CS566490A3 - Determination of appendicitis by determining concentration of delta hydroxyhippuric acid in urine - Google Patents

Determination of appendicitis by determining concentration of delta hydroxyhippuric acid in urine Download PDF

Info

Publication number
CS566490A3
CS566490A3 CS905664A CS566490A CS566490A3 CS 566490 A3 CS566490 A3 CS 566490A3 CS 905664 A CS905664 A CS 905664A CS 566490 A CS566490 A CS 566490A CS 566490 A3 CS566490 A3 CS 566490A3
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
acid
urine
hydroxyhippuric
appendicitis
sample
Prior art date
Application number
CS905664A
Other languages
English (en)
Inventor
David Bar-Or
Original Assignee
Appenditech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Appenditech Inc filed Critical Appenditech Inc
Publication of CS566490A3 publication Critical patent/CS566490A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • G01N33/523—Single-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/105831—Protein or peptide standard or control [e.g., hemoglobin, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Způsob zjišťování zápalu slepého střeva měřením koncentracekyseliny cf-hydroxyhippurové v *«£
Obffát techniky
Vynález se týká způsobu lištování zápalu slepého střevau lidí. Především se vynález týká zjištov_.ní zápalu slepéhostřeva na základě chemické analyzy moče lidí, u kterých jepodezření na zápal slepého střeva.
Dosavadní stav techniky Význam vynálezu dokládá skutečnost, že při diagnosticezápalu slepého střeva musí lékař č^sto odlišovat toto onemoc-nění od jiných onemocnění břišní a pánevní oblasti, jako jeabdominální aortické aneurysma, pánevní zánětlivé onemocnění,mimoděložhí těhotenství, protržený nebo perforovaný viscus.gastrointestinální krvácení, hemorrhagická pancreatitis, per-forované diverticulum, vaječníkový absces, Crohnova nemoc,mesenterická adenitická intestinální obstrukce, gastroente-ritis, diverticulitis, vaječníková cysta a avaječníko vejco-vodová patologie. iakováto onemocnění často simulují Bápal slepého střevaa lékař nemá často plně vyvinutý obraz, aby mohl spolehlivězápal slepého střeva určit; potvrzení periumbilikální boles-ti po dobu alespoň 72 hodin, migrace takové bolesti do pravé-ho spádního kvadrantu nemocného při teplotě 37,5 sž 38,5 °C,břišní citlivost, břišní tvrdost, soustředění bolesti do pra-vého spodního břišního kvadrantu, zjištování tvrdosti přirektálním vyšetření. Zjištění shora uvedených diagnostickýchindikací naznačuje podezření, že u nemocného jde o zápal sle-pého střeva. Z mnoha hledisek jsou často užitečnější negativ-ní zjištění napomáhající vyloučení onemocnění zápalem slepéhostřeva. Z nejběžnější negativních indikací se uvádí sympto-my přetrvávající déle než 72 hcdin, lokalizace boleli v jinéoblasti, než shora uvedeno, teplota pod 37,5 0 nebo nad 38,5 2 °G a nepřítomnost nechutenství k jídlu.
Na neštěstí ani počet leukocytů ani rentgenické snímky ne-jsou citlivé nebo specifické pro zápal slepého střeva. Kromětoho dosud nebyly vyvinuty spolehlivé chemické zkoušky prozjištění zápalu slepého střeva. Proto se diagnostika zápalu sle-pého střeva provádeí většinou jedině na základě shora uvede-ných klinických vyšetřní. Proto velký počet nemocných se do-stává na operační sál pro explorativní operace, přičemž střed-ní počet, mylých pozitivních vyšetření je 20 Tento poměrněvysoký, počet chybných diagnos je přijatelný, jelikož je tře-ba okamžitých zásahů, aby se předešlo akutnímu onemocnění, ře-šenému odnětím slepého střeva pro předcházerií jeho protržení,zánětu pobřišnice, dlouhodobému onemocnění a dokonce úmrtí.
Podstatou vynálezu je umožnit lékaři porovnat skutečnosturčitých prahových koncentrací kyseliny íO-hydroxyhippurovés určitým chorobným stavem, zvláště se zápalem slepého stře-va. Tento poznatek je důležitý, jelikož kyselina <?-hydroxy-hippurová se v těle normálně vytváří v nižší koncentraci. K takovému vytváření dochází pravděpodobně hlavně konjugacíorto-hydroxybenzoové kyyelin.y /kyseliny salicylové/ a glycinu.Enzymem, který tuto reakci katalýzaje, je glycin N-acylasa az tohoto označení vyplývá, že jeho působení vede k vytvářeníčetných různých glycinových konjugátů. Proto je kyselinaO* -hydroxyhippurová normální složkou moče lidí, ale i různýchživočichů, jako například koní a psů. Zjistila se také vekravském mléku. Na základě těchto poznatků je pracovníkům v o- v boru jasné, že tato pozorování sama o sobě, neumožňují závě-ry o zdroji této sloučeniny v moči, například zda jde zcela odietní záležitost nebo zda je kyselina ^hydroxyhippurovázčásti nebo zcela endogenního původu. Například některé zá-kladní biochemické studie prokázaly, že se orto-hydroxybenzo-ová kyselina může vytvářet acetátmalonátovou cestou shikimo-vé kypeliny. Je také doměnka, že sloučenina může být odvozenaod tryptofanu.
Ve velké míře se studovalo vylučování kyseliny CT -hydroxy-hippurové močí podáváním salicylátú ε/nebo podáváním samotné ť-hydroxyhippurové kyseliny. Je však mnohem omezenější sou-bor znalostí se zřetelem na fysiologické a patologické závěrynadměrného vytváření kyseliny -hydroxyhippurové ve srovnánís manifestací onemocnění nebo rozrušených metQbolických procesů. Například je známo, že se kyselina </-hydroxyhippurovájak odfiltrovává tak vylučuje ledvinami, přičemž k sekreci docházi, alespoň v případě psů, za vysoké koncentrace krve. Zdáse také, že se akumuluje v kortexu řezů králičích ledvin.
Zdá se, že tuto akumulaci snižuje hypoxia. Kyselina .^-hyd-roxyhippurová se mění, alespoň částečně, zpět na salicylátiv případě psů snižje exkreci para-aminohippuratu. Přítomnost nebo nepřítomnost kyseliny eT-hydroxyhippu-rové v lidské moči se začíná spojovat s určitými specifický-mi chrobnými stavy. Toto spojování je dobře shrnuto v lite-ratuře /například obecně Clinical Fharmacology and Therapeu-tics 15, 2, str. 111 až 117, 1574/. Například se v takové li-teratuře uvádí, že horečnaté stavy obecně mají sklon snižovatvytváření kyseliny 0" -hydroxyhippurové. Onemocnění jater všakobecně nevyvolává žádné změny v exkreci kyseliny flT-hydroxy-hippurové. Na druhé straně musi^skeletábí trauma a břišní o-perace vedou ke zvýšenému vylučování kyseliny {T^-hydroxy-hippurové. Zvyšování exkrece kyseliny (Τ’-hydroxyhippurové setaké zjištuje u pacientů s anemií a s chronickým traumatickýmmuskuloskeletálním trauma. Zjistilo se také, že levodopa amethyl dopa zvyšují exkreci kyseliny (5*-hydroxyhippurové. U-remičtí nemocní vykazjí zvýšenou koncentraci v seru a v dia-lytické kapalině. Některá podrobnější a doložená pozorovánív literatuře, zaměřené na poměr O"-hydroxyhippurové/onemocně-ní, jsou uvedeny v následující literatuře:
Horečka: Zjistilo se, že vytváření kyseliny íZ*-hydroxy-hippurové ze salicylové kyseliny je značně sníženo u osobs horečkou /Kapp. Ξ.Μ., a Coburn, A.F.: Urinary metabolitesof sodium salicylate, J. Biol. Chem., 145, str. 549 až 565,1942/.
Trauma: Břišní operace vedou ke zvýšeni vylučování kyse-liny /j* -hydroxyhippurové s mečí a ke zvýšenému vylučování hippurové kyseliny /Szumiel I., Chmielewska, I. a Minicki, J: - 4 - N-substituted. peptides in urine in the postoperative period,N-substituované peptidy v moči v pooperačním období, Bull.Ácad. Fol. Sci. /Biol/ 13, str. 565 až 567, AS65/. Zjistilose také, že moč nemocných se závažným muskuloskeletálnímtrauma obsahuje zvýšená množství tohoto materiálu z endogen-ních zdrojů. Tento vzrůst- je zvláště nápadný u jedinců sešpatným hojením ran. V této souvislosti je zajímavé poznamenat,že se salicyláty obecně uvádějí do vztahu se zpomalováním ho-jení ran. Nejsou však žádné odpovídající údaje jakéhokolivmožného vlivu kyseliny hydroxyhippurové. Avšak existencevelkého množství kyseliny ^-hydroxyhippurové naznačuje přítom-nost jejího prekursoru, kyseliny salicylové. Také se zjis-tilo, že kyselina salicylurová v případě podání se částečněhydrolyzuje na salicylát.
Zjištění zvýšené endogenní produkce kyseliny □-'-hydroxy-hippurové u nemocných po trauma také naznačuje, že zvýšená ak-tivita tyrosin-dopa-katecholaminu se může měřit studovánímexkrece močí této sloučeniny. Ve skutečnosti se zvýšená ex-krece může vysvětlovat záhadným selháním pacienta se závažnýmchronickým trauma vylučovat zvýšené množství katecholaminů aderivátů VMA močí. Ve skutečnosti tato sloučenina může indiko-vat druhou alternativní cestu katacholaminuvého metabolismu/jiného než' je indolová cesfe/.
Anemia v důsledku trauma. Pacienti s chronickým trauma-tickým muskuloskeletálním zraněním mají agenerativní hemoly-cikou anemii, která dosud nebyla plně charakterizována. Kro-mě jiného je známo, že takoví nemocní ztrácí nadměrné množ-ství železa a mědi prostřednictvím moče, což je zajímavá sku-tečnost se zřetelem na jejich zvýšené vylučování kyseliny -hydroxyhippurové, což je látka známá k vytváření kovovýchchelátů. Je však známo, že takoví nemocní vylučují jiné che- látotvorné sloučeniny za vytváření kovových chelatu ve svémoči.
Jaterní onemocnění. Snížené vytváření kyseliny hippurovéa její snížená exkrece se pozoruje u nemocných s extenzivnímparenchamatickým jaterním onemocněním, což přirozeně vede - 5 - ke studiu vytváření (Τ'-hydroxyhippurové kyseliny a ke studiujejí exkrece u těchto nemocných. Množství vylučovaní slouče-niny po podání aspirinu takovým nemocným je normální nebonízké. V případě psů s portocaválními zásahy se vylučuje mo-čí snížené množství salixylurové kyseliny.
Hypertense. Exkrece kyseliny -hydroxyhippurové jezpravidla normání u jedinců s hypertensí, u některých jednicůmůže všqk být mírně zvýšena nebo snížena. L-dopa a methyl dopa. Dodání methyl dopa samičkám albinůkrys způsobuje zvýšené vylučování kyseliny -hydroxyhippuro-rové močí; však podání drogy v terapeutických dávkách ženáma mužům nemá tento vliv. Připomíná se také, že podle jinýchstudijních prací vzorků moče nemocných jedinců, kterým bylopodáno L-dopa pro parkinsonismus, se ve většině případů zjis-til obsah většího množství sloučenin s chromatograřickými afluorescenčními vlastnostmi kyseliny -hydroxyhippurové apříbuzných sloučenin /Llrschule, M.D., a Hegedus, Z.L.hydroxyhippurová /alicylurová/kyselina, její klinický a fy-siologický význam, Clinical Phramacology and Therapeutics, 15, 2, str. 111 až 117, 1574/.
Downův syndrom. Děti s Downovým syndromem madí abnormál-ní salicylátový metabolismus. Po podání aspirinu se ho váženadměrné množství v buňkách červených krvinek a mnohem nižšíkoncentrace v plasmě. Po podáni aspirinu je vylučování o~-hydroxyhippurové kyseliny abnormálně nízké močí.
Urenje. U nemocných ledvinovou nedostatečností se zjisti-lo zvýšené množství kyseliny hippurové v tělesných kapalináchZvýšené množství se také nalezlo v jejich seru a také v je-jich dialyzované kapalině. Je domněka, že tato zvýšené končentrace je zodpovědlná za některé projevy uremie. P«k' netento uzávěr oprávněný, zůstává k prozkoumání· Avšak odstra-nění závažného množství sloučeniny dialyzou vede k vysvětlenízáhadných ztrát železa při dialyze, jelikož sloučenina železováže. - 6 -
Pheochromocytoma. Je známo, že nemocní pheochromocytoma,vy-lučují velká množství katecholaminů avšak jen normální množst-ví kyseliny í7**-hyároxyhippurové.
Je nutno poznamenat, že se v literatuře ještě neobjevilo,ani se nenavrhovalo využít přítomnosti kyselinyť7*-hydroxyhippu-rcvé pro diagnostiku zápalu slepého střeva, ogh již bylo uve—děno zjistování zápalu slepého střeva se provádí toliko nazákladě klinického vyšetření, přičemž je z literatury známe,že dochází k častým klamným pozitivním výsledkům . Samotnéklinické zkoušky nejsou tedy spolehlivé. Byla by tedy velmižádoucí chemická zkouška, která by byla jak vysoce ciitlivátak vysoce selektivní a tak mimořádně vhodné pro diagnostiko-vání zápalu slepého střeva.
Podstata vynálezu v
Podstata způsobu zjištování zápalu spepého střeva spočí-vá podle vynálezu v tom, že se od jedince s podezřením na zá-pal slepého střeva odebere vzorek moči a zjištuje se v němkoncentrace kyseliny a<-hydroxyhippurové, přičemž obsah ales-poň přibližně 10 mg/i indikuje zápal slepého střeva u vyše-třované osoby.
Způsob podle vynálezu je tedy založen na kvalitativním akvantitativním stanovení určitého prahového množství kyseliny
Cf-hydroxyhippurové v moči a/nebo v krvi jedinců s podezře-ním na zápal slepého střeva. Například prahová koncentracekyseliny g- -hydroxyhippurové /označované běžně také jako ky-seliny orto-hydroxyhippurová kyselina/ v moči jedinců trpí-cích zápalem slepého střeva je alespoň přibližně 10 mg/1. Ta-ková koncentrace se může zjištovat různými kvantitativními,polokvantitativními nebo kvalitativními chemickými způsoby.Obzvláště výhodnými způsoby pro provádění takového zjiš-tOvéní podle vynálezu jsou chromstografie v tenke vrstva/"TLC”/ a vysokotlaká kapalinová chromatografie /"HFLC"/.Podle zvléšt výhodného provedení vynálezu se za prahovoukoncentraci může považovat koncentrace, která poskytuje ur- - 7 - čité, dále popsané, empirické indikace takových koncentrací,když se moč podrobuje určitým procedurám chromátografie v ten-ké vrstvě. Nejužitečnější z těchto indikací empirických je ob-jevení modré fluorescenční skvrny /při vizuálním pozorování/pod zdrojem ultrafialového světla při 250 až 360 nm a/neboprodukce vizuálně pozorovatelné zabarvené skvrny, když kyse-lina. {Z*-hydrcxyhippurová reaguje s různými ionty vytvářející- 4.4-4- 4.4- , . mi. barevnou reakci, jako jsou ionty Fe a Cu . xato kon-centrace kyseliny 6^-hydroxyhippurové 10 mg/1. je klinicky prozápal slepého střeva přezkoušena a osvědčila se.
Pro zjistovéní kyseliny -hydroxyhippurové v lidské mo-či byly vyvinuty ještě další empirické chemické zkoušky prozjištění její přítomnosti i její koncentrace, přičemž se ta-kové zkoušky mohou provádět také pro zjištění její přítomnos-ti v lidské krvi, přičemž tyto zkoušky bude dále ještě pod-robně popsány. Nejvýhodnější a nejspecifičtější z těchto em-pirických zmoušek moče pacientů je především extrakce kyseli-ny -hydroxyhippurové a pak její hhromatografie v tenkévrstvě /”TLC”/. Nakonec se může použít vizuálního hodnocení.Vizuální hodnocení se s výhodou provádí za použití ultrafia-lového světla nebo se provádí barevná reakce ke zjištění,zdali je barevná skvrna se svým retenčním faktorem /rf/ srov-natelná nebo je nesrovnatelná se známou čistou standardní cf -hydroxyhippurovou kyselinou. Přítomnost takové skvrny jezvláště užitečným indikátorem přítomnosti kyseliny o-*-hyd-ro.xyhippurové v koncentraci alespoň 10 g/1, což je indikativ-ní na zápal slepého střeva u jednince s podezřením na toto o-nemocnení. Výsledky rychlejší avšak méně specifické indikační barevné reakční zkoušky, která bude dále popsána, se mohou použítk doložení vztahu k zápalu slepého střeva.Při výhodném pro-vedení způsobu má tato barevná reakcní zkouška povahu před-běžné zkoušky, načež se provádí exatnější forma zkoušky /připomíná se, že nepřítomnost barevné reakce je rovněž jako ta-ková, velmi užitečným negativním indikátorem zápalu slepéhostřeva/. 8
Na základě přítomnosti kyseliny ^-hydroxyhippurové ve sho-ra uvedeném množství nebo ve vyšším množství než 10 mg/]/které je považováno na prahovou koncentraci/ jakožto indika-ci zápalu slepého střeva jsou založeny jak kvalitativní takkvantitativní identifikační způsoby. Jakožto další takové in- dikační postupy se uvádějí: vysokotlaká kapalinový chmmatografie /"HPLC"/ hmotová spektrometrie /"Tví?"/ vysoce rozlišovací hmotová spektrometrie /"KRM?"/ plynová chromátografická hmotová spektrometrie /"GCMS"/nukleární magnetická resonanční spektrometrie. /"Nit®."/ ultrafialová absorpční světelná spektroskopie /”UV"/ fluorecenční spektroskopie infračervená spektroskopie /"IR"/ spektrofotometrická kolorimetrie porovnání s barevným standardem monoclonální zkoušky protilátek ratoimunozkoušky enzymatické zkoušky elektroforeza.
Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis s při-pojenými obrázky: na obr. 1 jsou stupně a zařízení pro prová-dění procedury A, sestávající ze dvou stupňů; na obr. 2 jsoustupně a zařízení pro provádění procedury A, sestávající zedvou stupňů /A a B/.
Způsob podle vynálezu se může provádět různými výhodnýmipostupy. Některá výhodná provedení zahrnují chemické zkoušky,jiná jsou spíše aparaturní /například zkušební zařízení/ dob-ře vhodná pro provádění určitých výhodných chemických postupů. Příklady provedení vynálezu Výhodný způsob stanovení kyseliny <ý^hydroxyhippurové přímov moči za použití oxidu křemičitého s ionicky vázaným troj-mocným železem myl vyvinut obzvláště účinný způsob zlepšení reakce - 9 - barevné s trojmocným železitým iontem za využití kyselé pova-hy povrchu silikagelu. Citlivost a selektivita a intenzita té-to barevné, reakce se může do určité míry řídit hodnotou pH,rozpouštědlovým prostředím a koncentrací železitého iontuv roztoku» Nakonec se využívá fixace železitého iontu na po-vrch oxidu křemičitého a oxidu křemičitého k dodání kyselostivzorku moče» Výsledného materiálu se mpže použít jakožto vol-ně tekoucího prášku nebo jakožto povlaku na pevné podložce amůže se ho používat ve formě zkušebních pásků nebo papírků.Jakožto jiné nosičové materiály se uvádějí vedle oxidu křemi-čitého Celit , hlinka, oxid hlinitý a/nebo žáruvzdorná cihla. Výhodný způsob pro přípravu oxidu křemičitého vázajícího že-lezité ionty
Rozpustí se 40 g hexahydrátu dusičnanu železitého ve 40ml 25&amp; chlorovodíkové kyseliny a prozvučuje se po dobu 15 mi-nut. Fak se do roztoku dusičnanu železitého pomalu vmíchá100 g oxidu křemičitého až do získání volně tekoucího prášku.Zpracování povrchu oxidu křemičitého chlorovodíkovou kyseli-nou před přidáním do roztoku dusičnanu železitého aktivujepovrch hydrosolu k ionickému vázání železitých skupin. Výhodný způsob detekce kyseliny <^-hydroxyhippurové přímo v moči
Pro účely této zkoušky se moč pacienta s podezřením nazápal slepého střeva používá přímo, to znamená, že se kyseli-na <o -hydroxyhippurová před zkouškou z moče neextrahuje.
Reakční činidlo - ICC mg oxidu křemičitého s vázanými žele- zitými ionty v 1 ml fiolezpůsob detekce - pozorování barvyPostup
Vnese se přibližně 20b mikrolitrů moče do 1 ml množstvíoxidu křemičitého s vázanými železitými ionty ve fiole. Fio-le se protřepe a nechá se usadit po dobu dvou minut. Výsledky η-srevná změna horní vrstvy kapaliny z normální močeze světle žluté na růžovou, červenou nebo fialovou indikujevysokou koncentraci fenolů a zvláště kyseliny <3" -hydroxy-
1G hippurové, což je jako takové indikativní pro zápal slepéhostřeva. Mnohem důležitější v případě této nespecifické zkouš-ky je, když nedojde k žádné barevné změně, což vylučuje zápalslepého střeva. Této barevné změny se nejlépe využívá při po-rovnaní výsledku buď s barevnou srovnávací destičkou nebos pozitními nebo negativními značkovači.
Pracovníku v oboru je jasné, že je možno použít mnoha dalších způsobů k detekci minimální přítomnosti a popřípadě kemnoho přesnějšímu stanovené koncentrace kyseliny gr-hydroxy-hippurové v moči. Tak se může použít vysokotlaké kapalinovéchromatografie /"HPLC"/, chromátografie v tenké vrstva /"TLC"/plynové chromátografie /"GC"/ a jiných chromatografickýchtechnik, jakož také .ultrafialové /"UV"/, infračervené /"IR"/a viditelné spektroskopie, nukleární magnetické resonance/"NMR"/, hmototvé spektrometrie /GC/hmotové spektrometrie,specifických impregnovaných zkušebních papírků, reakcí ba-revných změn, monoclonálních protilátek, radioimunozkoušek,enzymů, elektroforesy a/nebo kombinace těchto postupů prodetekci minimální koncentrace kyseliny q—hydroxyhippurové/například 10 mg/1 nebo více mg/1/, která je ve vztahu k zá-palu slepého střeva. Ze shora uvedených způsobů jsou kapali-nové chromátografické způsoby /například HPLC a TLC/ nejvý-hodnějšími pro přesné stanovení a selektivní měření koncen-trací kyseliny ^T-hydroxyhitppurové, což je důležité pro po-souzení stavu nemocného; je však také nutno připomenout,že světelná spektrofotometrie a způsoby,založené na barev-né změně, dávají rychlejší avšak méně selektivní výsledky.
Jemnější podrobnosti těchto a dalších výhodných speci-fických způsobů, kterými se může kyselina -hydroxyhippuro-vá, jakožto složka vzorku moče, identifikovat a kvantitativněstanovit, spolu s některými representativními příklady pro-vedení těchto technik se zřetelem na některé z těchto ana-lytických používaných způsobů, vynález ještě blíže objasní.Extrakce pevné fáze
Jelikož je kyselina¢7 -hydroxyhippurové jakožto složka vzorku moče v roztoku s komplexní matricí bílkovin, solí a ji-ných sloučenin normálně obsažených v moci, je žádoucí chemic-ky tuto sloučeninu extrahovat za minimálního množství zne-čišťujících látek» Jakkoliv dávají vynikající výsledky běžnézpůsoby rozpouštědlové extrakce za použití chemických systé-mů, jako je diethyl ether a butanol za nastavení hodnoty pH,je použití zjednodušené extrakce do pevné fáze rychlejší ačistší. Jakožto dva příklady takových chemických extrakcí seuvádějí použití Cl8 oxidu křemičitého, přičemž podle příkla-du /A/ se používá kyseliny cf-hydroxyhippurové ve vodném pro-středí a podle příkladu /B/ se používá nosičů kyseliny ^f-hyd-roxyhippurové v methanolovém prostředí. Určitého extrakčníhozpůsobu se může používat v závislosti na žádaném nosičovém v . prostředí potřebném pro další analytický stupen. Zkoušejí sei jiné vázající fáze, jako jsou kratší alkylové postranní ře-tězce jakožto fáze využívající ionexové schopnosti jakoNH^, CN a jiných skupin <s obecně stejným úspěchem za použitímírně odlišných elučních rozpouštědel, známých ze stavu tech-niky.
Příklad A
Extrakce moči do vodného rozpouštědla vakožto slabé kyseliny vytvářejí fenoly soli se sodíkema s jinými alkalickými kovy velmi snadno při hodnotě pH 2 ne-bo 3 jednotek nad jejich pKa. Tyto soli jsou ve vodě velmi dob-ře rozpustné, takže se ve skutečnosti nezadržují ve sloupcivyplněném Cl 8 oxidem křemičitým. Proto se ionizace Dotlačujepufrováním moči na alespoň 2 až 3 pH jednotky pod jejich pKa.Sloučenina se pak zachycuje ve sloupci.
Pro objasnění tohoto jevu se provádějí následující ex-trakce: 1/ loužije se. C18 oxidu křemičitého v extrakční trubceobsahující 100 mg materiálu. 2/ Slouec se prcmyje 1 ml methanolu a pak 1 ml vody. 3/ Okyselí se 1 ml vzorek moče buď 100 yul koncentrcvané - 12 - kyseliny chlorovodíkové nebo 100 mg kyseliny citrónové ne-bo přidáním ionexové pryskyřice s nechá se stát po dobupřibližně dvou minut. Okyselená moč se pak vede předem kondicionov&amp;ncu extrakční trubkou obsahující 1 ml C18. 4/ hrubka se pak promýje 1 ml vody a promývací. kapalina sevyhodí. 5/ Materiál se pak eluuje 1 ml octěnu sodného jakožto pufruo koncentraci 0,05M, hodnota pK 6,0 /může se použit jaké-hokoliv jiného pufru o hodnotě pH nad 5,5/. hluční kapalina je pro oči bezbarvá a žlutý a hnědý pigment močijzůstal ve sloupci, takže neznečistil eluant, Iři zkoušce na získání a koncentraci jsou dostatečné atypické příkladné hodnoty, jak dole uvedeno. Salicylová kyse-lina vykazuje také velmi podobné hodnoty, což lze jen očeká-vat, pro podobnou stukturu. Získání kyseliny 0"-hydroxyhippurové je následující:
Eluční objem % získání Celkové získané ; 1 ml 47,0 % 47,0 % 2 ml 24,6 % 71,6 % 3 ml 10,7 % 82,3 % 4 ml 6,5 % 88,8 %
Poznámka: Použití různých pufrů pH nebo koncentrace se zdá,že má malý vliv na získání. Studium kyseliny salicylové pos-kytuje podobné výsledky.
Příklad B
Extrakce moči do methanolu
Za použití nepolární extrakce a při úvaze, že jsou feno-ly slabými kyselinami se ionizace potlačuje pufrováním močina alespoň 2 až 3 jednotky pod její hodnotou pKa. Sloučeninase pak získá kolonou plněnou oxidem kiemičitým C18.
Provede se následující extrakce: 1/ Použije se extrekční trubky s oxidem křemičitým Cl 8 obsahu jící 100 mg tohoto materiálu. - 13 - 2/ Sloupec se promyje 1 ml methanolu &amp; pak 1 ml vody. 3/ Okyselí se 1 ml vzorku moče bu5 koncentrovanou kyselinouchlorovodíkovou v množství 100 ^ul nebo 100 mg kyselinycitrónové nebo přidáním ionexové pryskyřice, načež se ne-chá stát po dobu dvou minut. Okyselená moč se pak vede pře-dem kondicionovanou extrakční trubkou s 1 ml C18. 4/ Trubka se pak promyje 1 ml vody a promývací kapalina sevyhodí. 5/ Materiál se eluuje 1 ml methanolu.
Barva eluované kapaliny je od bezbarvé po žlutou až hně-dou. V průběhu procesu se: ně.co močového pigmentu ze sloupceodstraní. Fři zkoušce na kyselinu -hydroxyjiippurovou je cel-kové získané procento 95. až 100 %, Iv tomto případě kyseli-na salicyklová vykazuje velmi podobné hodnoty, což bylo lze o-čekávat na základě podobné struktury.
Chromátografie v tenké vrstvě
Chromatografie v tenké vrstvě je pravděpodobně nejsnad-nějším kvalitativním způsobem identifikace prahových koncent-rací kyseliny Cf-hydroxyhippurové v moči pacientů s podezře-ním na zápal slepého střeva. Tenká vrstva oxidu křemičité-ho buď na skle, kovu nebo plastické hmotě, s výhodou bezjakéhokoliv indikátoru fluorescence se normálně používá ač-koXiv papír a papír napuštěný oxidem křemičitým dávají podob-né výsledky. Připomíná se, že se používá čerstvých vzorků mo-če a s výhodou před zmrazením. Místo vzorků moče nebo vedlenich se také může používat vzorků krve.
Způsob
Ks povrch desky se nanese skvrna 1 sž 5 mikrolitrů metha-nolového extraktu vzorků moče, získaného použitím extrakční-ho způsobu /B/, shora popsaného. Peška se pak vyvíjí za po-užití vzestupné techniky s elučním rozpouštědlem jakožto mo-bilní fází obsahujícím jeden díl ledové kyseliny octové a 99dílů ethylacetétu. 14
Detekce se provádí Jedním ze dvou způsobů: použije se ultrafialového světle 250 sž 350 nm, čímž se vy-tvoří modrá fluorescenční skvrna nebo b/ deska se postříká nebo ponoří do roztoku dusičnanu železi-tého v methanolu k vývoji červené skvrny. Výsledky Výsledky chrométografie v tenké vrstvě za těchto podmínekodhalují skvrnu s retenčním faktorem /Rf/ přibližně 0,4 prokyselinu σ''-hydroxyhippurovou a 0,6 pro kyselinu salicylovou.Vždy se provádí zkouška s destičkou se standardem čisté ky-seliny fiP-hydroxyhippurové pro posouzení jakékoliv menšízměny v mobilní fázi nebo ve složení oxidu křemičitého. Ten-to zvláštní rozpouštědlový systém odděluje kyselinu hippuro-vou, kyselinu <3~-hyčLroxyhippurovou s kyselinu salicylovou.Jiných systémů se používá pro oddělení jiných možných nečis-tot .
Analýza vysokotlakou kapalinovou chromátografií
Vysokotlaká kapalinová chromatografická analýza je vyso-ce výhodná kvantitativní chromatografická metoda pro stanove-ní prahové a vyšší koncentrace kyseliny CT-hydroxyhippurovév moči nemocných s podezřením na zápal slepého střeva.
Vzorky moči, s výhodou čerstvé a nezmražené jsou zpravid-la vhodné pro toto stanovení i když se také podobně může pou-žívat vzorků krve. Jelikož je tento způsob kvantitativní aněkteří nemocní vykazují koncentraci nad 2 g/1, může teplotaskladování moče pod 4 °G způsobit u vzorků s tak vysokou kon-centrací kyseliny rj- -hydroxyhippurové, že dojde k vysráženíz roztoku a tak k nižším hodnotám při stanovení..
Pracovník v oboru rovněž posoudí vhodnost použití růz-ných způsobů stanovení, aby se v daném případě vždy dosáhloco největší citlivosti a selektivity. Pro delší vyšetření ne-mocného je možné monitorování se zřetelem na specifickou dél-ku vln, fluorescenci, elektrochemické a hmotové stanovení.Způsob
Používá se 5 sž 25 mikrolitrů extraktu vzorku moče, - 15 - získaných shora popsanými způsoby, a tyto vzorky se zavádějído systému vysokotlaké kapalinové chromátografie HPLC za ná-sledujících podmínek1: rozpouštědlo rychlost toku sloupec rozměr teplota detektor 50 % methanolu a 50 % fosfátového pufru0,01M o pH 2,31 ml/min
Cl 8 Apex oktedecyL
5/Um 15 cm x 4,5 mm, vnitřní průměr20 °C UV při 236 a/nebo 300 nm Výsledky analyzy HPLC se kvantifikují za použití mnoha-bodové kalibrace a získá se dobrý lineární souhlas v oborukoncentrací 1 až 2000 mg/1. Za těchto podmínek se objeví píks dobou retence 3,0 minut s absorbančním soektrem odpovídají-cím kyseliny éT^hydroxyhippurové. Podobné separace se dosáhnemezi všemi interferujícími sloučeninami, jako je napříkladkyselina hippurová, kyselina salicylová a různé jiné fenolic-ké sloučeniny. Toho je zapotřebí ke snížení mylných hodnotv důsledku podání salicylátu.Všechny identifikace sloučenina retenční doby se hodnotí za použití čistých známých stan-dardů. Dále je uveden příklad získaných hodnot z HPLC stano-vení pro’ typický vzorek pacientů:
Ref Kyselina čT^-hydroxyhippurová . mg/1 Kyselina salicylová mg/1 Výsledek chirurgie 138 743 16 + 151 1393 0 + 143 1609 43 + 152 159 0 + 187 524 45 + 196 255 52 + 136. 92 0 + 139 642 460 + 197 56 <10 + 148 331 0 + 1 45 0 0 - 140 0 ϋ - 16
Ref Kyselina ^-hydroxy· Kyselina Výsledek hippurová salicylová chirurgie mg/1 mg/1 194 645 0 + 142 0 0 199 0 0 — 147 0 0 136/2 : 20 43 + 149 0 0 - Tyto výsledky ja^sně dokládají vzte h prahové koncentrace kyseliny ď-hydroxyhippurové k zápslu slepého střeva, který jedoložen chirurgicky.
Reakce k získání barevného derivátu
Se zřetelem na fenolické charakteristiky kyseliny <y-hyd-roxyhippurové byl vyvinut způsob k vyvolání reakce s barev-nou změnou ke zviditelnění extrahované kyseliny &amp; -hydroxyhip-purové. Úvahy jsou založeny na skutečnosti, že Fe^+++ a Cu ++a jiné kovové soli se již dlouho používají pro detekci biolo-gických sloučenin, zvláště fenolů a enolů /a také několikaaminů/ na základě vytváření komplexních železitých fenoxidů.Komplex se vytvoří pomocí elektronů, které jsou schopny de-lokalizace na aromatických jádrech. Produkovaná barevná změ-na od zelené k purpurové závisí na typu fenolu. Tento typ re-akce, jakkoliv je citlivá, není specifický pro určitou feno-lovou skupinu, takže se stanoví všechny potenciálně reaktiv-ní materiály /nikoliv tedy jeden určitý specifický materiál/.Příkladně se uvádí:
Zjištěný stavfenylketonuriatyrosinemiahistidinemia v chorobné moči
Metabolit.fenylpyruvátp-hydroxyfenylpyruvátimidazolpyruvát rozvětvené ketokyseliny javorový sirup 5-hydroxyindoloctová kyselina karcinoidsalicyláty toxicita fenothiaziny toxicita
Pro pochopení tohoto mechanismu se uvádějí následujícíspektrofotometrické a barevné srovnávací způsoby: - 17 -
Barevná reakce přímo s močí
Pro účely této zkoušky se používá přímo moči jedince s po-dezřením na zápal slepého střeva, přičemž se tato moč předzkouškou nepodrobuje extrakci.
Reakční činidlo: 3M roztok hydratovaného dusičnanu železitéhov 3M chlorovodíkové kyselině a vodě detekce: UV-VIS spektrofotometr Hitachi U20C0 a pozo- rování barvy
Způsob
Do 1 ml moče se vnese 0,1 ml reakčního činidla a vizuál-ně se pozoruje barevná změna. Fro hodnocení měření absorbancese volí 400 až 900 nm. a vypočte se následující polokvantita-tivní hodnocení po posouzení normální moče. Pokud je odečte-ní absorbance větší než 2,0, pak se vzorek, moče zředí 1 dílmoče na 10 dílů vody a pro výpočet se použije odpovídajícíhofaktoru. Konstruuje se kalibrační křivka přidáním známéhomnožství kyseliny č"-hydroxyhippurové do normální moče, kte-rá je lineární až do 300 mg/1. Do téhož standardu se přidámnožství reakčního činidla pro vytvoření standardní řady probarevné porovnávání. Výsledky takových zkoušek se fotografujía používá se jich pro barevné srovnávaní zkoušených vzorkůpro stanovení prahové koncentrace kyseliny cr-hydroxyhippu-rové. Výsledky
Jelikož nejde o specifický způsob, zaznamenávají se vel-ké rozdíly v případě HPLC stanovení a rozdíly výpočtu vyšet-řované moče. Hodnoty při tomto způsobu jsou mnohem vyšší, je-likož se na celkovém výsledku podílejí všechny reaktivní ma-teriály. Zjištuje se dobrý vztah mezi hodnocenou močí /vět-ší než 500 mg/1/ a odpovídajícím vzrůstem absoiPcie·' ' 18
Ref Poměr ředění Ábs. 620 nm Konc.mg/1 Barevní změna á Výsledekchirurgie OHHA 1 :1 0,620 316 ano NOEM 1 :1 9,238 0 ne 138 10:1 0,295 1371 ano + 151 10:1 0 Í750 3671 ano + 143 10:1 0,667 3303 ano + 152 1 :1 0,553 159 ano + 187 10:1 0,272 1255 ano + 196 1 :1 1 ,281 527 ano + 136 1 :1 0,456 110 ano + 139 10:1 0,597 2898 ano + 197 1 :1 0,815 292 ano + 148 1 :1 0,714 241 ano + 145 1 :1 0,162 Q ' ne — 140 1 :1 1 ,047 409 ano — 194 1 :1 0,648 207 ano + 142 1 :1 0,346 32 .ne - 199 1 :1 0,756 262 ano - 147 1 :1 0,211 0 ne - 136/2 1 :1 0,474 1Í9 ano + Jakkoliv je měření absorpce při specifické vlnové dél- ce přesným měřením, komplexní povaha vytváření barvy v přípa-dě mnoha různých složek, obsažených v moči, vede k nepřesnos-tem. Pozorování barevné změny a následné porovnání se stan-dardy nebo s barevnou tabulkou poskytuje lepší vztah k pří-tomnosti vysokých koncentrací kyseliny cr^-hydroxyhippurové.Například barevná změna od normální světle žluté moče k rů-žené, červené nebo fialové barvě indikuje vysokou koncentra-ci. fenolických sloučenin, což může být indikativní pro zápal,slepého střeva. Mnohem důležitější při této nespecifické me-todě je skutečnost, že žádná barevná změna vylučuje zápalslepého střeva. garevná reakce v případě extrahované moče
Pro účely této zkoušky se moč jedinců s podezřením na zópal slepého střeva extrahuje způsobem podle odstavce /B/. Pro 19 tuto zkoušku se používá 1 ml vzorku methanolového extraktu.Reakční činidlo 2% roztok hydratovaného dusičnanu železité- ho v methanolu
Detekce UV-VIS spektrofotometr Hitachi U2000 a foto- metr k pozorování barvy
Způsob
Do 1 ml methanolového extraktu moče se vnese 0,1 ml re-akčního činidla a vizuálně se pozoruje barevná změna. Frohodnocení měření absorbance se volí 400 až 900 nm a vypočtese následující polokvantitativní posouzení po posouzenínormální moče. Pokud je odečtení absorbance větší než 2,0,pak se vzorek moče zředí na 1 díl moče na 10 dílů methanolua pro výpočet se použije odpovídajícího faktoru. Konstruujese kalibrační křivka zředěním známého standardu kyselinyV -hydroxyhippurové, která je lineární až do 600 mg/1. Dotéhož standardu se přidá množství reakčního činidla pro vy-tvoření standardní řady pro barevné porovnávání. Výsledky ta-kových zkoušek se fotografují,a používá se jich jakožto přís-slušné části barevné tabulky. Výsledky
Fodobně jako v případě předchozího způsobu jde o nespecifický způsob a zaznamenává se řada rozdílů od stanovení způ-sobem. HPLC a od přímých výpočtů moče. Hodnoty jsou obecně větší než při způsobu HPLC avšak menší než za použití přímo mo-če. <Je to proto, že na výsledku stanovení se podílejí všech-ny složky moče. Ve srovnání se stanovením za přímého použi-tí moče jsou výsledky mnohem nižší v důsledku semiselektiv-ní extrakce, Oe dobrý vztah s vysoce koncentrovanou močí/větší než 150 mg/1/ a odpovídajícím vzrůstem absorbance.
Ref Abs. 600 nm Kbnc. mg/1 Výsledek chirurgie STD 0,354 272 n/a 138 0,875 672 + 151 1 ,712 1315 + 143 1 ,799 1383 + 152 0,212 163 + 187 0,655 503 + - 20 -
Ref Abs. 600 nm Konc.mg/1 Výsledek chirurgie 196. 0,429 330 + 136- 0,153 117 + 139 1,208 926 + 197" 0,203 156 + 148 0,11,2 86 + 145 0,066 51 - 140 0,141 108 - 194 0,325 A50 + 142 0,054 42 - 199 0,163 125 - 147 0,032 15 - 1 36/2 0,193 148 + oa kkoliv je měření absorpce při specifické vlnové délce přesným měřením, komplexní povaha vytváření barvy v případě mnoha různých složek, obsažených v moči, vede k nepřesnostem.Pozorování barevné změny a následující porovnání se standardynebo s barevnou tabulkou poskytuje lepší vztah v případě vy-sokých koncentrací kyseliny č5"-hydroxyhippurové. Napříkladbarevná změna od normální světle žluté moče k růžové, čer-vené nebo fialové barvě indikuje vysokou koncentraci fenolo-vých sloučenin, což může být indikativní pro zápal slepéhostřeva. Mnohem důležitější při této nespecifické metodě jeskutečnost., že žádná barevná změna vylučuje zápal slepéhostřeva.
Stanovení struktury a izolace kyseliny -hydroxyhippurovéz moče
Požorování modré fluorescenční skvrny při posuzování vzor-ků moče jedinců s podezřením na zápal slepého střeva je uve-deno u chromatografie v tenké vrstvě. Izolace a identifikacesloučeniny je možná následujícím způsobem; provádí se takto:Způsob
Vzorky moče, používané pro izolaci různých složek, sekombinují od jedinců, u kterých byl potvrzen zápal slepéhostřeva a pak se zpracovávají následujícím způsobem: 21 1/ Použije se extrakční trubky s oxidem křemičitým C18 obsa-hující 5 g tohoto materiálu. 2/ Sloupec se promyje 5 ml methanolu a pak 5 ml vody. 3/ Moč se vede trubkou s C18. 4/ Trubka se pak promyje 5 mL vody a promývací kapalina sevyhodí. 5/ Materiál se eluuje 5 ml methanolu.
Barva eluované kapaliny je žlutá až hnědá. V průběhu procesu se některé pigmenty z moče odstraní, klethanol, jakožtorozpouštědlo, se odstraní za sníženého tlaku a surový zby-tek se rozpustí v malém množství methanolu a následně se ana-lyzuje způsobem TLC a HPLC. Další izolace modrého fluores-cenčního pásu se provádí nejprve chromatografií /"flash chro-matography"/ a pak preparativní chromatografií v tenké vrstvěChromatografie /"flash chromatography/
Do skleněné trubky se vnese oxid křemičitý /"flash si-lica"/ 20 - 40u a kondicionuje se chloroformem a veškerý su-rový extrakt se vnese na vrstvu. Sloupcem se vede systémchloroform/methanol /9 : 1/ za použití 200 ml rozpouštědlak extrakci veškerého modře fluoreskujícího materiálu. Ex-trakční proces se monitoruje chromatografií v tenké vrstvě aUV.
Preparativní chromátografie v tenké vrstvě
Jak TLC tak HPLC analýza dokládá že frakce chromato-grafie /"flash chromatography"/ nejsou čisté, což však bylomožno předpovídat. Z těchto extraktů je však odstraněna vět-šina polárních složek. Dalšího čištění se dosáhne spojenímfrakcí, obsahujících modře fluoreskující sloučeniny a je-jich nanesení na preparativní déstičky s oxidem křemičitýmpro chromatografií v tenké vrstvě / v počtu 6/. Pro vyvíjenídestiček se používá rozpouštědlového systému, který obsahuje80 % ethylacetátu, 20 L methanolu a 3 % kyseliny octové. Z. destičky se seškrábnou modré složky a materiál se re-extrahuje do methanolu. Filtrací a následným odstraněním roz- - 22 pouštědla se získá surový zbytek., ze kterého se mohou vysrá-žeh bílé krystaly přidáním několika kapek methanolu.
Identifikace fanolické sloučeniny hmotovou spektrometrií Předpokládá se přítomnost sloučeniny fenolického typu aprovede se počáteční vyšetření GC hmotovým spektrometrem. To-to vyšetření dokládá možnou přítomnost alespoň tří sloučenin,hlavně kyseliny hippurové, kyseliny 6Γ-hydroxyhippurové a ky-seliny salicylové. Další vzorek spektra po elektronovém bom-bardování /31/ při teplotě 2CO °C naznačuje, že 1/ je obsa-ženo více než jedna složka a 2/ jedna ze složek má molekulovouhmotnost. 195· Hlavní fragmentační vzorek ve velké míře ko-responduje s hydroxybenzoylglycinem /kyselina c? -hydroxyhippu-rová/. Následující fragmentační vzorek vykazuje fragmenty195 - 177 - 149 - 135 - 121 - 93a nebo 96b.
Podíly /a/ a /b/ ochotně ztrácejí NHCH^ /za vzniku methylaminu/ nebo NH^ avšak většina fragmentace mateřské molekulyse láme ve slabé vazbě CO-NH.
Zkoušky El také potvrzují přítomnosti intenzivního 105molekulárního iontu, který koresponduje s benzoylovým podílem.
Identifikace sloučeniny ultrafialovou spektrometrií Čištěný materiál vykazuje UV absorpční maxima při 302a 236 nm. To souhlasí s čistým standardem kyseliny čT-hyd-roxyhippurové.
Identifikace fenolické složky N-IvI.R. spektrometrií 360 MHZ NMR spektra čištěné frakce zpočátku vykazujísměs hippurové kyseliny a kyseliny cT-hydroxyhippurové v po-měru 3 : 6. Po dalším čištění je možné izolovat čistou frakci,která má identické spektrum jako čistá kyselina <o-hydroxy-hippurová.
Další identifikace HPLC K potvrzení správnosti izolované sloučeniny se provededalší esterifikace produktu. Wielý podíl kyseliny hippurové, - 23 - kyseliny <y-hydroxyhippurové a kyseliny p-hydroxyfenyloctovése převede vždy na jejich estery zahříváním pod zpětným chla-dičem v methanolovém roztoku, obsahujícím bortrifluorid. Fakse estery izolují. Identifikuje se HPLC stopa těchto esterů,která je stejná jako je podobná stopa čistých obchodních stan-dardů tří shora uvedených sloučenin.
Klinické posouzení
Provede se 100 a 51 postupných stanovení kyseliny (5“-hyd-roxyhippurové ve vzorcích moče pacientů /většinou jde o paci-enty Swedish Medical Center, Englewood, Colorado nebo LutheranMedical Center, Arvada, Colorado/, kde se analýza moče prová-dí jako součást klinického vyšetření osob s bolestmi břicha/s podezřením na zápal slepého střeva/. Výsledky zkoušky seposuzují se zřetelem na specifičnost a citlivost. Jakkoliv jedobře znám velký počet chybných pozitivních a chybných nega-tivních výsledků v případě tohoto onemocnění, přičemž v tomtopřípadě, vždy šlo o jedince s podezřením na zápal slepého stře-va, jsou výsledky zkoušky analyzy moči vysoce směrodatné. Vý-sledky takové zkoušky se musí hodnotit také z takového hle-diska, že dosud neexistupjí jiné spolehlivé chemické zkouš-ky pro zjištování onemocnění zápalem slepého střeva. Popsa-né zkoušky se použilo jen v případě jedinců s podezřením nazápal slepého střeva po standardním klinickém hodnocení. Zkouš-ka je považována za pozitivní, pokud se pozoruje modrá fluo-rescenční skvrna v oblasti souhlasící s kyselinou cf-hydroxy-hippurovou. ''ato přítomnost se pak potvrdí HPLC. Výsledkytěchto zkoušek jsou následující. 35/151 skutečně kladné /zkouška i chirurgie pozitivní/ 3/151 klamně negativní /zkouška negativní, chirurgie pozitivní/1/151 klamně pozitivní /zkouška pozitivní, chirurgie negativní/104/151 skutečné negativní /zkouška negativní, chirurgie ne- gativní nebo zbytečná/ 8/151 pozitivní zkouška avšak dále nesledováni. - 24 citlivost = _skutečně positivní_ = skutečně pozitivní + klamně negativní specifičnost, = skutečně negativní_ _ 104 = 99 0 % skutečně negativní + klamně pozitivní 104+1
Tyto výsledky jsně potvrzují objev vztahu prahové /mini-mální/ koncentrace /10 mg/1/ kyseliny £7~-hydroxyhippurovév moči. jedinců se zápalem slepého střeva, na kterém je způ-sob podle vynálezu založen. Výhodné zařízení pro provádění výhodného způsobu stanoveníkyseliny <j-'-hydroxyhippurové v moči
Za využití shora uvedeného vztahu mezi obsahem kyseliny(?"-hydrcxyhippurové v moči a zápalem slepého střeva byla vy- vinuta různá diagnostická zařízení pro zjištování zápalu sle-pého střeva. Většiny těchto diagnostických zařízení se pou-žívá pro dvoudílnou diagnostickou zkoušku pro zjištování akut-ního zápalu slepého střeva. °akkoliv je výhodné takové zku-šební zařízení ze dvou částí, jsou možná také dvě oddělenázařízení pro provádění na sobě nezávislých oddělených dvouzkoušek zjištění zápalu slepého střeva. Společné použití oboučástí však dává spolehlivější výsledky, na jejichž základěje možno provádět rozhodnutí o operaci. Úkolem diagnostickéhozařízení je možnost dobrého provádění zkoušky identifikacechemické sloučeniny /kyseliny ^f-hydroxyhippurové/ v dosta-tečných koncentracích k potvrzení zápalu slepého střeva. Ta-to sloučenina, označovaná nadále jakožto "markér" při pojed-návání o způsobu a zařízení, není zpravidla v moči v koncen-traci 10 mg/1 nebo větší nebo v krvi zdravých osob a přítom-nost tohoto "markéru" v uvedených koncentracích indikuje zá-pal slepého střeva. Podle nejvýhodnějšího provedení zkouškyse může obou částí zařízení používat odděleně, přičemž obe 35 35 + 3 = 92,3 ·.· ř’ λ ή f·: - 25 části poskytují použitelné výsledky. Část A zkoušky s výhodou poskytuje rychlé vytřídění vzorků s obsahem markéru v moči ze využití reakce oxidu křemi-čitého s železitými ionty k vyvolání barevné změny v přítom-nosti markéru u jedinců se zápalem slepého střeva. Část B zmoušky potvrzuje výsledky za použití extrakce achromátografie v tenké vrstvě, při které se markér oddělí azviditelní se jakožto barevná skvrna. Tento druhý postup slouží k potvrzení, že pozitivní výsledek Části A zkoukšy nenízpůsobem nějakou interferující nečistotou.
Chemická podstata postupu Část A výhodného provedení zkoušky je založena na re-akci vázaných železitých inotů na oxidu křemičitém jakožtomatrici, které reagují s markérem /s kyselinou ^-hydroxyhip-purovou/ v moči za vzniku růžového až tmavo hnědého nebo pur-purového zabarvení, část B této zkoušky se s výhodou rozpadádo tří procedur: 1/ extrakce vzorku pevné fáze k izolacisprávného markéru, jak bylo shora popsáno, 2/ chromatografiev tenké vrstvě a 3/ vyvolání markéru k vytvoření okem pozoro-vatelné barevné skvrny, která se porovnává s kontrolou za ú-čelem pozitivní identifikace.
Materiály pro provádění zkoušky
Složek pro toto výhodné provádění zkoušky se může pou-žívat. jakožto jednotky. Avšak součásti pro část zkoušky A asoučásti pro část zkoušky B mohou tvořit také samostatná za-řízení. V každém případě výhodné provedení zahrnuje tytodí&amp;y: Část A barevná reakční fiolapolyethylenové kapátkobarevná porovnávací destička část B 3 ml stříkačka s citrétovým pufremCl 8 extakční trubkafiola promývací vodyfiola extrakčního rozpouštědla - 26 fiola pro shromažďování vzorkutenkovrstvá destička v držákuaplikátor pro 5 skvrnuskleněná vyvíjecí nádobafiola s vyvíječím roztokemkontrolní porovnávací destička
Shromažďování vzorku
Pro zkoušku se používá vzorku čerstvé moče; moče stačíi 1 ml, zkouška se však má provést co nejrychleji po získá-ní moče. Výsledky zkoušky mohou ovlivnit konservační přísa-dy, určité potraviny a určitá léčiva.
Provádění části A zkoušky 1/ Vnese se 10 až 15 kapek vzorku moče na 1 ml oxidu křemi-čitého s železitými ionty. 2/ Za účelem promíšení se fiola několikrát obrátí. 3/ V několika sekundách vytvořené zabarvení zůstává stálé poněkolik hodin. Výsledky zkoušky se mohou odečíst za 20sekund, s výhodou na dobrém světle přoti bílému základu.
Výsledky části A
Zabarvení moči na růžovou až tmavo hnědou nebo purpuro-vou barvu indikuje možnost zápalu slepého střeva, ^srva semůže snadno odečíst za použití kontrolní porovnávací destič-ky. Kontrolní porovnávací destička s výhodou zahrnuje řadupozitivních barevných reakcí spolu s negativním oborem vý-sledků. Není zaootřebí- žádných výpočtů. Jestliže je část A-_zkoušky pozitivní, pak se většinou provádí ještě část Bzkoušky k potvrzení výsledku zjištěných částí A zkoušky.
Mocí, použitou při části B zkoušky není tatáž moč, kterése použilo při části A zkoužáy ale druhá část vzorku ode-braného pacientovi. Část B zkoušky také napomáhá určit mož-ný chybný výsledek zkoušky vlivem jiných znečišťujících lá-tek. - 27 -
rrovádění části B
Tato zkouška se rozpadá většinou do tří stupňů.
Stupeň 1 Extrakce vzorku z pevné fáze k izolaci markéru1/ Vnese se 1 ml vzorku moče do 100 mg kyseliny citrónové a mírně se promisí k rozpuštění bílých krystalů. 2/ Roztok se zavede do předem kondicionované C18 extrakčnítrubky a proteklá moč se zahodí. 3/ Extrakční trubkou se nechá protéci 1 ml vody k odstraněnísolí a proteklá kapalina se vyhodí. 4/ Extrakční trubkou se nechá protéci 1 ml methanclu k vyj-mutí kyseliny pj-hydroxyhippurové a eluant se uschová vefiole pro dalěí stupeň.
Stupeň 2 - Separace chromatografii v tenké vrstvě 1/ Za použití mádoby skleněné pro chromatografii v tenké vrst-vě se vnese 2 ml roztoku 1% kyseliny octové v methanclu nadno nádoby a nádoba se přikryje ke snížení odpařování. 2/ Za použití destičky v držáku /například v lepenkovém dr-žáku/ se položí systém destička/držák na plochý povrch. V tomto stupni se destičky nedotýkáme. Ze použití 5 nlkapiláry se kapka vzorku nanese do středu souboru /oz-načeného jako /pacientův vzorek”/, na kterém je destička. V případě potřebné koncentrace kyseliny cr-hydroxyhippu-rové má být skvrna rozpouštědla přibližně 1 až 2 mm. 3/ Skvrna se nechá několik minut zaschnout /může se využítmírného foukání/. Destička se vyjme z držáku a umístí sesvisle do skleněné nádoby. Rozpouštědlo se nechá vzlínatna destičku až například po výšku 5 mm od horního koncedestičky. Tento proces trvá zpravidla přibližně dvě minu-ty. ^ak se destička z nádoby vyjme, nechá se asi minutuzaschnout a vrátí se do lepenkového držáku.
Stupeň 3 - Vývoj markéru k vytvoření vizuální barevné skvrny 1/ Za použití roztoku dusičnanu železitého v methanolu sevnese 4 nebo 5 kapek tohoto roztoku na absorpční konecměkké cupaniny. Mokrou cupaninou se potírá okénko lepen-kového držáku hladkým pohybem. V okénku se bezprostředněobjeví barevné skvrny a výsledek se muže porovnat s xon— 28 trolním standardem. Výsledky části B zkoušky Výsledků části B zkoušky se může použít k povržení vý-sledků zkoušky části A. ^arevná skvrna ve stejné vertikálnípoloze v okénku destičky jako na kontrolním vzorku, povrzujepozitivní výsledek, jak je ukázáno ne obr. 1 a 2.
Pokud je skvrna v interferenční kontrolní oblasti, nemu-sí to nutně znamenat, že je zkouška negativní·. Může to všakznamenat, že nemocný bral nějaké léky, které mohou poskyto-vat klamně pozitivní výsledky. V takovém případě se zkouškamá po možnosti opakovat za 12 hodin a v opakování zkoušky po12 hodinách se pokračuje tak dlouho, až skvrna v interferen-ční kontrolní oblasti zmizí. Při tomto zvláštním provedení jezkouška kvalitativní a toliko semikvantitativní a intenzitaskvrny není směrodatná. Pozorování jakékoliv jasně definova-né skvrny naznačuje možnost zápalu slepého střeva.
Pracovníkům v oboru je jasné, že při interpretaci zkouš-ky je třeba také klinických úvah a profesionálního posouzenístavu vyšetřované osoby. V mnoha případech se klinická diag-nóza neprovádí na základě jediné zkoukšy ale spíše se z do-stupných klinických a laboratorních výsledků skládá celkovýobraz o nemocném. Nicméně výsleky zkoušky podle vynálezu po-skytují velmi hodnotnou informaci pro předběžné diagnostiko-váni zápalu slepého střeva. Negativní výsledky těchto zkou-šek podle vynálezu nevylučují totálně možnost zápalu slepéhostřeva, jelikož koncentrace urinárního markéru může být taknízká, že je pro zkoušku nedostatečná. Naopak pozitivní výs-ledek nemůže rovněž znamenat konečnou diagnózu bez potvrzenídalších projevů onemocnění a bez posouzení dalších faktorů.
mi způsoby, než bylo příkladně popsáno a že tedy shora uve-dené příklady neznamenají žádné omezení vynálezu.
Rovněž úkolem připojených obrázků je způsob blíže objasnit a nikbliv omezit vnáší
Na obr. 1 je znázorněno kapátko, kterým seyiG až 15 kapek - 29 moce do trubky s oxidem křemičitým s nanesenými železitýmiionty, nákres hodin, ukazujících, že se mírné promícháváníprovádí 20 až 30 sekund a barevná porovnávací destičkas barevným vzorkem rýžovým až hnědým nebo purpurově červe-ným. Tento obrázek se týká příkladného provádění části Azkoušky»
Ne obr. 2 jsou postupně zobrazeny jednotlivé fáze Části B.Vnáší se 1 ml moče ze stříkačky 1_ s citrátovým pufrem, ne-chá se protéci extrakční trubkou 2., z fioly 3. s promývacívodou, se vnese 1 ml promývací vody, z fioly £ se nechá při-téci 1 ml methanoluj do skleněné nádobky 5 se vnese vyvo-lávací rozpouštědlo, skvrna zkoušené moče se nanese na des-tičku 6_ v držáku 7, destička 6_ se vloží do skleněné nádobky5_, na absorpční konec měkké cupaniny 8_ se nanese 4 nebo 5kapek dusičnanu železitého a tímto koncem měkké cupaniny 8_se potírá destička 6. v držáku 7, přičemž se v několika se-kundách na ní zviditelný barevné skvrny.
Průmyslová využitelnost
Rychlý způsob ke spolehlivému doplnění diagnostických způsobůzápalu slepého střeva. Je založen na skutečnosti, že v močinemocných zápalem slepého střeva je zjistitelná prahová kon-centrace kyseliny čT-hydroxyhippurové.

Claims (17)

  1. 1 . Způsob 23tétování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedince, u něhož je podezře-ní na zápal slepého střeva a stanoví se v něm koncentracekyseliny ď*-hydroxyhippurové, přičemž onemocnění indikujealespoň přibližně 10 mg/1 moči.
  2. 2. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedince, u něhož, je podezře-ní na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním; a bolestí břicha,a stanoví se v něm koncentrace kyseliny ΖΓ-hydroxyhippurové, přičemž onemocnění indikuje obsah -hydroxyhippurové kyseliny přibližně 10 mg/1 moče.
  3. 3. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře-ni na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním a bolestí břicha,, a stanoví se v něm koncentrace kyse-liny ^-hydroxyhippurové v množství alespoň 10 mg/1 chemic-kým identifikačním způsobem ze souboru zahrnujícího chroma-tografii v tenké vrstvě, vysokotlakou kapalinovou chromato-grafii, spektrofotometriekou kolorimetrii, chemickou reakciprobíhající za vyvolání barevné změny, použití destičky s ba-revnými standardy, monoclonální testy protilátek, radioimu-nologické zkoušky, enzymatické zkoušky, nukleární magnetic-kou resonanci, ultrafialové světlo, hmotovou spektrometrii a elektroforesu. - , . v \Q
  4. 4. Způsob zjištování zapalu splepeho střev, vyznačenytím, že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře-ní na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním a bolestí břicha a stanoví se v něm koncentrace kyse-liny q--hydroxyhippurové v množství alespoň 10 mg/1 zavyužití chromátografie v tenké vrstvě.
  5. 5. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře- - 31 ní ηε zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním, a bolestí břicha, kyselina -hydroxyhippurová se zevzorku moči chemicky extrahuje a vysokotlakou kapalinovouchromatografií se stanovuje koncentrace kyseliny (j^-hydroxy-hippurové, přičemž její množství alespoň 10 mg/1 moče je in-dikativní pro zápal slepého střeva.
  6. 6. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtímř že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře-ní na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním a bolestí břicha, kyselina ý^-hydroxyhippurová se zevzorku moči chemicky extrahuje a chromatografií v tenké vrst-vě se stanovuje koncentrace kyseliny O^-hydroxyhippurové,přičemž její množství alespoň 10 mg/1 moče je indikativnípro zápal slepého střeva.
  7. 7. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře-ní na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním a bolestí břicha, kyselina čT^-hydroxyhippurová se zevzorku moči chemicky extrahuje a vysokotlakou kapalinovouchromatografií se stanovuje složka kyseliny í^-hydroxyhippu-rové, přičemž kyselina á^-hydroxyhippurová v množství ales-poň 10 mg/1 moči je indikativní pro zápal slepého střeva.
  8. 8. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře-ní na zápal, slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním a bolestí břicha, složka kyseliny <?~-hydroxyhippurové se z moči chemicky extrahuje za použití chemického extrakčního systému voleného ze souboru zahrnujícího diethylether,butanol , oxidu křemičitého C18 pro kyselinu hydroxyhippu-rovou ve vodném prostředí nebo se používá oxidu křemičitéhoC18 pro kyselinu (y-hydroxyhippurovou v methanolovém prostředí k vytvoření barevné reakce mezi kyselinou fjr^-hydroxyhippuřovou a chemickým extrakčním systémem a zjištění koncentracekyseliny ζΤ^-hydroxyhippurové ve vzorku moče alespoň 10 mg/1se považuje za indikativní pro zápal slepého střeva, přičemž - 32 se. toto zjištění provádí chromatografii v tenké vrstvě ε pakpomocí ultrafialového světla o délce vln přibližně 250 ažpřibližně 360 nm, přičemž zviditelnění modré fluorescenčnískvrny s retenčním faktorem shodným se standardem potvrzujekoncentraci kyseliny -hydroxyhippurové a tak zápal sle-pého střeva. v
  9. 9. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedinci, u něhož je podezře-ní na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním a bolestí břicha, přítomnost kyseliny ^-hydroxyhippuro-vé. se ověří nejprve v části vzorku moče trojmocným železitýmiontem nebo s měďnatým iontem, které jsou schopny barevné re-akce. s kyselinou , , -y-hydroxyhippurovou a výsledek barevné re-akce uvedených iontů s kyselinou 5<-hydroxyhippurovou se po-rovná s předem připravenou barevnou standardní tabulkou, čímž se zjistí zápal slepého střeva.
  10. 10. Způsob zjištování zápalu slepého střeva, vyznačenýtím, že se odebere vzorek moči jedinci, fiu něhož je pode-zření na zápal slepého střeva a který trpí nevolností, zvrace-ním, a bolestí břicha, přítomnost kyseliny tT^hydroxyhippuro-vé. se. ověří nejprve v první části moče reakcí s železitým ion-tem vázaným na silikagel, přičemž železitý iont je schopen ba-revné reakce s kyselinou ^^-hydroxyhippurovou, složka kyse-liny (^--hydroxyhippurové se ze vzorku moče extrahuje chemickýmsystémem ze souboru zahrnujícího diethylether, butanol, oxidkřemičitý s váženým želefcitým iontem nebo Cl 8 oxid křemičitýpro vnesení složky kyseliny (3-hydroxyhippurové do vodnéhoprostředí nebo Cl8 oxidu křemičitého pro vnesení složkykyseliny q- -hydroxyhippurové do methanolového prostředí,přičemž se zjištuje koncentrace kyseliny 0--hydroxyhippuro- vé ve druhém podílu vzorku moče alespoň 10 mg/1 podrobovánímtohoto druhého vzorku moče chromatografii v tenké vrstvě a pakpomocí ultrafialového světla o délce vln přibližně 250 nm až360 nm, přičemž zviditelnění modré fluorescenční skvrny s re-tenčním faktorem přibližně Ο,γ je indikací zápalu slepéhostřeva. - 33
  11. 11. Způsob podle bodu 10, vyznačený tím, že se trojmoc-ného železitého iontu používá ve formě vázané na oxid křemi-čitý»
  12. 12. Soubor pro stanovení přítomnosti kyseliny fT-hydroxy-hippurové v lidské moči v koncentraci alespoň 10 mg/1 vyzna-čený tím, že zahrnuje fiolu obsahující jako reagenční či-nidlo oxid křemičitý s vázaným železitým iontem, do které sevnáší zkoušená moč, prostředky pro přidávání odměřeného množ-ství moči k reakčnímu činidlu na bázi oxidu křemičitého atrojmocného železitého iontu k vytvoření barevné reakce atabulku barevných standardů pro porovnání barvy vzniklé re-akcí.
  13. 13. Soubor podle bodu 12, vyznačený tím, že fiola ob-sahuje. přibližně 1 ml činidla na bázi oxidu křemičitého a že-lezitého iontu, přičemž prostředkem pro vnášení moče je ka-pátko a moče se odměřuje 10 až 15 kapek.
  14. 14. Soubor pro stanovení přítomnosti kyseliny ^-hydrcxy-hippurové v lidské moči v koncentraci alespoň 10 mg/1, vy-značený tím, že zahrnuje stříkačku s citrátovým pufrem propříjem odměřeného množství moče, extrakční trubku obsahují-cí C18 reakční činidlo a schopnou přijímat kapalinu ze stří-kačky, fiolu s vodou pro zavádění vody do extrační trubkyobsahující C18 reakční činidlo, přičemž se voda po průcho-du trubkou vyhazuje, fiolu s rozpouštědlem schopným extra-hovat kyselinu ^-hydroxyhippurovou z C18 extrakční trub-ky, fiolu pro shromažňování vzorku rozpouštědla a kyseli-ny (7^-hydroxyhippurové z extrakční trubky, nádobu provzorek rozpouštědla a kyseliny (Z^-hydroxyhippurové, dr-žák. se vmontovanou destičkou pro chromatografii v tenkévrstvě pro přijímání vzorku rozpouštědla a kyselinyhydroxyhippurové s okénkem, které se potírá cupaninou im-pregnovancu systémem rozpouštědlo - kyselinafhydroxy-hippurová a cupaninu a kontrolní standard pro porovnání umí stění skvrn ne okénku s kontrolním standardem. - 34 -
  15. 15. Soubor pro stanovení přítomnosti kyseliny 5^-hydroxy-hippurové v lidské moči v koncentraci alespoň 10 mg/1, vyzna-čený tím, že zahrnuje fiolu obsahující jakožto reakční činid-lo oxid křemičitý s železitými ionty, do které se vnáší prv-ní zkoumané množství moče, prostředky k přidávání odměře-ného množství moče k reakčnímu činidlu na bázi oxidu křemiči-tého a železitých iontů, barevnou porovnávací destičku, Stří-kačku s citrátovým pufrem pro příjem odměřeného množství mo-če, extrakční trubku obsahující C18 reakční činidlo a schop-nou přijímat kapalinu ze stříkačky, fiolu s vodou pro zavádě-ní vody do extrakční trubky obsahující G18 reakční činidlo,přičemž se voda po průchodu trubkou vyhazuje, fiolu s rozpouš-tědlem, schopným extrahovat kyselinu GT-hydroxyhippurovcuZ.C18 obsaženým v extrakční trubce, fiolu, pro shromažňovánívzorku rozpouštědla a kyseliny SJ”-hydnoxyhippurové z extrak-čni trubky, nádobu pro vzorek rozpouštědla a kyseliny 6~-hyd-roxyhippurové, držák se vmontovanou destičkou pro chrométo-grafii- v tenké vrstvě, mašíci první plochu destičky k příjmuvzorku rozpouštědla a kyseliny <5*-hydroxyhippurové a plochuokénka pro příjem systému rozpouštědlo a kyselina zT^hydro- v xyhippurová ze napuštěné cupaniny, přičemž se alespoň část.vzorku rozpouštědla a kyseliny (^-hydroxyhippurové dostanena plochu okénka destičky, cupaninu a kontroln^standard proporovnání polohy skvrn na ploše okénka destičky a na kon-trolním standardu.
  16. 16. Soubor podle bodu 15, vyznačený tím, že fiola s ob-sahem reakčního činidla na bázi oxidu křemičitého a trojmoc-ných iontů železa obsahuje 1 ml tohoto reakčního činidla nabázi oxidu křemičitého a trojmocných iontů železa.
  17. 17. Soubor podle bodu 15, vyznačený tím, že stříkačka s citEátovým pufrem obsahuje přibližně 100 mg kyseliny citrónovéjakožto citrátový pufr a rozpouštědlo pro extrakci kyseliny <5“-hydroxyhippurové ze C18, kterým je přibližně 1 ml metha-nolu.
CS905664A 1989-11-15 1990-11-15 Determination of appendicitis by determining concentration of delta hydroxyhippuric acid in urine CS566490A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43682389A 1989-11-15 1989-11-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS566490A3 true CS566490A3 (en) 1992-03-18

Family

ID=23733967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS905664A CS566490A3 (en) 1989-11-15 1990-11-15 Determination of appendicitis by determining concentration of delta hydroxyhippuric acid in urine

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5470750A (cs)
EP (1) EP0428080A3 (cs)
JP (1) JPH03209164A (cs)
KR (1) KR910010187A (cs)
AU (1) AU6657890A (cs)
CA (2) CA2008414A1 (cs)
CS (1) CS566490A3 (cs)
HU (1) HU207584B (cs)
NZ (1) NZ236062A (cs)
ZA (1) ZA909070B (cs)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08227785A (ja) * 1994-11-30 1996-09-03 At & T Corp コネクタ洗浄方法および洗浄キット
CA2331116A1 (en) * 2001-01-15 2002-07-15 Chenomx, Inc. Compound identification and quantitation in liquid mixtures -- method and process using an automated nuclear magnetic resonance measurement system
US6734973B1 (en) * 2001-02-06 2004-05-11 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for determining plant nutrient status
NZ539734A (en) 2002-10-09 2011-07-29 Dmi Biosciences Inc Diagnosis and monitoring of inflammation, ischemia and appendicitis
US7659087B2 (en) 2004-07-23 2010-02-09 Aspenbio Pharma, Inc. Methods and devices for diagnosis of appendicitis
CA2574991C (en) * 2004-07-23 2015-03-24 Aspenbio Pharma, Inc. Methods for diagnosis of appendicitis
WO2006036476A2 (en) * 2004-09-07 2006-04-06 The General Hospital Corporation Methods of detecting myocardial ischemia and myocardial infarction
JP5417262B2 (ja) * 2010-06-08 2014-02-12 株式会社エスアールエル 検体認識装置
US8655009B2 (en) * 2010-09-15 2014-02-18 Stephen L. Chen Method and apparatus for performing color-based reaction testing of biological materials
EP2750706A4 (en) * 2011-09-29 2015-04-15 Alere San Diego Inc 2-HYDROXYHIPPURIC ACID ANALOGUES AND METHODS FOR THEIR SYNTHESIS AND USE
US9528941B2 (en) 2012-08-08 2016-12-27 Scanadu Incorporated Method and apparatus for determining analyte concentration by quantifying and interpreting color information captured in a continuous or periodic manner
WO2014025415A2 (en) 2012-08-08 2014-02-13 Scanadu Incorporated Method and apparatus for performing and quantifying color changes induced by specific concentrations of biological analytes in an automatically calibrated environment
US9285323B2 (en) 2012-08-08 2016-03-15 Scanadu Incorporated Quantifying color changes of chemical test pads induced concentrations of biological analytes under different lighting conditions
EP3180596A4 (en) 2014-08-15 2018-09-26 Scanadu Incorporated Precision luxmeter methods for digital cameras to quantify colors in uncontrolled lighting environments
US10345278B2 (en) * 2016-09-23 2019-07-09 Chromatic Technologies, Inc. High pressure processing pressure sensor
CN116250004A (zh) 2020-09-17 2023-06-09 斯肯威尔健康公司 诊断测试试剂盒及其分析方法
USD970033S1 (en) 2020-10-23 2022-11-15 Becton, Dickinson And Company Cartridge imaging background device
CN116324382A (zh) 2020-10-23 2023-06-23 贝克顿·迪金森公司 用于测试设备的成像和基于图像的分析的系统和方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3915647A (en) * 1974-08-16 1975-10-28 Polaroid Corp Device for determining the concentration of a substance in a fluid
WO1989001471A1 (en) * 1987-08-12 1989-02-23 Bar Or David Method for detecting appendicitis

Also Published As

Publication number Publication date
HUT56451A (en) 1991-08-28
ZA909070B (en) 1993-02-24
EP0428080A3 (en) 1993-01-20
KR910010187A (ko) 1991-06-29
HU907152D0 (en) 1991-05-28
NZ236062A (en) 1992-12-23
US5470750A (en) 1995-11-28
CA2008414A1 (en) 1991-05-15
HU207584B (en) 1993-04-28
CA2029831A1 (en) 1991-05-16
JPH03209164A (ja) 1991-09-12
AU6657890A (en) 1991-05-23
EP0428080A2 (en) 1991-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS566490A3 (en) Determination of appendicitis by determining concentration of delta hydroxyhippuric acid in urine
WO2016107576A1 (zh) 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用
WO2008031288A1 (fr) Colonne centrifuge préremplie servant à dépister un variant d&#39;alpha-fétoprotéine spécifique de l&#39;hépatocarcinome, et trousse d&#39;analyse contenant ladite colonne
Waalkes et al. The determination of pentamidine (4, 4′-diamidinophenoxypentane) in plasma, urine, and tissues
JP2019531261A (ja) 化合物、試薬およびその使用
JP5194000B2 (ja) 薬剤誘導肝臓損傷及び中毒性物質誘導肝臓損傷の同定及び早期同定並びに治療の同時観察のためのｉｎｖｉｔｒｏ方法
US20200400673A1 (en) Methods for cancer detection by evaluation of glycan-binding patterns of immunoglobulins in gastrointestinal lavage fluid samples
JP5095600B2 (ja) 哺乳動物生物体における哺乳動物乳酸発酵プロセス／好気的グルコース発酵代謝経路を確認および制御する方法
JPS61126472A (ja) 診断方法
KR950006170B1 (ko) 사람과 동물에 있는 고리 모양의 입자 및 암의 존재를 진단하기 위한 시험관 내의 방법 및 프로브(probe)
JP7081861B1 (ja) ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法
Ando et al. A simple screening method for detecting isovalerylglycine in urine of patients with isovaleric acidemia
US20070196927A1 (en) Method For Qualitative And/Or Quantitative Detection Of Polyethylene Glycols In Biological Fluids
Sadoughi et al. Prognostic value of cell surface antigens using immunoperoxidase methods in bladder carcinoma
Tsuchiya et al. Isolation and characterization of an N-linked oligosaccharide that is increased in glioblastoma tissue and cell lines
JP2002538834A (ja) アレルギー及び感染症を区別するための迅速診断法
CN109696547B (zh) 一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用
US5055389A (en) Detection of appendicitis by measurement of uroerythrin
JP4795353B2 (ja) 腫瘍疾患および慢性炎症性腸疾患の診断のための液性バイオマーカーとしてのカルバモイルリン酸合成酵素１（ｃｐｓ１）の使用
WO2018143336A1 (ja) 膵臓癌の検査方法
JP2002544520A (ja) 胃癌の危険性を予測および／または診断するための方法
CN113403300B (zh) 一种使用mof材料富集体液中循环游离核酸的方法及其应用
WO2024101853A1 (ko) 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트
Wang et al. Abnormalities of the Serum proteomic in thrombosis after CVC catheterization in patients with end-stage renal disease
RU2234091C1 (ru) Способ определения скрытой крови в выделениях из молочной железы