CZ20003631A3 - Způsob sterilizace nativního kolagenu v tekutém médiu, získaného sterilního nativního kolagenu, preparátů, které ho obsahují a jeho použití - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy kolagenu zahrnujícího krok sterilizace řečeného kolagenu, dále sterilního kolagenu takto připraveného a preparátů a jejich použití, obzvláště preparátů farmaceutických a/nebo parafarmaceutických a/nebo medicinskochirurgických a/nebo oftalmologických a/nebo kosmetických a použiti preparátů posledně zmiňovaných jako hemostatik.

Description

Způsob sterilizace nativního kolagenu v tekutém médiu, získaného sterilního nativního kolagenu, preparátů, které ho obsahují a jeho použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy kolagenu zahrnujícího krok sterilizace řečeného kolagenu, dále sterilního kolagenu takto připraveného a preparátů a jejich použití, obzvláště preparátů farmaceutických, a/nebo parafarmaceutických, a/nebo medicínskochirurgických, a/nebo oftalmologických, a/nebo kosmetických, a konečně se týká vynález také použití preparátů posledně zmiňovaných.

Dosavadní stav techniky

Kolagen a jeho použití byl zevrubně popsán v referenčních pracech, jako jsou například Collagen, Sv. 1, 2, 3 Marcel E. Nimmi., CRC Press lne, 1988 a Methods in Enzymology, Sv. 144, 1987 a Sv. 82, 1982, Ed. Leon W. Gunningham.

Je dobře známo, že kolagen je molekulou s trojrozměrnou strukturou, která je přítomná ve většině lidských a živočišných tkání a nachází se zejména v kůži, ve šlachách a v placentě.

Mezi rozličné známé vlastnosti patří například zvlhčující účinky, srážení krve a hojení ran.

Aby byl zachován hemostatický účinek kolagenu, je obecně žádoucí, aby byl kolagen konzervován ve své nativní formě před podáním do lidského těla, jak je uvedeno například v dokumentu US-A-4515637.

Navíc nesmí být kolagen z důvodů svého použití, zejména použití lékařského, a/nebo kosmetického, nijak kontaminován (viry, baktériemi, priony, atd.). Sterilizace kolagenu byla v předchozích studiích široce zkoumána. Výsledky těchto studií byly konfrontovány s novými problémy (riziko přenosu AIDS, Creutzfeld-Jakobovy choroby, atd.), jako důsledek přirozeného původu kolagenu.

Techniky sterilizace kolagenu v pevné formě zahrnují použití etylen oxidu, zejména podle dokumentu FR-A-2393581, nebo ozáření (použití beta nebo gama ionizujícího záření), jak je popsáno například v dokumentu EP-A-0224453. Posledně jmenovaný dokument, který popisuje kosmetické a farmaceutické použití pěnového typu kolagenu, • · · · doporučuje sterilizaci v suché formě podle tohoto dokumentu pro nemožnost sterilizace rozpustného přirozeného kolagenu inkorporovaného do emulzí nebo roztoků.

Dokument EP-A-0664132 popisuje adhezivní preparát pro chirurgické použití, který je založený na nezesíťovaném kolagenu modifikovaném oxidativním štěpením. Jedna z přednostních forem vynálezu popsaná v tomto vynálezu se skládá z přípravy sterilního prášku nezesíťovaného kolagenu typu I (lakuna) pomocí oxidativního štěpení a rozpuštěním tohoto prášku ve sterilní ultrafiltrované vodě zahřátím na teplotu 60° za probíhajícího míchání. Je specifikováno, že při zahřívání, které je prováděno, ztrácí kolagen svoji helikální strukturu a je transformován v gelatin. Navíc je vysvětleno, že s adhezivními které reprezentují dosavadní stav techniky ve zmíněném preparáty, dokumentu, j ednoduchá s mechanickou silou a které jsou založeny na zesíťovaném manipulace a představují problémy kolagenu, není s aplikací i

Dokument EP-A-0667352 popisuje alkalickou léčbu založenou na kolagenech v roztoku za účelem eliminace možných prionů. Aby došlo k vyloučení veškerého rizika reziduální kontaminace řečenými priony, je v tomto dokumentu uveden specifičtěji způsob spočívající v solubilizaci kolagenu extrahovaného z tkáně buďto enzymatickým natrávením, nebo alkalickým naštěpením kovalentních vazeb, které spojují řetězce kolagenu s následným odstraněním zbytků tkáně filtrací a podrobením takto solubilizovaného kolagenu alkalickému zpracování.

Dokument FR-A-2586703 se týká přípravy transparentních a fyziologických gelů nebo roztoků kolagenu založených na kolagenu typu IV. Je připomínáno, že kolageny typu I, II nebo III z důvodu jejich praktické nerozpustnosti při neutrálním pH umožňují pouze tvorbu neprůhledných suspenzí a je nemožné je použít pro přípravu transparentních a fyziologických gelů bez chemických úprav molekul kolagenu, které mohou mít antigenní a/nebo toxické účinky.

Znalost dosavadního stavu techniky a výzkumná práce umožnila předkládajícímu vynálezci demonstrovat následující obtíže a problémy, které stále dosud spočívají v přípravě sterilního nativního kolagenu, zejména typu I:

• Manipulace

Vysoká viskozita nativního kolagenu, která vede k technickým problémům při provádění filtrace, zejména při přímé filtraci konvenčního nativního kolagenu v tekutém médiu.

• Denaturace

Částečná nebo celková tepelná denaturace nativního kolagenu během různých obvyklých sterilizačních technik, která způsobuje ztrátu celé nebo části jeho kolagenu a/nebo ztrátu prospěšných vlastností jako jsou například resorpce, mechanická síla nebo zvlhčující vlastnosti.

Sterilizace ozářením (ionizačním zářením) nebo etylen oxidem, což způsobuje zhoršení vlastností výhodných aktivních látek, jako například antibiotik, které mohou být kombinovány v roztoku s kolagenem, a/nebo způsobuje separaci konvenčního gelu s nativním kolagenem do dvou fází, což vede k nepoužitelnosti ke komerčnímu využití.

- Denaturace trvalým působením alkáliemi.

• Toxicita a/nebo kontaminace (viry, priony)

Přítomnost stop reziduálního etylen oxidu v produktech sterilizovaných tímto způsobem/přítomnost kontaminantů v hrubém výchozím kolagenu

Inkompatibita pH inkompatibilita mezi výhodnými aktivními látkami, které jsou rozpustné při neutrálním pH, jako jsou například antiinfekční látky, a kolagenem, který je rozpustný v kyselém prostředí.

• Galenické preparáty

Neuspokojivá prezentace preparátů založených na nativním kolagenu, které mají fibrózní a heterogenní vzhled.

Prezentace konvenčních preparátů s biologickým adhezívními látkami, které jsou nevhodné pro zamýšlené použití (jako jsou například preparáty, které nejsou připraveny k použití, a které vyžadují příliš dlouhou přípravu).

Z těchto důvodů je cílem předkládaného vynálezu překonat výše zmíněné obtíže a vyřešit výše zmíněné problémy, zejména sterilizaci kolagenu v tekutém prostředí při současném ochránění jeho nativní formy, a i dalších problémů, které budou dále vysvětleny.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy způsob přípravy v nativní formě zahrnující krok rozrušení kolagenu s dvojitými příčnými noži, který je vybaven systémem rychlosti míchání a stupně mixování, a dále termostatem, s krokem sterilizace kolagenu v tekutém médiu.

kolagenu v mixéru kontroly následným

Předmětem předkládaného vynálezu je také sterilní kolagen, zejména kolagen převážně typu I v nativní formě, a preparáty pro humánní a/nebo veterinární použití, které obsahují kolagen jako jedinou aktivní látku, nebo v kterých je kolagen zkombinován s dalšími výhodnými látkami, které jsou přijatelné z pohledu farmaceutického, parafarmaceutického, medicínsko-chirurgického, a/nebo oftalmologického, a/nebo kosmetického.

Předmětem předkládaného vynálezu je také použití kolagenu ve shodě s vynálezem při výrobě preparátu zamýšleného pro farmaceutickou, parafarmaceutickou, medicínsko-chirurgickou, a/nebo oftalmologickou, a/nebo kosmetickou léčbu člověka nebo živočicha.

Tyto i další předměty předkládaného vynálezu budou zřejmé osobám zkušeným v oboru po přečtení detailního popisu, který následuje.

Popis vynálezu

Způsoby přípravy sterilního kolagenu, které jsou v současnosti dostupné vedou k výše zmíněným problémům s realizací a dosud v praxi neumožnily přímou sterilizaci samotného kolagenu v tekutém médiu, ani kolagenu v přítomnosti dalších aktivních složek. Tuto přímou sterilizaci je možno jednoduše provést a obzvláště účinně garantuje sterilitu a nativní charakter získaného kolagenu, čímž dochází k uchování jeho výhodných vlastností.

Předkládaný vynález dosáhl tohoto cíle a týká se způsobu přípravy kolagenu zahrnujícího krok před vlastní sterilizací spočívající v mechanickém rozvolnění v mixéru, jako je například mixér prodávaný pod značkou DITO-SAMA 175 (LA BOVIDA) a upravený společností J.F.I. Graulhet z Francie, který je vybaven systémem kontrolujícím teplotu extraktu nesterilního nativního kolagenu, který je solubilizován a purifikován, či volitelně natráven pepsinem. Tento krok mechanického ···· · · ·· ·· ·· • ·· · 4 » · * · · · » · · » · · · · · : : · · ··· · · · · · «· ·· rozvolnění umožňuje překvapivě a neočekávaně sterilizaci tekuté formy kolagenu a ochranu jeho nativní formy.

Přednostně je takto připravený kolagen převážně kolagenem typu I. Kolagen takto připravený, který je převážně typu I je sterilní a v nenativní formě, tj. s nezměněnou sekundární a terciární strukturou a se zachováním všech výhodných vlastností, dokonce i po sterilizaci.

Kolagen ve shodě s předkládaným vynálezem je užitečný ve velkém množství aplikací, které jsou detailněji popsány níže, zejména se jedná o:

humánní a veterinární lékařské aplikace: farmaceutické aplikace parafarmaceutické aplikace oftalmologické aplikace medicínsko-chirurgické aplikace kosmetické aplikace

Může být použit jako takový, tj . bez jakékoli další aktivní složky, například ve formě sterilního čistého roztoku, pro injekční preparáty nebo alternativně jako biologická adhezivní látka i v dalších formách, které jsou detailněji popsány níže.

Může být použit v preparátech v kombinaci při nízkém pH, jako vehikulum pro další aktivní složky pro jejich okamžité uvolnění. Tyto další aktivní látky jsou výhodně vybrány ze skupiny obsahující srážlivé faktory, například trombin, antiinfekční látky, například metronidazol, antibiotika, zejména makrolidová, jako je například gentamicin, fluorochinolony, jako je například pefloxacin, protizánětlivé látky, například acylkarboxylové nebo oxikamové deriváty steroidních nebo nesteroidních protizánětlivých látek, antimykotické látky a růstové faktory, zejména kostní růstové faktory, jako je například somatotropin, a epidermální růstové faktory, jako je například EGF.

Avšak v určitých specifických indikacích, například v oftalmologii, nebo v případě medicinálních kombinací se začleněnými aktivními složkami, které jsou nekompatibilní s kyselým pH, jako je například ♦ · · · • ·

glykopeptidové antibiotikum vankomycin, aby byly citovány alespoň dva příklady, je samozřejmě preferováno mít kolagen s neutrálním pH.

Je také výhodné mít kolagen s neutrálním pH jako vehikulum pro trvalé uvolňování aktivních složek, jako například srážlívých faktorů, nebo alternativně v případě potřeby aktivity srážlívých faktorů a mechanického účinku. Z tohoto důvodu je také obzvláště výhodné použít kolagen ve shodě s předkládaným vynálezem,

- nebo použít kombinací v stratifikovaných pevných formách, dvě předchozí kombinace při kyselém pH a při neutrálním pH ve specifických aplikacích, které budou popsány níže.

Jako příklad velkého množství preparátů s kolagenem, které jsou předmětem vynálezu, mohou být zmíněny:

tekuté formy: gel, zejména pro injekční podání, kapky, pěna, sprej pseudopevné formy: filmy, plachty, membrány, pásky nebo náplasti, atd.

- pevné formy: pudry, laminované/stratifikované tampóny, filmy, membrány, vlákna, šicí materiály, atd.

Je také možné využít kyselé a rozpustné vlastnosti sterilního kolagenu ve shodě s vynálezem ve farmaceutických nebo kosmetických preparátech, zejména ve zvlhčujících preparátech.

Je možné například použít kolagen při nízkém pH a v pseudopevné formě získané ve shodě se způsobem, který je předmětem vynálezu, a to samotný, nebo v kombinaci s dalšími aktivními látkami, jako jsou například vitamíny E nebo C, zejména jako látky zvlhčujíci epidermis a jako vehikulum pro aktivní látku(y) v pleťové masce.

Tyto preparáty a některé další budou ilustrovány ve zbývající části předkládaného vynálezu.

V kontextu předkládaného vynálezu znamená termín nativní kolagen kolagen, jehož výchozí struktura nebyla nijak modifikována, integrita jeho polypeptidových řetězců byla ochráněna (včetně telopeptidů) a helikální struktura molekuly zůstala intaktní.

Termín atelopeptidový kolagen znamená kolagen, který byl částečně proteolyticky naštěpen enzymatickým natrávením za použití proteolytického enzymu jiného, než je kolagenáza, jako je například .7 trypsin, papain, atd., nebo dokonce ještě lépe pepsin, což vede k odstranění jeho telopeptidů. Samozřejmě pokud je v nativní formě, je jeho trihelikální struktura zachována.

Termín sterilní kolagen znamená kolagen, který je sterilní ve shodě se standardami Světové zdravotnické organizace, Evropského lékopisu a Amerického lékopisu (USP 22), tj. u kterého je ověřena sterilita po mikrobiologické analýze podle příslušných kritérií výše uvedených standard.

Termín tekutý kolagen znamená kolagen v roztoku, nebo ve formě suspenze, disperze, nebo gelu.

Termín pseudopevný kolagen znamená kolagen ve formě gelu, který neteče, a který tvoří kompaktní a homogenní hmotu obsahující více než 75% vody.

Termín pevný kolagen znamená kolagen, který neobsahuje více než

10-25% vody, a který může být v pevné formě, například ve formě prášku, filmu, tampónu, membrány, atd.

Fráze nativní kolagen s polymerizující silou znamená nativní kolagen připravený podle jedné varianty způsobu, který je ve shodě s předkládaným vynálezem, který má v tekuté formě nebo v solubilizované pevné formě tekutý charakter při teplotě vyšší než 37°C. Tento kolagen se transformuje do homogenní hmoty a je v pseudopevné formě při teplotě nižší nebo rovné 37°C. Takový kolagen může být samozřejmě atelopeptidem.

Fráze solubilizovný a purifikovaný extrakt znamená nesterilní extrakt kolagenu při nízkém pH (od 1,5 do 6,5, konvenčně od 3 do 6 a dokonce ještě lépe od 4 do 5, v kterém obsah popelu síry je obecně menší než 2% a obsah lipidů je obecně menší než 1%, a který obsahuje od 12 do 13,9% hydroxyprolinu a od 17 do 18,7% celkového dusíku, a který neobsahuje žádné stopy tryptofanu nebo polypeptidových řetězců menších než 95000 Da.

Takový extrakt může být získán ze sušených čerstvých kůží, jako jsou například telecí nebo králičí kůže, a/nebo z pojivových tkání, zejména z hovězího dobytka, z koz, ovcí, koní, králíků, jelenů, pštrosů, ryb, atd., nebo ze sušených nebo čerstvých kostí živočichů, z rohovek, nebo dokonce ze šlach (například z Achillových šlach • · · · • · pštrosů), nebo alternativně z purifikovaných vláken nebo prášku kolagenu. Může být také extrahován z placenty lidského původu.

Extrakt, který je užitečný v kontextu předkládaného vynálezu je připraven sérii experimentů zahrnujících sumárně kroky: působení vápnem/odstranění srsti/omytí/odvápnění/odstranění epidermis a podkožních tkání/nařezání/vysušení stáčení/namočení do IN NaOH na 12 hodin při teplotě 25°C/promytí za účelem odstranění NaOH/rozemletí/nařezání do filmů/delipidace v lázni s Tritonem X100 v koncentraci 0,01%/volitelně eliminace aminoglykanů v lázni s K₂HP0₄/promyti/vysušení stáčením/promyti purifikovanou vodou/vysušení stáčením/acidifikace 10'² M kyselinou octovou, monochlorooctovou kyselinou, nebo citrónovou kyselinou/volitelně naředění kolagenového extraktu.

Extrakt může být ve formě vodného roztoku, suspenze, disperze, gelu, nebo pasty, atd.

Způsob předkládaného vynálezu může být použit na kolagen různých typů I, II, III, IV, atd. Avšak od této chvíle a čistě pro nijak nelimitující ilustraci se termín kolagenový extrakt a kolagen týká, pokud není jinak specifikováno, kolagenového extraktu nebo kolagenu zejména typu I.

Proto v kontextu předkládaného vynálezu se kolagenový extrakt skládá hlavně z kolagenu typu I, tj. obsahuje více než 90% kolagenu typu I. Extrakt se může také skládat výhradně z kolagenu typu I, například za použiti známých technik na eliminaci kolagenu typu III, jako jsou například dialýza, centrifugace, diferenciální precipitace pomocí chloridu sodného.

Kolagen typu I je vysoko-molekulární polymer o váze 285000 daltonů obsahující trihelikální strukturu dvou identických polypeptidových řetězců nazývaných ai(I)₂ a polypeptidového řetězce nazývaného 012(1)2Patří do rodiny vláknitých kolagenů (typ I, II, III a V).

Kolagen má denaturační vrchol, který závisí na jeho původu, na extrakčním způsobu, který vede k denbaturaci, a na zesíťované nebo nezesíťované formě, denaturační vrchol je okolo 35 až 45°C.

• · · · • ·

Kolagen převážně typu I má poměr a₂(I)₂/ «1(1)2 0,48-0,52, jak lze určit denzitometricky na polyakrylamidovém gelu po migraci řetězců na elektroforéze.

Virová inaktivace tohoto extraktu a volitelně přítomného pepsinu může být provedena chemickou úpravou prostřednictvím protlačení přes pufrové roztoky o pH vyšším nebo rovným 13 a o pH nižším nebo rovným 2,5. Dále jsou obecně prováděny další známé úpravy, jako je například namáčení do lázně hydroxidu vápenatého v 4% koncentraci v kombinaci se sulfidem sodným v 3% koncentraci, což je následováno druhou lázní metabisulfitu sodného v 0,5% koncentraci v kombinaci s chloridem amonným v 2% koncentraci.

Volitelná neutralizace pepsinu je provedena reakcí se sodíkem, který vrací pH na 6,8 až 7,4, jak je vysvětleno například v dokumentu FR 2586703.

Podobně může být také provedena známým způsobem eliminace možných patogenů, které jsou zodpovědné za rozvoj bovinní spongiformní encefalopatie, a které jsou nazývány 'priony', jak je popsáno například ve směrnicích WHO (WHO/COS/VHP/92104) a Evropského společenství z 11. prosince 1991. Eliminace může být tedy provedena reakcí s roztokem IN hydroxidu sodného po dobu 1 až 48 hodin při teplotě 25°C, nebo alternativně reakcí s hypochloritem sodným po dobu alespoň 1 hodiny při teplotě 25°C.

Podle prvního aspektu je tedy předmět předkládaného vynálezu přesnějším způsobem přípravy kolagenu ze solubilizovaného a purifikovaného extraktu nesterilního, nativního, volitelně atelopeptidového kolagenu, charakterizovaného tím, že zahrnuje kroky spočívající v mixování a nařezání řečeného extraktu v mixéru s dvojitými příčnými noži po dobu 1 až 60 minut, konvenčně od 15 do 40 minut a přednostně od 10 do 20 minut při rychlosti míchání 100 až 10000 otáček za minutu, obecně od 500 až 7000 otáček za minutu a přednostně od 1000 do 5000 otáček za minutu, při současné kontrole teploty s následnou sterilizací extraktu, čímž dochází k získání sterilního kolagenu v nativní formě.

Kolagen takto získaný může být ve formě tekuté, ve formě gelu, ve formě pseudopevné nebo pevné.

• · · · • · · · · · · · · · · « · ··· · · · ·

S výhodou podle varianty prvního provedení a pokud extrakt není obvykle natráven pepsinem (od této chvíle se bude pro zjednodušení varianta 1 týkat formy způsobu vynálezu, v které extrakt není natráven pepsinem, pouze pokud není jinak specifikováno), teplota, která je vždy kontrolována, nepřesahuje 40 až 50°C, nebo dokonce 60 až 80°C v přítomnosti zesíťujících látek (podle jiné formy vynálezu, která je alternativou k této variantě a je popsána detailněji níže).

Přednostně podle první varianty způsobu předkládaného vynálezu, protože extrakt není natráven pepsinem, jeho teplota postupně stoupá z pokojové teploty, až je v řečeném mixéru dosaženo teploty 40 až 50 C při současném vzestupu inicialní rychlosti mícháni z 500 otáček za minutu na 5000 až 7000 otáček za minutu. Pro vzrůstající viskozitu v každé fázi je prováděno naředění extraktu. Kolagen je tedy udržován při zvolené vysoké viskozitě, zatímco se současně snižuje jeho koncentrace. Řečená vysoká viskozita je s výhodou 17000 až 20000 cps. Pokud je například řečená maximální teplota 42 až 44°C, je řečený extrakt před sterilizačním krokem ponechán ustát.

Po sterilizaci je pozorováno, že kolagen takto připravený má konzervovanou svoji nativní formu a došlo ke zlepšení jeho vlastností, zejména elasticity a mechanické síly. Má adhezivní a polymerů zující sílu.

Přednostně je řečený extrakt v řečeném mixéru převeden z pokojové teploty na teplotu alespoň 40 až 50°C po stupních o 3 až 5°C, zatímco současně se zvyšuje rychlost míchání po 500 až 1000 otáčkách za minutu tak, aby rychlost dosáhla 1500 až 7000 otáček za minutu, přednostně 5000 otáček za minutu.

Je skutečně důležité zvyšovat teplotu stupňovitě, protože náhlý vzestup teploty dočasně denaturuje kolagen bez dostatečného zvýšení « jeho elastických vlastností. Tato teplota se zvyšuje alespoň na 40°C, protože při nižší teplotě je obtížné nebo dokonce nemožné provádět _t následnou filtraci.

Je také důležité zvyšovat rychlost míchání stupňovitě, aby bylo možno lépe kontrolovat zvolenou vysokou viskozitu při současném snižování koncentrace kolagenu, jak již bylo zmíněno.

Koncentrace kolagenu v extraktu je od 0,001% až do 15%, obecně od

0,1 do 10% a přednostně od 3 do 6%.

• ·

1.1 «

Jak je popsáno výše, může však teplota v řečeném mixéru dosáhnout vyšších hodnot, dokonce až 80°C v přítomnosti zesíťujících látek, jako je například glutaraldehyd, a azylové kyseliny, jako je například hydrazin, nebo jakákoli jiná zesíťující látka, která je kompatibilní s kolagenem. Pokud jsou přítomny, mají tyto látky finální koncentraci v extraktu od 0,00075% do 0,1%, přednostně 0,0075% až 0,01% v případě glutaraldehydu a 0,1% až 2%, přednostně 0,5% až 1,5% v případě hydrazinu. Takto zesíťovaný kolagen má následně vyšší nastavenou teplotu, která může být okolo 40 až 50°C a má delší in vivo resorpční čas ve srovnání s nezesíťovaným kolagenem, který může být až 8 až 12 týdnů.

Podle obzvláštní formy této varianty, která spočívá v získání sterilního nativního kolagenu ve formě viskózní kapaliny, je prováděn následující postup:

- Nesterilní nativní kolagen, který je extrahován z králičích kůží nebo Achillových šlach pštrosů, je přípraven v dostatečné vysoké koncentraci okolo 10 až 15%.

- Extrakt s nesterilním nativním kolagenem je poté promícháván a promixován ve výše zmíněném mixéru s dvojitými příčnými noži při mírné rychlosti 500 až 1000 otáček za minutu a při pokojové teplotě okolo 20°C.

- Rychlost otáčení a mixování se zvyšuje stupňovitě, což velmi zvyšuje viskozitu extraktu. Viskozita může dosáhnout hodnot 7000 cps až 20000 cps. Od 1500 cps má extrakt skutečně elastický vzhled, což činí míchání a mixování v mixéru extrémně obtížným.

V každém stupni zvýšení viskozity je provedeno naředění extraktu přidáním vody pro injekce nebo 10'² M kyseliny citrónové a rychlost promíchávání a teplota v mixéru jsou stupňovitě zvýšeny až je dosaženo velmi vysoké viskozity okolo 20000 cps.

Tato operace je několikrát opakována, přednostně 4 až 5 krát až do dosažení teploty 35°C, rychlosti 3000 až 5000 otáček za minutu a koncentrace kolagenu okolo 3 až 6%.

- Produkt je udržován při této teplotě 35°C a této rychlosti 3000 až 5000 otáček za minutu po dobu několika minut, přednostně 3 až 5 minut.

- Teplota v mixéru je zvýšena až na 40 až 50°C, přednostně na 40 až 45°C v případě nezesíťovaného kolagenu. Při této teplotě je překvapivě pozorováno zkapalnění extraktu s poklesem viskozity na přibližně 40 až 100 cps.

Kolagenový extrakt připravený výše vysvětleným způsobem je okamžitě pečlivě zfiltrován, při kontrolované operační teplotě 40 až 50°C, přes membrány s porozitou 0,45 um až 0,22 um.

Poté je sterilizován, přednostně pomocí absolutní filtrace přes membránu s porozitou 0,22 um, jako je například membrána Millidisck od společnosti Millipore, při kontrolované operační teplotě 40 až 50°C. Filtrační čas při teplotě 40 až 50°C je zvolena, aby nepřesáhla 1 hodinu, ještě lépe, aby byla v rozmezí až 20 přednostně, společností koncentraci minut. Je také možné provést sterilizaci, také přidáním kyseliny peroctové, produkované zejména Air Liquide pod názvem Soproper, ve finální pečlivě zfiltrovaného roztoku 0,5% až 50% a přednostně od 5% do 15% váhově, s ohledem na suchou váhu kolagenu. Neutralizace této sterilizační látky je prováděna přidáním pomocí přidání thiosulfátu sodného v množství 2 až 20 g na 1 g kyseliny peroctové a přednostně 4 až 12 g/g kyseliny peroctové. Kontaktní čas vyžadovaný pro sterilizaci kyselinou peroctovou je od 1 hodiny do 24 hodin při pokojové teplotě, přednostně od 2 do 4 hodin.

Podle jiné obzvláštní formy této první varianty způsobu ve shodě s předkládaným vynálezem, která spočívá ve získání nativního kolagenu ve formě pseudopevného gelu, protože koncentrace kolagenu je mezi 0,5% až 10%, je také výhodné sterilizovat kolagen přímo ozářením v dávce 2,5 Mrad (beta nebo gama ionizujícím zářením). Překvapivě je pozorováno, že pseudopevný gel zůstává kompaktní a heterogenní a že proto nedochází na rozdíl od konvenčních gelů k separaci do dvou fází, a konzervuje jeho fyzikálně chemické vlastnosti a polymerizujici sílu. Pseudopevný gel sterilizovaný tímto způsobem může být s výhodou zkapalněn tak, aby mohl být zkombinován se sterilními aktivními látkami, které jsou senzitivní k ionizujícímu záření, jako jsou například srážlivé faktory, antibiotika, antimykotika, atd., pro tvorbu tekutých nebo pevných preparátů, obzvláště preparátů uváděných jako příklady: tampóny, prášky, filmy, membrány, náplasti, atd.

Pokud je tento způsob sterilizace použit na pevné preparáty kolagenu získaného podle první varianty způsobu a zkombinovaného s aktivními látkami, které jsou rezistentní na ionizující záření a které jsou vybrány z terapeutických tříd citovaných v předkládaném dokumentu, nedochází k modifikacím fyzikálně-chemických vlastností nebo polymerizující a adhezivní síly této formy kolagenu.

• · · · • · · ··· · · ·« · • · · · · · · · ·

1·3 ·· ··· · · · .

·· ··· ··· ·· ·· ··

Podle této varianty 1 může způsob podle vynálezu zahrnovat také neutralizační krok. Neutralizace může být dosaženo před nebo po sterilizačním kroku. Tato neutralizace může být provedena například pomocí hydroxidu sodného, aby došlo k úpravě pH na 6,8 až 8,2 a přednostně na 7,0 až 7,4. Překvapivě se ukázalo, že tato neutralizace kolagenu ve viskózní kapalné formě a při teplotě 40 až 50°C nezpůsobuje precipitaci kolagenu. Extrakt zůstává v čisté nebo průsvitné viskózní kapalné formě a rychle se ustavuje za stejných podmínek jako kolagen při nízkém pH. Je velmi výhodné zabránit do této chvíle tvorbě určitých preparátů, jako je například gel založený na bázi kolagenu, nebo kombinace kolagenu s vankomycinem, kvůli precipitaci kolagenu při neutrálním pH.

Analýzy molekuly kolagenu, který je předmětem vynálezu, pomocí konvenčních technik již zmíněných, potvrzují integritu primárních, sekundárních a terciárních struktur takto neutralizovaného kolagenu.

Charakteristiky kolagenu získaného podle varianty 1:

Překvapivě je kolagen sterilizovaný ve shodě s první variantou způsobu předkládaného vynálezu konzervován ve své nativní formě.

Při teplotě 40 až 50°C se jedná o viskózní průsvitnou kapalinu.

Jeho viskozita se obecně liší od 20 cps do 300 cps a přednostně od 30 do 200 cps a dokonce ještě lépe od 40 do 100 cps.

Jeho pH je obecně od 1,5 do 6,5, přednostně od 2 do 5 a dokonce ještě lépe od 3 do 4.

Jeho koncentrace je obecně od 0,001 do 15%, přednostně od 0,1 do 10%, a dokonce ještě lépe od 3 do 6%.

Velmi rychle se ustaluje při teplotě nižší nebo rovné 38°C. Zaujímá pseudopevnou formu, která má vynikající adhezívní vlastnosti jako hemostatikum. Jeho ustalovací čas při teplotě přibližně 38°C je méně než 1 minuta při koncentraci vyšší nebo rovné 5%, mezi 1 a 2 minutami pří koncentraci 3% až 4%, a přibližně 3 minuty při koncentraci nižší než 2%.

• · · · • · · · · · · · · « · • · · · · ····

Získaný nativní sterilní kolagen má také další následující důležité charakteristiky a vlastnosti:

kolagen je převážně, tj . v 90 nebo více procentech, tvořen typem I, tj. poměrem α₂ (I)1/Oíi(I)₂, který je v rozmezí 0,48 až 0,52 obsah vody: větší než 80% vzhled: kapalina při teplotě vyšší než přibližně 38°C a lepkavá na dotek; pseudopevná kompaktní a homogenní gelovitá hmota při teplotě nižší než přibližně 38°C.

celkový obsah dusíku: 17,0% až 18,7%

- hydroxyprolin: od 12% do 13,9% bez tryptofanu, aminoglykanů a polypeptidů o molekulové váze menší než 95000 Da

- lipidy:: méně než 1% popel síry: méně než 2%

- denaturační vrchol: 38°C až 45°C, měřeno diferenciální termografií (DSC)

- adhezivní síla

- polymerizační síla konzervace při pokojové teplotě

- okamžitě k použití.

Předmětem předkládaného vynálezu je proto také kolagen, který má výše zmíněné charakteristiky.

Preparáty na bázi získaného kolagenu podle této první varianty způsobu ve shodě s předkládaným vynálezem a jejich použití:

Jak již bylo zmíněno, kolagen ve shodě s vynálezem má při kyselém nebo neutrálním pH polymerizační sílu a významné adhezivní vlastnosti. Adhezivní vlastnosti v kombinaci s jeho hemostatickými a resorpčními vlastnostmi mu propůjčují vlastnosti resorbovatelné hemostatické adhezivní látky.

Kolagen, který je předmětem předkládaného vynálezu může být distribuován přednostně do injekčních stříkaček nebo lahviček o obsahu 2 až 5 ml, které jsou přednostně vyrobeny ze skla a které jsou udržovány při teplotě umožňující polymerizaci, nebo při teplotě mezi 0°C a 38°C, dokonce ještě lépe při pokojové teplotě.

Další výhodnou formou tohoto rezorbovatelného hemostatického adheziva je ve shodě s vynálezem suchá, prášková nebo pěnová forma. Tato forma nevyžaduje před svým použitím·žádnou předchozí přípravu.

·« ·· • « · · • · · · • · · ·

K získání takové formy kolagenu, který je předmětem vynálezu, je viskózní forma kolagenu podrobena například lyofilizací.

Kolagen v kapalné formě, který je předmětem vynálezu je za aseptických podmínek rovnoměrně umístěn do nádobek (lyofilzačních destiček) , což vede ke vzniku lyofilizátu o tloušťce 1 až 20 mm, 2 až 10 mm a dokonce ještě lépe 3 až 5 mm. Získaný má krémovou barvu a má mírně elastické, film-tvořící Obsahuje 1% až 25% vody, přednostně 5% až 15%.

Lyofilizáty mohou být rozemlety za vzniku prášku z malých částic o zvolené velikosti.

přednostně lyofilizát vlastnosti.

U práškových preparátů je preferováno mít koncentraci kolagenu před lyofilizací okolo 3 až 6%, nebo více, aby bylo zajištěno lepší sprej ování.

Po rozmělnění může být prášek uložen do sterilních polyetylénových lahviček s dvojitým víčkem, nebo jiné nádobky umožňující udržení sterilního prostředí, a která usnadňuje sprejování na hemoragický povrch.

V případě pěnových lékových forem by měla být koncentrace kolagenu relativně nízká, přednostně od 1 do 2%.

Film-vytvářejicí pěnové lékové formy mohou být baleny jednotlivě, po lyofilizací, v dvojitých sáčcích nebo v baleních uzavřených tepelným svarem. Jsou například čtvercového, trojúhelníkového, nebo kruhového tvaru a mají boční délku nebo průměr 1 cm až 30 cm v závislosti na použití.

Účinek dvou suchých forem zmíněných výše je podobný účinku kapalné formy popsané výše. Avšak film-vytvářející pěnové formy mají také mechanický účinek, který je často vitální v případech krvácení, zejména krvácení břišního.

Toto adhezivum v jakékoli formě, obzvláště ve formě viskózní kapalné, pseudopevné, pěnové formy vytvářející film, nebo formy práškovité, může být zkombinováno s aktivními látkami, zejména s farmaceutickými aktivními látkami, jako jsou například srážlivé faktory, které hrají roli v urychlení hemostázy (jako jsou například

• · · · i*’ trombin, fibrinogen, faktor XII, atd.), nebo alternativně antibiotika, obzvláště u chirurgických zákroků na kostech.

Obsahuje-li toto adhezivum srážlivé faktory, může být s výhodou zkombinováno se stabilizátory, jako jsou například polyoly (například glycerol, nebo polyalkylen glykol, kde alkylenový radikál má od 1 do 4 atomů uhlíku, jako je tomu například zejména u polyetylén glykolu nebo polypropylen glykolu), nebo mono-, di-, nebo polysacharidy (jako jsou například glukóza nebo sacharóza).

Podobně jako u jiných preparátů získaných z viskózní tekuté formy kolagenu podle varianty 1 způsobu vynálezu, měla by být pozornost věnována:

Pseudopevné náplasti jako vehikula pro aktivní látky pro extraepidermální lokální použití, nebo alternativně cikatrizačnímu spreji, který je vhodný pro pacienty s popáleninami třetího stupně, stejně tak jako zvlhčující masce pro kosmetické použití.

více antibiotik, antibakteriálních látek a dalších zejména kyselina

Do náplasti může být inkorporováno jedno nebo protizánětlivých látek, antiseptických látek, látek, antifungálních látek a antimykotických fyziologicky a farmaceuticky aktivních látek, salicylová nebo nikotin. Tyto aktivní látky jsou přidávány při teplotě vyšší než 40°C až do dosažení homogenizace. Směs je odvzdušněna a prohnána systémem pod tlakem, jako například měřící pumpou, a distribuována do zapečetěných obalů (například polyetylénových filmů, apod.). Po ochlazení tekutiny na pokojovou teplotu je obal uzavřen tepelným svarem.

Koncentrace kolagenu v náplasti se pohybují v rozmezí od 1 do 8%, a přednostně od 2 do 5%.

Jsou-li přítomna antibiotika, mají následující koncentrace v mg antibiotika na mg kolagenu.

Gentamycin: od	0,01	do 2	mg/mg,	dokonce ještě	lépe	od	0,1	do	0,7
mg/mg a přednostně od	0,15	mg/mg	do 0,5 mg/mg.
Vankomycin: od	0,01	do 2	mg/mg,	dokonce ještě	lépe	od	0,1	do	0,7
mg/mg a přednostně od	0,15	mg/mg	do 0,5 mg/mg.
Pefloxacin: od	0, 01	do 2	mg/mg,	dokonce ještě	lépe	od	0,05	do	0, 5

mg/mg a přednostně od 0,075 mg/mg do 0,25 mg/mg.

9· 9 9 • · • ·

1·7 ··· ··· ·· ·« • 4 9 · • · ♦ * • · · · • 9 9 9

9 i·

Tloušťka náplasti se může pohybovat od 1 do 5 mm, nebo může být i tlustší, avšak jsou preferovány náplasti o tloušťce.1,5 až 2,5 mm.

Délka a šířka jsou upraveny podle předpokládaného použití. Náplast získaná ve shodě s předkládaným vynálezem má pseudopevnou formu, je flexibilní, silná a vysoce hydratovaná (obsah vody je větší než 80%) a má průhledný vzhled.

Snadno se aplikuje na vnitřní i zevní povrchy tkání, ať poškozené či zdravé. V případě zevního epidermálního použití může být náplast fixována na nepropustný hypoalergenní adhezívní materiál, který umožňuje udržení adherence na povrchu tkáně.

Maska je získána nalitím kolagenu jako takového, nebo v kombinaci s aktivními látkami, jako jsou například vitamíny (C, E, atd.), surfaktant, jako je například benzalkonium chlorid, nebo zvlhčující látky, jako je například glycerol, například na pomalu se pohybující pás, což umožňuje získat homogenní film o rovnoměrné tloušťce. Po ochlazení je nakrájen na vhodné rozměry v pseudopevné formě a uložen do hermetických sáčků (vyrobených například z hliníku s vnitřní polyetylénovou výstelkou).

Koncentrace kolagenu, které jsou užitečné v preparátu takové masky, se pohybují obecně od 0,2 do 3%, dokonce ještě lépe od 0,5 do 2% a přednostně od 1 do 1,5%.

Tvary a rozměry nejsou nijak omezeny. Pleťová maska má konvenčně tvar a rozměry listu papíru o velikosti A4 (21 x 29,7 cm). Tloušťka je obecně od 0,5 do 3 mm a přednostně od 1 do 1,5 mm.

Maska má pseudopevnou formu, je velmi pružná, měkká na dotek a průhledná, a vysoce hydratovaná (obsah vody větší než 97%). Velmi snadno se nanáší na kůži. Do preparátu pleťové masky může být přidáno jedno nebo více barviv a i další aktivní látky, které jsou kompatibilní s kolagenem.

Sprej obsahuje kolagen a aktivní látky ve stejných koncentracích a ve stejných kombinacích jako je popsáno u náplasti. Sprejovací látka je s výhodou balena do lahviček s jednou dávkou nebo do sprejů o 5 až 25 ml, které jsou přednostně vyrobeny ze skla nebo polyetylénu.

• Φ >

• φ · · « φ · ·

Před použitím je kolagen, který je při pokojové teplotě v polymerizující formě, zkapalněn teplem ve vodní lázni nebo v inkubátoru po dobu 2 až 3 minut ve svém původním obalu. Kolagen je sprejován na povrch tkáně ze vzdálenosti okamžitě před svým ustálením.

Takto aplikovaný kolagen adheruje na povrch tkáně a velmi rychle polymerizuje na tomto povrchu, čímž vytváří hemostatický a cikatrizující homogenní film. Takový sprej je obzvláště výhodný, jeli cílem cikatrizující účinek a/nebo trvalé uvolňování aktivních látek, jako jsou například antibiotika, antiseptika, antimykotické látky, protizánětlivé látky, atd.).

Toto zařízení pro sprejování ze vzdálenosti má výhodu, že vylučuje kontakt operátora s poškozeným povrchem tkáně, a vylučuje tím tedy jakékoli riziko možné lokální infekce.

Jedno z použití tohoto spreje, které je výhodné a možné kvůli specifickým vlastnostem kolagenu ve shodě s překládaným vynálezem, se týká zejména pacientů s popáleninami třetího stupně, u kterých je nezbytné garantovat sterilitu a rychlost péče.

Podobně jako u jiných preparátů získaných z viskózní tekuté formy kolagenu podle varianty 1 způsobu vynálezu, měla by být pozornost věnována: filmům nebo membránám získaným například nalitím na polyetylénový pás s následným vysušením vzduchem ve ventilovaném inkubátoru nebo pod vakuem. Operační teplota se pohybuje od 10°C do 35°C a přednostně od 20°C do 25°C.

Například k získání filmů o tloušťce menší než 1 mm, přednostně od 25 um do 250 um, jsou konvenčně použity roztoky kolagenu v koncentracích od 2% do 5%, přednostně od 2,5% do 3,5%. Trvání vysoušení se může pohybovat od 1 hodiny do 120 hodin. Trvání vysoušení je s výhodou okolo 24 hodin. Specificky je pozorováno, že nej lepší výsledky jsou získány relativně pomalým vysoušením a relativně pomalým proudem vzduchu.

Takto získané filmy nebo membrány mají obsah vody od 1 do 15% a přednostně od 5 do 10%. Jsou nakrájeny za aseptických podmínek, buďto manuálně nebo automaticky a zabaleny do uzavřených a nepropustných balení.

• · · » • ♦ *<·»·»*

10* ί* · ί · · · · * £ _7 · · « - < · * · »· ··· ··· · ·

Podobně jako u výše zmíněných forem mohou filmy nebo membrány obsahovat aktivní látky, jako jsou například antibiotika, antiseptika nebo také protizánětlivé látky, atd. Mohou být připraveny z kyselého (nízké pH) nebo neutrálního kolagenu.

Jsou používány na zevní i vnitřní povrchy pro cikatrizaci a/nebo uvolňování aktivních látek, například medicinálních. Pro jejich elasticitu v kontaktu s hemoragickým mokrým povrchem mohou s výhodou vytvářet kryt, který adheruje na oblast poškozené tkáně.

V oftalmologických indikacích jsou vytvářeny z kolagenu při pH 6,8 až 7,2. V tomto případě mohou filmy nebo membrány zaujímat například formu cylindrického rezervoáru nebo transparentních kontaktních čoček pro trvalé lokální dopravení aktivních složek do očí. Pokud je požadováno použít tento preparát kolagenu v tekuté formě (kapky/oční průplachy), je kolagen konzervován v kapslích nebo v jiných baleních s jednou dávkou, které musí být před použitím znovu zahřátý.

V případě použití v oftalmologii se pohybují koncentrace kolagenu v membránách nebo čočkách při neutrálním pH od 1% do 2,5% a přednostně od 0,5% do 2%, pro oční kapky při neutrálním pH se pohybují tyto koncentrace od 0,1% do 1,5%, přednostně 0,2% až 0,5%.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou tedy také preparáty popsané výše, pro které byly pouze pro ilustraci citovány některé možné farmaceutické formy.

Podle druhé varianty způsobu podle předkládaného vynálezu je extrakt vystaven před mechanickým zpracováním v řečeném mixéru s kontrolou teploty omezené proteolýze pomocí vhodného enzymu s výjimkou kolagenázy, jako jsou například trypsin, papain nebo pepsin, přednostně pepsin, jak bude vysvětleno níže. Koncentrace kolagenu se v extraktu pohybuje obecně od 0,1% do 2%, dokonce ještě lépe od 0,2% do 1% a zcela nejlépe od 0,3% do 0,5%.

Řečený pepsinizovaný extrakt (purifikovaný, solubilizovaný je poté podroben následujícímu postupu:

- Jsou prováděny kaskádové filtrace pomocí membrán s různou porozitou, například od 100 na 50 a poté na 20 um, 1 um až na 0,45 um.

• « · ’

2(]

Poté je proveden nový purifikační krok pomocí diferenciální precipitace s kovovými solemi alkalických zemin, například s chloridem draselným nebo sodným, přednostně s chloridem sodným s případnou dialýzou proti K₂HPO₄ a Na₂HPO₄ fosfátovým pufrům, a finálně je provedena centrifugace za účelem získání precipitovaného kolagenu.

Takto získaná peleta je homogenizována jemným promícháváním v purifikované vodě s koncentrací kolagenu od 1% do 30% a poté 2 až 3 krát promyta před resuspendací v purifikované vodě a jemně promíchávána po dobu 48 hodin při teplotě 0°C až 20°C, přednostně při teplotě 0°C až 10°C.

Tato suspenze je zcentrifugována nebo dekantována pomocí rotačního vysoušení. Kolagen je sbírán do 10'² M roztoku kyseliny citrónové při nízkém pH 2 až 5, přednostně 2,5 až 3,5, jehož objem je vypočítán jako funkce zvolené finální koncentrace kolagenu.

Peleta je ponechána stát v tomto kyselém roztoku bez promíchávání při nízké teplotě 0°C až 10°C po dobu 2 hodin až 48 hodin, přednostně 12 hodin až 24 hodin. Peleta s kolagenem bobtná a ztrácí svoji bílou barvu, takže se stává průsvitnou.

Peleta je přemístěna do mixéru s dvojitými podélnými noži, jako je například již zmíněný mixér DITO-SAMA a poté je postupně zvyšován stupeň mixování až do dosaženi přednostně 1000 až 5000 otáček za minutu, dokonce ještě lépe 2000 až 3000 otáček za minutu při současné kontrole nárůstu teploty tak, aby nepřesáhla 35°C, přednostně 25°C, až do získání úplné solubilizace. Získaný roztok je čirý.

Kolagen připravený z extraktu kolagenu je opět přednostně převážně typu I.

Podle této varianty 2, může být takto připravený roztok nativního kolagenu s výhodou sterilizován absolutní filtrací přes membránu o 0,22 um porozitě při operační teplotě, tj. podle této varianty přednostně při teplotě 20 až 25°, nebo alternativně přidáním kyseliny peroctové za podmínek, které jsou identické s těmi, které již byly popsány výše, nebo alternativně může být použita sterilizace pomocí ionizačního záření (2,5 Mrad) předem vysušené formy, která může být solubilizována ve sterilním tekutém médiu, aby mohla být zkombinována s aktivními látkami citlivými na ionizující záření, které jsou vybrány z terapeutických tříd citovaných v předkládaném dokumentu.

• · · ·

Volitelně může být provedena neutralizace, přednostně po kroku sterilizace a při pokojové teplotě. Při pokojové teplotě je pozorováno, že se začíná od druhé hodiny tvořit precipitát. Proto je obzvláště výhodné konzervovat kolagen při teplotě 0°C až 8°C a připravit kombinace nebo směsí kolagenu s dalšími aktivními látkami, které jsou inkompatibilní při nízkém pH (od 1 do 6,5), během prvních dvou hodin po neutralizaci, přednostně během první hodiny, a dokonce ještě lépe během 30 minut a poté provést zejména volitelné postupy zamrazení, lyofilizace nebo vysušení vzduchem nebo pod vakuem.

Charakteristiky kolagenu získaného podle varianty 2:

Takto připravený atelopeptidový kolagen je sterilní a v nativní formě. Je ve formě čirého roztoku, který má nízkou viskozitu 2 až 40 cps, a který má, pokud je to požadováno kyselé nebo neutrální pH.

Další charakteristiky takto připraveného kolagenu jsou následující:

kolagen obsahuje 90% nebo více kolagenu typu I, tj. poměr a₂(I)i/ cg (I) ₂ 0,48 až 0,52 denaturační vrchol: 38°C až 45°C, měřeno diferenciální termografií (DSC) celkový obsah dusíku: 17,0% až 18,7% hydroxyprolin: od 12% do 13,9% bez tryptofanu, aminoglykanů a polypeptidů o molekulové váze menší než 95000 Da lipidy:: méně než 1% popel síry: méně než 2%

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy také takový atelopeptidový sterilní nativní kolagen.

Preparáty založené na kolagenu získaného podle varianty 2 a použití. Jako příklad může být zmíněno:

Použití bez modifikace v tekuté formě při kyselém pH, jako tkáňová zvlhčující látka, nebo kombinovaná v preparátech s kosmetickými aktivními látkami v koncentracích například 0,1% až 3%; v kombinaci v cikatrizujících terapeutických preparátech, například v přítomnosti aktivních látek v dermatologii, jako jsou například protizánětlivé látky, lokální antiseptika, antibakteriální látky, antifungální látky, kyselina salicylová, atd. Tyto preparáty jsou ve formě krému, gelu, pěny nebo masti pro • ·

zevní použití a kolagen je v nich v koncentracích 1% až 3%. Mohou být také ve formě tekuté nebo ve spreji pro zevní použití v těchto formách bývá koncentrace kolagenu od 0,1% do 1%. Zmíněné aktivní látky jsou použity ve známých terapeutických dávkách. Použití při neutrálním pH v pastě nebo gelu v kombinaci s fosfáty a alkalickými solemi (například chlorid sodný) s koncentracemi kolagenu například od 2% do 7% na korekci kožních depresí, jako jsou například vrásky nebo jemné linky, nebo alternativně pro posílení hladkého svalstva, jako například v případě močové inkontinence, nebo konečně pro výrobu náhrad tkání, jako jsou například srdeční chlopně, nebo náhrad kostní tkáně, kdy je kolagen kombinován zejména s hydroxyapatitem nebo korálem.

Použití při neutrálním nebo kyselém pH v pěnovém preparátu, který obsahuje kolagen v nízké koncentraci, a který je zejména užitečný v chirurgii a mikrochirurgii při opravách poškozených tkání a pro udržení mezitkáňového a parenchymového prostoru a zamezení anatomicko-patologických adhezí v poškozených tkáních (přednostně v parenchymové, kardiovaskulární, hrudní, plastické nebo ORL chirurgii). Do této pěny mohou být inkorporovány aktivní látky, zejména antibiotika, antiseptické a protizánětlivé látky ve stejných koncentracích jako u výše zmíněných preparátů podle varianty 1. Taková pěna bude detailněji popsána níže.

Při použití sterilního kolagenu podle varianty 2 je také možné připravit obzvláště s pomocí vysušení lyofílizací resorbovatelné hemostatické pěnové preparáty, které jsou obzvláště výhodné pro jejich hemostatický účinek pro lokální dopravení jedné nebo více aktivních látek, jako jsou například zejména antiinfekční látky a/nebo srážlivé faktory.

Takové pěnové materiály získané z kolagenu o kyselém pH podle varianty 2 jsou velmi výhodné, protože jsou okamžitě rozpustné, jakmile se dostanou do kontaktu s tekutým médiem, což umožňuje okamžité uvolnění jedné nebo více aktivních látek. Stejné pěnové materiály získané z kolagenu o neutrálním pH podle varianty 2, jejichž vzhled je mikrofibrilární, umožňuji trvalé uvolňováni a také vykazuji výhodný mechanický účinek na herrtoragickém povrchu, ke kterému adheruji.

Kolagen o kyselém nebo neutrálním pH, v koncentracích 0,1% až 3%, přednostně 0,2% až 2% a dokonce ještě lépe 0,5% až 1% mohou být použity v přípravě těchto pěnových preparátů.

Jsou-li přítomna následující antibiotika: gentamycin, pefloxacin a vankomycin, jsou použita v koncentracích zmíněných pro preparáty varianty 1.

Mohou být přítomny také další aktivní látky, jako jsou například trombin, a to v koncentraci, v mezinárodních jednotkách na mg kolagenu, 0,1 IU/mg až 20 IU/mg, přednostně 0,5 IU/mg až 10 IU/mg a dokonce ještě lépe 1 IU/mg až 5 IU/mg. V případě fibrinogenu (v mg fibrinogenu na mg kolagenu) v poměru 0,1 mg/mg až 20 mg/mg, přednostně 0,1 mg/mg až 10 mg/mg a dokonce ještě lépe 0,5 až 5 mg/mg. Mohou být také zkombinovány další aktivní látky, jako jsou jiné krevní deriváty, zejména protrombin, faktor Xa, faktor Ixa, faktor XIII a jakýkoli další aktivátor nebo proaktivátor vnitřního a zevního systému srážení krve, volitelně mohou být zkombinovány s dalšími fyziologicky a farmakologicky aktivními látkami, jako jsou aktivátory a inhibitory plazminogenu, nebo antifibrinolytické látky. Mohou být zkombinovány také další látky například specifické enzymy, které regulují resorpci kolagenu, nebo alternativně i zesíťující látky.

Směsi kolagenu podle vynálezu a výše zmíněných aktivních látek jsou připraveny v nádobkách, které jsou vyrobeny z nerezové oceli, skla, nebo polyetylénu a uskladněny při teplotách 5°C až 35°C, přednostně 10°C až 30°C, dokonce ještě lépe 15°C až 20°C.

Jak již bylo zmíněno, pokud má kolagen neutrální pH, měl by být použit během 2 hodin po neutralizaci. Směs je poté rozmístěna do lyofilizačních nádobek, které umožňují vytvoření vrstev o tloušťce od 1 do 20 mm, přednostně od 3 do 15 mm a dokonce ještě lépe od 5 do 8 mm. Tyto preparáty mohou být tedy lyofilizovány v jedné vrstvě podle následujících operačních parametrů: mrazící teplota -5°C až 60°C, resorpční teplota 20°C až 50°C, obecně 25°C až 40°C a přednostně 30°C až 35°C.

Takto lyofilizované pěnové preparáty mají bílou barvu a homogenní prachový vzhled. Obsah vody je 1% až 25%.

Pěnové preparáty ve shodě s vynálezem mohou být použity bez modifikace, nebo mohou být in šitu laminovány (v lyofilizační komoře) vyvinutím tlaku na ni, nebo za aseptických podmínek

24' protlačením přes lis. Tento postup zvyšuje sílu tohoto typu pěnového preparátu.

Řečené preparáty mohou být s výhodou lyofilizovány v jedné nebo více vrstvách. V tomto případě se vyskytuje přednostně adheze mezi vrstvami během mrazící fáze -11°C až -20°C, přednostně -11°C až -13°C. Takto je získán vrstvený materiál, v kterém mohou dvě spodní vrstvy například obsahovat kolagen o kyselém pH zkombinovaný například s trombinem a s fibrinogenem (který umožňuje uvolňování těchto produktů a tvorbu biologického adhezního materiálu), a v kterém se horní vrstva skládá například z kolagenu o neutrálním pH (který umožňuje mechanický účinek na hemoragický povrch, jak bylo zmíněno). Výše zmíněná forma umožňuje na rozdíl od jiných adhezív velmi výhodně dopravu biologického adheziva bez jakékoli další přípravy. Vrstva o neutrálním pH obsahuje s výhodou antibiotika, dovolujíce jejich trvalé uvolňování, které je obzvláště výhodné v případě kostních infekcí. Volba pořadí a počtu vrstev je nepodstatná, záleží na osobě znalé oboru, která upraví tyto charakteristiky v závislosti na uvažovaném použití.

U těchto kombinací ve shodě s předkládaným vynálezem mohou být použity stabilizační látky, jako jsou například polyoly, polyalkylen glykoly, nebo polysacharidy, nebo alternativně aminokyseliny, nebo další aktivní látky, které jsou kompatibilní s kolagenem, jako jsou například protizánětlivé látky, nebo alternativně zesíťující látky, jak již bylo zmíněno, aby došlo ke zvýšení, opět s výhodou, jejich resorpce. Je také možné použít kombinaci s dalšími resorbovatelnými látkami, které mají mechanický účinek, a sešívání, jako jsou například tkaniva z (R) celulózy, nebo vicryl¹ ’ (prodáván společností Ethnor) které umožňují provádět celulózy nebo oxidované

Navíc kolagen získaný podle varianty 2 způsobu vynálezu, o kyselém nebo neutrálním pH, eventuálně zkombinovaný s dalšími aktivními látkami, může po lyofilizaci nebo vysušení vytvářet hemostatický prášek. Použitý kolagen má pak koncentraci 1% až 3%.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou tedy také preparáty popsané výše, u kterých byly ilustrovány některé z možných farmaceutických preparátů, které představují preparáty nepolymerizovaného kolagenu získané podle varianty 2.

• ·

25Í • ·

Budou uvedeny nelimitující příklady některých předmětů předkládaného vynálezu s odkazem na vyobrazení, v kterých:

Obrázky 1 a 2 jsou schémata elektroforézy na polyakrylamidovém gelu, které ukazují separaci polypeptidových řetězců kolagenu typu I, před a po mechanickém a tepelném zpracování vynálezu (varianta 1) ·

Obrázky 3 a 4 jsou schémata tepelné denaturace kolagenu před mechanickým a tepelným zpracováním vynálezu (varianta 1) a po těchto zpracováních.

• · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Způsob přípravy kolagenu s polymerizující silou (varianta 1: nepepsinizovaný extrakt)

Extrakt kolagenu v 10% koncentraci připravený z Achillových šlach pštrosů, jak je uvedeno výše, je přemístěn do mixéru s dvojitými podélnými noži, jak již bylo zmíněno. Poté je provedeno promíchávání a mixování při rychlosti otáčení 1500 otáček za minutu při pokojové teplotě (20°C) po dobu 7 minut. Je zaznamenán nárůst viskozity na 15000 cps. Extrakt získává bělavou barvu a má elastický vzhled. Poté je provedeno postupné naředění, tak aby koncentrace kolagenu byla 6%. Po každém naředění je teplota postupně zvyšována o 4°C a rychlost promíchávání je postupně zvyšována o 500 otáček za minutu v 3- až 4minutových intervalech. Když je dosaženo rychlosti promíchávání 3500 otáček za minutu a teploty 35 až 36°, jsou tyto podmínky udržovány po dobu přibližně 3 minut a poté je promíchávání zastaveno a extrakt je ponechán stát při stejné teplotě 35 až 36°C po dobu 30 minut. Poté je provedeno nové naředění (5 krát) a rychlost je zvýšena, aby dosáhla 5000 otáček za minutu, teplota je zvýšena, aby dosáhla 42°C za 3 až 4 minuty. Kolagen má poté těstovitý charakter s viskozitou 17000 až 20000 cps. Teplota je poté zvýšena, aby dosáhla 44°C. Tyto podmínky jsou poté udržovány po dobu 30 sekund až jedné minuty, těstovitý kolagen se rychle zkapalňuje, získává kapalný vzhled, jeho viskozita se snižuje na 30 až 50 cps.

Zkapalněný kolagen je okamžitě přenesen do tlakového filtračního zařízení, které bylo předem sterilizováno teplem, a které je vybaveno dvojitým krytem s cirkulací vody, což umožňuje udržet teplotu 42 až 45°C. Extrakt je poté pečlivě zfiltrován přes dvě sterilní filtrační membrány, první s porozitou 0,45 um a druhá s porozitou 0,22 um. Filtrát je sbírán do tlakové nádobky vybavené dvojitým krytem, při udržování teploty na 42 až 45°C. Filtrát je poté podroben absolutní filtraci přes membránu s porozitou 0,22 um.

Získaný kolagen je sterilní, jak je potvrzeno bakteriologickými testy podle Evropského lékopisu.

Navíc analýzy provedené před, během a po mechanickém a tepelném zpracování takto získaného kolagenu ukazují, že aminokyselinové složení zůstává nezměněno. Navíc nejsou na polyakrylamidovém gelu detekovány žádné polypeptidy o molekulové váze nižší než 95000 Da • · • · « * · S

(Obrázky 1 a 2). Poměr a₂ (I) (I) ₂ je 0,49, t j . kolagen obsahuje více než 95% kolagenu typu I.

Termografická analýza provedená diferenciální termografií (DSC) za pomoci modelu Delta-Series DSC7 od společnosti Perkin-Elmer během tepelného a mechanického zpracování při teplotě 40 až 50°C, potvrzuje zmizení denaturačního vrcholu kolagenu, což koresponduje se ztrátou trihelikální struktury molekuly. Avšak tato ztráta je pouze dočasná, protože po ochlazení kolagenu a jeho ustálení dochází ke znovuobjevení denaturačního vrcholu (Obrázky 3 a 4) . Toto je důkaz, že ztráta trihelikální struktury kolagenu během tepelného a mechanického zpracování ve shodě s předkládaným vynálezem je svým charakterem reverzibilní.

Tento soubor výsledků prokazuje, že jsou zachovány sekundární a terciární struktury, a tedy že takto připravený kolagen je v nativní formě.

Další hlavní charakteristiky a vlastnosti takto získaného kolagenu jsou následující:

- obsah vody: 95% vzhled: viskózní tekutina při teplotě vyšší než přibližně 38°C, lepkavá na dotek; pseudopevná kompaktní a homogenní gelová hmota při teplotě nižší než přibližně 38°C.

viskozita: 45 cps v tekuté formě

- celkový dusík: 17,9% hydroxyprolin: 12,8%

- bez tryptofanu, aminoglykanů a polypeptidů o molekulové váze menší než 95000 Da

- pH 5,5 lipidy:: méně než 1% popel síry: méně než 2%

Sterilní kolagen připravený právě popsaným způsobem je udržován při teplotě 42 až 45°C po omezenou dobu, aby mohl být rychle distribuován bez další úpravy do vhodných nádobek nebo balení, jako jsou například nádobky, injekční stříkačky, atd., nebo po smísení s dalšími aktivními látkami, jako jsou například srážlivé faktory, které byly v případě potřeby předem sterilizovány.

Pokud je takto připravený kolagen používán samotný, vytváří adhezní materiál, které má vynikající hemostatické vlastnosti pro použití · · · v obecné, parenchymové, kardiovaskulární, hrudní, ortopedické, ORL, urologické, jaterní, viscerální a gynekologicko-porodnické chirurgii, v transplantační chirurgii a chirurgii kostní dřeně; v mikrochirurgii a v dalších lékařských oblastech vyžadujících účinek této medicinální aktivními látkami.

formy při možné kombinaci s dalšími

Je uchováván při pokojové teplotě, pří které se ustaluje.

Toto ho jasně odlišuje od dalších takzvaných biologických adhezív dostupných v současnosti na trhu, jako jsou například Tissucol⁰ od společnosti Immuno-AG, Rakousko, nebo Biocolle® od společnosti Laboratoires des Fractionnements et des Biotechnologies, Francie, jejichž suché formy je nezbytné skladovat při nízké teplotě, okolo + 4°C.

Adhezivum na bázi kolagenu podle předkládaného vynálezu by mělo být rekonstituováno na tekutou formu před svým použitím. K tomu je dostatečné jednoduše preparát zahřívat po dobu 2 až 3 minut, například v inkubátoru nebo ve vodní lázni při 40 až 45°C s následným pomalým manuálním promícháváním.

Proto ve srovnání s výše zmíněnými známými adhezívy má adhezivum na bázi kolagenu podle vynálezu kromě jiných výhodných vlastností čas přípravy, který je přibližně 10 krát kratší.

Jsou-li přítomny srážlivé faktory, jsou připraveny předem, před tím, než jsou přidány ke kolagenu, a to následujícím způsobem.

Množství trombinového nebo fibrinogenového prášku odpovídajícího 2IU/mg a 1 IU/mg kolagenu je přidáno do 40 mM roztoku chloridu vápenatého (tj . 1 ml kolagenu na 50 IU trombinu) a do vody pro injekce. Poté je provedena separátně filtrace přes absolutní filtrační membránu s porozitou 0,22 um.

Trombin nebo fibrinogen je poté přidán ke sterilnímu kolagenu, který byl předem neutralizován (pH 7,0), jak bylo zmíněno výše. Směs je homogenizována a distribuována.

Distribuce je prováděna pod tlakem, například za použití měřící pumpy, do vhodných nádobek, zejména do skleněných nádobek nebo injekčních stříkaček v případě biologického adhezivního preparátu;

• Λ

do teplem zatavených sáčků v případě náplastí, filmů nebo zvlhčujících masek, nebo alternativně do lyofilizačních destiček, aby bylo možno získat prášek, nebo pěnový preparát, atd., jak je popsáno výše.

Příklad 2: Sterilní tekutý biologický adhezivní preparát obsahující kolagen + trombin

Za použití produktu získaného v Příkladu 1 ve sterilní tekuté formě je připraven do skleněné nádobky preparát obsahující 2 ml 5% kolagenu a množství trombinu odpovídající 200 IU.

Při použití tohoto preparátu na hemoragický povrch dochází k jeho ustálení a adherenci k povrchu tkáně, což vede k uzavření léze nebo řezu a účinkuje jako kontaktní hemostatická látka, která zastavuje krvácení.

Příklad 3: Prášek obsahující sterilní kolagen + fibrinogen

Za použití produktu získaného v Příkladu 1 a po lyofilizaci a zpracování kolagenu zkombinovaného s fibrinogenem na sterilní práškovou formu, je distribuováno 360 mg kolagenu obsahujícího 700 IU fibrinogenu na jednu nádobku do sterilních polyetylénových nádobek.

Tento prášek, je-li aplikován sprejováním na hemoragický povrch, obzvláště v mikrochirurgii v oblastech s obtížným přístupem, umožňuje zastavení krvácení prostřednictvím jeho hemostatického účinku na vnitřní i zevní systém srážení krve a adherence na hemoragický povrch.

Příklad 4: Pěna obsahující sterilní kolagen + trombin ml sterilního tekutého kolagenu o 1% koncentraci, který byl získán v Příkladu 1 a poté neutralizován, je distribuováno do destiček nebo sáčků o velikosti 5x7 cm. Poté je provedena lyofilizace a destičky nebo sáčky jsou uzavřeny za aseptických podmínek. Tyto destičky nebo sáčky jsou poté baleny do sterilních dvojitých sáčků.

Takto připravená pěna umožňuje pokrýt oblast 35 cm² a odpovídá množství kolagenu 350 mg s 700 IU trombinu.

Pěnový preparát má rychlý hemostatický účinek, kdy dochází ke kombinaci účinku kolagenu s účinkem trombinu na mechanismus srážení krve a adherence na hemoragický povrch s významným mechanickým účinkem. Pro své film-vytvářející vlastnosti je možno tento preparát použít k pokrytí velkých hemoragických ploch.

Příklad 5: Náplast obsahující kolagen (pseudopevný + metronidazol

Sterilní antiinfekční látka metronidazol v tekuté formě je přidána do 2% kolagenu získaného z Příkladu 1 v tekuté formě při 42 až 45°C a neutralizovaného, jak je uvedeno výše v poměru 0,05 mg/mg suchého kolagenu.

Po ochlazení je kolagen, který je ve formě 1 mm tlustého, čirého a homogenního pseudopevného gelu, sterilizován zářením beta paprsky o intenzitě 2,5 Mrad, Laboratoires Caric Orsay, Francie.

Překvapivě je zjištěno, že se gel připravený z kolagenu ve shodě s předkládaným vynálezem netrhá, tj . neoodděluje do dvou fází, na rozdíl od konvenčních gelů podstupujících stejnou proceduru sterilizace zářením.

Je-li náplast aplikována na infekční ránu, má topický a ochranný účinek, funguje jako dezinfekční látka v důsledku přítomnosti a uvolňování metronidazolu.

Příklad 6. Atelopeptidový kolagen s polymerizující silou (varianta 1)

Za použití 10% extraktu purifikovaného kolagenu pocházejícího z čerstvých pštrosích Achillových šlach je proveden následující postup:

kolagen je naředěn přidáním 10² M kyseliny citrónové o pH 2,5 až do získání 1% koncentrace kolagenu

- je přidán pepsin; 1/10 w/w suchého kolagenu,

- je ponechán účinkovat při pokojové teplotě (20°C) po dobu 7 hodin, • ·

7. den je kolagen zneutralizován hydroxidem sodným (30%) na pH 7,2. Kolagen precipituje, nekolagenové proteiny a pepsinová rezidua, která zůstávají v roztoku jsou odstraněna centrifugaci s rotačním vysoušecím/dekantovacím zařízením, jako je například zařízení od společnosti Rousselet, referenční číslo RC40,

Peleta je promyta demineralizovanou vodou s následným rotačním vysušením, váha vody odpovídá desetinásobku váhy pelety a poté je získána kolagenová peleta ve formě vlhkých vláken,

Tento postup je třikrát zopakován za stejných podmínek, čímž dochází ke vzniku vláken kolagenu se 70% obsahem vody,

Peleta je solubilizována v 10”²M kyselině citrónové o pH 2,5,

Směs je homogenizována až do úplné solubilizace a je získán extrakt kolagenu o 10% koncentraci, který je čirý a má viskozitu 6000 cps,

Extrakt je přenesen do výše zmíněného mixéru s dvojitými podélnými noži a je pokračováno v postupu podle Příkladu 1, až je získán zhruba 5% kolagen.

Sterilní atelopeptidový nativní kolagen s polymerizující silou je formě čočky, jak již bylo obzvláště výhodný v oftalmologii a může být ve flexibilních membrán, nebo kapek/očních průplachů, popsáno výše. Navíc je obzvláště výhodná absence potencionálně imunogenních telopeptidů.

Příklad 7. Kolagenová pěna (varianta 2)

Pěna je připravena z pelety vlhkých vláken kolagenu s obsahem vody 70% při dodržení postupu podle varianty 2 popsané výše. Peleta je homogenizována a jemně promíchávána v purifikované vodě při teplotě +4°C po dobu 48 hodin. Po centrifugaci je peleta přenesena do roztoku 10~²M kyseliny citrónové (pH 2,5) při 2,5% koncentraci kolagenu. Po 24 hodinovém ustálení při teplotě 4°C je peleta přenesena do mixéru s dvojitými podélnými noži. Rychlost promíchávání a teplota se postupně zvyšují až do dosažení 2000 otáček za minutu a teploty 25°C. Extrakt je poté zfiltrován přes membránu o porozitě 0,22 um při teplotě 25°C.

Ke sterilnímu kolagenu je přidán benzalkonium chlorid v koncentraci 1,5 g/l tak, že koncentrace kolagenu činí 2,5%. Směs je promíchávána za pokojové teploty při zvyšujících se otáčkách od 500 otáček za minutu až po 2500 otáček za minutu, extrakt se zhušťuje, nabývá bílé barvy a takto je získána pěna ve shodě s předkládaným vynálezem.

• · · ·

Pěna je distribuována ve sprejích o obsahu 10 ml nebo více, volitelně vybavených katetrem, který umožňuje aplikaci v místech obtížně přístupných, jako je tomu například v mikrochirurgii.

Takto konzervovaná je pěna stabilní při skladování při pokojové teplotě po dobu alespoň 24 měsíců. V případě přítomnosti na teplo citlivých aktivních látek je preferováno udržovat skladovací teplotu takto vzniklé pěny při 4 až 10°C.

Tato pěna je s výhodou používána zejména v parenchymové a hrudní chirurgii. Je obzvláště užitečná pro udržení mezitkáňových a parenchymových prostor a zamezuje vzniku anatomicko-patologických adhezi mezi poškozenými tkáněmi.

Příklad 8. Stratifikované nebo jednovrstevné hemostatické pěny (varianta 2)

Pěny jsou produkovány z kolagenu získaného podle varianty 2 z Příkladu 7. Tento kolagen je sterilizován filtrací přes membránu s porozitou 0,22 um.

Aby bylo možno získat jednovrstevnou pěnu, která také obsahuje například srážlivý faktor, je proveden následující postup:

ml tekutého kolagenu o 1% koncentraci, který byl předem smíšen se sterilním trombinem (700 IU), nebo sterilním fibrinogenem (350 IU) a poté zneutralizován, je distribuováno do sáčků o velikosti 5x7 cm.

Každá z výše uvedených kombinací kolagenu (mrazící a resorpční teploty -25°C a respektive 35°C) jsou konvenčním způsobem a separátně zlyofilizovány.

Takto získaná pěna obsahující kolagen při neutrálním pH má prachový, lehce vláknitý vzhled a je bílá v přítomnosti fibrinogenu a krémové barvy v přítomnosti trombinu.

Tato pěna má hemostatický účinek, který vzniká v důsledku zevního i vnitřního účinku kolagenu na mechanismus srážení, který je dále podpořen hemostatickým účinkem srážlivých faktorů, zejména trombinu a fibrinogenu.

···: ·· ·· · : ::::

* 1 « ·······♦

33: : ........

.. ............

Navíc kolagen při neutrálním pH, jak je získán podle varianty 2, vykazuje pro svou nerozpustnost mechanický účinek na hemoragický povrch tkání, který srážlivé faktory samotné, pokud jsou použity v lyofilizované formě, nemají.

Navíc jak již bylo zmíněno výše je v takovém preparátu, který je ve shodě s předkládaným vynálezem, zcela zachována aktivita srážlivých faktorů na rozdíl od konvenčních preparátů (jako je například Tachocomb ^ÍR|, Hafslund, Nycomed, popsaný v dokumentu EP-A-59 265), v kterých jsou srážlivé faktory sterilizovány ionizujícím zářením a jsou proto částečně denaturovány.

Aby bylo možno získat startifikovanou pěnu, je proveden následující postup:

- 18 ml tekutého kolagenu o pH 5, který má 0,5% koncentraci, a který byl předem smíšen se sterilním trombinem (700 IU) a 1 ml 40 mM chloridu vápenatého, je distribuováno do sáčků o velikosti 5x7 cm a poté je provedeno mírné zamražení při teplotě -10°C. Poté je přidáno k první vrstvě 18 ml tekutého kolagenu o pH 5, který je předem smíšen s fibrinogenem (350 IU) a poté je opět provedeno mírné zamražení za stejných podmínek a k druhé vrstvě takto získané je přidána finální vrstva 1% tekutého kolagenu, který má neutrální pH.

- Nakonec je provedena lyofilizace tak, jak je popsáno výše v případě jednovrstevné pěny.

Takto je získána troj-vrstevná stratifikovaná pěna, která má následující zajímavé vlastnosti:

- po aplikaci je kolagen při kyselém pH okamžitě solubilizován uvolňujíce takto srážlivé faktory, které tvoří hemostatické adhezivum na hemoragickém povrchu, zevní vrstva při neutrálním pH vykazuje také mechanický účinek, podporujíce tak účinek hemostatického adheziva tím více, čím je hemoragická plocha větší.

Navíc tato pěna ve shodě s vynálezem má tu výhodu, že nevyžaduje před svým použitím žádnou přípravu.

Tento typ hemostatického preparátu je obzvláště vhodný v obecné, parenchymové, kardiovaskulární, hrudní, plastické, ortopedické, ORL, urologické, jaterní, viscerální, gynekologicko-porodnické a

3.4’

transplantační chirurgii, v chirurgii kostní dřeně, v mikrochirurgii a obecně v jakékoli oblasti vyžadující hemostatický účinek.

Příklad 9. Pěna + vankomycin (varianta 2)

Je proveden následující postup:

- Šest litrů 1,4% kolagenu získaného podle varianty 2 způsobu ve shodě s předkládaným vynálezem je přeneseno do sterilní nádoby a neutralizováno přidáním hydroxidu sodného.

Poté je přidán k roztoku hydrochlorid vankomycinu v koncentraci 42 g/l, který je udržován při pokojové teplotě při jednu hodinu trvající neutralizaci.

Poté je roztok homogenizován a s pomocí odměrné pumpy je výsledná směs přenesena přes filtrační membránu s porozitou 0,22 um do lyofilizační nádoby v množství 70 ml na 10 cm nádobu.

Poté je zahájen cyklus zamrazení na -25°C s následným cyklem sublimace a desorpce do teploty +35°C.

Sterilní pěna, která je 7 mm tlustá a která obsahuje kolagen v množství 8,4 mg kolagenu/cm² a 4,2 mg hyrochloridu vankomycinu/cm², nebo pěna o tloušťce 1 až 2 mm je nakonec získána vyvinutím automatického tlaku na povrch vrstev uvnitř lyofilizačního zařízení za účelem získání laminované pěny.

Pěna je nakonec balena do polyetylenových dvojitých sáčků opatřených tepelným svarem.

Identické pěny ve shodě s vynálezem jsou získány při použití gentamycinu, pefloxacinu nebo jiných antibiotik či antiinfekčních látek na místo vankomycinu.

Tyto pěnové preparáty, které lokálně a postupně uvolňují aktivní látku(y) jsou obzvláště užitečné v léčbě mnoha patologií, zejména kostních, viscerálních, traumatologických a chirurgických patologií, zejména v prevenci nebo v léčbě možných mikrobiálních kontaminací.

Tyto pěnové materiály obsahující kolagen ve shodě s předkládaným vynálezem mají kromě vynikající tolerance a biodegradability velkou výhodu v přítomnosti vankomycinu, který je sterilizován filtrací, jak je popsáno výše, čímž byla konzervována jeho aktivita, na rozdíl od konvenčních preparátů, v kterých je toto antibiotikum částečně denaturováno sterilizací ionizujícím zářením.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy kolagenu ze solubilizovaného a purifikovaného, volitelně pepsinizovaného extraktu nesterilního kolagenu, kterýžto způsob je charakterizován tím, že obsahuje kroky tvořené:

   (i) promícháváním a mixováním extraktu v mixéru s dvojitými podélnými noži při postupném zvyšování rychlosti otáčení, bez překročení rychlosti 10000 otáček z minutu, při teplotě od 2°C do 10°C, přednostně 3°C až 10°C tak, aby došlo ke zvýšení výchozí okolní teploty na kontrolovanou maximální teplotu, přednostně pod 50°C, a poté (ii) je provedena sterilizace tekutého média řečeného extraktu, čímž dochází k získání sterilního kolagenu v nativní formě.
2. 2. Způsob podle patentového nároku 1 bez pepsinizace solubilizovaného a purifikovaného extraktu, kterýžto způsob je charakterizován tím, že v kroku (i) je provedeno naředění extraktu v každé z řečených stádií, v kterých viskozita řečeného extraktu dosahuje zvolené vysoké hodnoty 15000 až 20000 cps a pokud je maximální teplota 42 až 44°C je řečený extrakt ponechán před krokem (ii) ustát.
3. 3. Způsob podle patentového nároku 1 a 2, který je charakterizován tím, že před krokem (ii) je řečený extrakt důkladně zfiltrován při řečené kontrolní maximální teplotě přes membrány o porozitě 0,45 um až 0,22 um.
4. 4. Způsob podle patentového nároku 1, kdy řečený solubilizovaný a purifikovaný extrakt je pepsinizován, kterýžto způsob je charakterizován tím, že v kroku (i) je maximální dosažená teplota 35°C, přednostně 25°C a rychlost promíchávání je od 1000 do 5000 otáček za minutu, přednostně 2500 otáček za minutu, vyčeřovací filtrace jsou provedeny kaskádovitě za použití membrán o různé porozitě do 0,45 um a poté je provedena diferenciální precipitace filtrátu pomocí chloridu sodného.
5. 5. Způsob nárokovaný v jakémkoli z patentových nároků 3 a 4 charakterizovaný tím, že v kroku (ii) je provedena úplná filtrace přes membránu o porozitě 0,22 um, nebo je extrakt sterilizován přidáním kyseliny peroctové.

   36:

   • ·
6. 6. Způsob nárokovaný v jakémkoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že obsahuje krok neutralizace řečeného extraktu před nebo po kroku (ii).
7. 7. Způsob nárokovaný v jakémkoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že kolagen je vláknitého typu, přednostně převážně typu I.
8. 8. Způsob nárokovaný v jakémkoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že extrakt kolagenu je získán z kůže, z pojivové tkáně, nebo z živočišných šlach, zejména z králičí kůže a pštrosích Achillových šlach.
9. 9. Nativní kolagen typu I, který může být získán způsobem nárokovaným v jakémkoli z patentových nároků 5 až 8, a který je charakterizovaný tím, že má následující charakteristiky a vlastnosti:

   poměr α_; (I) γ/cg (I) ₂ je 0,48 až 0,52 je sterilní podle standardů Evropského lékopisu celkový obsah dusíku: 17,0% až 18,7%

   - hydroxyprolin: od 12% do 13,9% bez tryptofanu, aminoglykanů a polypeptidů o molekulové váze menší než 95000 Da lipidy: méně než 1% popel síry: méně než 2%
10. 10. Farmaceutický a/nebo medicínsko-chirurgický a/nebo oftalmologický a/nebo kosmetický preparát obsahující kolagen, jak je nárokováno v patentovém nároku 9, a to buďto samotný, nebo v kombinaci s alespoň jednou další aktivní látkou.
11. 11. Preparát, jak je nárokován v předcházejícím patentovém nároku, charakterizovaný tím, že řečená další aktivní látka je vybrána ze skupiny obsahující srážlivé faktory, například trombin, antiinfekční látky, například metronidazol, antibiotika, zejména makrolidová, jako je například gentamycin, glykopeptidy, jako například vankomycin, fluorochinolony, jako je například pefloxacin, acylkarboxylové nebo oxikamové deriváty steroidních nebo nesteroidních protizánětlivých látek, růstové faktory, zejména kostní růstové faktory, jako je například somatotropin, a epidermální růstové faktory, jako je například EGF (epidermální růstový faktor), surfaktanty, zvlhčující a stabilizující látky a vitamíny.

    « ·

    Ž7
12. 12. Farmaceutický preparát, jak je charakterizován v jakémkoli z patentových nároků 10 a 11, charakterizovaný tím, že je zvolen ze skupiny obsahující gely, zejména injekční gely a pseudopevné gely, pěny, oční průplachy, jednovrstevné nebo stratifikované pěny, prášky, destičky nebo proužky, masky, spreje, filmy, spreje, filmy, membrány, plachty a vlákna, zejména pro šití.
13. 13. Použití kolagenu, jak je nárokováno v patentovém nároku 9, k výrobě preparátu zamýšleného k farmaceutické a/nebo parafarmaceutické a/nebo medicínsko/chirurgické a/nebo oftalmologické a/nebo kosmetické léčbě lidského nebo živočišného těla.