CZ138497A3

CZ138497A3 - Neural cultures

Info

Publication number: CZ138497A3
Application number: CZ971384A
Authority: CZ
Inventors: Bradley Michael John Stringer
Original assignee: Bradley Michael John Stringer
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1997-11-12
Also published as: MX9703386A; GB9422643D0; ATE213267T1; HUT77080A; CA2204109A1; AU3812095A; GB2294945A; DK0791051T3; KR970707271A; EP1138760A1; GB9522561D0; JPH10509315A; DE69525467T2; DE69525467D1; ES2172596T3; WO1996014396A1; HU221243B1; EP0791051A1; PT791051E; EP0791051B1

Description

Vynález se týká způsobu produkce neurálních kultur, a zejména, ale nejenom, neurálních buněčných linií; a těchto buněk a buněčných linií produkovaných takovým způsobem.

Vynález se také týká lidských a zvířecích neurálních buněčných linií, zejmena, ale nejenom, linií nervových buněk.

Dosavadní stav techniky

Nervové buňky jsou vysoce diferencované buňky obsahující buněčné tělo a výběžky, které jsou dále děleny na dendrity a axony. Nervové buňky se významně liší ve tvaru a velikosti v různých částech těla. Například, granulosové buňky mozečku mají průměr 5 mikrometrů, zatímco velké motorické neurony předních rohů míšních mají průměr větší než 120 mikrometrů. Navíc, délka axonů nervových buněk se pohybuje od stovky mikrometrů do více než jednoho metru. Kromě této variability ve tvaru a velikosti nervových buněk se také v přírodě odlišují receptory na jejich buněčném povrchu a charakter neurotransmiterů pro účinnou přenos signálu nervovými buňkami. Tyto rozdíly v biochemii mohou být použity za účelem klasifikace. Tak, zjednodušeně, mohou být nervové buňky klasifikovány jako, například, adrenergní, cholinergní, serotoninergní, dopaminergni atd. podle charakteru jejich neurotransmiterů. Tento biochemický způsob klasifikace může být dále rozdělen takovým způsobem, aby změněný list

IPEA/EP identifikoval celý rozsah nervových buněk secernujících odlišné neuropeptidy, o kterých se soudí, že účinkují jako neurotransmitery nebo neuromodulátory jako jsou neuropeptidy beta endorfin, met - enkefalin, somatostatin, luteinizační hormon - uvolňující hormon, tyreotropin - uvolňující hormon, substance P, neurotensin, angiotensin 1, angiotensin 2, vazoaktivní intestinální peptid, -neuropeptid Y, kalcitoninovému genu příbuzný peptid atd., nebo alternativně, aminy nebo aminokyseliny, adrenalin, noradrenalin, octopamin, serotonin, histamin, kyselina gama aminomáselná, a taurin. Výše uvedený seznam nemá být vyčerpávající, ale spíše slouží jako ilustrace charakteru biochemické diverzity nervových buněk.

Je obecně známo, že by bylo nesmírně výhodné, aby bylo možné poskytnout kulturu homogenní populace nervových buněk a tak poskytnou, například, homogenní populaci nervových buněk bud z jednoho místa v centrálním nervovém systému, nebo alternativně, homogení populaci nervových buněk vykazujících bud předem určené morfologické charakteristiky, a/nebo biochemické charakteristiky. Například by bylo vysoce výhodné, pokud by bylo možné poskytnout homogení populaci nervových buněk, která je charakterizována bud transmiterem secernovaným v odpovědi na aktivaci nebo alternativně obsazeným receptorem v odpovědi na aktivaci. S takovou populací nervových buněk by bio 1ogové-výzkumníci mohli dosáhnout zřetelného pokroku v pochopení nervového systému a biologové v průmyslu by mohli testovat a vyrábět léčiva, agens nebo entity, které ovlivňují funkci dané populace nervových buněk s ohledem na vývoj terapeuticky aktivního agens.

změněný list

IPEA/EP

Kromě toho, pokud by bylo možné poskytnout homogenní populaci nervových buněk, pak by bylo možné poskytnout nervové buňky dané klasifikace pro účely transplantace. Toto bude zejmena výhodné v případech, kde dochází k degeneraci nebo poškození nervových buněk. Například, je dobře známo, že Parkinsonova choroba se týká degenerace nervových buněk a koresponduje se ztrátou dopaminové sekrece nervových buněk. Tak, pokud by bylo možné poskytnout homogení populaci nervových buněk, které secernují dopamin, pak by bylo možné transplantovat takové nervové buňky a tak odstranit nebo zmírnit nebo alespoň zpomalit symptomy Parkinsonovy choroby. Obdobně, jiné formy demence, které jsou charakterizovány progresivní degenerací nervových buněk, mohou být léčeny stejným způsobem. Obdobně, akutní destrukce nervové tkáně může být léčena implantáty nervových buněk, které obsahují homogenní populaci nervových buněk a/nebo implantací vybrané kombinace nervových buněk z odlišných homogeních populací.

Nicméně, výše uvedená diverzita nervových buněk a také postmitotický charakter nervových buněk si vynucuje určitá omezeni v množství buněk, které mohou být získány in vitro pro výzkum a/nebo transplantaci při použití konvenčních technik kultivace buněk. Z tohoto důvodu byly provedeny pokusy poskytnout kultury nervových buněk kultivací primární nádorové tkáně nebo fúsí primárních buněk s nádorovými buňkami. Nicméně, nádorové buňky jsou ireverzibilně transformovány a mají chorobnou minulost. Jejich použití v buněčných modelech je proto vysoce sporné a kromě toho vzhledem k potenciální tumorigenici tě nemohou být takové tkáně použity za účelem transplantace.

změněný list

IPEA/EP

Byly také provedeny pokusy poskytnout homogenní populaci nervových buněk za použití karcinogenem - indukované transformace jak in vivo, tak in vitro a také za použití spontální transformace, to znamená růstem buněk z primárních kultur bez jakékoliv úmyslné genetické manipulace.

Nicméně, bylo shledáno, že jiným omezením pro poskytnutí homogenní populace nervových buněk je fakt, že většina nervových tumorů jsou glioblastomy a tak neudělují nekontrolovatelné dělení nervovým buňkám.

Jiní pracovníci transfektovali neurální buňky onkogeny, aby tak vytvořili neurální buněčné linie. Někteří pracovníci ukázali, že je možné zavést onkogeny do primárních neurálních buněk a získat buněčné linie, nicméně, tyto buněčné linie nejsou nervovými buněčnými liniemi. Nejsou to funkční nervové buňky, ani to není homogenní populace definovatelných nervových buněk (1).

Transfekční techniky použité v minulosti vyžadovaly použití retrovirů, vzhledem k schopnosti takových virů stabilně se integrovat do genomu hostitelské buňky. Kromě toho, transfekce byla provedena za použití teplotně senzitivního mutantu DNA viru - simian (opičího) viru 40 (SV40). Gen SV 40 kóduje velký nádorový (T) antigen, který je vyžadován pro iniciaci a udržení transformace.

Integrace virových genů do genomu hostitelských buněk vyžaduje, aby v hostitelských buňkách proběhlo alespoň jedno kolo DNA syntesy. Z toho vyplývá, že tam, kde je požadována integrace virového genomu do hostitelských buněk, jsou změněný list

IPEA/EP cílové buňky omezeny na mitotické neurální buňky.

Transfekční techniky byly proto prováděny na takových buňkách. Ačkoliv bylo možné produkovat buněčné linie, to znamená, že bylo možné imortalizovat transfektované buňky, nebylo možné produkovat imortalizované buňky s požadovaným stupněm diferenciace, který je žádoucí pro takové buňky, které mají být prostředkem pro další výzkum, studium nebo použití. Zdá se, že imortalizace brání terminální diferenciaci nervových buněk. Skutečně, typicky buňky procházejí krizí a podléhají apoptose. Například, pokud je imortalizace buněk provedena za použití SV 40 T, může být kultivována homogenní populace buněk, nicméně při nepermisivní teplotě 39 °C exprese aktivního virového proteinu ustává a buňky podléhají diferenciaci. Nicméně, diferenciace neprobíhá úplně, buňky podléhají krizi a apoptose.

Kromě toho je také obecně známo, že je extrémně obtížné poskytnout kultury diferencovaných neurálních nebo nervových buněk pro použití při transplantacích a/nebo pro použití v testování léčiv, agens nebo entit, která ovlivňují funkci dané populace nervových buněk s ohledem na vývoj terapeutických agens. Je obtížné poskytnout takovou kulturu nervových buněk, zejmena tam, kde je zamýšleno poskytnou, obecně, homogenní populaci nervových buněk, nebo heterogenní populaci nervových buněk obsahující relativně malé množství fenotypů, protože, kromě jiných důvodů, je velmi obtížné poskytnout diferenciaci takových nervových buněk.Typicky je obtížné poskytnout diferenciaci primárních nervových buněk v kultuře.

změněný list

IPEA/EP

Podstata vynálezu

Je proto předmětem vynálezu poskytnout způsob pro produkci nervových buněčných linií, které reprezentují homogenní populace nervových buněk, které nejsou funkční, ale jejichž charakter může být spolehlivě definován. Jinými slovy je předmětem vynálezu poskytnutí způsobu produkce stabilních nervových linií, který je vázán na jejich fenotyp. Například, za použití vynálezu je možné poskytnout homogenní populaci serotoninových buněk nebo acety1cholinových buněk nebo adrenalinových buněk atd.

Je dalším předmětem vynálezu poskytnout nemitotické buněčné linie, jejichž nemitotická charakteristika přetrvává i za přítomnosti faktorů a/nebo podmínek, které normálně navozují mitosu.

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnutí buněčné linie, která přežívá za nízkých hustot.

Je také předmětem vynálezu poskytnout způsob pro produkci nervových buněčných linií, které mohou být vyrobeny tak, aby vstupovaly do apoptosy, takže proces apoptosy může být studován s výhledem na větší pochopení procesu a také s výhledem na přípravu léčiv, agens nebo entit, které ovlivňují apoptosu.

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnutí populace nervových buněk, homogenní nebo jiné, které jsou plně diferenci ovány.

změněný list

IPEA/EP

Metoda podle vynálezu je založena na základním pozorování. Za použití konvenčních transfekčních technik jsme byly schopni imortalizovat vybrané neuronální buňky. Nicméně, stejně jako jiní, do realizace vynálezu jsme nebyl schopni poskytnout plně funkčně diferenciované nervové buňky. Nicméně, když jsme modifikovali naší metodu pro produkci buněčných linií, shledali jsme, že jsme schopni indukovat plnou diferenciaci nervových buněk, které byly vystaveny, po transfekci a imortalizaci, předem určeným podmínkám. Tyto podmínky zahrnují vystavení buněk bud prostředí, ze kterého pocházejí, a zejména, ale nejenom, mitotickému prostředí, ze kterého pocházejí, nebo podmínkám které maskují prostředí, ze kterého pocházejí a tak poskytnutí druhotné imitace prostředí, ze kterého pocházejí

Naše pozorování nám také umožnilo produkovat in vitro kulturu nervových buněk, které nebyly imortalizovány. V tomto případě, primární nervová tkáň je nejprve podnícena k replikaci vystavením replikačnímu agens (8 a 9) a pak je podnícena k diferenciaci vystavením buněčné kultury výše uvedenému prostředí, ze kterého uvedená primární tkáň pochází, nebo podmínkám, které imitují uvedené prostředí.

Termínem prostředí, ze kterého pocházejí míníme region centrálního nervového systému, a lépe, region centrálního nervového systému v sousedství, nebo funkčně spojený s přirozeným umístěním kultivovaných buněk v centrálním nervovém systému. Podporujeme mitotické prostředí proto, že podporujeme region centrálního nervového systému, který je mitoticky aktivní a lépe podporujeme region centrálního nervového systému v sousedství, nebo funkčně spojený s změněný list

IPEA/EP přirozeným umístěním kultivovaných buněk v centrálním nervovém systému.

Zdá se, že vystavení buněk prostředí, ze kterého pocházejí, znamená, že buňky, jejichž prostředí secernuje agens, jako jsou například cytokiny, růstové faktory, transmitery atd. nebo snad takové buňky obsahují odstranitelné faktory buněčného povrchu, které mohou zvyšovat diferenciační odpověd.

Kromě toho jsme zjistili, že je možné použít tkáně a buňky z odlišných druhů tak, aby fungovaly ve vynálezu. Například, je možné kultivovat lidské nervové buňky a vystavit takové lidské nervové buňky uvedenému prostředí nebo uvedenému arteficiálnímu prostředí, které je odvozeno od krysího centrálního nervového systému. Naopak, je možné kultivovat krysí nervové buňky a vystavit uvedené nervové buňky uvedenému prostředí nebo uvedenému arteficiálnímu prostředí, které je odvozeno od lidí.

Může se proto zdát, že agens, která zvyšují neuronální diferenciaci podle vynálezu jsou agens, která mohou mít svůj účinek mezi druhy. To znamená, že tato agens jsou biologicky aktivní v alespoň dvou systémech, krysím a lidském, a proto pravděpodobně budou stejné nebo podobné struktury.

Tak jsme zjistili, že modifikace naší metody tak, že transfektované buňky nebo kultivované buňky jsou vystaveny podmínkám původního prostředí, ze kterého alespoň první kultura pochází, přináší diferenciaci. Nemáme jasno ohledně charakteru faktorů zahrnutých v tomto účinku.

změněný list

IPEA/EP

Dále, při použití transfektovaných buněk preferujeme využití metody, která zahrnuje poskytnutí přesmyku, který umožňuje kontrolu imortalizace a apoptosy. Za použití naší metody jsme zjistili, že kultivované nervové buňky nepodléhají spontální apoptose charakterizující dříve kultivované neurální buněčné linie, ale byly jsme schopni selektivně kontrolovat, zda mají buněčné linie zůstat imortalizované nebo podlehnout apoptose.

Navíc jsme také zjistili, že naše buněčné linie, jsou-li diferencovány, jsou spojeny se svým fenotypem a tak si uchovávají své fenotypické charakteristiky i když je prostředí, ze kterého pocházejí, odstraněno a/nebo jsou-li vystaveny faktorům jako je fetální telecí sérum. Navíc, také jsme zjistili, že naše buněčné linie nevykazují mitosu, opět, ani za podmínek, které by měly navodit mitosu,a navíc, naše buněčné linie jsou schopné přežívat při nízkých hustotách.

V souladu s prvním aspektem vynálezu je zde proto poskytnuta metoda pro produkci velkých populací neurálních buněk, kde tato metoda zahrnuje:

a) zvýšení replikace prvotních nediferenciovaných neurálních buněk, nebo prekurzorových buněk neurálních buněk, nebo prekurzorových kmenových buněk,

b) vystavení uvedených replikovaných neurálních buněk prostředí, ze kterého prvotní neurální buňky pocházejí, nebo prostředí, které imituje uvedené prostředí; a změněný list

IPEA/EP

c) umožnění diferenciace uvedených buněk za produkce plně diferenciovaných aktivních neurálních buněk.

Z výše uvedeného je jasné, že za použití metody podle vynálezu je možné kultivovat a/nebo imortalizovat prekursorové buňky neurálních buněk a tak produkovat homogenní populaci buněk. Nicméně, úspěšná diferenciace je dosažena vystavením buněk bud prostředí, ze kterého prvotní nervové buňky pocházejí nebo alternativně prostředí, které imituje toto prostředí. Tímto způsobem je možné produkovat homogenní populaci plně diferenciovaných aktivních nervových buněk.

V prvním provedení vynálezu, je prostředím, ze kterého prvotní nervové buňky pocházejí jakýkoliv region centrálního nervového systému, nicméně, lépe je uvedeným prostředím prostředí, které je sousední nebo funkčně spojené s přirozeným prostředím odvozených kultivovaných buněk v centrálním nervovém systému. Termín prostředí, které imituje uvedené prostředí, je také konstruován v souladu s tímto.

Ještě lépe je uvedeným prostředím mitotické prostředí, což znamená, že obsahuje buňky podléhající mitose. Zdá se, že v tomto případě uvolňována nebo exprivována agens, která navozují proces diferenciace, a tato agens nějakým způsobem ovlivňují diferenciaci buněk v mitotickém prostředí buněk.

Preferovaně jsou uvedené nervové buňky a tkáně z uvedených přirozených a arteficiálních prostředí odvozeny od jednoho druhu. Nicméně, alternativně, mohou být uvedené nervové buňky a tkáně odvozeny od různých druhů. Například, změněný list

IPEA/EP uvedené nervové buňky mohou být odvozeny od fetální lidské tkáně, zatímco uvedené prostředí a přesněji uvedená tkáň a uvedené prostředí může být odvozeno od jiného zvířecího druhu jako je krysa, myš, opice atd.

V preferovaném provedení vynálezu je imortalizace dosaženo za použití konvenčních transfekčních technik a preferovaně transfekcí vyžadující inkorporaci onkogenu do buněčného genomu, kde onkogen podporuje navození buněčného dělení vysoko nad normální úrovní danou buňkami netransdukovanými onkogenem, jinými slovy onkogen imortalizuje buňku.

Alternativně může být imortalizace dosažena za použití fyzikálních a chemických prostředků. Například může být imortalizace dosažena vystavením uvedených buněk radiaci nebo chemikáliím (2), o kterých je známo, že navozují buněčné dělení v úrovni o mnoho vyšší, než je pro buňky, které nebyly vystaveny uvedeným chemickým a fyzikálním prostředkům.

Ideální transfekce je provedena za použití onkogenů odvozených od virů, jako je myc, src, ras, SV40T, nebo retrovirových konstruktů obsahujících jakýkoliv z výše uvedených onkogenů a/nebo jakýkoliv lidský onkogen. Retrovirový konstrukt je upřednostňován, jelikož je schopen stabilně se integrovat do genomu hostitelské buňky.

V prvním preferovaném provedení vynálezu imortalizační agens obsahuje nebo je asociováno s kontrolním prostředkem, kde aktivace kontrolního prostředku ukončuje imortalizaci a změněný list

IPEA/EP způsobuje to, že buňka podléhá apoptose.

Je preferováno, aby imortalizace uvedených buněk imortalizačním agens byla provedena ideálně v průběhu posledního dělení před migrací z proliferativní zóny a započetím terminální diferenciace. Toto je z důvodů pravděpodobnosti produkce buněčných linií majících jednu sadu funkčních charakteristik zvýšenou. Imortalizace před touto preferovanou dobou může být provedena, ale je zvýšena pravděpodobnost, že prekurzorové buňky přijmou několik různých fenotypů po diferenciaci.

V preferovaném provedení vynálezu reagují kontrolní prostředky na podmínky kultury a prostředí, jako je teplota, pH nebo iontové koncentrace. Například, v preferovaném provedení je imortali začni agens teplotně senzitivní a kontrola je tak representována teplotně senzitivním přesmykem tak, že zvýšením nebo snížením první dané teploty je imortali začni agens aktivováno, takže imortalizuje vybraný nervový typ, ale při zvýšení nebo snížení druhé dané teploty je imortali začni agens deaktivováno a v tomto případě je imortalizace ukončena a začíná apoptosa.

Imortali začni agens a kontrolní prostředky mohou zahrnovat, například, jednotlivou entitu jako je teplotně sensitivní onkogen. Alternativně, imortali začni agens a kontrolní prostředky mohou být dvě nezávislé entity, ale v každém případě ideální kontrolní prostředek akt ivace/deaktivace má reciproční efekt na imortali začni agens. Například, je-li kontrolní prostředek aktivován, je imortali začni agens deaktivováno. Naopak, je-li kontrolní prostředek deaktivován, je imortali začni agens aktivováno. Schopnost změněný list

IPEA/EP kontrolního prostředku deaktivovat imortali začni agens znamená ukončení imortalizace a navození apoptosy.

Vystavení uvedených buněk původnímu prostředí může vyžadovat transplantaci uvedené homogenní populace buněk zpět do centrálního nervového systému nebo lépe do místa v centrálním nervovém systému v sousedství nebo funkčním spojení s původním prostředím prvotních buněk, a lépe, jednoduše extrakci populace buněk z uvedeného centrálního nervového systému nebo uvedeného původního prostředí a umístění uvedené extrahované populace v těsné blízkosti uvedené homogenní populace buněk.

Ideálně uvedené vybrané prostředí obsahuje mitoticky aktivní buňky.

V případě, kde uvedená buňka je vystavena extrahované populaci buněk, jsou ideálně uvedené extrahované buňky umístěny na substrát a je jim umožněno dosáhnout konfluence bud před uvedením do kontaktu s uvedenou homogenní populací buněk nebo jsou-li chvíli v kontaktu s uvedenou homogenní populací buněk. Alternativně, uvedená extrahovaná populace buněk je kultivována do konfluence a medium z uvedené populace je přidáno k uvedené homogenní populaci buněk, aby bylo dosaženo diferenciace.

Preferovaně je uvedená homogenní populace buněk také vystavena jednomu nebo více faktorům jako je fibroblastový růstový faktor a/nebo epidermální růstový faktor.

Z výše uvedeného je jasné, že charakter homogenní změněný list

IPEA/EP populace buněk bude určen charakterem nediferencovaných nervových buněk nebo prekurzorových buněk nervových buněk. Tak za použití metody podle vynálezu bude možné produkovat buněčné linie různých nervových buněk, jejichž funkce a vlastnoxti budou určeny charakterem nediferencovaných nervových buněk nebo prekurzorových buněk nervových buněk. Tak má vynález velký rozsah aplikací v tom, že vynález poskytuje metodu podle které může být celá škála homogenních populací nervových buněk kultivována v kultuře. Toto je samozřejmě signifikantní pro neurobiology jak z výzkumného hlediska, tak z technického hlediska.

Preferovaným imortalizačním agens je, což je zde typicky uvedeno, slabý onkogen jako je SV40 virový onkogen a lépe, v případě, že je preferován kontrolní prostředek, je preferován onkogen SV40T antigen, který je permisivní, což znamená, že aktivní produkt virového genu je exprivován při 33 °C a nepermisivní, což znamená, že aktivní produkt virového genu není exprivován, při 39 °C, takže buňky imortalizované za použití tohoto agens jsou teplotně sensitivní pro apoptosu.

Unikátně, naše buňky, jsou-li transformovány za použití SV40T antigenu a vystaveny prostředí, přirozenému nebo arteficiálnímu, které navozuje diferenciaci, potom přežívají krizi - stav, který je obvykle následován apoptosou.

Zdá se, že uvedené prostředí také poskytuje uvolnění substancí či čehosi, co účinkuje na buňky a umožňuje jim přežít apoptosu.

změněný list

IPEA/EP

V ještě dalším provedení vynálezu obsahují uvedené buněčné linie bezpečný rys, který umožňuje selektivní narušení nebo zničení uvedené buněčné linie. Tato bezpečnostní vlastnost je výhodou, pokud je buněčná linie použita za účelem transplantace nebo je jiným způsobem, trvale nebo dočasně, připojena na, podána, nebo skladována v individuu. Tato bezpečnostní vlasnost umožňuje, aby buněčná linie byla selektivně narušena, čímž míníme učiněna neškodnou, nebo zničena, v případě, že se zdá, nebo je dokázáno, že buněčná linie má tumorigení potenciál in vivo, nebo se zdá, že jakýmkoliv způsobem škodí individuu.

Naše související patentová přihláška GB 9422236.1 ukazuje jak může být produkován vektor, který poskytuje bezpečnostní vlastnost pro koexpresi ve formě genu, který může nebo nemusí být navázán na imortalizovaný onkogen.

Podle dalšího aspektu vynálezu jsou zde poskytnuty buňky a/nebo buněčné linie produkované podle metody podle vynálezu. V souladu s tím je zde poskytnuta alespoň jedna homogenní populace imortalizovaných buněk, které mohou být plně diferenciovány, takže vytvoří homogenní populaci plně diferenciovaných nervových buněk; a/nebo alternativně, je zde poskytnuta alespoň jedna homogenní populace imortalizovaných buněk, které jsou poskytnuty s prostředkem pro ukončení imortalizace a aktivaci apoptosy.

Podle ještě dalšího aspektu vynálezu jsou zde poskytnuty buňky a/nebo buněčné linie produkované podle metody podle vynálezu, které, jsou-li diferencovány, si uchovávají své fenotypické charakteristiky a/nebo jsou nonmitotické a/nebo změněný list

IPEA/EP přežívají při nízké hustotě.

Provedení vynálezu bude nyní popsáno prostřednictvím příkladů, které jsou míněny pouze jako příklady pouze se specifickým odkazem na serotonin secernující funkční nervové buňky.

Další příklady jsou shrnuty v tabulkách a na obrázcích, kde:

1. Tabulka 1 shrnuje experimenty provedené s klonem 1 nesmrtelné nervové buněčné linie.

2. Obrázek 1 ukazuje proud - napětí vztahy při 30 mM Ba buněk klonu 1 jeden až dva týdny po diferenciaci.

3. Obrázek 2 ukazuje časový průběh VDCC účinků aplikace toxinů na klon 1 nervových buněk; a

4. Obrázek 3 ukazuje proud - nmapětí vztah pro klon 1 buněk.

Příklady provedení vynálezu

Imortalizacc buněk

Krysí embrya v den 12 - 13 gestace byla vyjmuta, a předpokládaný region raphe nuclei obsahující ventrální mediální rhombencephalon a medulla oblongata byl odebrán. Po disociaci mírnou triturací v mediu (Hamovo F12/Dulbeccovo modifikované Eaglovo medium (50/50 objem/objem) supiementované L-glutaminem (2mM), pěnici 1in:streptomycin změněný list

IPEA/EP (100 IU/ml;1Opg/ml) a a modifikovaným skladovacím roztokem (3,4) obsahujícím 5 ng/ml bázického fibroblastového růstového faktoru (5) (vše od Sigma), byly buňky umístěny na poly-L-lysin/želatina-potažené 162 cm² tkáňové kultivační lahvičky (Costar UK Ltd) v hustotě 5 x 10⁵ buněk/ml, 20 ml na lahvičku. Jakmile buňky adherovaly, byly k mediu přidány retrovirové částice obsahující konstrukt (tsA58) inkorporující teplotně sensitivní formu velkého-nádorového antigenu (ts)SV40T simian viru a markér resistence na geneticin, G418^r (dodán Dr.P.Jat, Ludwig Institute,

Middlesex Hospital, London. Též dostupný ve sbírce, detaily jsou poskytnuty (6)), spolu s 0,8 pg/ml polybrenu. Titr viru byl upraven tak, aby dával nízkou účinnost transdukce 0.0002%, za tvorby asi 20 kolonií na lahvičku. Po jedné hodině bylo kultivační medium nahrazeno čerstvým mediem. Kultury byly udržovány při 33 °C, permisivní teplotě pro aktivní formu produktu onkogenu SV40-T. Pět dní po transdukci by přidán geneticin ke kultivačnímu mediu (0,4 mg/ml) po dalších 8 dní, kvůli eradikaci buněk, které neinkorporovaly retrovirový vektor.

Mezi 14 a 20 dnem po transdukci byly identifikovatelné jednotlivé kolonie replikujících se buněk. Klony byly vybrány na základě toho, že byly dobře odděleny od jiných replikujících se kolonií, na základě jejich cirkulárního tvaru a na základě jejich morfologie. Jednotlivé klony byly odebrány očkem a expandovány do konfluence v 75 cm²lahvičkách, t.j. přibližně 23 dělení jednotlivého prekurzoru před vymražením aliquotů buněk. Aliquoty byly také umístěny na poly-L-lysin/želatinou-potažené 12 jamkové plotny pro analýzu potenciálních diferenciačních změněný list

IPEA/EP charakteristik.

Alternativně byla výše zmíněná krysí embrya ošetřena tak, aby poskytla buňky v tkáňové kultuře a tyto buňky potom byly vystaveny replikačnímu agens jak je popsáno v odkazech 8 a 9 před tím, než proběhla diferenciace jak je popsáno níže.

Buněčná diferenciace

Buňky byly uchovávány v konstituentním mediu stejně jako pro replikaci (výše) a při permisivní teplotě 33 °C, ale homogenní populace nervových buněk, nyní označena jako RAPHE KLON 1 BUŇKY, byla kokultivována na dně jamky s primárnímy RAPHE BUŇKAMI (připravenými jak je popsáno výše, ale bez kroku následné transfekce) jako nekonfluentní buněčnou vrstvou umístěná na PTFE insertech (Corning). Jak imortalizované, tak primární RAPHE buňky byly replikovány do té doby, dokud se primární RAPHE buňky nestaly konfluentními. V té době vykazovali imortalizované buňky značně redukovaný stupeň replikace. Primární RAPHE buňky byly odstraněny odstraněním insertů a imortalizované buňky začaly vykazovat signifikantní stupeň diferenciace. Například, 5-hydroxytryptamin byl nyní syntetizován bez nutnosti zavedení prekurzoru, to je 5-hydroxytryptamin byl nyní demonstrovatelný. Morfologická diferenciace byla o mnoho komplexnější, bylo při ní visualizováno mnoho špičatých dendritů, často se větvících. Navíc, u buněk se vyvíjely některé iontové kanály, včetně určitého N-typu vápníkových kanálů. Málo či žádná apoptosa nebyla pozorována při permisivní teplotě, a buňky byly refrakterní na gliální diferenciaci indukující účinek séra.

změněný list

IPEA/EP

Buněčná apoptosa

Výše uvedená populace raphe klon 1 buněk může být vybídnuta k tomu, aby vstupovala do apoptosy následujícími čtyřmi způsoby.

1. Teplota byla zvýšena na nepermisivní hodnoty (39 °C) po více než 72 hodin, za přítomnosti nebo absence fibroblastového růstového faktoru nebo epidermálního růstového faktoru. Neurální buňky vyvíjely schopnost vychytávat 5-hydroxytryptofan (5HTP, prekurzor 5HT), 5 HT samotný, a dekarboxy1 ovát 5-hydroxytryptofan na 5HT. Nativní 5HT nebyl detekovatelný. 5HT odvozený z 5HTP byl uvolňován, ačkoliv mechanismus takového uvolnění není známý. Byla demonstrovatelná slabá neurofi 1amenta a neuron - specifické enolase podobná imunoreaktivita. Morfologická diferenciace byla omezena na vývoj tří nebo čtyř neuritů s jedním větvenímBuňky také podléhaly rozsáhlé apoptose, takže po třech dnech jich zbývalo méně než 10%. Zbývající buňky byly pravděpodobně neuronální.

2. Teplota byla zvýšena na nepermisivní hodnoty (39 °C) po více než 72 hodin, za přítomnosti cyklického AMP plus fibroblastového růstového faktoru. Ačkoliv parametry diferenciace popsané výše jsou v podstatě stejné po inkubaci buněk s cyklickým AMP, byl zde nárůst v rozsahu vývoje vláken. Buňky byly pravděpodobně neuronální.

3. Teplota byla zvýšena na nepermisivní hodnoty (39 °C) po více než 96 hodin, za přítomnosti retinové kyseliny (10 μΜ) plus fibroblastového růstového faktoru. Přežívání buněk bylo změněný list

IPEA/EP značně zvýšeno, ale buňky selhaly ve vývoji 5HT parametrů popsaných výše. Kromě toho, barvení na neuron specifickou enolázu bylo značně redukováno, zatímco imunoreaktivita na gliální fibrilární acidický protein byla nyní nacházena v mnoha, ale ne ve všech buňkách. Dosáhly pouze výběžkaté (flattended) morfologie a nevykazovaly dále prodlužování vláken. Buňky byly pravděpodobně gliální.

4. Teplota byla zvýšena na nepermisivní hodnoty (39 °C) po více než 96 hodin, za přítomnosti 5% fetálního hovězího séra plus 5% teplem inaktivovaného koňského séra plus fibroblastového růstového faktoru. Přežívání buněk bylo vyšší než po retinové kyselině, a buňky ztratily 5HT parametry jak je popsáno výše. Kromě toho, barvení na neuron specifickou enolázu bylo značně redukováno, zatímco imunoreaktivita na gliální fibrilární acidický protein byla nyní nacházena v mnohem více buňkách. Dosáhly pouze výběžkaté (flattended) morfologie a nevykazovaly dále prodlužování vláken. Buňky byly pravděpodobně gliální.

Myslíme si, že u buňek může být navozena apoptosa, když dosáhnou konfluence.

Diferenciační podmínky

Neurální buňky mesencefalického a medullárního raphé z E12 - E13 krysích embryí (El = den koncepce) byly imortalizovány za použití teplotně sensitivního onkogenu jak je popsáno výše (Stringer et al., 1994). Za permisivních podmínek, t.j. za přítomnosti 5 ng/ml fibroblastového změněný list

IPEA/EP růstového faktoru (FGF)(Sigma, produkt č. F3391) a při 33 °C imortalizované raphé prekurzorové buňky replikovaly. V jednom klonu (921203-6), jenž vlastnil všechny charakteristiky klonu 921202-6 popsaného Stringerem et al, 1994, teplotní posun na 39 °C, ale za uchování všech ostatních podmínek jako byly dříve, se u prekurzoru vyvíjely některé charakteristiky serotoninergních (5HT) neuronů, jako neuron specifická enolasa - (NSE) a neurofilamentum - (NF) imunoreaktivita, výrazně fázová morfologie se dvěma nebo třemi krátkými bifurkačními procesy, schopnost vychytávat serotonin prostřednictvím nízkoafinitniho nosiče (Κ·=56 μΜ) a dekarboxylace 5-hydroxytryptofanu (5HTP) na serotonin. Tryptofin hydroxylasová aktivita, nicméně, nebyla demonstrovatelná, a buňky selhaly v syntéze serotoninu z tryptofanu. Žádné vápníkové kanály nebyly demonstrovatelné za použití svorkové analýzy skvrn.

Růst klonu 921203-6 raphé prekurzorů za přítomnosti primárních buněk odebraných ze stejných venntromediálních regionů mesencephalonu a medulla oblongata, ze kterých byl klon původně derivován, vedl ke zvýšené diferenciaci klonu, což poskytovalo uchování mitotického prostředí. Pro navození takových podmínek byly ventromediální mesencephalon a medulla oblongata odebrány z E12 - E13 krysích embryí a umístěny na poly-L-lysin potažené inserty (PTFE membrána, velikost póru 0,4 pm, Corming, produkt č. 25204-6), přibližně jeden mesencephalon/medulla oblongata na insert. Primární buňky byly inkubovány za přesně stejných replikačních podmínek jako byly ty, které byly použity pro získání replikace v imortalizovaných prekurzorech, t.j. s 5 ng/ml FGF, a při 33 °C. Po několika změněný list

IPEA/EP dnech se hustota primárních buněk přiblížila konfluenci. V této době byly buňky z raphé klonu 921203-6 umístěny v nízké hustotě na 6 jamkové plotny (předem potažené želatinou a poly-L-lysinem) a, po potvrzení jejich připojení na substrát, byly primární buňky obsahující inserty umístěny ve stejných jamkách, spolu s jejich kondiciovaným mediem. Žádný přímý kontakt mezi primárními a klonálními buňkami nebyl možný;difusibilní faktory v běžném mediu mohly mít účinek na obě sady buněk, klonální a primární buňky, ale účinek na první z nich je nepochybně přímý. Inkubační podmímky byly zachovány stejné jako dříve, t.j. při 33 °C s FGF. Po 2 - 3 dnech vyvíjely imortalizované prekurzory mnohem výrazněji diferenciovanou morfologii, se dvěma až třema dlouhými, špičatými a větvícími se výběžky (pravděpodobně dendrity) a větší fázově zřetelné tělo. Imunocytochemická analýza klonálních buněk nyní demonstrovala NSE-, NF-, a serotoninovou imunoreaktivitu, poslední z nich za absence zavedení 5HT, 5HTP nebo tryptofanu. Vápníkové kanály byly nyní demonstrovatelné, a zahrnovaly předpokládaný N-typ, a no-T, non-P kanály také. jakmile se inzerty staly konfluentními, začaly jak primární, tak imortalizované buňky vykazovat známky stresu a smrti. Sérum tomuto nezabránilo. Nicméně, odstranění insertů a/nebo kondicionovaného media zcela zabránilo buněčnému stresu a smrti. Navzdory ztrátě kondiciovaného media vykazovaly imortalizované buňky nadále všechny výše popsané parametry zralých 5HT neuronů.

Použití regionu střední linie hlavové míchy E12 - E13 krys jako zdroje primární tkáně pro plnou diferenciaci klonálních buněk.

změněný list

IPEA/EP

Inkluze fetálního telecího a koňského teplem inaktivovaného séra (oboje 5%) v kultivačním mediu nemělo žádný zjevný účinek na diferenciaci klonálních serotoninových neuronů. Oproti tomu, přidání séra ke stejným buňkám podléhajícím rudimentární diferenciaci způsobené teplotním posunem způsobovalo ztrátu všech jejich neuronálních charakteristik a navození astrocytárního f enotypu.

Denně bylo počítáno množství imortalizovaných raphé neurálních prekurzorů/diferenciovaným serotoninovým neuronům. Ačkoliv buňky pokračovaly v replikaci po další dva až tři dny, od té chvíle, co se diferenciace stala morfologicky zřetelnou, replikace ustala, ačkoliv buňky byly stále udržovány při 33 °C. Odstranění insertů po diferenciaci neindukovalo zvýšení v počtu buněk; kromě toho, žádný důkaz mitotických těl nebyl zjevný. Na druhou stranu, odstranění inzertů před diferenciací umožnilo buňkám pokračovat v dělení.

Závěrem, návrat imortalizovaných raphé neurálních prekurzorových buněk do mitotického prostředí, ze kterého původně pocházejí vedlo k o mnoho rozsáhlejší diferenciaci, než mohou poskytnout dříve popsané metody. Účinek je na přímý na klonální prekurzorové buňky samotné, a není zprostředkován jinými typy buněk ani mezibuněčným kontaktem. Kromě toho, taková diferenciace může proběhnout za přítomnosti pokračující replikace, a vede rychle k navození vybraného fenotypu (např. plně vyvinutého serotoninového neuronu), který je zachován i za přítomnosti faktorů, které normálně způsobují expresi alternativního fenotypu (např.

změněný list

IPEA/EP astrocytárního). Odstranění kondiciovaných faktorů nezpůsobuje změnu buněk z jejich nyní navozeného fenotypu. Pravděpodobné je, že solubilní faktory přítomné v kondiciovaném mediu mitotických primárních buněk jsou odpovědné za indukci takové diferenciace, a mohou být ve vztahu s nedávno popsaným N-terminálním štěpným produktem ultrazvukového ježka, o kterém je známo, že indukuje diferenciaci mozkových a míšních kmenových prekurzorů směrem k dopaminergním neuronům (Hyneš et al., Neuron 15 (1995) 35 - 44) a cholinergním motoneuronům (Roeling et al., Cell (1995) 445 - 455), v příslušném pořadí.

Poskytnutí nervových buněčných linií obsahujících alespoň jednu selektivně kontrolovatelnou bezpečnostní vlastnost.

Jiné preferované provedení vynálezu se týká přípravy homogenní populace buněk retrovirovou transdukci, ale také inkorporování bezpečnostní vlastnosti, která v případě potřeby umožňuje selektivní zneschopnění a/nebo destrukci buněk. Toto se zdá být výhodné, pokud jsou takové buněčné linie použity pro transplantaci pacientům pro zmírnění symptomů neurodegenerativních chorob.

Bezpečnostní vlastnost umožňuje selektivní destrukci transplantátu v, například, situaci, kde se transplantovaný materiál stane tumorigenní in vivo a/nebo v situacích, kde se transplantovaný materiál stane jiným způsobem škodlivý. Způsobů, kterými může toto být provedeno je mnoho a odborníkům jsou dobře známé. Například, buněčné linie mohou být aktivovány genem, který pokud je aktivován účinkuje, bud přímo nebo nepřímo, tak, že způsobuje zneschopnění nebo změněný list

IPEA/EP destrukci transplantátu. Příklady takovýchto genů jsou odborníkům dobře známy a nebudou zde popsány detailně.

V preferovaném provedení vynálezu může být bezpečnoství vlastnost navázána na transformační onkogen, takže se bude vyskytovat ko-exprese dvou korespondujících buněčných produktů. To znamená, že v případě, kde bude onkogen aktivován, bude také aktivován bezpečnostní rys a tak bude vyřešeno nebezpečí asociované s tumorigenním charakterem onkogenu. Ko-exprese může být dosaženo množstvím způsobů, například, bezpečnostní gen může být umístěn downstream od imortalizačního genu a hned po, ale 3' po, například, od polioviru odvozené sekvenci vnitřního ribosomálního vstupního místa (IRES). Tímto způsobem bude stejný promotor/enhancer kontrolující transkripci imortali začniho genu shodně kontrolovat transkripci bezpečnostního rysy. To proto, že bude transkribován jako jedna kompletní jednotka, včetně IRES sekvence, která bude umístěna mezi nimi. IRES sekvence umožňuje translaci sekvencí downstream směrem, které kódují protein separátní od její 5' sekvence, možnost poskytnutí takového vektoru je v rozsahu znalostí odborníků.

Experimenty pro ukázání funkčních charakteristik diferenciovaných nervových buněčných linií

Funkční iontové kanály

Tabulka 1 ukazuje funkční aktivitu klonu 1 imortalizovaných nervových buněk za různých neurofyziologických podmínek.

změněný list

IPEA/EP

Dvanáct různých buněk bylo testováno bud 2 nebo 4 týdny po diferenciaci po dokončení úplné diferenciace nervových buněk. Za použití konvenčních technik svorkových analýz skvrn byla určena konduktivita iontových kanálů uvnitř testovaných nervových buněk při bud 5 mM Ca nebo při 30 mM Ba. Při 5 mM Ca buňky 2 a 7 vykazovaly kondukt ivitu menší než 50 pA. Buňky 8 a 9 vykazovaly konduktivitu vyšší než 100 pA. Tyto výsledky ukazují, že klon 1 obsahoval funkční nervové buňky. Při 30 mM Ba vykazovaly buňky 8 a 9 funkční iontové kanály mající konduktivitu vyšší než 200 pA. Buňky 11 a 12 také vykazovaly konduktivitu za těchto podmínek. Slabý signál menší než 50 pA byl prokázán pro buňky 11 a silnější signál vyšší než 200 pA byl prokázán pro buňky 12.

Vystavení buněk klonu 1 toxinům, o kterých je známo, že interferují s kondukt ivitou vápníkových iontových kanálů ovlivnilo konduktivitu klonu 1 funkčních nervových buněk. Přesněji, 1 mM w-CgTxGVIA, toxinu, o kterém je známo, že blokuje N-typ vápníkových kanálů, bylo ovlivněno 100% buněk

8. Při nižší koncentraci 100 nM bylo ovlivněno 70% buněk 9. Při 1 nM bylo také ovlivněno 70% buněk 12. Tyto výsledky ukazují, že faktory, které specificky ovlivňují konduktivitu nervových buněk ovlivňují diferenciované nervové buňky klonu 1 a to ukazuje, že tyto diferenciované nervové buňky byly plně funkční nervové buňky exprivující fenotypové charakteristiky a přesněji nervové buňky obsahující N-typ vápníkových kanálů.

Použití toxinu w-Aga IVA, což je toxin, o kterém je známo, že blokuje P-typ vápníkových kanálů, bylo méně změněný list

IPEA/EP úspěšné - při koncentraci 50 nM byly buňky 9 nesensitivní.

Na Obrázku 1 jsou dosažitelná data proud napětí pro klon 1 buněk. Na buňky podle vynálezu bylo aplikováno napětí v rozsahu -85 a 50 mV. Simultáně byla monitorována odpověd uvedených buněk měřením proudu. Napětí vyšší než klidový potenciál vyvolalo průtok proudu a tak otevřelo iontové kanály nervových buněk. Depolarizačni potenciál byl pozorován při přibližně minus 50 mV. Tento depolarizační potenciál vedl ke generování akčního potenciálu, což ukazuje, že buňky jsou plně funkční. Buňky byly inaktivní při přibližně 10 mV.

Obrázek 2 ukazuje časový průběh na napětí závislé vodivosti kanálu a účinek aplikace roxinu na tuto vodivost. V průběhu asi 5 minut vedla aplikace w-CgTxGVIA ke znatelnému snížení vodivosti nervových buněk. Po 10 minutovém intervalu byl přidán druhý toxin a proud byl udržován asi na 70 pA. Vztahy proud napětí jsou ukázány na Obrázku 2, kde je možné vidět, že přidání w-CgTxGVIA v koncentraci 100 nM signifikantně ovlivňuje vodivost iontových kanálů nervových buněk. Přidání w-AgalVA také ovlivňuje vodivost nervových buněk, ale významně menší měrou.

Konečně, Obrázek 3 ukazuje vztahy proud napětí při 30 mM Ba CI2 roztoku pro klon 1 buněk. Při depolarizačním potenciálu -50 mV jsou iontové kanály nervových buněk otevřeny a protéká proud -350 pA.

Také máme údaje ukazující, že naše buňky obsahují plně změněný list

IPEA/EP funkční na napětí závislé draslíkové kanály, které jsou blokovatelné za použití konvenčních fyziologických prostředků, (data nejsou ukázána).

Výše uvedená data ukazují, že nervové buňky klonů podle vynálezu mohou být plně diferenciovány a tak mohou vykazovat fenotypické charakteristiky plně funkčních a tak plně diferenciovaných nervových buněk.

změněný list

IPEA/EP

Odkazy:

1. White L A and Whittemore S R., Lmmortalisation of Raphe Neurons: an Approach to Neuronal Function in vitro and in vivo, Journal of Chemical Neuroanatomy, Vol 5:327-330 (1992).

2. Stampfer MR, Bartley JC 1985. Induction of transformation and continuous cells lineš from normál mammary epithelial cells after exposure to benzo[a]pyrene. Proč Nati Acad Sci USA 82:2394-2398.

3. Bottenstein, J E and Sáto G H., Growth of a rat neuroblastoma cellline in serum-free supplemented medium, Proč. Nati. Acad. Sci., 76(1979) 514-517.

4. Romijn H J., Mud Μ T., Habets, A.M.M.C. and Wolters P S., A quantitative electron microscopic study of synapse formation in dissociated fetal cerebral cortex in vitro, J Neurophysiol., 40(1981) 1132-1150.

5. Murphy M, Drago J and Bartlett P F. Fibroblast growth factor directly stimulates the proliferation and differentiation of neural precursor cells in vitro, J Neurosci Res., 25(1990) 463-475.

6. Jat P S. and Sharp P A., Cell-lines established by a temperaturesensitive simian virus 40 large-T-antigen gene are growth restricted at the změněný list

IPEA/EP non-permissive temperature, Mol. Cell Biol, 9(1989) 1672-1681.

7. Stringer Β. M. J., et al., Raphé neural cell immortalised with a temperature-sensitive oncogene, Developmental Brain Research 79:267-274, 1974.

8. Reynolds B. A. and Weiff S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian centrál nervous systém. Sci. 255:1707-1710, 1992.

9. Mayer E., Dunnett F. B., and Fawcett J. W. Mitogenic effect of basic fibroblast growth factor on embryonic mesencephalic domapinergic neurone precursors. Dev Brain Res 72:253-258, 1993.

změněný list

IPEA/EP

RATENTOVZÉ NÁROKY

1. Způsob pro produkci velkých populací neurálních buněk vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) zvýšení replikace prvotních nediferencovaných nerálních buněk, nebo prekurzorových buněk neurálních buněk, nebo prekurzorových kmenových buněk,

b) vystavení uvedených replikovaných neurálních buněk bud prostředí, ze kterého uvedené prvotní neurální buňky pocházejí, nebo prostředí, které napodobuje uvedené prostředí; a

2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že prostředím, ze kterého prvotní neurální buňky pocházejí je jakýkoliv region centrálního nervového systému.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že uvedeným prostředím je prostředí v sousedství, nebo ve funkčním vztahu k přirozenému místu centrálního nervového systému, ze kterého jsou prvotní nediferenci ováné nervové buňky odvozeny.

4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, změněný list

IPEA/EP že uvedeným prostředím je mitotické prostředí.

5. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že uvedené nervové buňky jsou vystaveny rozpustnému extraktu z uvedeného prostředí.

6. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že uvedené prostředí je ze stejného druhu jako uvedené prvotní nediferencované nervové buňky.

7. Způsob podle nároků laž5vyznačující se t í m, že uvedené prostředí je od jiných druhů než pocházejí uvedené prvotní nediferencované nervové buňky.

8. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že je poskytnuto zvýšení replikace použitím replikačního činidla jako je růstový f aktor.

9. Způsob podle nároků laž7vyznačující se t í m, že je poskytnuto zvýšení replikace pomocí imortalizačního činidla.

10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že uvedeným činidlem je onkogen.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačuj ící se tím, že uvedený onkogen zahrnuje, nebo je s ním asociován, kontrolní prostředek.

změněný list

IPEA/EP

12. Způsob podle nároku llvyznačující se tím, že uvedený kontrolní prostředek je reagující na kultivační podmínky nebo na stav prostředí.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedený kontrolní prostředek je reagující na teplotu.

14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedený onkogen je SV40T.

15. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že uvedené prostředí obsahuje extrakt buněk z regionu sousedícího, nebo funkčně spojeného, s původním regionem, ze kterého jsou prvotní nediferencované nervové buňky odvozeny.

16. Způsob podle nároků 1 až 14 vyznačuj ící se t í m, že uvedené prostředí obsahuje rozpustný extrakt odebraný z populace buněk fyziologicky umístěných v regionu sousedícím, nebo funkčně spojeném, s původním regionem, ze kterého jsou prvotní nediferencované nervové buňky odvozeny.

17. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že uvedená homogenní populace buněk je vystavena alespoň jednomu růstovému f aktoru.

18. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že dále obsahuje transformaci prvotních nediferencovaných nervových buněk bezpečnostním genem, který je bud konstitutivní, nebo může změněný list

IPEA/EP být selektivně aktivován tak, že je v každém případě schopen selektivního zneschopnění nebo destrukce uvedené buněčné linie.

19. Použití nervové buněčné linié, která obsahuje:

první nediferenci ovanou nervovou buňku nebo buněčný prekurzor nervové buňky, která byla imortalizována imortalizačním činidlem, které obsahuje, nebo je s ním asociováno, kontrolní prostředek, takže imortali začni agens může být selektivně akt ivováno/deaktivováno jako model pro hodnocení apoptosy, kultivací uvedených imortalizovaných nervových buněk tak, že poskytnou homogenní populaci nervových buněk do té doby, než je dosaženo konfluence a aktivaci uvedených kontrolních prostředků tak, aby se odstranil funkční účinek imortali začnich agens a tak došlo k apoptose buněk.

20. Buněčné linie produkované způsobem podle nároků 1 až 18.

21. Nervové buněčné linie podle nároků 1 až 18, mající plně diferencovaný fenotyp.

22. Non-mitotické nervové buněčné linie podle nároků 1 až 18.

23. Nervové buněčné linie, které přežívají při nízkých hustotách podle nároků 1 až 18.

Claims

1. Způsob pro produkci velkých populací neurálních buněk vyznačující se tím, že zahrnuje;

4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že uvedeným prostředím je mitotické prostředí.

8. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že je poskytnuto zvýšení replikace použitím replikačního činidla jako je růstový faktor.

9. Způsob podle nároků laž7vyznačující se t í m, že je poskytnuto zvýšení replikace pomocí imortali začniho činidla.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedený onkogen zahrnuje, nebo je s ním asociován, kontrolní prostředek.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedený kontrolní prostředek je reagující na kultivační podmínky nebo na stav prostředí.

17. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že uvedená homogenní populace buněk je vystavena alespoň jednomu růstovému faktoru.

18. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že dále obsahuje transformaci prvotních nediferencovaných nervových buněk bezpečnostním genem, který je bud konstitutivní, nebo může být selektivně aktivován tak, že je v každém případě schopen selektivního zneschopnění nebo destrukce uvedené buněčné linie.

19. Způsob poskytnutí nervových buněčných linií, které mohou selektivně podléhat apoptose vyznačující se t i m, že obsahuje:

a) imortalizaci prvotních nediferencovaných nervových buněk nebo prekurzorů nervových buněk imortalizačním činidlem, které obsahuje, nebo je s ním asociováno, kontrolní prostředek, takže imortalizační agens může být selekt ivně akt ivováno/deaktivováno.

b) kultivaci uvedených imortalizovaných nervových buněk tak, aby poskytovaly homogenní populaci uvedených nervových buněk do té doby, než je dosaženo konfluence; a

c) aktivaci uvedených kontrolních prostředků tak, aby se odstranil funkční účinek imortali začnich agens a tak došlo k apoptose buněk.

20. Buněčné linie produkované podle způsobu vynálezu.

21. Nervové buněčné linie mající plně diferencovaný fenotyp.

22. Non-mitotické nervové buněčné linie.

23 Nervové buněčné linie, které přežívají při nízkých hustotách.

změněný list IPEA/EP

Tabulka 1

Souhr pokusů provedených s klonem 1 imortalizované buněčné linie

Buňka ICa(5mM Ca) IBa(30mM Ba) -CgTxGVIA -AgalVA 1(2týden) 0 nd nd nd 2(2týden) <50pA nd nd nd 3(2týden) 0 nd nd nd 4(2týden) 0 nd nd nd 5 (2týden) 0 nd nd nd 6(2týden) 0 nd nd nd 7(2týden) <50pA nd nd nd 8(2týden) >100pA >200pA 100%@1μΜ nd 9(2týden) >100pA >200pA 70% @100nM nečitiivý (50nM) 10(4týden) 0 0 nd nd 11(4týden) nd <50pA nd nd 12(4týden) 0 >200pA 70% @1μΜ nd

6/12 buněk mělo ICa

Predominantní N typ

V jedné buňce zbytkovýproud není inhibován -AgalVA změněný list