Detekce byla prováděna diodovým polem). Byly odebírány 4 mililitrové frakce. Frakce 16-20, které obsahovaly velký podíl produktu, byly spojeny a zahuštěny ve vakuu na přibližně dvacet pět procent původního objemu. Koncentrát byl dvakrát extrahován stejným objemem ethylacetátu a organické vrstvy byly spojeny, promyty stejným objemem solanky, sušeny nad bezvodým síranem sodným a po odpaření rozpouštědel ve vakuu bylo získáno 3,7 miligramu sordarinu.

Izolace II

Methylethylketonový extrakt ze šarže -004Y fermentace kultury MF6232 (ATCC 74387) odpovídající 980 mililitrům surové živné půdy byl ve vakuu odpařen do sucha. Získaný zbytek o hmotnosti 4,9 gramu byl rozpuštěn v takovém množství směsi methanol/dichlormethan (1:9), aby objem roztoku byl 21,5 mililitru. Z tohoto roztoku bylo odebráno 21 mililitrů, tj. podíl obsahující 4,8 gramu rozpuštěného zbytku, a tento

0» 0000 • 0 • 00»

0 0 0

0 »00 »

0 0

00

0 0 0 00

000

0» • 0 0 ·

0 0 0

0» 00 podíl byl nanesen na chromatografickou kolonu naplněnou 500 mililitry silikagelu 60 (0,040-0,0630 milimetrů, 230400 mesh, E. Merck) a ekvilibrovanou 2 procentním roztokem methanolu v dichlormethanu. Kolona byla eluována rychlostí 25 mililitrů za minutu skokovou gradientovou elucí nejprve 1 litrem 2 procentního roztoku methanolu v dichlormethanu, dále 1 litrem 5 procentního methanolu a následně 2 litry 15 procentního methanolu. Nakonec byla kolona promyta nejprve 1 litrem 30 procentního methanolu a poté 2 litry samotného methanolu. Byly odebírány frakce o objemu dvacet pět mililitrů. Biologickým testem bylo stanoveno že frakce číslo 75-85 a 111-121 obsahovaly velký podíl produktu a podle analýzy provedené HPLC s reverzními fázemi obsahovaly sloučeninu (I).

Spojené frakce číslo 75-85 a 111-121 byly odděleně odpařeny ve vakuu do sucha a byly získány vzorky o hmotnosti 69,3 miligramu, respektive 95,3 miligramu. Ze vzorku získaného odpařením spojených frakcí 75-85 byly odebrány dva podíly o hmotnosti 34 miligramů, které byly dále purifikovány pomocí dvou identických HPLC (byla použita kolona o rozměrech 21,2 x 250 milimetrů naplněná pevnou fází Zorbax Rx-C8, 7 mikrometrů, která byla eluována mobilní fází sestávající ze 40 % acetonitrilu a 60 % vody s celkovým obsahem 0,1 % H3PO4. Rychlost promývání byla nastavena na 20 mililitrů za minutu při 25 °C. Detekce byla prováděna detektorem při vlnové délce 220 nanometrů). Byly odebírány 10 mililitrové frakce. Frakce 27-31 z obou preparací, které obsahovaly velký podíl produktu, byly spojeny a zahuštěny ve vakuu na přibližně čtyřicet procent původního objemu. Koncentrát byl dvakrát extrahován stejným objemem ethylacetátu a organické vrstvy byly spojeny, promyty stejným objemem solanky, sušeny nad bezvodým síranem •φ ···· • φ φ

φφφ φ φ φφφ φ · φ φ φ φ φ φ φ · φ φ sodným a po odpaření rozpouštědel ve vakuu bylo získáno 27 miligramů sordarinu. Za stejných podmínek byly purifikovány i dva podíly po 46 miligramech, které byly odebrány ze vzorku získaného odpařením spojených frakcí 111-121. Frakce 25-28 z obou preparací byly spojeny a po zpracování výše popsaným způsobem bylo získáno 17 miligramů sordarinu.

Meziprodukt 1 [IR-(la,3aP,4β,4a3,7β,7aa,83β)]-Benzyl-4-formyl-8a(hydroxymethyl)-4,4a,5,6,7,7a,8,8a-oktahydro-7-methyl-3-(1methylethyl)-1,4-methano-s-indacen-3a(1H)-karboxylát (benzylester sordaricinu)

CHO

Ke 2 miligramům sordarinu rozpuštěným v 1 mililitru acetonu bylo přidáno 0,2 mililitru koncetrované kyseliny chlorovodíkové. Směs byla jeden den míchána při teplotě místnosti. Roztok byl naředěn vodou, vodně zpracován (dichlormethan) a organický podíl byl sušen nad bezvodým síranem sodným, zfiltrován a zahuštěn ve vakuu. Vzniklá směs byla rozpuštěna ve 2 mililitrech N,N-dimethylformamidu (DMF) a do vzniklého roztoku bylo postupně přidáno 0,1 mililitru benzylbromidu a přebytek pevného NaHCO3. Směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti a následně zahuštěna ve vakuu. Ke směsi byl přidán chloroform a byl z ní odfiltrován NaHCO₃. Filtrát byl zahuštěn ve vakuu a po purifikaci preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) byl získán 1,0 miligram benzylesteru sordaricinu. ^XH NMR (CDC1₃) : δ (1H, m) , 3,48 (1H, d (1H, d, J=ll,7), 5,31

): δ	0,51	(3H, d,
1,0	(3H, d,	J=6,6),
2,24	(1H, m)	, 2,51
·, d,	J=ll,0)	, 5,11
04	(1H, d,	J=2,l),

7,31-7,40 (5H, m), 9,62 (1H, s).

Meziprodukt 2 [IR-(la,3aP,4β,4a3,7β,7aa,83β)]-4-Methoxybenzyl-4-formyl-8a(hydroxymethyl)-4,4a,5,6,7,7a,8,8a-oktahydro-7-methyl-3- (1methylethyl)-1,4-methano-s-indacen-3a(1H)-karboxylát (p-methoxybenzylester sordaricinu)

Bylo postupováno stejným způsobem jako při přípravě benzylesteru sordaricinu s tím, že místo benzylbromidu byl použit 4-methoxybenzylchlorid. ¹H NMR (CDC1₃) : δ 0,51 (3H, d, ·»· fefe fe··* • · fe fefefe

(IH, s) .

Meziprodukt 3 [IR-(la,3a3,4β,4a3,7β,7aa,83β)]-Allyl-4-formyl-8a(hydroxymethyl) -4,4a, 5,6,7,7a, 8,8a-oktahydro-7-methyl^k-3- (1methylethyl)-1,4-methano-s-indacen-3a(IH)-karboxylát (allylester sordaricinu)

CHO

Bylo postupováno podobným způsobem jako při přípravě benzylesteru sordaricinu s tím, že místo benzylbromidu byl použit allylbromid.

Meziprodukt 4

Kyselina [IR- (la,3a3,4β,43β,7β,7aa,8θβ)]-4-formyl-8a-(hydroxymethyl)-4,4a,5,6,7,7a,8,8a-oktahydro-7-methyl-3-(1methylethyl)-1,4-methano-s-indacen-3a(IH)-karboxylová (sordaricin)

CkOH £H0 xt-rFW

K methanolickému roztoku 0,6 miligramu benzylesteru sordaricinu byl přidán Pearlmanův katalyzátor. Směs byla 15 minut míchána pod tlakem vodíku (tlak vytvořený připojením salonku, který byl naplněný vodíkem) Po filtraci skrz vatu a zahuštění ve vakuu bylo získáno 0,4 miligramu sordaricinu. 'H NMR (CDC1₃) : δ 0,82 (3H, d, J=6,8), 0,98 (3H, d, J=6, 6) ,

1,01 (3H, d, J=6,9), 1,23 (IH, m) , 1,25 (IH, d, J=12, 6) , 1,582,10 (9H, m) , 2,34 (IH, m) , 2,41 (IH, t, J=3, 6) , 3,45 (IH, d, J=ll,0), 4,14 (IH, d, J=ll,0), 6,05 (IH, d, J=3,0), 9,75 (IH,

s) .

Meziprodukt 5 [IR-(la,3a8,4β,4ap,7β,7aa, 83β)]-Benzyl-4-kyano-8a(hydroxymethyl)-4,4a,5,6,7,7a,8,8a-oktahydro-7-methyl-3-(1methylethyl)-1,4-methano-s-indacen-3a(IH)-karboxylát .0

CN

00

0 0 0 • · · ·

0 000

0 ·

00

0000 00 00 0 0 0 « 0 0 0 · 000 0 0 0 0

0 00 *00 0 0 0 0 0 0 4 0

400 00 00

161,2 miligramu benzylesteru sordaricinu bylo rozpuštěno v 6 mililitrech N,N-dimethylformamidu a k roztoku byl postupně přidán 1 mililitr p-methoxybenzylchloridu a přebytek hydridu sodného (50 miligramů 60 % disperze v minerálním oleji). Vzniklá směs byla míchána přes noc, naředěna etherem a opatrně promyta vodou. Etherická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem sodným a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl purifikován chromatografií na silikagelu a bylo získáno 192,5 miligramu (93 %) p-methoxybenzyletheru.

150 miligramů získaného etheru bylo rozpuštěno v 5 mililitrech suchého ethanolu a k roztoku byly přidány 3 mililitry suchého pyridinu. Po přídavku 96 miligramů hydrochloridu hydroxylaminu byla směs 3 hodiny zahřívána na teplotu 70 °C. Reakční směs byla ochlazena a zahuštěna ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v etheru, promyt vodou a sušen nad bezvodým síranem sodným. Zbytek získaný po odstranění etheru ve vakuu byl purifikován preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) a bylo získáno 143,4 miligramu (93 %) příslušného aldoxímu.

143 miligramů získaného aldoximu bylo rozpuštěno v

do roztoku byl přidán přebytek soli (methoxykarbonylsulfamoyl)byla 2 hodiny míchána při mililitrech toluenu a (700 miligramů) vnitřní triethylamoniumhydroxidu.

Směs teplotě 70 °C. Po zahuštění ve vakuu byl zbytek purifikován preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) a bylo získáno 116,6 miligramu (84 %) příslušného nitrilu.

67,5 miligramu shora připraveného nitrilu bylo rozpuštěno v 5 mililitrech dichlormethanu a do roztoku bylo přidáno 43 miligramů DDQ a 0,5 mililitru vody. Vzniklá směs byla 2 hodiny míchána při teplotě místnosti. Po vodném zpracování a ·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· ··· ···· • · · · · · ··· · · · · • · ··· ·· · ··· · · · ·· ··· ····· ·· ·· ·· ··· η· ·· purifikaci preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) bylo získáno 47,6 miligramu (91 %) meziproduktu 5.

Následující příklady jsou uvedeny pro lepší ilustraci předmětného vynálezu a nijak nevymezuji rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Část A ekvivalent sloučeniny výše uvedeného vzorce s tím rozdílem, že R je skupina -CH(C₆H₅)2 a X je skupina -CHO a jejíž příprava je popsána ve WO 96/14326 byl rozpuštěn v ethanolu a k roztoku byl postupně přidán stejný objem pyridinu a 10 ekvivalentů hydrochloridu hydroxylaminu. Reakční směs byla míchána v dusíkové atmosféře po dobu 20 minut nebo tak dlouho, dokud nedošlo k reakci, což bylo zjišťováno pomocí analytické chromatografie na tenké vrstvě (TLC) , zahuštěna za sníženého tlaku a rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Organický podíl byl sušen nad bezvodým síranem sodným, zfiltrován a zahuštěn ve- vakuu. Produkt byl získán po • ·

•·· ·· ·· purifikaci zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě (hexan/ethylacetát) .

Část B

K roztoku 1 ekvivalentu produktu získaného v části A v toluenu bylo přidáno 5 ekvivalentů Burgessovy soli. Reakční směs byla míchána při teplotě 60 °C v dusíkové atmosféře 1 hodinu nebo tak dlouho, dokud nezreagovalo dostatečné množství výchozí látky. Následně byla směs ochlazena a těkavé podíly byly odstraněny ve vakuu. Produkt byl získán po purifikaci zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě (hexan/ethylacetát).

Část C

Produkt získaný v části B byl rozpuštěn při teplotě 0 °C v dichlormethanu obsahujícím 2 hmotnostní procenta kyseliny trifluoroctové. Vzniklá směs byla 4 hodiny míchána nebo tak dlouho, dokud nedošlo k dostatečné reakci. Těkavé podíly byly odstraněny za sníženého tlaku a po purifikaci zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) byl získán požadovaný produkt výše uvedeného vzorce.

Příklad 2

Kyselina [IR-(la, 3a£, 4β, 4ap, 7β, 7aa, 83β) ] -8a- [ (6-deoxy-4-C>-methyl^-D-altropyranosyloxy)methyl]-4-kyano-4,4a, 5,6,7,7a, 8,8aoktahydro-7-methyl-3-(1-methylethyl)-1,4-methano-s-indacen3a(1H)-karboxylová (4-kyano-4-deformylsordarin) » · 0 · · • ·

K roztoku 50 miligramů sordarinu ve 3 mililitrech N,N-dimethylformamidu byly postupně přidány 0,3 mililitru benzylbromidu a 200 miligramů hydridu sodného (60 % disperze v minerálním oleji). Tato směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Po vodném zpracování(diethylether) a purifikaci preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLCj byl získán benzylester 2',3-'di-C-benzylsordarinu.

K roztoku 1 ekvivalentu benzylesteru 2',3'-di-Obenzylsordarinu, který byl připraven shora popsaným způsobem, ve směsi ethanol/pyridin (2:1) byl přidán přebytek hydrochloridů hydroxylaminu a směs byla 2 hodiny míchána při teplotě 70 °C. Následně byla směs zahuštěna ve vakuu a po vodném zpracování(dichlormethan) a následné purifikaci preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) byl získán benzylester 2',3'-di-0-benzyl4-aldoximsordarinu

K roztoku benzylesteru 2', 3'-di-0-benzyl4-aldoximsordarinu, který byl připraven shora popsaným způsobem, v toluenu byl přidán přebytek vnitřní soli (methoxykarbonylsulfamoyl)triethylamoniumhydroxidu (Burgessova činidla). Vzniklá směs byla 2 hodiny míchána při teplotě 70 °C v dusíkové atmosféře. Po zahuštění ve vakuu a purifikaci preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) byl získán benzylester 2',3'-di-0-benzyl-4-kyano-4-deformylsordarinu.

·· ·· ·· ···· ·· 00 • 00 0 · 0 0000 • 0 · · 0000 0 0 0 0

	60	0 0000 00 0 000 00 · 00 0 00 0 0000 00 00 00 000 00 00
Byl připraven roztok	shora	připraveného benzylesteru
v methanolu. K roztoku byl	přidán	palladiumhydroxid na uhlí
(Pearlmanův katalyzátor) a	nádoba	byla propláchnuta vodíkem.

Směs byla 15 minut intenzivně míchána ve vodíkové atmosféře, zfiltrována a po zahuštění roztoku byl získán produkt uvedený v úvodu tohoto příkladu. MS (CI): m/z=507,5 (M+NH₄) .

Příklad 3

Kyselina [IR- (la,3a3,4p,4ap,7p, 7aa, 8ββ) ] -8a- [ (6-deoxy^-D-altropyranosyloxy)methyl]-4-kyano-4,4a,5,6,7,7a, 8,8a-oktahydro7-methyl-3-(1-methylethyl)-1,4-methano-s-indacen-3a(1H)karboxylová (4-kyano-4-deformyl-4'-demethyl-sordarin)

Jeden mililitr zmrazeného mycelia Streptomyces avermitilis MA 4848 (ATCC 31272) bylo inokulováno do každé z osmi zakrytých Erlenmeyerových baněk obsahujících 40 mililitrů BaSa média, [které obsahovalo v jednom litru 20 gramů kvasného extraktu (Difco), 20 gramů Hykasy (bez obsahu soli, Sheffield), 20 gramů dextrosy, 2 gramy dusičnanu draselného, 10 mililitrů níže definované směsi stopových prvků, jehož pH bylo 7,0 a které bylo 20 minut tepelně upravováno • · • · ···· · · ·· • · · · ··· · « · · • · · · · ···· · · · f • ······ · ··· · · · • · · ·· · ···· • · · · ·· · · · ·· · · v autoklávu]. Baňky byly inkubovány 27 °C, rychlosti 220 otáček za minutu byla mikroskopicky zkoumána na nemyceliálního původu.

hodin při teplotě a PH 6,7-6,8. Mycélia přítomnost nečistot

Složka

Obsah v 1 litru

NaCl (12,5 % roztok) 4 ml

MgSO₄.7 H₂O (12,5 % roztok) 4 ml

FeSO₄.7 H₂O 25 mg

MnSO₄.H₂O (0,5 % roztok) 1 ml

ZnSO₄.7 H₂O (1 % roztok) 1 ml

CaCl₂.2 H₂O (2 % roztok) 1 ml

Čtyřicet miligramů produktu připraveného v příkladu 2 (4kyano-4-deformylsordarinu) bylo rozpuštěno v 0,40 mililitrech 80 % ethanolu a do každé baňky bylo přidáno 50 mikrolitrů tohoto roztoku. Směs byla inkubována 18 hodin při teplotě 27 °C. Průběh reakce a stanovení jejího konce bylo prováděno analytickou HPLC. 200 mililitrů živné půdy bylo zředěno stejným objemem methanolu, extrahováno a pevné podíly byly odstraněny odstředěním. Z kapaliny nad sedlinou byla ve vakuu odstraněna většina methanolu. Pomocí hydroxidu sodného bylo upraveno pH zbývajícího roztoku o objemu přibližně 200 mililitrů upraveno na hodnotu 11. Roztok byl dvakrát extrahován 200 mililitry dichlormethanu a pomocí zředěné kyseliny sírové bylo pH vodné vrstvy upraveno na hodnotu 2,5. Takto upravená vodná vrstva byla následně dvakrát extrahována dichlormethanem. Spojené dichlormethanové vrstvy byly postupně promyty vodou, solankou a sušeny nad bezvodým síranem sodným. Síran sodný byl odfiltrován a dichlormethan byl odstraněn ve • · · · · · · · · · • · · · ··· * · φ · • · · fe · fefefefe · · · fe • · fefefe ·· · fefefe fefe · • fe · fefe · fefefefe ·· fefe fefe fefefe fefe fefe vakuu. Bylo získáno 53 miligramů pevného zbytku, který byl purifikován preparativní HPLC s reverzními fázemi na stacionární fázi Phenomenex Primesphere C8 o velikosti částic 5 mikrometrů, kterou byla naplněna kolona o rozměrech 9, 4 x 250 milimetrů. Mobilní fází byla směs acetonitril/voda (34:66) obsahující 0, 1 % kyseliny fosforečné a rychlost promývání byla 3,5 mililitrů za minutu při teplotě 40 °C. Produkt začal z kolony vytékat po 14,4 minutách. Frakce bohaté na produkt byly spojeny a ze směsi byl ve vakuu pod proudem dusíku odstraněn acetonitril. Zbývající vodný roztok byl extrahován dichlormethanem shora popsaným způsobem a bylo získáno 7,2 miligramu požadovaného produktu.

^ΧΗ NMR (1,5 miligramu v 0,25 mililitrech CD₃OD): δ 0,790 (3H, d, J=6,8), 1,059 (3H, d, J=6,8), 1,161 (3H, d, J=6,8), 1,141,32 (m) , 1,257 (3H, d, J=6, 4), 1,650 (IH, m) , 1,74-1, 86 (m) ,

2,00-2,18 (m),	2,43-2	(IH,	dd, J=4,4;	12,8) ,	2, 670	(IH,	br
heptet, J=6,8) ,	2,836	(IH,	brdd, J=3,6)	, 3,450	(IH, dd	, J=4	,0;
9,2), 3,67 (2H,	m) , 3,	871 ,	(IH, dd, J=3,	6; 3,6)	, 3,914	(IH,	d,
J=9, 6) , 4,472	(brs),	6, 225	(brd, J=3,	2) . IČ	(tenký	film	na

ZnSe) : 2958, 2234, 1713, 1071 cm’¹. MS: 475,2607 (M⁺)

Příklad 4

• · • · • » • · • ·

Část A

0,500 gramu (3,37 milimolu) digitoxosy bylo v baňce azeotropicky destilováno se suchým benzenem. Takto upravený materiál byl rozpuštěn v 5 mililitrech suchého pyridinu a ke vzniklému roztoku bylo přidáno 5 mililitrů acetanhydridu. Reakční směs byla míchána 18 hodin. Reakce byla monitorována chromatografií na tenké vrstvě silikagelu v soustavě ethylacetát/hexan (1:2) do úplného vymizení digitosy. Těkavé podíly byly odstraněny ve vakuu a bylo získáno 1,013 gramu světle žlutého oleje. ¹H NMR (CDCI3) : δ 1,11 (3H, d) , 1,96-2,16 (2H, m) , 2,02 (3H, s) , 2,11 (6H, s), 4,06 (1H, m) , 4,61 (1H, dd) , 5,49 (1H, bq) , 6,02 (1H-, dd) . MS: 215,1 (M-C₂H₃O₂)⁺.

Část B

9,31 gramu (33,9 milimolu) peracetyldigitosy připravené způsobem popsaným v části A bylo přidáno do 150 mililitrů vody a ke vzniklé směsi bylo přidáno 50 mililitrů ledové kyseliny octové. Reakční směs byla míchána tři dny při teplotě místností. Po odstranění rozpouštědla byl surový zbytek purifikován mžikovou chromatografií na silikagelu s eluční soustavou ethylacetát/směs hexanů (1:1). Bylo získáno 7,37 gramu (94 %) světle žlutého sirupu, který byl identifikován jako směs anomerů 3,4-diacetoxydigitosy.

Část C

1,23 gramu (5,3 milimolu) 3,4-diacetoxydigitosy bylo naváženo do baňky a v dusíkové atmosféře bylo přidáno 25 mililitrů bezvodého dichlormethanu. Poté bylo ke směsi postupně přidáno 0,35 gramu (1,1 milimolu) uhličitanu česného a 7,2 gramu (50 milimolů) trichloracetonitrilu. Směs byla míchána přibližně 1 hodinu, zfiltrována a těkavé podíly byly • 0 · · • ·

0

000 odstraněny ve vakuu. Byly izolovány 2 gramy surového trichloracetamidátu, který byl použit bez přečištění v dalších reakcích. Jí NMR (CDC1₃) : δ 1,34 (3H, d) , 2,03 (3H, s) , 2,07 (3H, s), 2,11 (IH, m), 2,29 (IH, ddd), 4,17 (IH, m) , 4,80 (IH, dd) , 5,52 (IH, m), 6,20 (IH, dd), 8,76 (IH, s) .

Část D

1,6 gramu (3,8 milimolu) meziproduktu 1 bylo azeotropicky destilováno s benzenem a vysušená sloučenina byla rozpuštěna v 10 mililitrech dichlormethanu. K roztoku bylo přidánu 0,340 gramu (1,5 milimolu) bezvodého bromidu zinečnatého. Směs byla ochlazena na teplotu 0 °C a lineárním injekčním dávkovačem bylo během jedné hodiny přidáno. 2,8 gramu (7,5 milimolu) produktu z části C rozpuštěného v 5 mililitrech dichlormethanu. Reakční směs byla následně vylita do vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahována dichlormethanem. Organická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a ve vakuu byla odstraněna rozpouštědla. Surový produkt byl purifikován mžikovou chromatografií na silikagelu s eluční soustavou ethylacetát/hexan (1:4) a bylo získáno 2,09 gramu (86 %) požadovaného produktu ve formě čirého oleje. Bylo stanoveno, že produkt tvořila směs a a β anomeru v poměru 2:3. MS: 654,2 (M+NH₄) ⁺ .

Část E

2,09 gramu (3,3 milimolu) produktu z části D bylo rozpuštěno v 50 mililitrech methanolu a k roztoku bylo přidáno 0,20 gramu uhličitanu draselného. Reakční směs byla míchána 2 hodiny při teplotě okolí. Uhličitan draselný byl odfiltrován a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Surový produkt byl

00 00 0000 00 00 0000 000 00*0 0 00 0 0 0000 0 00 0 0 0 000 00 0 000 00 0 00 0 0 0 0 0000 00 ·0 00 000 00 00 purifikován mžikovou chromatografií na silikagelu s eluci nejprve soustavou ethylacetát/hexan (1:2), později ethylacetát/hexan (1:1) a bylo získáno .0,84 gramu (49 %) požadovaného deacetylovaného β-anomeru spolu s 0,48 gramu (26 %) požadovaného deacetylovaného a-anomeru.

	α-Anomer:	parciální ^XH NMR	(CDC1₃) : δ	0,51 (3H, d) , 0,80
	(3H,	d) ,	0,85-0, 95 (m) , 1,00	(3H, d) , 1,	02 (m) , 1,14 (3H, d) ,
-	2,77	(1H,	t), 3,44 (1H, d),	3,58 (m) ,	3,93 (1H, dd) , 3,27 a
	3, 98	(2H,	TIB kvartet) , 4,7 5	(1H, m) , 5	,18 (2H, AB kvartet),
	6, 02	(1H,	m), 7,37 (5H, m) , 9,	67 (1H, s) .	MS: 570,5 (M+NH₄) ⁺
	β-Anomer:	parciální ¹H NMR	(CDCI3) : δ	0,51 (3H, d) , 0,81
	(3H,	d) ,	0,85-1,1 (m) , 1,00 (3H, d) ,	1,13 (3H, d) , 2,83
	(1H,	t) ,	3,64 (1H, m) , 3,60 a	3,87 (2H,	TIB kvartet), 4,10 (1H,
	bs) ,	4,58	(1H, dd), 5,17 (2H,	AB kvartet), 6,01 (1H, d) , 7,35
	(5H,	m, ) ,	9,69 (1H, s). MS: 423,3 (M+H-digitosa)

Část F

35,6 miligramu β-anomeru připraveného v části E bylo rozpuštěno ve 3 mililitrech dibromethanu a k tomuto roztoku byly postupně přidány 3 mililitry 50 % vodného roztoku hydroxidu sodného a 4,2 miligramu (0,013 milimolu) tetrabutylamoniumbromidu. Reakční směs byla 18 hodin intenzívně míchána, extrahována dichlormethanem a organická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl purifikován preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (9:1). Bylo získáno 16,4 miligramu (45 %) pevné bílé látky. Parciální ^XH NMR (CDC1₃) : δ 0,52 (3H, d) , 0,90 (3H, d) , 0,9 (m) , 1,00 (3H, d) , 1,04 (m) , 1,13 (3H, d) ,

					66		• ♦ 9 9 • 9 9 • 9 9 • 9 99 • · 99 99	9 9 9999 9 9 9 9 9 9 9999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99	9 9 9 9 • 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 »9
2,71	(IH,	t) ,	3,38	(IH, m),	3, 60	a 3,	89 (2H, AB	kvartet),	3,64
(IH,	m),	4,13	(IH,	m), 4,48	(IH,	dd)	, 4,85 (IH,	s), 5,14	(IH,
s) ,	5,18	(2H,	AB	kvartet),	6,01	(IH	, d), 7,36	(5H, m) ,	9, 71

(IH, s) .

Část G

9,7 miligramu (0,017 milimolu) produktu připraveného v části F bylo rozpuštěno v 1 mililitru pyridinu a k tomuto roztoku byl postupně přidán 1 mililitr ethanolu a 12 miligramů (0,17 milimolu) hydrochloridu hydroxylaminu. Reakční směs byla ohřátá na 70 °C a míchána 1 hodinu. Směs byla ochlazena a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl rozdělen mezi vodu a dichlormethan, vodná vrstva byla dále extrahována dichlormethanem. Spojené organické vrstvy byly sušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Po purifikaci preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (4:1) bylo získáno 8,6 miligramu (87 %) pevného produktu. Parciální

^ΧΗ NMR (CDC1₃)	: δ 0	,52 (3H, d), 0	, 81	*3H, d),	0,9 (m),	0,98
(3H, d) , 1,01	(m),	1,23 (3H, d),	1,34	(IH, d),	2,62 (IH,	t) ,
3,36 (IH, m) ,	3,60	(IH, d) , 3,64	(IH,	dd), 3,87	(IH, d),	4,13
(IH, m), 4,49	(IH,	dd), 4,85 (IH,	s, ) ,	5,15 (IH,	s), 5,18.	(2H,
AB kvartet),	5, 96	(IH, d) , 7,36	(5H,	m) , 7,46	(IH, bs),	7,81

(IH, s)

Část H

8,6 miligramu (0,015 milimolu) produktu připraveného v části G bylo rozpuštěno ve 2 mililitrech toluenu a k tomuto roztoku bylo přidáno 18 miligramů (0,074 mmolu) Burgessova činidla. Reakční směs byla míchána přibližně 1 hodinu při teplotě 60 °C. Ke směsi bylo přidáno další Burgessovo činidlo a směs • · 999 · « * · • · 0 · · ♦ · · ·· » * · <

» · · 4 ·· ·· byla míchána dalších 20 minut, ochlazena a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Po purifikaci zbytku preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (4:1) bylo získáno 7,3 miligramu (86 %) pevného produktu. Parciální ¹H NMR (CDCI3) : δ 0,39 (3H, d) , 0,88 (3H, d), 0,95 (m), 1,14 (3H, d), 1,23 (3H, d), 2,62 (1H, m) , 2,72 (1H, t) , 3,36 (1H, m) , 3,59 (1H, d) , 3,63 (1H, dd) , 3,88 (1H, d) , 4,11 (1H, m) , 4,48 (1H, dd) , 4,85 (1H, s) , 5,14 (1H, s), 5,18 (2H, AB kvartet), 6,12 (1H, m) , 7,34 (3H,

m) , 7,46 (2H, m) .

Část I

7,3 miligramu (0,013 mmolu) produktu připraveného v části H bylo rozpuštěno ve 2 mililitrech methanolu a k roztoku byly přidány 2 miligramy Pearlmanova katalyzátoru. Reakční nádoba byla propláchnuta vodíkem a její obsah byl 2 hodiny míchán ve vodíkové atmosféře. Směs byla přefiltrována skrz křemelinu a po odstranění těkavých složek ve vakuu bylo získáno 6,1 miligramu (100 %) konečného produktu ve formě pevné bílé látky. Parciální ¹H NMR (CDC1₃) : δ 0,77 (3H, d) , 1,01 (3H, d) ,

1, 18	(3H,	d) ,	1,28	(3H, d), 2,23 (1H, dt),	2,35	(1H,	dd) , 2,67
(2H,	m) ,	3,39	(1H,	m) , 3,54 (1H, d), 3,63	(1H,	dd) ,	3,99 (1H,
m),	4,15	(1H,	m) ,	4,57 (1H, dd) , 4,85 (1H	r s) ,	5,13	(1H, s),

6,16 (1H, d) . MS: 489,2 (M+NH₄)⁺. IČ: 2240 cm'¹,

φ φ φ « φ φ φ φ φφ

ΦΦΦ φφ φφ • · φ φ • φ φ φ φ φφφφ • φ φ φφ • φ φ φ φ φ

Příklad 5

Část A

0,84 gramu (1,5 mmolu) β-anomeru připraveného v části E příkladu 4 bylo rozpuštěno ve 100 mililitrech toluenu, v dusíkové atmosféře bylo k roztoku přidáno 0,568 gramu (2,3 mmolu) dibutylcínoxidu a směs byla 4 hodiny zahřívána k refluxu a míchána. Poté byla reakční směs ochlazena na teplotu místnosti a bylo k ní postupně přidáno 0,544 gramu (4,5 mmolu) allylbromidu a 2,3 mililitru 1,0 molárního roztoku tetrabutylamoniumfluoridu v tetrahydrofuranu (2,3 mmolu). Směs byla zahřívána na teplotu 50 °C, po 36 hodinách byla ochlazena a těkavé podíly byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl purifikován mžikovou chromatografií se skokově měněnou gradientovou elucí soustavou hexan/ethylacetát (9:1, 4:1, 2:1) a bylo získáno 0,454 (51 %) produktu absorbujícího UV záření.

Parciální	NMR (CDC1₃)	: δ 0,51	(3H,	d), 0,81 (3H, d),	0,9
(m), 1,00	(3H, d), 1,05	(m), 1,22	(3H,	d) , 2,21 (1H, m),	2,72
(1H, t),	3,01 (1H, dd),	3,60 (1H,	d) ,	3,68 (1H, m), 3,87	(1H,
d) , 3,98	(1H, m) , 4,10	(1H, m),	4,18	(1H, m),4,59 (1H,	dd) ,
5,10 (m),	5,18 (2H, AB	kvartet),	5,26	(1H, d) , 5,86 (1H,	m) ,
6,01 (1H,	d) , 7,37 (5H,	m), 9,66 (	1H,S)	•

* * 9 49 4 (0,49 mmolu) produktu připraveného ♦ ♦ 99 ♦ 9 9 4

9 4 4

4 4 44

4 4 ·ί

4

444

44 » * » « > 4 4 I

I ♦ · 1 ► · · 4 ·« ·«

Část Β

Směs 288 miligramů v části A, 511 miligramů (1,95 mmolu) trifenylfosfinu a

133 miligramů (1,95 mmolu) imidazolu bylo v baňce rozpuštěno ve 40 mililitrech čerstvě předestilovaného tetrahydrofuranu. K roztoku bylo přidáno 371 miligramů (1,46 mmolu) pevného jodu a směs byla 1,5 hodiny míchána v dusíkové atmosféře. Poté byla ke směsi přidána 1 N kyselina chlorovodíková a reakční směs byla extrahována ethylacetátem. Organický podíl byl postupně promyt vodou, roztokem thiosíranu sodného a solankou. Následně byl organický podíl sušen nad bezvodým síranem zfiltrován a zahuštěn ve vakuu. Zbytek preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (9:1) a bylo získáno 211 miligramů (61 %) sodným, byl purifikován

produktu.	Parciální	^XH NMR (CDC1₃) : δ	0,51	(3H,	d) ,	0,80
(3H, d),	0,9 (m), 1,00	(3H, d), 1,05 (m),	1,33	(3H,	- d) ,	1,22
(1H, d) ,	2,51 (1H, dd),	2,70 (1H, t), 3,13	! (1H,	t) ,	3,25	(1H,
m) , 3,59	a 3,82 (2H, AB	kvartet), 4,01 (1H,	r m) ,	4,38	(1H,	dd) ,
5,18 (2H,	AB kvartet) ,	5,20 (1H, s), 5,30	(1H,	d),	5,96	(1H,
m) , 6,00	(1H, d), 7,37 (5H, m), 9,69	(1H,	s) .	MS:	725,0

(M+Na) .

Část C

K 8 mililitrům suchého toluenu bylo přidáno 0,267 mililitru (0,993 mmolu) tri-n-butylcínhydridu a tento roztok byl přibližně 2 hodiny zahříván k refluxu. 211 miligramů (0,301 mmolu) produktu připraveného v části B bylo rozpuštěno v 10 mililitrech suchého toluenu a pomocí lineárního injekčního dávkovače přidáno během 2 hodin k refluxujícímu roztoku tri-n-butylcínhydridu. Ke směsi byl přidán další ekvivalent tri-n-butylcínhydridu a směs byla zahřívána dalších

ΊΟ ·0 «0 0000 00 00 * 0 0 0 000 0000 • · 0 0 « «0 0« 0 «0 ·

0 000 00 0 0«0 0« 0

0« 0 ·0 0 0000

00 «0 000 00 00 minut, kdy bylo analytickou chromatografií na tenké vrstvě (TLC) stanoveno, že došlo ke zreagování veškeré výchozí sloučeniny. Směs byla ochlazena a těkavé složky byly odstraněny za sníženého tlaku. Purifikací preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) byl získán žlutý olej, jehož dalším čištěním pomocí preparativní HPLC (byla použita pevná fáze Zorbax Rx-C8, která byla eluována mobilní fází sestávající z 95 % acetonitrilu a 5 % vody. Detekce byla prováděna detektorem při vlnové délce 220 nanometrů) a byly získány 2 produkty, a to 23,0 miligramů (13 %) β-anomeru a α-anomeru.

β-anomer: Parciální ^XH NMR (CDC1₃) : δ 0,50 (3H, d) , 0,80

(3H,	d), 0,89	(m),	0,98	(3H,	d),	1,02	(3H,	d),	1,20	(3H, d),
2,22	(1H, m) ,	2,72	(1H,	t) ,	3,29	(2H,	m) ,	3,58	(1H,	d) , 3,65
(1H,	t), 3,82	(1H,	d), 3	,99	(1H,	t), 4	,41	(1H,	dd) ,	5,19. (2H,

AB kvartet), 6,01 (1H, m), 7,36 (5H, m), 9,72 (1H, s).

α-anomer: Parciální ^XH NMR (CDC1₃) : δ 0,47 (3H, d) , 0,79

(3H,

d) ,

0,89

(1H,

m) ,

0,93

(3H,

d) ,

0,98

(3H,

d) ,

1,21

(3H,

d) ,

2,21

(1H,

m) ,

2,38

(1H,

m) ,

2,66

(1H,

t) ,

3,39

(1H,

t) ,

3,54

(1H,

d),

3,65

(1H,

t) ,

3,77

(1H,

d) ,

3,82

(1H,

t) ,

4,64

(1H,

m) ,

5,18

(2H,

S) ,

5,99

(1H,

m),

7,32

(5H,

m).,

9, 69

(1H,

s) .

Část D

5.6 miligramu v části C bylo roztoku bylo

6.7 miligramu Reakční směs (0,0097 milimolu) β-isomeru připraveného rozpuštěno v 0,5 mililitru ethanolu a k tomuto postupně přidáno 0,5 mililitru pyridinu a (0,097 milimolu) hydrochloridu hydroxylaminu. byla přibližně 20 minut míchána v atmosféře

Μ 99 • · · · • 9 · 9 • · ··· 9

9 9 «9 99

9

9 ·· ·Μ· • 9 • 999

9« 99

9 9 9 * 9 9 9

9 9 » 9

9 9 9

99 dusíku, zahuštěna za sníženého tlaku a rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Organická fáze byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a zahuštěna ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (4:1) bylo získáno 6,6 miligramu (kvantitativní výtěžek) požadovaného produktu. Parciální

^τΗ NMR (CDCI3)	: δ 0,	51 (	3H, d), 0,	81	(3H,	d) ,	0,98	(3H,	d) ,
1,02 (3H, d) ,	1,20	(3H,	d) , 2,23	(1H,	m) ,	2,63	(1H,	t) ,	3,29
(2H, m) , 3,58	(1H,	d) ,	3,65 (1H,	t) ,	3,82	(1H,	d) ,	3, 99	(1H,
t), 4,41 (1H,	dd) ,	5,19	(2H, s),	5,95	(1H	, m) ,	7,35	(5H,	m),
7,47 (1H, s),	7,81 (	1H,	s) .

Část E

K roztoku 6,6 miligramu (0,011 milimolu) produktu připraveného v části D v 1 mililitru toluenu bylo přidáno 13,3 miligramu (0,055 milimolu) Burgessovy soli. Směs byla jednu hodinu míchána při teplotě 60 °C v dusíkové atmosféře, ochlazena a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (9:1) bylo získáno 5,1 miligramu (81 %) požadovaného produktu. Parciální ’Ή NMR (CDCI3) · δ

0,39	(3H, d),	0, 86	(3H,	d) ,	1,01	(3H,	d) ,	1,15 (3H,	d) ,	1,20
(3H,	d), 2,27	(1H,	dd) ,	2, 63	(1H,	m) ,	2,73	(1H, t),	3,29	(1H,
m),	3,58 (1H,	d),	3, 65	(1H,	t) ,	3,83	(1H,	d), 3,99	(1H,	t) ,
4,41	(1H, dd),	5,27	' (2H,	AB	kvart	et) ,	6, 13	(1H, m) ,	7,33	(3H,

m) , 7,46 (2H, m) .

Část F

K roztoku 5,1 miligramu (0,0087 milimolu) produktu připraveného v části E v 1 mililitru methanolu byl přidán ♦ 0 00 ·» ···· ► 0 0 0 0 0 0

P 0 0 0 0 0 000 » 0 000 000 *

00

000

00 » 0 0 0

I 0 0 0

I 0 0 0 > 0 0 0

00 přibližně 1 miligram palladiumhydroxidu na uhlí ( Pearlmanův katalyzátor). Reakční nádoba byla propláchnuta vodíkem a směs byla 30 minut intenzívně míchána pod tlakem

101,325 kilopascalů (1 atmosféry) ve vodíkové atmosféře. Katalyzátor byl odstraněn přefiltrováním skrz křemelínu a po zahuštění filtrátu za sníženého tlaku bylo získáno

3,8 miligramu (88 %) konečného produktu ve formě pevné bílé látky. Parciální ^XH NMR (CDC1₃) : δ 0,77 (3H, d) , 1,01 (3H, d) ,

1,04 (3H, d), 1,02 (3H, d) , 1,17 (3H, d) , 1,22 (3H, d) , 3,67 (IH, t), 3,98 (IH, t), 4,05 (IH, d) , 4,55 (IH, dd) , 6,17 (IH, m) .

Příklad 6

Část A

18,3 miligramu (0,033 milimolu) α-anomeru připraveného v části E příkladu 4 bylo rozpuštěno v 1,5 mililitru dibromethanu a ke vzniklému roztoku bylo postupně přidáno 1,5 mililitru 50 % vodného roztoku hydroxidu sodného (0,006 milimolu) tetrabutylamoniumbromidu.

hodin intenzívně míchána, a po přidání dalších 6 miligramů a 2,1 miligramu Reakční směs byla • · fe · fe « • fefe • fefe • fe • · • fe fe • fefe

• fefe · • fefe * • fefe · • fefe · fe· fefe tetrabutylamoniumbromidu byla směs míchána dalších 24 hodin. Reakce byla ukončena přidáním 9,4 mililitru 2 N kyseliny chlorovodíkové a směs byla rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Spojené organické vrstvy byly sušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a zahuštěny ve vakuu. Zbytek byl purifikován pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát (4:1) a bylo získáno 3,1 miligramu (17 %) produktu. Parciální ^XH NMR (CDC1₃) : δ 0,51 (3H, d) , 0,81 (3H, d) , 0,9 (m) , 1,00

(3H,	d), 1,	05 (m) ,	1,13 (3H,	d) ,	2,78 (IH, t),	3,63	(2H,
3,23	a 3,91	(2H, AB	kvartet),	4,05	(IH, m), 4,62	(IH,	m) ,
(IH,	s) , 5,	13 (IH,	s), 5,18	(2H,	AB kvartet),	5,99	(IH,
7,35	(5H, m)	, 9,69 (	IH, s).

Část B

K roztoku 3,1 miligramu (0,0055 milimolu) produktu připraveného v části A v 1 mililitru methanolu byl přidán přibližně 1 miligram palladiumhydroxídu na uhlí (Pearlmanova katalyzátoru). Reakční nádoba byla propláchnuta vodíkem a směs byla 40 minut míchána ve vodíkové atmosféře. Katalyzátor byl odstraněn přefiltrováním skrz křemelinu a po zahuštění filtrátu za sníženého tlaku bylo získáno 3,1 miligramu (kvantitativní výtěžek) konečného produktu. Parciální ^XH NMR (CDCI3) : δ 0,80 (3H, d) , 0,95 (3H, d) , 1,01 (3H, d) ,

1,27 (3H, d) , 2,39 (m) , 2,78 (IH, t) , 3,76 (4H, m) , 4,06 (IH, m), 4,71 (IH, m) , 4,87 (IH, s) , 5,13 (IH, s), 6,02 (IH, d) , 9,73 (IH, s).

• · « · • · • · • · «« · · ftft·· ft ftft · · ftft • ftft · · ···· • · ftftft ftftft ft • · ftftft ft • ft ftft ftft ftftft

Příklad 7

Část A ekvivalent α-isomeru připraveného v části C příkladu 5 byl rozpuštěn v ethanolu a k tomuto roztoku byl postupně přidán stejný objem pyridinu a 10 ekvivalentů hydrochloridu hydroxylaminu. Reakční směs byla míchána v atmosféře dusíku přibližně 20 minut nebo tak dlouho, dokud nebylo pomocí analytické TLC prokázáno, že došlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny. Reakční směs byla zahuštěna za sníženého tlaku a rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Organická fáze byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a zahuštěna ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán požadovaný produkt.

Část B

K roztoku 1 ekvivalentu produktu připraveného v části A v toluenu bylo přidáno 5 ekvivalentů Burgessovy soli. Směs byla míchána při teplotě 60 °C přibližně jednu hodinu, nebo tak dlouho, dokud nedošlo ke zreagování výchozí látky, v dusíkové atmosféře, ochlazena a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán produkt.

·· *·· · • ft ftft • ftftft · · · · · * · • II · · ftft ··· · ft · · ft ······ · ftftft ft· ft • ft · ftft · · · · ft • ft ftft ftft ftftft ftft ftft

Část C

K roztoku produktu připraveného v části B v methanolu bylo přidáno katalytické množství palladiumhydroxidu na uhlí (Pearlmanova katalyzátoru). Reakční nádoba byla propláchnuta vodíkem a směs byla intenzívně míchána pod tlakem

101,325 kilopascalů (1 atmosféry) ve vodíkové atmosféře po dobu 30 minut nebo dokud nedošlo k úplnému zreagování výchozí sloučeniny. Katalyzátor byl odstraněn přefiltrováním skrz křemelinu a po zahuštění filtrátu za sníženého tlaku byl získán konečný produkt.

Příklad 8

Část A

16,3 miligramu (0,039 mmolu) meziproduktu 5 bylo třikrát azeotropicky destilováno s benzenem a vysušená sloučenina byla spolu s 2,0 gramy (0,0078 milimolu) bezvodého bromidu zinečnatého přidána v dusíkové atmosféře do baňky. Poté byl do baňky přidán 1,0 mililitr suchého dichlormethanu a směs byla ochlazena na teplotu 0 °C. K reakční směsi byl během jedné hodiny přidán roztok 29,2 miligramu (0,078 milimolu) 3,4-diacetyldigitosy-l-trichloracetamidátu (připraveného způ• * 000 0 « · » • 0 0 9

9 9 9

0 999

9 9

99

9 9

9 999

9 9 0

0 0

0 0 00 • 0 00

0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

04 sobem popsaným v části C příkladu 4) v 0,075 mililitru suchého dichlormethanu. Směs byla ponechána přes noc ohřát na teplotu místnosti, vylita do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahována dichlormethanem. Organická fáze byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a těkavé podíly byly,odstraněny ve vakuu. Zbytek byl přečištěn pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (jednou v soustavě hexan/ethylacetát (9:1), poté v soustavě hexan/ethylacetát (4:1)) a bylo získáno 17,0 miligramů (69 %) produktu ve formě směsi a- a β-isomeru v poměru přibližně 1:2.

Část B

Produkt připravený v části A byl rozpuštěn v methanolu a k tomuto roztoku . byl přidán paliadiumhydroxid na uhlí (Pearlmanův katalyzátor). Reakční nádoba byla propláchnuta vodíkem a směs byla intenzívně míchána ve vodíkové atmosféře po dobu 30 minut nebo dokud nedošlo k úplnému zreagování výchozí sloučeniny. Katalyzátor byl odstraněn přefiltrováním skrz křemelinu a po zahuštění filtrátu za sníženého tlaku byl získán konečný produkt. MS: 561,4 (M+NH₄)⁺.

Příklad 9

R = -Η, X = -CN ·· ··»» ·· 99

9 9 9 9 9

9 999 9 9 9

9 9 9 9

99 99

99

9 9 9 9

999 · 9 9 9 • 9 9 · 9 · • 9 9 9 ·

999 99 99

Část A

Jeden ekvivalent sloučeniny výše uvedeného vzorce, kde R je skupina -CH(C₆H5)₂ a X je skupina -CHO, jehož příprava je popsána ve zveřejněné patentové přihlášce WO 96/14326 byl rozpuštěn v ethanolu a k tomuto roztoku byl postupně přidán stejný objem pyridinu a 10 ekvivalentů hydrochloridů hydroxylaminu. Reakční směs byla míchána v atmosféře dusíku přibližně 20 minut nebo tak dlouho, dokud nebylo pomocí analytické TLC prokázáno, že došlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny. Reakční směs byla zahuštěna za sníženého tlaku a rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Organická fáze byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a zahuštěna ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/et.hylacetát byl získán požadovaný produkt.

Část B

K roztoku 1 ekvivalentu produktu připraveného v části A v toluenu bylo přidáno 5 ekvivalentů Burgessovy soli. Směs byla míchána při teplotě 60 °C přibližně jednu hodinu, nebo tak dlouho, dokud nedošlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny, v dusíkové atmosféře, ochlazena a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán produkt.

Část C

K roztoku produktu připraveného v části B v methanolu bylo přidáno katalytické množství palladiumhydroxidu na uhlí (Pearlmanova katalyzátoru). Reakční nádoba byla propláchnuta vodíkem a směs byla intenzívně míchána pod tlakem ·9 • 9 9 9 • · · · • 9 999 9

9 · »9 ··

9999 » *

9 9 * ·· • C • 9 «· • ««

9 9

9 9 • « 9

9 9

Příklad 10

Část A

Jeden ekvivalent sloučeniny výše uvedeného vzorce, kde R je skupina -CH(C₆H₅)₂ a X je skupina -CHO, jehož příprava je popsána ve zveřejněné patentové přihlášce WO 96/14326 byl rozpuštěn v ethanolu a k tomuto roztoku byl postupně přidán stejný objem pyridinu a 10 ekvivalentů hydrochloridu hydroxylaminu. Reakční směs byla míchána v atmosféře dusíku přibližně 20 minut nebo tak dlouho, dokud nebylo pomocí analytické TLC prokázáno, že došlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny. Reakční směs byla zahuštěna za sníženého tlaku a rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Organická fáze byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a zahuštěna ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán požadovaný produkt.

			79	00 00 ·· • · · · · 0 • 0 · 0 0 · • · ··· · · 0 0 0 0 0 0 • 0 ·· ··	•000 00 • · • 00 0 0 0 0 0 0 ··· ·«	• 0 • · 0 • 0 0 • 0 0 0 0 0 • 0
Část B
K roztoku 1	ekvivalentu produktu	připraveného v	částí	A v
toluenu	bylo	přidáno	5 ekvivalentů	Burgessovy soli.	Směs	byla
míchána	při	teplotě	60 °C přibližně jednu hodinu,	, nebo	tak

dlouho, dokud nedošlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny, v dusíkové atmosféře, ochlazena a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán produkt.

Část C

Produkt připravený v části B byl rozpuštěn při teplotě 0 °C v dichlormethanu, který obsahoval 2 hmotnostní % kyseliny trifluoroctové. Vzniklý roztok byl míchán po dobu 4 hodin nebo dokud nedošlo k úplnému zreagování výchozí sloučeniny. Těkavé podíly byly odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) byl získán konečný produkt.

Příklad 11

Část A

Jeden ekvivalent zofimarinu (kde R = -H a X = -CHO) byl rozpuštěn v suchém N,N-dimethylformamidu (DMF) obsahujícím 5 objemových % p-methoxybenzylbromidu. Poté byl k roztoku přidán přebytek pevného hydrogenuhličitanu sodného a směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 18 hodin nebo dokud nezreagovalo podstatné množství zofimarinu. Směs byla zahuštěna ve vakuu a ke zbytku byl přidán chloroform. Ze směsi byl filtrací odstraněn hydrogenuhličitan sodný, filtrát byl zahuštěn ve vakuu a zbytek přečištěn preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) a byl získán produkt výše uvedeného vzorce, kde R je -CH₂C₆H₄-p-OCH₃ a X je -CHO.

Část B

Jeden ekvivalent produktu připraveného v části A byl rozpuštěn v ethanolu a k tomuto roztoku byl postupně přidán stejný objem pyridinu a 10 ekvivalentů hydrochloridu hydroxylaminu. Reakční směs byla míchána v atmosféře dusíku přibližně 20 minut nebo tak dlouho, dokud nebylo pomocí analytické TLC prokázáno, že došlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny. Reakční směs byla zahuštěna za sníženého tlaku a rozdělena mezi vodu a dichlormethan. Organická fáze byla sušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a zahuštěna ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán požadovaný produkt.

Část C

K roztoku 1 ekvivalentu produktu připraveného v části B v toluenu bylo přidáno 5 ekvivalentů Burgessovy soli. Směs byla míchána při teplotě 60 °C v dusíkové atmosféře přibližně jednu hodinu, nebo tak dlouho, dokud nedošlo ke zreagování dostatečného množství výchozí sloučeniny, ochlazena a těkavé složky byly odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku pomocí preparativní chromatografie na tenké vrstvě (PTLC) v soustavě hexan/ethylacetát byl získán produkt.

Část D

Produkt připravený v části C byl rozpuštěn při teplotě 0 °C v dichlormethanu, který obsahoval 2 hmotnostní % kyseliny trifluoroctové. Vzniklý roztok byl míchán po dobu 4 hodin nebo k úplnému zreagování výchozí látky. Těkavé odstraněny ve vakuu. Přečištěním zbytku preparativní chromatografií na tenké vrstvě (PTLC) byl získán konečný produkt.

dokud nedošlo podíly byly

Příklady 12 až 19

Analogicky k postupu popsanému v příkladu 9 bylo možné připravit následující sloučeniny:

•O

O'

v příkladu 1 bylo možné

Příklady 20 až 22

Analogicky k postupu popsanému připravit následující sloučeniny:

Pv' 4.oco- é>32_

Claims

1. Sloučeniny obecného vzorce I (I) kde Z je tetrapyranová skupina vybraná z (f) a soli a solváty (například hydráty) nebo metabolicky labilní deriváty těchto sloučenin, kde

R^a je skupina C(O)CH₃ nebo methylová skupina;

R² a R³ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituovaná alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, nebo

R² a R³ spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=O), thiokarbonylová skupina (C=S) nebo cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku;

R⁴ je atom vodíku nebo skupina CH₂R⁷ (kde R⁷ je atom vodíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo skupina OCOR⁸, ve které R⁸ je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo arylová skupina);

n je nula nebo 1;

X a Y jsou každý nezávisle atom kyslíku, atom síry nebo skupina CR⁹R¹⁰ (kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů vodíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituovaná alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; nebo R⁹ a R^lúspolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=0), thiokarbonylová skupina (C=S), cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo skupina C^CHR¹¹, kde R¹¹ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku); nebo pokud X nebo Y je atom kyslíku a n=0, mohou skupiny -Y-CR~R³ respektive -X-CR²R³ být také skupina -N=CR³- nebo skupina -NR¹²-CR²R³- (kde CR² a R³jsou karbonylová skupina (C=0) a R¹² je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, acylová skupina COR¹³, kde R¹³ je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku) nebo pokud Y je atom kyslíku a n=0, může X být skupina CR¹¹ (kde Rⁿ má výše uvedený význam), která je vázána dvojnou vazbou k pyranovému kruhu;

R¹⁵ je atom vodíku, atom halogenu, azidoskupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, hydroxyskupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku (případně substituovaná 1 nebo 2 hydroxyskupinami nebo jejich ketalem nebo 1 nebo 2 alkoxyskupinami obsahujícími 1 až 3 atomy uhlíku), arylovou skupinou substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkenyloxyskupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, skupina OCOR¹⁸ (kde R¹⁸ je arylovou skupinou substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku případně obsahující jednu nebo dvě dvojné vazby) nebo alkoxykarbonylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a R^lú je atom vodíku nebo R¹⁵ a R¹⁶ spolu s atomem uhlíku, ke kterému, jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=0) nebo skupina C=CH₂;

R¹^ je skupina CH₂R¹⁹, kde R¹⁹ je atom vodíku, hydroxylové skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 14 atomů uhlíku nebo skupina OCOR²⁰, ve které R²⁰ je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; a

R^la je atom vodíku, atom halogenu, hydroxylová skupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

R^2a je atom vodíku, atom halogenu, hydroxylová skupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, alkylthioskupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, alkoxylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylovou skupinou substituovaná alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, arylovou skupinou substituovaná alkenyloxyskupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, azidoskupina, skupina NR^5aCOR^5a (kde každý substituent R^5a je nezávisle atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku), skupina OR^5a (kde substituent R^Sa je cyklický ether obsahující 4 až 8 atomů vázaný k atomu kyslíku uhlíkovým atomem tohoto cyklického etheru, který sousedí s atomem kyslíku) nebo skupina Y^aC (=0) -X^a-R^7a, kde Y^aje atom kyslíku, atom síry nebo skupina NH, X^a je buď vazba, atom kyslíku nebo skupina NR⁸, ve které substituent R^9a je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až β atomů uhlíku a R^7a je alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku případně obsahující jednu nebo dvě dvojné vazby, arylová skupina, arylovou skupinou substituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylovou skupinou substituovaná alkenylová skupina obsahující 2 až 4 atomy uhlíku, haloalkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo alkoxyskupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku substituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a R^3a je atom vodíku nebo

R^2a a R^3a spolu s atomem uhlíku, ke kterému jsou vázány jsou karbonylová skupina (C=0) nebo skupina C=NOR^9a (kde R^9dje alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku); a

R^4a je hydroxylová skupina, alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo skupina OC(=O)R^7a (kde R^7a má výše definovaný význam).

2. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce:

CN

OH

3. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce:

OH

CN

HO

OH

4. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce

5. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce

6. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce

7. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce:

8. Sloučenina podle nároku 1 strukturního vzorce:

9. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že sloučeninu podle nároku 1 a z farmaceutického akceptovatelný nosič.

10. Agrochemický prostředek vyznačující se tím, že sloučeninu podle nároku 1 a ze zemědělského akceptovatelný nosič.

11. Způsob léčby nebo prevence plísňových infekcí u vyznačující se tím, že zahrnuje podávání fungicidně množství sloučeniny podle nároku 1 těmto živočichům.

zahrnuj e hlediska zahrnuj e hlediska ž ivočichů účinného

12. Způsob kontroly fytopatogenních plísní vyznačující se tim, že zahrnuje aplikaci fungicidně účinného množství sloučeniny podle nároku 1 na rostliny, u kterých je taková kontrola potřeba.

13. Způsob výroby 4-kyano-4-deformyl-4'-demethylsordarinu vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování 4-kyano-4deformylsordarinu s kulturou kmene Streptomyces avermitilis ve fermentačním médiu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku; a izolaci 4-kyano-4-deformyi-4' demethylsordarinu z uvedeného fermentačního média.