CZ149498A3

CZ149498A3 - Deriváty chinolinu, způsob jejich přípravy, farmaceutický prostředek, který je obsahuje, a jejich použití

Info

Publication number: CZ149498A3
Application number: CZ981494A
Authority: CZ
Inventors: Rainer Lüönd; Villar Esteban Pombo
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 1998-08-12
Also published as: CN1202170A; MX9803839A; HUP9903492A2; BR9611504A; TR199800851T2; CO4770973A1; EP0873338A1; KR19990067574A; SK63998A3; WO1997018208A1; JPH11515000A; HUP9903492A3; AU7570996A; CA2235126A1; PE17598A1; GB9523267D0; PL326636A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových derivátů chinolinu, způsobů jejich přípravy, jejich použití jako léčiv a farmaceutických prostředků, které je obsahují.

Podstata vynálezu

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že deriváty chinolinu substituované v poloze 8 benzo[c]thiadiazolylovým, benzo [c] furazanylovým nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolylovým zbytkem (které tvoří zcela novou skupinu sloučenin), vykazují velmi žádoucí a užitečné vlastnosti, jak jsou popsány níže, zejména dobrou účinnost při orálním podání, zlepšený profil z hlediska vedlejších účinků a výraznou selektivní inhibiční účinnost na PDE IV.

Tak podle nej širšího provedení vynález popisuje 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin ve volné formě, ve formě N-oxidu, adiční soli ^_ s kyselinou nebo amoniové soli. Tento 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin je popřípadě substituován na chinolinovém jádře, například v polohách 3 nebo/a 6. Mezi vhodné substituenty v poloze 3 patří alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, například methylová skupina, při jejíž přítomnosti se jedná o 3-alkyl-8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části. Substituenty v poloze 6 jsou výhodně navázány přes atom uhlíku, t.j. jedná se o 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)-6-karbochinolin nebo 8 -(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazo• · · · · · · · ·· ·· · · « · · · · · • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · • · · ·» · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ·· lyl)-3-alkyl-6-karbochinolin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části. Zejména výhodným substituentem v poloze 6 je pyridylmethylová skupina, například pyridin-4-ylmethylová skupina. Mezi výhodné sloučeniny tedy patří například 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]trihzolyl)-6-(pyridylmethyl)chinoliny nebo 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)-3-alkyl-6 -(pyridylmethyl)chinoliny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, ve volné formě, ve formě N-oxidu, adiční soli s kyselinou nebo amoniové soli.

je zbytek následují

Benzo[c]thiadiazolylovým zbytkem

2-methyl-2H-benzo[d]triazolylovým zbytek následujícího zbytkem je zbytek následujícího vzorce:

8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolinem podle vynálezu je výhodně sloučenina obecného vzorce I

*2 (I) ve kterém

X	představuje atom kyslíku, atom síry nebo skupinu -N(CH₃)- (výhodně atom kyslíku nebo atom síry),
Rx	znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku (výhodně methylovou skupinu nebo atom vodíku), a
r₂	představuje alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo pyridylovou skupinu (výhodně 4-pyridylovou skupinu),
ve	volné formě nebo ve formě N-oxidu nebo ve formě

farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo amoniové soli.

Vynález například zahrnuje sloučeniny obecného vzorce I, kde X představuje atom kyslíku nebo atom síry, R_x znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a R₂představuje alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo pyridylovou skupinu, ve formě volné báze nebo adiční soli s kyselinou.

8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolinem podle vynálezu je vhodně 8-(benzo[c]thiadiazol-3- nebo -4-yl)- nebo 8-(benzo [c]furazan-3- nebo -4-yl)- nebo 8-(2-methyl-2H-benzo[d]triazol-4·♦·· nebo -5-yl)chinolin, výhodně 8-(benzo[c]thiadiazol-4-yl)nebo 8-(benzo[c]furazan-4-yl)- nebo 8-(2-methyl-2H-benzo[d]triazol-4-5-yl)chinolin, například sloučenina obecného vzorce la:

Ir'

(la) ve kterém mají symboly X, R_x a R₂ výše definované významy, ve volné formě nebo ve formě N-oxidu nebo ve formě farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo amoniové soli.

Alkylové skupiny mohou být s rozvětveným nebo přímým řetězcem, výhodně s přímým řetězcem, přičemž výhodná je methylová skupina.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být ve volné formě nebo mohou být asociovány s kyselinou za vzniku adiční soli s kyselinou nebo s alkylhalogenidem za vzniku amoniové soli, nebo mohou být N-oxidovány, přičemž tyto různé formy molekuly jsou považovány za farmaceuticky užitečné. Mezi vhodné farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami pro použití podle vynálezu patří soli s anorganickými kyselinami, například hydrochloridy (soli s kyselinou chlorovodíkovou), a soli s organickými kyselinami, například hydrogenmaleináty (soli s kyselinou maleinovou), nebo oxaláty (soli s kyselinou šúavelovou). Sloučeniny podle vynálezu jsou ve formě amoniových solí a N-oxidů zejména pokud R₂ představuje pyridylovou skupinu, přičemž atom dusíku v pyridylovém kruhu je alkylován nebo oxidován, takže mezi amoniové soli patří například N-alkylované (například N-methylované) pyridiniové soli a mezi N-oxidy patří sloučeniny obecného vzorce I nebo

• ♦ · · · *

9· • 9999

99

9 9 9

Ia, kde R₂ představuje N-oxopyridylovou skupinu, například

1- oxopyridin-4-ylovou skupinu.

Podle dalšího provedení vynález popisuje způsob přípravy 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo

2- methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolinu, při kterém se (i) 3-Q- nebo 4-Q-benzo[c]thiadiazol, -benzo[c]furazan nebo -2-methyl-2H-benzo[d]triazol podrobí reakci s 8-Q'-chinolinem (například popřípadě 3-alkylsubstituovaným skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo/a 6-karbosubstituovaným), přičemž symboly Q a Q představují odstupující skupiny schopné podílet se na křížové reakci (například pokud jeden ze symbolů Q a Q představuje atom halogenu (například bromu) nebo trifluormethansulfonylovou skupinu, potom druhý z těchto symbolů znamená vhodné kovovou nebo organokovovou odstupuj ící skupinu (například skupinu B(OH)₂~, (CH₃ (CH₂) ₃) ₃Sn-, Li--, ClZn- nebo BrMg-), (ii) produkt se popřípadě N-alkyluje (například reakcí s alkylhalogenidem, například methyljodidem) nebo N-oxiduje (například reakcí s peroxidovým činidlem, například m-chlorperbenzoovou kyselinou), a takto získaná sloučenina se izoluje ve volné formě, ve formě N-oxidu nebo ve formě farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo amoniové soli.

Reakce se účelně provádí za přítomnosti katalyzátoru na bázi palladia nebo niklu, popřípadě za přidání dalších kovů, jako je měď, například v analogii se známými reakcemi při kterých dochází ke spojování arylových seskupení, například se Stillovou, Suzukiho, Negishiho nebo Heckovou reakcí, například jak je popsáno v příkladu 1. Takto získaný 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin lze izolovat a vyčistit pomocí standardních způsobů, například pomocí chromatografických • φφφφ φφ φφφφ ·· φφ φφ · φ φ φ φφφφ • φ · · φφφ φ φ φφ • φφφ φ φφ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ* φφ φφφ φφ φφ nebo krystalizačních postupů.

Sloučeniny obecného vzorce I nebo Ia například reakcí chinolinu obecného vzorce se

II vhodně připraví

ve kterém mají symboly představuje alkylovou benzo[c]thiadiazolem, výše definované významy, a Y atomy uhlíku, s nebo 2-methyl-2Hs 1 až

Ri a R₂skupinu benzo[c]furazanem

-benzo[d]triazolem obecného vzorce III

ve kterém má X výše definovaný atom jodu nebo skupinu SO₃CF₃, izoluje ve formě volné báze kyselinou.

význam a a takto nebo ve znamená atom bromu, získaná sloučenina se formě adiční soli s

II symbol Y výhodně představuje butylovou skupinu, například n-butylovou skupinu. Ve sloučeninách obecného atom bromu.

Ve sloučeninách obecného vzorce vzorce III symbol Z výhodně znamená

Výchozí pomocí známých sloučeniny způsobů ze vzorce II lze obecného sloučenin

vzorce

připravit

IV (IV)

R₂ výše definovaný ve kterém má obecného vzorce V význam, nebo sloučenin • 99 9 ·· ···· ·· ·· ·· 9 ··· · 9 9·

9 9 9 999 9999

99·· 99 99999

999 99 9 9 99

999 99 99 999 9999

R.
I
	1 ²		(V)
N
	Br
ve kterém ma j í symboly R_x	a R₂ výše	definované	významy.
Sloučeniny obecného vzorce	V lze	získat za	použití
2-Ri-akroleinu za přítomnosti	kyseliny. Pokud Ri znamená atom
vodíku, potom lze akrolein	připravit	in šitu	(syntéza

chinolinu podle Skraupa).

Sloučeniny obecných vzorců III a IV jsou známé nebo je lze připravit pomocí známých způsobů. Například sloučeninu obecného vzorce IV, ve kterém R₂ představuje pyridin-4-ylovou skupinu, lze připravit jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/22852.

Vynález ilustrují následující příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

8-(benzo[c]furazan-4-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

a) 8-brom-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

Sloučenina uvedená v názvu se získá Skraupovou syntézou chinolinu, jak popsal Manské R.H.F., Organic Reactions, 7, 59 (1953) za použití 2-brom-4-(pyridin-4-ylmethyl)fenylaminu (jako sloučeniny obecného vzorce IV).

R_f (silikagel, směs hexanu, ethylacetátu a ethanolu v poměru : 35 : 10): 0,25

Teplota tání produktu: 96 - 99° C.

b) 6-(pyridin-4-ylmethyl)-8-tributylstannylchinolin

2,5 g (8,36 mmol) 8-brom-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolinu, 5,33 g (9,2 mmol) hexabutyldistannanu a 485 mg ♦ ···

4444

4 4 44444

4 4444 4 444

4·· 4 ·· 4444·

4·44 ·444

444 44 444 4444 (0,42 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladia se suspenduje ve 40 ml toluenu, směs se zahřívá k varu pod zpětným chladičem v atmosféře argonu po dobu 24 hodin, a poté se reakční směs nechá vychladnout na teplotu místnosti -a zfiltruje se. Filtrát se naředí ethylacetátem, promyje se vodným uhličitanem sodným, vysuší se síranem sodným a odpaří, za vzniku žlutého oleje, který se poté chromatograficky zpracuje na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 2 : 1 jako elučního činidla, čímž se získá produkt uvedený v názvu ve formě žlutého oleje.

R_f. (silikagel, směs hexanu a ethylacetátu v poměru 2 : 1) :

0,18

Hmotová spektrometrie (ionizace rychlými neutrálními částicemi - fast atom bombardment (FAB)): 510 (MH+)

c) 8 -(benzo[c]furazan-4-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

Suspenze 420 mg (2,1 mmol) 4-brombenzo[c]furazanu, 1,0 g (1,96 mmol) 8-tributylstannyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolinu a 20 mg (0,017 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladia v 15 ml dimethylformamidu se zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu 8 hodin, poté se směs nechá vychladnout, naředí se ethylacetátem a extrahuje se vodnou kyselinou chlorovodíkovou. Smíchané vodné extrakty se zalkalizují vodným uhličitanem sodným, a extrahují se ethylacetátem. Organické extrakty se vysuší síranem sodným, čímž se získá hnědý olej, ze kterého krystaluje sloučenina uvedená v názvu. Teplota tání produktu činí 154 - 157° C.

Hmotová spektrometrie (FAB): 339 (MH+)

Příklad 2

8-(benzo[c]thiadiazol-4-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

Sloučenina uvedená v názvu se získá analogickým způsobem jako je popsán v příkladu lc), s tím rozdílem, že se ♦ · • ··· použije 4-brombenzo[c]thiadiazol. Hydrochlorid produktu vykazuje teplotu tání 150 - 155° C.

Hmotová spektrometrie (FAB): 391 (MH+)

Příklad 3

6-(pyridin-4-ylmethyl)-8-(benzo[c]furazan-3-yl)chinolin

Sloučenina uvedená v názvu se získá analogickým způsobem jako je popsán v příkladu lc), s tím rozdílem, že se použije 3-brombenzo[c]furazan. Teplota tání produktu činí 183 - 188° C.

Hmotová spektrometrie (FAB): 339 (MH+)

Příklad 4

8-(benzo[c]furazan-4-yl)-3-methyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

a) 8-brom-3-methyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

Roztok 6,0 g (22,8 mmol) 2-brom-4-(pyridin-4-ylmethyl)fenylaminu, 4,3 g (22,8 mmol) p-toluensulfonové kyseliny a 20,0 ml (228 mmol) methakroleinu ve 200 ml toluenu se zahřívá k varu pod zpětným chladičem, v zařízení vybaveném Dean-Starkovou aparaturou, po dobu 8 hodin. Reakční směs se nechá vychladnout přes noc a toluen se oddekantuje. Pryskyřičný zbytek se míchá se 150 ml dichlormethanu a 80 ml nasyceného vodného roztoku uhličitanu draselného, až se rozpustí. Organická fáze se oddělí a promyje se 50 ml roztoku chloridu sodného. Vodná fáze se extrahuje dvakrát vždy 50 ml dichlormethanu. Smíchané organické extrakty se vysuší síranem hořečnatým a odpaří, čímž se získá hnědý olej. Produkt se chromatograficky izoluje na silikagelu za použití směsi hexanu, ethylacetátu a ethanolu v poměru 65 : 35 : 10 jako elučního činidla, přičemž R_f produktu činí 0,25. Produkt se získá ve formě krystalické pevné látky o teplotě tání 108 až » ·«·· 4 * *»*« 44 44 • · · · · · e · **

4 4 4444 4444

4·· 4 44 44444

444 · 4 4444 _ ₁₀ _ ..............

109° C.

Hmotová spektrometrie (chemická ionizace (Cl), C₂H₅) :313,

315 (100, MH+)

b) 3-methyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)-8-tributylstannyl- chinolin

Sloučenina uvedená v názvu se připraví ze 3-methyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)-8-bromchinolinu analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 1b). Produktem je žlutý olej.

R_f (silikagel, směs hexanu, ethylacetátu a ethanolu v poměru : 35 : 10): 0,5

Hmotová spektrometrie (FAB): 523 (M+)

c) 8-(benzo[c]furazan-4-yl)-3-methyl-6-(pyridin-4-yl- methyl)chinolin

Sloučenina uvedená v názvu se získá z 3-methyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)-8-tributylstannylchinolinu a 4-brombenzo[c]furazanu analogickým způsobem jako je popsán v příkladu lc).

Hmotová spektrometrie (ionizace nárazem elektronů - electron impact (El)): 352 (MH+)

Teplota tání produktu: 193 - 194° C

Příklad 5

8-(benzo[c]thiadiazol-4-yl)-3-methyl-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

Sloučenina uvedená v názvu se získá analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 4, s tím rozdílem, že se použije 4-brombenzo[c]thiadiazol.

Hmotová spektrometrie (El): 367 (100, (M-H)+), 276

Hydrogenmaleinát produktu vykazuje teplotu tání 147 až 148° C.

Příklad 6

8-(2-methyl-2H-benzo[d]triazol-5-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

a) 5-brom-2-methyl-2H-benzotriazol (Sandmeyerova reakce)

K 1,64 g (11 mmol) 5-amino-2-methyl-2H-benzo[d]triazolu (Eur. J. Med. Chem. 1992, 161) se ve 30 ml koncentrované kyseliny sírové při teplotě 10° C přidá 830 mg (12 mmol) dusitanu sodného. Po uplynutí 30 minut se tento roztok při teplotě 5° C přidá k 1,66 g (11,6 mmol) bromidu měďného v 9 ml 48% kyseliny bromovodíkové a 9 ml vody, a poté se směs zahřívá po dobu 15 minut na teplotu 90° C. Po extrakci ethylacetátem se surový olej podrobí velmi rychlé chromatografii na silikagelu za použití směsi hexanů a ethylacetátu v poměru 2 : 1 jako elučního činidla. 5-brom-2-methyl-2H-benzo [d]triazol krystaluje ve formě bíložlutých jehliček o teplotě tání 51 - 54° C.

^-NMR (perdeuterodimethylsulfoxid) : 8,25 (s, 1H) , 7,93 (d,

1H), 7,55 (d, 1H), 4,50 (s, 3H)

b) 2-methyl-2H-benzo[d]triazol-5-boronová kyselina

500 mg (2,4 mmol) 5-brom-2-methyl-2H-benzo[d]triazolu a 500 mg (2,6 mmol) triisopropylborátu se při teplotě -78° C rozpustí ve 20 ml tetrahydrofuranu a přidá se 1,6 ml (2,6 mmol) n-butyllithia v hexanech. Reakční směs se míchá po dobu 3 0 minut při teplotě -78° C a poté po dobu 3 hodin při teplotě místnosti. K reakční směsi se přidá 20 ml vody, směs se okyselí 4N kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje se třikrát vždy 50 ml ethylacetátu. Organická fáze se vysuší nad síranem sodným, zfiltruje se a odpaří, čímž se získá sloučenina uvedená v názvu ve formě bílé pevné látky o teplotě tání více než 260° C.

^-NMR (perdeuterodimethylsulfoxid): 8,39 (s, 1H) , 8,24 (s,

2H), 7,88 - 7,75 (AB-systém, 2H), 4,51 (s, 3H)

c) 8-(2-methyl-2H-benzo[d]triazol-5-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin

240 mg (1,36 mmol) 2-methyl-2H-benzo[d]triazol-5-boronové kyseliny a 470 mg (1,56 mmol) 8-brom-6-(4-mehylpyridyl)chinolinu se při teplotě 90° C po dobu 20 hodin udržuje ve 40 ml toluenu za přítomnosti 12 mg palladiumdiacetátu, 17 mg tri(o-tolyl)fosfinu, 1,8 ml 2M roztoku uhličitanu sodného a 0,5 ml ethanolu. Studená reakční směs se zfiltruje, naředí se 80 ml roztoku chloridu sodného a extrahuje se třikrát vždy 50 ml ethylacetátu, vysuší se nad síranem sodným, .zfiltruje se a odpaří. Surový produkt se vyčistí na silikagelu za použití ethylacetátu jako elučního činidla, čímž se získá nažloutlý olej. Teplota tání oxalátu produktu činí 98 - 103° C.

¹H-NMR (deuterochloroform,	volná báze):	8,91	(dd,	1H) ,	8,55
(d, 2H) , 8,18	(dd,	1H) ,	8,08 (s,	1H) ,	7,92	(d,	1H) ,
7,71 (dd, 1H) ,	7,62	(s,	2H) , 7,42	(dd,	1H) ,	7,20	(d,

2H), 4,53 (s, 3H), 4,20 (s, 2H)

Hmotová spektrometrie (El) : 351 (70, M+) , 350 (100), 259 (64)

Analýza pro C₂₄H₁₉N₅O₄:

vypočteno:	65,29	%	c,	4,30	%	H,	15,86	% N;
nalezeno:	65,17	%	c,	4,61	%	H,	15,84	% N.

8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinoliny, například obecného vzorce I nebo Ia, a zejména sloučeniny z výše uvedených příkladů, ve volné formě, ve formě N-oxidu, farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo amoniové soli, dále označované ··«· ·· ····

- 13 ·· ·· • f · · · · « » ·4 « · 4 · ··♦···· • · · · 4 4 4 ··»··

4 4 4 4 · * ·4

4·· 44 44 ··· «444 jako činidla podle vynálezu, vykazují farmakologickou účinnost a jsou použitelné jako léčiva, například pro použití k léčení onemocnění a stavů uvedených dále.

Činidla podle vynálezu jsou selektivními inhibitory isoenzymové rodiny cAMP-fosfodiesterasy typu IV, a vykazují relativně malý účinek na fosfodiesterasové isoenzymy typů I, II, III a V. V důsledku toho lze činidla podle vynálezu použít v případě stavů, u kterých je vhodné zvýšení hladin cAMP pomocí selektivní inhibice fosfodiesterasových isoenzymů typu IV. Jelikož zvýšení hladin cAMP v zánětlivých buňkách, jako jsou eosinofily, inhibuje jejich aktivaci, jsou činidla podle vynálezu vhodná pro použití u zánětlivých stavů, při kterém hraje roli aktivace eosinofilů.

Činidla podle vynálezu jsou v důsledku svého inhibičního účinku na fosfodiesterasu typu IV v lidských eosinofilech vhodné k léčení atopického a neatopického astmatu, jak dokládají níže popsané modely inhibice PDE (fosfodiesterasy), inhibice aktivace eosinofilů a bronchodilatační modely.

Inhibice isoenzymů PDE

Schopnost sloučenin podle vynálezu selektivně inhibovat cAMP-fosfodiesterasu (PDE) typu IV demonstruje následující test:

Test inhibice lidské fosfodiesterasy

Všechny preparáty isoenzymů se získají z lidských zdrojů. Preparáty typu III a IV se získají s využitím toho, že v destičkách převládají isoenzymy typu III a v neutrofilech isoenzymy typu IV, pomocí následujícího postupu:

Odebere se lidská krev, ošetří se citrátem, a neutrofily se oddělí dextranovou sedimentací, centrifugací podle hustotního gradientu na směsi Histopaque 1077 a 1119, s φφφφ

- 14 • φ

φ φ • ΦΦ

ΦΦ φφφφ • φ • ···

ΦΦ ΦΦ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φ • φ φ «φ ΦΦ konečnou hustotou 1,089 g/1 a hypotonickou lýzou erythrocytů. Lidské destičky ze stejného zdroje se promyjí PBS (fosfátem pufrovaným solným roztokem, o složení: 140 mM chloridu sodného, 2,7 mM chloridu draselného, 1,5 mM dihydrogenfosforečnanu draselného a 8,1 mM hydrogenfosforečnanu sodného, pH 7,4). Neutrofily a destičky se suspendují v 10 ml pufru (0,24 M sacharosy, 1 mM EDTA (kyseliny ethylendiamintetraoctové), 1 mM dithiothreitolu a 10 mM tris-HCl (tris = = tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH 7,4), který obsahuje následující roztoky inhibitorů proteas: roztok fenylmethylsulfonylfluoridu v koncentraci 5 μΐ/ml (7 mg/ml v 2-propanolu), roztoky lepeptinu a pepstatinu A v koncentraci 1 μΐ/ml (vždy 1 mg/ml v ethanolu) . Po sonikaci po dobu 15 sekund při teplotě 4° C za použití sonikátoru pro sonikaci vzorků se homogenáty centrifugují při 2200 g. Peleta se resuspenduje v 10 ml pufru a sonikace se opakuje. Smíchané supernatanty se skladují při teplotě -20° C.

Další isoenzymy se částečně purifikují za použití chromatografických postupů, které jsou popsány v oboru (typy I a V z lidských plicních buněk, a typ II z lidských destiček). Aktivita PDE (fosfodiesteras) se testuje za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky při různých koncentracích pomocí metody na iontoměničové koloně, jak ji popsali Thompson a kol., Nucleotide Res., 10., 69 - 92 (1979), za použití 1 μΜ [³H] -cyklického AMP jako substrátu (typy III a IV) nebo 0,5 μΜ kalcia, 0,125 μΜ kalmodulinu a 1,0 μΜ [³H] -cyklického AMP (typ I) nebo 100 μΜ [³H] -cyklického AMP (typ II) nebo 1,0 μΜ [³H]-cyklického GMP (typ V).

V tomto testu inhibují činidla podle vynálezu převážně isoenzymy PDE typu IV, přičemž vykazují relativně malý účinek na typy I, II, III a V. V rámci isotypu PDE IV se činidla podle vynálezu dále vyznačují selektivitou vůči PDE IV D, přičemž napřilad sloučenina z příkladu 2 inhibuje PDE IV D v nižších než nanomolárních koncentracích.

• · • · · · ·· · · • · ·· ··

Protizánětlivá účinnost

Inhibice aktivace eosinofilů

Neatopickým laboratorním pracovníkům se odeberou vzorky krve o objemu 50 ml, ve kterých se počty eosinofilů pohybují mezi 0,06 a 0,47 x 10⁹ l'¹ (Microcellcounter F300, Sysmex) . Žilní krev se odebere do centrifugačních kyvet obsahujících 5 ml 3,8% trinatriumacetátu (pH 7,4, Sigma).

Antikoagulačně ošetřená krev se naředí v poměru 1 : 1 (objem : objem) fosfátem pufrovaným solným roztokem (neobsahujícím ani vápník ani hořčík, Gibco) a v centrifugační kyvetě o objemu 50 ml (Falcon) se navrství na 15 ml isotonického Percollu (hustota 1,082 - 1,085 g/ml, pH 7,4,

Pharmacia). Po centrifugaci prováděné po dobu 30 minut při 1000 g a 20° C se jednojaderné buňky na rozhraní plazma/Percoll opatrně odsají a odstraní.

Peleta neutrofilů, eosinofilů a erythrocytů o objemu zhruba 5 ml se opatrně resuspenduje ve 35 ml isotonického roztoku chloridu amonného (155 mM chloridu amonného, 10 mM hydrogenuhličitanu draselného, 0,1 mM EDTA) o teplotě 0 až 4° C. Po uplynutí 15 minut se buňky dvakrát promyjí (10 minut, 400 g, teplota 4° C) v PBS (fosfátem pufrovaném solném roztoku) obsahujícím fetální telecí sérum (2 %, FCS, Gibco).

Pro separaci eosinofilů a neutrofilů se použije magnetický systém pro separaci buněk (Miltenyi Biotec). Tento systém je vyvinut pro separaci buněk v suspenzi podle povrchových markérů, a zahrnuje permanentní magnet, do kterého je umístěna kolona, která obsahuje magnetovatelnou ocelovou matrix. Před použitím se kolona ekvilibruje po dobu 1 hodiny s PBS/FCS a poté se zpětně propláchne ledově chladným PBS/FCS za použití stříkačky o objemu 20 ml. Na základnu kolony se napojí hypodermická jehla (21G) a touto jehlou se nechají odtéci 1 - 2 ml ledově chladného pufru.

Po centrifugaci granulocytů se odsaje supernatant a buňky se opatrně resuspendují se 100 μΐ magnetických částic (monoklonální protilátka anti-CD16, konjugovaná se superparamagnetickými částicemi firmou Miltenyi Biotec, SRN). Směs eosinofilů, neutrofilů a magnetických částic anti-CD16 se inkubuje na ledu po dobu 4 0 minut a poté se naředí na objem 5 ml ledově chladným PBS/FCS. Suspenze buněk se pomalu nanese na horní konec kolony a otevře se ventil, čímž se umožní pomalý pohyb buněk do ocelové matrix. Kolona se poté promyje 35 ml PBS/FCS, přičemž tento roztok se opatrně přidává na horní konec kolony tak, aby se nevířily magneticky značené neutrofily již zachycené v ocelové matrix. Neznačené eosinofily se izolují v centrifugační kyvetě o objemu 50 ml a promyjí se (10 minut, 400 g, teplota 4° C) . Výsledná peleta se resuspenduje v 5 ml Hankova vyváženého solného roztoku (HBSS), takže lze před použitím stanovit počet buněk a čistotu. Separační kolona se odstraní z magnetu a netrufilová frakce se vymyje. Kolona se poté promyje 50 ml PBS a absolutním ethanolem, a skladuje se při teplotě 4° C.

Celkový počet buněk se stanoví zařízením pro počítání buněk microcellcounter (Sysmex). Ke vzorku se přidá jedna kapka lýzovacího roztoku (Sysmex), a po uplynutí 30 sekund se znovu spočítá počet buněk, pro stanovení kontaminace erythrocyty. Provede se odstředění na přístroji Shandon Cytospin 2 cytospinner (vzorky o objemu 100 μΐ, 3 minuty při 500 otáčkách za minutu). Tyto preparáty se obarví (Diff, Quick, Baxter) a světelnou mikroskopií se stanoví diferenciální počty buněk, přičemž se zkoumá alespoň 500 buněk. Životaschopnost buněk se stanoví vylučováním trypanové modři.

Eosinofily se naředí v HBSS a pipetují se do mikrotitračních desek s 96 jamkami v množství 1 - 10 x 10³ buněk na jamku. Každá jamka obsahuje 200 μΐ vzorku, obsahujících:

100 μΐ suspenze eosinofilů, μΐ HBSS, • · • · · ·

μΐ lucigeninu, μΐ aktivačního stimulátoru, a μΐ testované sloučeniny

Vzorky se inkubují s testovanou sloučeninou nebo nosičem po dobu 10 minut před přidáním aktivačního stimulátoru fMLP (10 μΜ) rozpuštěného v dimethylsulfoxidu a poté naředěného pufrem, takže nejvyšší použitá koncentrace rozpouštědla činí 1 % (při 100 μΜ testované sloučeniny). Mikrotitrační desky se třepou na mixéru Titertek MTP (Flow) pro usnadnění promíchání buněk a média, a mikrotitrační desky se umístí do luminometru Hamamatsu. Po dobu 20 minut se současně měří celková chemiluminiscence a časový profil každé jamky, a výsledky se vyjádří v relativních jednotkách nebo jako procento chemiluminiscence indukované fMLP za nepřítomnosti testované sloučeniny. Výsledky se zpracují Hillovou rovnicí a automaticky se vypočítají hodnoty IC₅₀.

Činidla podle vynálezu jsou ve výše uvedeném testu účinná v koncentracích řádově od 0,0001 do 0,5 μΜ, v případě sloučenin uvedených v příkladech obecně řádově zhruba 1 nM. Například sloučenina z příkladu 2 vykazuje v tomto testu hodnotu IC₅₀ 1,9 nM, zatímco sloučenina z příkladu 4 vykazuje hodnotu IC₅₀ 0,71 nM.

Bronchodilatační účinnost

Relaxace lidské průdušky

Vzorky lidských plic vyjmutých během chirurgického zákroku z důvodu rakoviny se získají během 3 dnů po vyjmutí. Vyříznou se malé průdušky o vnitřním průměru zhruba 2 až 5 mm, rozřežou se na části a umístí se do ampulek pro skladování v tekutém dusíku o objemu 2 ml, naplněných fetálním telecím sérem (FCS), s obsahem 1,8 M dimethylsulfoxidu (DMSO) a 0,1 M sacharosy jako kryoprotektivních činidel. Ampulky se umístí do polystyrénové krabice o

rozměrech	11	x 11 x 22	cm	a	pomalu se mrazí	průměrnou
rychlostí	chlazení zhruba	0,6°	C/min v mrazícím	zařízení
chladícím	na	teplotu -70°	C.	Po	uplynutí 3-15	hodin se

ampulky přenesou do kapalného dusíku (teplota -196° C) , kde se skladují až do použití. Před použitím se tkáně vystaví na 3 0 - 60 minut působení teploty -70° C, a poté se roztaví během 2,5 minuty umístěním ampulí do vodní lázně o teplotě 37° C. Poté se části průdušek promyj í umístěním do misky obsahující Krebs-Henseleitův roztok (o složení: 118 mM chloridu sodného, 4,7 mM chloridu draselného, 1,2 mM síranu horečnatého, 1,2 mM chloridu vápenatého, 1,2 mM dihydrogenfosforečnanu draselného, 25 mM hydrogenuhličitanu sodného, 11 mM glukosy a 0,03 mM EDTA) o teplotě 37° C, nařežou se na kroužky a suspendují v orgánové lázni o objemu 10 ml pro měření isometrického tlaku, s předpětím zhruba 1 g. Kumulativním přidáváním se vytvoří křivky odpovědí na koncentraci, přičemž koncentrace se zvyšuje vždy v okamžiku, kdy bylo dosaženo maximálního účinku předchozí koncentrace. Na konci vytváření křivky odpovědí na koncentraci se přidá 300 μΜ papaverinu, pro vyvolání úplné relaxace kroužků průdušek. Tento účinek je považován za 100% relaxaci.

Ve výše uvedeném testu vyvolávají činidla podle vynálezu relaxaci kroužků lidských průdušek závisející na koncentraci při koncentracích od 0,001 do 1,0 μΜ.

Potlačení bombesinem indukované bronchokonstrikce

Samci morčat Dunkin-Hartley o hmotnosti 400 - 800 g, kteří měli před pokusem volný přístup k potravě a vodě, se anestetizují intraperitoneálním podáním natrium-fenobarbitalu v množství 100 mg/kg a rovněž intraperitoneálním podáním natrium-pentobarbitalu v množství 30 mg/kg, a poté se paralyzují intramuskulárním podáním gallaminu v množství 10 mg/kg. Zvířata, jejichž teplota se udržuje na 37° C pomocí zahřívané dečky, při řízení rektálním teploměrem, se ventilují tracheální kanylou (zhruba 8 ml/kg, 1 Hz) směsí vzduchu a kyslíku v poměru 45 : 55 (objem/objem). Ventilace se monitoruje na trachei pneumotachografem (Fleisch, typ 0000), napojeným na diferenciální transduktor tlaku (MP 4514871, Validyne, USA) spojený s respirační pumpou. Změny tlaku v hrudníku se přímo monitorují pomocí intrathorakální kanyly, za použití diferenciálního transduktoru tlaku (MP 4524, Validyne, USA), takže lze měřit a zobrazovat rozdíly v tlaku mezi tracheou a hrudníkem. Z těchto měření průtoku vzduchu a transpulmonálního tlaku se pro každý dýchací cyklus vypočítává pomocí digitálního elektronického analyzátoru respirace (PMS 300, Mumetd Ltd., Velká Británie) rezistence dýchacích cest (R_L, cmH₂0/l/s) a poddajnost (C_dyn) . Na krční tepně se měří krevní tlak a srdeční frekvence za použití transduktoru tlaku (P23Dd, Gould, USA).

Jakmile jsou hodnoty bazální rezistence a poddajnosti stálé, vyvolá se kontinuální intravenosní infuzí bcmbesinu v množství 100 ng/kg/min trvalá bronchokonstrikce. Bombesin se užívá rozpuštěný ve 100% ethanolu a naředění fosfátem pufrovaným solným roztokem.

Testované sloučeniny se podávají když je reakce na bombesin maximální a stabilní (zhruba 2 minuty po začátku infuze bcmbesinu) _. Působení proti bronchokonstrikci se stanovuje po dobu 1 hodiny po intratracheální nebo intraduodenální instilaci intravenosní bolusové injekce. Bronchospasmolytická účinnost se vyjádří jako % inhibice počáteční maximální rezistence (R_L) po infuzi bombesinu. Vypočítají se hodnoty ED₅₀, které představují dávku způsobující 50% redukci zvýšení rezistence vyvolané bombesinem. Trvání působení je definováno jako doba v minutách, po kterou je bronchokonstrikce snížena o 50 % nebo více. Účinky na krevní tlak a srdeční frekvenci jsou charakterizovány hodnotami ED₂₀, tedy dávkami, které snižují krevní tlak nebo srdeční frekvenci o 20 % (5 minut po podání).

Testované sloučeniny se podávají buď ve formě roztoků nebo, v případě intratracheální nebo intraduodenální instilace, rovněž ve formě vodných suspenzí obsahujících v případě nerozpustných sloučenin 0,5 % tragantu. Suspenze se sonikují před aplikací po dobu 5 minut pro dosažení malé velikosti částic.

Každé léčivo se testuje ve 2 až 4 různých dávkách (s počtem opakování (n) =3-4 pro každou dávku). Použije se adekvátní počet kontrol (5 - 6) .

Ve výše uvedeném testu vykazují činidla podle vynálezu výraznou bronchodilatační účinnost při dávkách řádově od 0,001 do 0,1 mg/kg (při intravenosním podání) nebo 0,1 až 5,0 mg/kg (při intraduodenálním podání).

V souladu s tím, co je uvedeno výše, jsou činidla podle vynálezu vhodná k léčení zánětlivých nebo obstruktivních onemocnění dýchacích cest nebo jiných stavů, které zahrnují obstrukci dýchacích cest. Zejména jsou vhodná k léčení bronchiálního astmatu.

Vzhledem k jejich protizánětlivé účinnosti, jejich vlivu na hyperreaktivitu dýchacích cest a jejich profilu vzhledem k inhibici isoenzymů PDE, zejména jejich působení jako selektivních inhibitorů typu IV, jsou činidla podle vynálezu vhodná k léčení, zejména profytaktickému léčení, obstruktivních a zánětlivých onemocnění dýchacích cest. Tak při kontinuálním a pravidelném podávání po delší dobu jsou činidla podle vynálezu vhodná k dosažení předem působící ochrany proti návratu bronchokonstrikce nebo jiného symptomatického ataku v důsledku obstruktivního nebo zánětlivého onemocnění dýchacích cest nebo ke kontrole, zmírnění nebo působení proti bazálnímu stavu takového onemocnění.

Vzhledem k jejich bronchodilatační účinnosti jsou činidla podle vynálezu vhodná jako bronchodilátory, například pro léčení chronické nebo akutní bronchokonstrice, například pro symptomatické léčení obstruktivního nebo zánětlivého

- 21 onemocnění dýchacích cest.

Rozumí se, že slovo léčení, jak je užíváno v popisu a nárocích ve vztahu k obstruktivním nebo zánětlivým onemocněním dýchacích cest, zahrnuje jak profylaktické tak symptomatické způsoby terapie.

V souladu s tím, co je uvedeno výše, vynález dále popisuje:

A. Způsob

a) léčení hyperreaktivity dýchacích cest,

b) vyvolání bronchodilatace, nebo zejména

c) léčení obstruktivního nebo zánětlivého onemocnění dýchacích cest, zejména astmatu, u pacienta, který takové léčení potřebuje, kterýžto způsob zahrnuje podání účinného množství činidla podle vynálezu uvedenému pacientovi.

Mezi obstruktivní nebo zánětlivá onemocnění dýchacích cest, kterých se vynález týká, patří astma, pneumokoniosa, chronická obstruktivní onemocnění dýchacích cest nebo chronická obstruktivní pulmonální onemocnění (COAD nebo COPD) a syndrom respirační tísně dospělců (adult respirátory distress syndrome, ARDS), jakož i exacerbace hyperreaktivity dýchacích cest v důsledku léčení jinými léčivy, například aspirinem nebo β-agonistou.

Vynález lze využít k léčení astmatu libovolného typu nebo původu, včetně vnitřního (intrinsic) a zejména vnějšího (extrinsic) astmatu. Lze jej využít k léčení alergického (atopického/lgE-zprostředkovaného) astmatu. Lze jej rovněž využít k léčení neatopického astmatu, včetně například bronchitického astmatu, cvičením vyvolaného astmatu nebo astmatu z povolání, astmatu v důsledku bakteriální infekce nebo jiných nealergických typů astmatu. Lze jej dále využít k léčení syndromu sípotu dětí (wheezy infant syndrome,

- 22 • ·· · dětského, počátečního astmatu).

Vynález lze využít k léčení pneumokoniosy libovolného typu nebo původu, včetně například aluminosy, anthraknosy, azbestosy, chalikosy, ptilosy, siderosy, silikosy, tobakosy a byssinosy.

Vynález lze využít k léčení chronických obstruktivních onemocnění dýchacích cest nebo chronických obstruktivních pulmonální onemocnění, včetně chronické bronchitidy, pulmonálního emfysemu nebo dusnosti s nimi související.

Vynález lze rovněž využít k léčení bronchidity libovolného typu nebo původu, včetně například akutní, arachidické, katarální, chronické, krupózní nebo ftinoidní bronchitidy atd.

Vzhledem k jejich účinnosti jako selektivních inhibitorů uvolňování TNF-α, jsou činidla podle vynálezu rovněž vhodná ke snižování nebo inhibici uvolňování TNF-a, například k léčení onemocnění nebo stavů, na kterých se podílí uvolňování TNF-α nebo při kterých hraje uvolňování TNF-α zprostředkující úlohu, například onemocnění nebo stavů jejichž etiologie zahrnuje chorobné, například nežádoucí, nadměrné nebo neregulované uvolňování TNF-α, zejména k léčení kachexie nebo endotoxického šoku a k léčení AIDS.

Způsob podle vynálezu lze využít k léčení kachexie související s chorobným uvolňováním TNF-α nebo chorobnými hladinami TNF-α v séru, libovolného původu, včetně kachexie v důsledku například bakteriální, virové nebo parazitární infekce, nebo výpadku nebo zhoršení humorální nebo jiné organické, například renální, funkce. Vynález lze využít například k léčení rakovinné, malarické a vermální kachexie, kachexie v důsledku dysfunkce hypofýzy, štítné žlázy nebo brzlíku, jakož i uremické kachexie. Vynález lze zejména využít k léčení kachexie související s AIDS, například kachexie v důsledku infekce HIV nebo související s infekcí

- 23 ···· • · · · · · • · • ·♦·

HIV.

Způsob podle vynálezu lze rovněž využít k léčení septického šoku, například šokových stavů v důsledku bakteriální infekce. V tomto ohledu je třeba uvést že vynález se týká způsobu léčení septického šoku, jakož i stavů které jsou důsledkem septického šoku nebo které jsou symptomy septického šoku, například ARDS (syndromu respirační tísně dospělců - adult respirátory distress syndrome).

Způsob podle vynálezu lze dále využít k léčení onemocnění, které je důsledkem infekce HIV, například AIDS, například ke zlepšení nebo kontrole rozvoje tohoto onemocnění.

Vzhledem k jejich profilu pokud jde o inhibici isoenzymů PDE nebo/a inhibici uvolňování TNF-α, jakož i k jejich imunosupresivní účinnosti, jsou činidla podle vynálezu rovněž vhodná jako imunosupresivní činidla, například k léčení autoimunitních onemocnění, zejména k léčení autoimunitních onemocnění, na kterých se podílí zánětlivé procesy, nebo která vykazují zánětlivou komponentu nebo etiologii, nebo jako protizánětlivá činidla k léčení zánětlivých onemocnění, zejména k léčení zánětlivých onemocnění na kterých se podílí autoimunitní reakce nebo která vykazují autoimunitní komponentu nebo etiologii.

Mezi příklady takových onemocnění, k jejichž léčení lze využít vynález, patří autoimunitní hematologické poruchy (například hemolytická anemie, aplastická anemie, anemie pouze červených krvinek a idiopatická thrombocytopenie), systémový lupus erythematosus, polychondritida, sklerodermie, Wegenerova granulomatosa, dermatomyositida, chronická aktivní hepatitida, myasthenia gravis, Steven-Johnsonův syndrom, idiopatická sprue, autoimunitní zánětlivá onemocnění střev (například ulcerativní kolitida a Crohnova nemoc), endokrinní oftalmopatie, Gravesova nemoc, sarkoidosa, alveolitida,

- 24 chronická hypersensitivní pneumonitida, roztroušená sklerosa, primární biliární cirhosa, juvenilní diabetes (diabetes mellitus typu I) , uveitida (anterior a posterior), suchá keratokonjunktivitida a vernální keratokonjunktivitida, intersticiální fibrosa plic, psoriatická artritida a glomerulonefritida (s nefrotickým syndromem či bez něho, například včetně idiopatického nefrotického syndromu nebo nefropatie s minimální změnou (minimal change nephropathy)), jakož i zánětlivá nebo/a hyperproliferativní onemocnění kůže, jako je psoriasa, atopická dermatitida, pemfigus a zejména kontaktní dermatitida, například alergická kontaktní dermatitida.

Činidla podle vynálezu jsou zejména vhodná k léčení artritidy a jiných revmatických nebo zánětlivých onemocnění, zejména k léčení revmatické artritidy.

Jako imunosupresiva jsou činidla podle vynálezu dále indikována pro použití k prevenci odmítnutí štěpů, například pro udržení alogenního orgánového transplantátu nebo podobně, například pokud jde o transplantát ledviny, jater, plíce, srdce, srdce a plíce, střeva, kostní dřeně, kůže nebo rohovky.

Vzhledem k jejich protizánětlivé účinnosti, zejména pokud jde o inhíbici aktivace eosinofilů, jsou činidla podle vynálezu rovněž vhodná k léčení poruch souvisejících s eosinofily, například eosinofilie, zejména poruch dýchacích cest souvisejících s eosinofily (například zahrnujících chorobnou eosinofilovou infiltraci pulmonálních tkání), včetně hypereosinofilie ovlivňující dýchací cesty nebo/a plíce, jakož i například poruch dýchacích cest souvisejících s eosinofil, které jsou důsledkem nebo průvodním jevem Lófflerova syndromu, eosinofilové pneumonie, parazitického (zejména metazoálního) napadení (včetně tropické eosinofilie) , bronchopulmonální aspergilosy, uzlovité polyarteriitidy (včetně Churg-Straussova syndromu), eosinofilového granulomu a s eosinofily souvisejících poruch ovlivňujících • ··· dýchací cesty, vyvolaných reakcí na léčiva (drogy).

Vzhledem k jejich schopnosti synergicky interagovat s imunosupresivy nebo/a protizánětlivými léčivými látkami jsou činidla podle vynálezu rovněž vhodná jako koterapeutická činidla pro použití v kombinaci s těmito léčivy, například jako činidla zesilující terapeutickou účinnost těchto léčiv nebo jako činidla snižující potřebné dávky nebo potenciální vedlejší účinky těchto léčiv. Mezi léčivé látky, se kterými lze vhodně společně podávat činidla podle vynálezu, patří například cyklopeptidová, cyklopeptolidová nebo makrolidová imunosupresiva nebo protizánětlivé látky, například léčiva patřící do skupiny cyklosporinů, například cyklosporiny A nebo G, dále látky jako tacrolimus (ronvěž známý jako FK 506), ascomycin a rapamycin, a jejich různé známé obdoby a deriváty, jakož i glukokortikosteroidová léčiva. Mezi onemocnění, při kterých lze takovou kombinační terapii (koterapii) použít, patří například jakákoli onemocnění nebo stavy, při kterých je potřeba léčení imunosupresivy· nebo protizánětlivými léčivy, například jak jsou uvedena výše. Činidla podle vynálezu jsou zejména vhodná pro použití v kombinační terapii jak je uvedena výše, například pro účely imunosupresivního, protizánětlivého nebo antiastmatického léčení, například pro dosažení úspory cyklosporinů, například cyklosporinů A, makrolidu nebo steroidu.

Vzhledem k jejich profilu pokud jde o inhibici isoenzymů PDE, zejména jejich profilu jako selektivních inhibitorů typu IV, jsou činidla podle vynálezu dále vhodná jako inhibitory PDE typu IV, například k léčení onemocnění zahrnujících ztrátu vápníku z tkáně, zejména degenerativních onemocnění kostí a kloubů zahrnujících ztrátu vápníku, zejména osteoporosy. V tomto ohledu jsou dále vhodná k léčení alergických zánětlivých onemocnění, jako je rhinitida, konjunktivitida, atopická dermatitida, kopřivka a gastrointestinální alergie; dále jako vasodilátory, například k « ·9 ♦

4 4 4

44·· •4 4

444

4 4

4

4444 léčení angíny, hypertenze, městnavého selhání srdce a demence v důsledku více infarktů; a k léčení jiných stavů při kterých je indikována inhibice PDE IV, například deprese a stavů a onemocnění vyznačujících se zhoršenou kognitivní funkcí, včetně Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci a mrtvice.

Účinnost na centrální nervový systém

Neuropatologie Parkinsonovy nemoci se vyznačuje degenerací dopaminergních neuronů v černé hmotě. Zvýšení hladin cAMP v dopaminergních neuronech zlepšuje jejich přežití v kultuře a chrání je před účinky neurotoxických činidel. Inhibitory fosfodiesterasy typu IV podle vynálezu snižují in vivo úbytek dopaminu indukovaný MPTP (l-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinem) v žíhaném tělese (corpus striatum) myší C57BL/6. Dále tyto inhibitory částečně -zabraňují redukci počtu neuronů pozitivních na tyrosin-hydroxyla.su, vyvolané toxinem.

Buněčná kultura, příjem dopaminu nebo MPP⁺ (l-methyl-4-fenylpyridiniového iontu) a přežití dopaminergních neuronů

Primární kultury obsahující dopaminergní neurony se připraví z ventrálního mesencefalonu krysího plodu E14 a příjem dopaminu' nebo MPP⁺ se měří způsobem, který popsali Hartikka a kol., J. Neurosci. Res., 32., 190 - 201, 1992. Kultivační jamka a průměru 15 mm obvykle obsahuje 6 x 10⁵neuronů. Příjem dopaminu nebo MPP⁺ se měří za použití tritiovaného dopaminu respektive MPP⁺ při koncentracích 50 nM (specifická aktivita 45 Ci/mmol, New England Nuclear). Přežití dopaminergních neuronů v kultuře se stanoví spočítáním neuronů pozitivních na tyrosin-hydroxylasu (TH⁺) , předem obarvených myší protilátkou proti tyrosin-hydroxylase (Boehringer Mannheim).

Myši injikované MPTP

Myším C57BL/6 se subkutánně injikuje MPTP nebo • ·Φ ·

- 27 fyziologický roztok. Druhá a v některých pokusech třetí injekce MPTP následuje o dvě a čtyři hodiny později. V čase 0, 2 a 4 hodiny se myším orálně podá testovaná sloučenina ve fyziologickém roztoku nebo stejný objem samotného fyziologického roztoku. O sedm dnů později se zvířata usmrtí dekapitací a pomocí HPLC se stanoví monoaminy (Schneider a kol., Science 256, 843 - 846 (1992) ) nebo se imunocytochemicky vyšetří mozky na přítomnosti tyrosin-hydroxylasy (TH). Za tímto účelem se myši intrakardiálně perfundují 4% paraformaldehydem a celé mozky se dále fixuje přes noc ve studeném 4% paraformaldehydu. Z oblasti středního mozku se vyříznou kryosekce (40 /zrn), blokují se z důvodů endogenních peroxidas po dobu 15 minut 0,3% peroxidem v methanolu a štěpí se 0,1% trypsinem v PBS (fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku) po dobu 10 minut.

Potě se provádí po dobu 48 hodin při teplotě 4°' C inkubace s polyklonálním králičím antisérem proti tyrosin-hydíOxylase (Eugene Těch. International lne., New Jersey), naředěným v poměru 1 : 50 v PBS s 2 % kozího séra a 0,2 % přípravku Triton-X. Kryosekce se dále vyvíjejí za použití soupravy Vectastain Elitě ABC Kit (Vector Laboratories, CA, USA) a zesílení diaminobenzidinem nikelnatým (DAB). Před reakcí s DAB se sekce inkubují po dobu 10 minut v 2% síranem nikelnatým v 0,lM Tris-HCl o pH 7,4. Tento roztok se odstraní a nahradí 0,05% DAB, 0,2% síranem nikelnatým a 0,3% peroxidem vodíku v 0,1M Tris.

Činidla podle vynálezu jsou v tomto testu účinná. Například myši injikované MPTP, kterým byla perorálně podána sloučenina z příkladu 2 v dávce 4 mg/kg v čase 0, 2 a 4 hodiny, vykazují hladiny dopaminu o 25 % vyšší než jaké byly zjištěny u neošetřených kontrol. Činidla podle vynálezu lze tudíž použít k inhibici ztráty dopaminu a zvýšení hladin dopaminu, a jsou tedy vhodná například k léčení Parkinsonovy nemoci.

- 28 Činidla podle vynálezu dále podporují přežití noradrenergních jakož i serotoninergních neuronů v kultuře. Činidla podle vynálezu jsou tudíž vhodná k léčení neurodegenerativních onemocnění.

Mezi taková neurodegenerativní onemocnění patří primární degenerativní demence, například senilní demence, zejména senilní demence Alzheimerova typu, jakož i senilní mentální pokles, například senilní kognitivní pokles, a stavy zmatenosti u starších pacientů.

Činidla podle vynálezu dále zlepšují přežití motorických neuronů a senzorických neuronů v kultuře a potlačují expresi nádorových nekrotických faktorů (tumor necrosis factors).

Činidla podle vynálezu jsou proto vhodná k léčení roztroušené sklerosy, amyotrofní laterální sklerosy a jiných onemocnění motorických neuronů nebo autoimunitních onemocnění .

Navíc po injekci činidel podle vynálezu do myší jsou poměry DOPAC/dopamin jakož i 5-HIAA/serotonin v žíhaném tělese (corpus striatum) zvyšovány s faktorem 2 respektive 1,5. Činidla podle vynálezu jsou tudíž vhodná k léčení deprese.

V souladu s tím, co je uvedeno výše, vynález dále popisuje:

B. Způsob

a) snižování nebo inhibice uvolňování TNF-a,

b) inhibice aktivity isoenzymu PDE IV,

c) provádění imunosuprese,

d) léčení zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění nebo stavů,

e) léčení deprese nebo stavů nebo onemocnění vyznačujících se zhoršenou kognitivní funkcí, včetně « ·Μ

- 29 Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci a mrtvice, nebo

f) léčení libovolného konkrétního stavu nebo onemocnění, jak jsou popsána výše, u pacienta, který takové léčení potřebuje, kterýžto způsob zahrnuje podání účinného množství činidla podle vynálezu uvedenému pacientovi.

Vynález rovněž popisuje:

C. Činidlo podle vynálezu pro použití jako léčivo, například pro použití při libovolném způsobu nebo k léčení libovolného onemocnění nebo stavu, jak jsou popsány výše, například jak jsou definovány výše poid body A nebo B, a

D. Farmaceutický prostředek, který obsahuje činidlo podle vynálezu, popřípadě v kombinaci nebo ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem pro toto činidlo, například pro použití při libovolném způsobu popsaném výše, například jak je definován výše pod bodem A nebo B, například farmaceutický prostředek v inhalovatelné formě nebo v orální dávkovači formě.

Dávky používané při využívání vynálezu se budou samozřejmě lišit v závislosti například na konkrétním léčeném onemocnění nebo stavu, konkrétním činidle podle vynálezu, které se používá, způsobu podání a požadovaném účinku. Obecně se však indikuje, že se uspokojivých výsledků, například při léčení obstruktuvního nebo zánětlivého onemocnění, například při léčení astmatu, dosáhne při dávkách řádově od zhruba 0,01 do 2,0 mg/kg při perorálním podání. U větších savců, například lidí, bude indikovaná denní dávka pro orální podání, při léčení hyperreaktivity dýchacích cest nebo při léčení zánětlivých stavů při obstruktivním nebo zánětlivém onemocnění dýchacích cest, v rozmezí od zhruba 0,75 do

150 mg, přičemž podání se vhodně provádí jedenkrát denně nebo

····	·#	9···	··		ar
a	• ·	•	• ·	•	a
w	• *	···	• a		aa
• ·	• ·	•	• ·♦·		•
• ·	• ·	•	a	•	•
• 9»	• a	a··	• a		a·

- 30 v dělených dávkách dva- až čtyřikrát denně nebo ve formě s postupným uvolňováním účinné látky. Jednotkové dávkovači formy pro orální podány tedy vhodně obsahují od zhruba 0,2 do 75 nebo 150 mg, například od zhruba 0,2 nebo 2,0 do 50, 75 nebo 100 mg činidel podle vynálezu, spolu s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

Pro použití k léčení chronického nebo obstruktivního onemocnění dýchacích cest, například astmatu, lze činidla podle vynálezu rovněž podávat inhalací. Používané dávky se budou rovněž lišit například v závislosti například na konkrétním onemocnění nebo stavu, konkrétním činidle podle vynálezu, které se používá, konkrétním způsobu podání (například zda se aplikace provádí inhalací suchého prášku nebo jinak) a požadovaném účinku. Obecně však indikovaná inhalovaná denní dávka bude řádově od zhruba 2,5 do zhruba 13 0,0 /zg/kg/den, například od zhruba 13,0 do zhruba 60,0 /zg/kg/den. V případě větších savců, například lidí, bude indikovaná denní dávka pro inhalační podání, například k léčení astmatu, v rozmezí od zhruba 0,2 do zhruba 10,0 mg, například od zhruba 1 do zhruba 5 mg, přičemž aplikace se vhodně provádí jedenkrát denně nebo dvěma nebo třemi oddělenými podáními během dne. Odpovídající dávka pro každé podání tak bude řádově od zhruba 200 μ$ do zhruba 3,3 mg, při podávání až třikrát denně, přičemž vhodně se podání provádí pomocí inhalačního zařízení na suchý prášek sérií dvou až osmi aplikací při každém podání.

Podobně se indikuje, že uspokojivých výsledků při léčení Parkinsonovy nemoci a jiných neurodegenerativních onemocnění, onemocnění motorických neuronů nebo autoimunitních onemocnění, jako jsou onemocnění uvedená výše, a deprese, se dosáhne při použití dávek řádově od zhruba 0,5 do 5,0 mg/kg perorálně. U větších savců, například lidí, bude indikovaná denní dávka pro orální podání, při léčení uvedených neurodegenerativních onemocnění a deprese, v • ·

• · rozmezí od zhruba 40 do 400 mg, přičemž podání se vhodně provádí jedenkrát denně nebo v dělených dávkách dva- až čtyřikrát denně nebo ve formě s postupným uvolňováním účinné látky. Jednotkové dávkovači formy pro orální podány tedy vhodně obsahují od zhruba 10 do 200 nebo 400 mg činidel podle vynálezu, spolu s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

Činidla podle vynálezu lze rovněž podávat libovolným jiným vhodným způsobem, například infuzí, například při léčení septického šoku; nasálně, například při léčení rhinitidy; okulárně, například při léčení autoimunitních onemocnění očí; dermálně, t.j. místně na kůži, například při léčení dermatosy nebo psoriasy; nebo rektálně, například pomocí klystýru nebo čípků, například při léčení zánětlivého onemocnění střev. Vhodné dávky pro aplikaci pomocí těchto způsobů budou obecně nižší, například řádově desetkrát až stokrát nižší, než dávky nutné při orálním podání.

Farmaceutické prostředky obsahující činidla podle vynálezu lze připravit za použití běžných ředidel nebo nosných a pomocných činidel, jak jsou v oboru známá, a pomocí libovolného z postupů známých v iboru vytváření farmaceutických prostředků. Tak mezi orální dávkovači formy mohou patřit tablety, kapsle a podobně. Prostředky pro inhalaci mohou obsahovat aerosol nebo jiné atomizovatelné formulace, jakož i inhalovatelné suché prášky, přičemž může ale nemusí být přítomno ředidlo, pro podání pomocí libovolného vhodného inhalačního systému na suchý prášek, jak jsou v oboru známy. Formulace pro dermální podání mohou být ve formě krémů, mastí, gelů, nebo transdermálních aplikačních systémů, npaříklad náplastí, a kormě inertních ředidel nebo nosičů mohou vhodně obsahovat činidla zvyšující penetraci kůží, jak jsou rovněž známá v oboru.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo [c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin ve - volné formě, ve formě N-oxidu nebo farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo amoniové soli.

benzo[c]furazanyl nebo podle nároku 1
2. 8-(benzo [c]thiadiazolyl,

2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin obecného vzorce I ve kterém

Ri znamená atom atomy uhlíku,

R₂ (I) atom kyslíku, atom síry nebo vodíku nebo alkylovou skupinu s představuje alkylovou skupinu s 1 až nebo pyridylovou skupinu,

4 atomy skupinu

1 až 4 uhlíku volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné adiční amoniové soli.

ve

N-oxidu soli s nebo ve kyselinou formě nebo benzo [c]furazanyl

2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin podle nároku 1 nebo 2 vybraný ze skupiny zahrnující
3. 8-(benzo [c]thiadiazolyl, nebo

i)

8-(benzo[c]furazan-4-yl)-6-(pyridin-4-yl)chinolin, • · · · ii) 8-(benzo[c]furazan-4-yl)-3-methyl-6-(pyridin-4-yl)- chinolin, iii) 8-(benzo[c]furazan-3-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl)chinolin, iv) 8-(benzo[c]thiadiazol-4-yl)-6-(pyridin-4-yl)chinolin,

v) 8-(benzo[c]thiadiazol-4-yl)-3-methyl-6-(pyridin-4-yl)chinolin, a vi) 8-(2-methyl-2H-benzo[d]triazol-5-yl)-6-(pyridin-4-ylmethyl) chinolin, ve volné formě nebo ve formě

N-oxidu nebo ve formě farmaceuticky přijatelné adiční amoniové soli.

soli s kyselinou nebo
4. 8 -(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin podle nároku 1, 2 nebo 3 pro použití jako léčivo.
5. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím , že obsahuje 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin podle nároku 1, 2 nebo 3, popřípadě v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
6. Použití 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolinu podle nároku 1, 2 nebo 3 k přípravě léčiva k léčení

a) obstruktivního nebo zánětlivého onemocnění dýchacích cest,

b) zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění nebo stavů, nebo

c) deprese, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci nebo • · • · mrtvíce.
7. Způsob léčení

a) obstruktivního nebo zánětlivého onemocnění dýchacích cest,

b) zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění nebo stavů, nebo

c) deprese, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci nebo mrtvice, vyznačující se tím, že se pacientovi, který takové léčení potřebuje, podá účinné množství 8-(benzo [c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolinu podle nároku 1, 2 nebo 3.
8. Způsob přípravy 8 -(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolinu podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se (i) 3-Q- nebo 4-Q-benzo[c]thiadiazol, -benzo[c]furazan nebo

-2-methyl-2H-benzo[d]triazol podrobí reakci s 8-Q'-chinolinem, přičemž symboly Q a Q' představují odstupující skupiny schopné podílet se na křížové reakci, (ií) produkt se popřípadě N-alkyluje nebo N-oxiduje, a takto získaný 8-(benzo[c]thiadiazolyl, benzo[c]furazanyl nebo 2-methyl-2H-benzo[d]triazolyl)chinolin se izoluje ve volné formě, ve formě N-oxidu nebo ve formě farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo amoniovš soli.