CS276891B6 - Biokompatibilní atelókolagen a způsob jeho přípravy - Google Patents

Abstract

Je popsán nový kolagenový materiál určený pro humánní a veterinární medicínu, založený na vysokočistém, krystalickém kolagenu typu I, zbaveném podstatných podílů telopeptidů, přičemž obsah trypsinem odštépitelných bílkovin je menší než 0,1 % hmot., obsah minerálních látek nepřevyšuje 6,5 % hmot. a podíl krystalického atelokolagenu je vyšší než 99,0 % hmot., vztaženo na obsah bílkovin. Podstata způsobu přípravy spočívá v tom, že vazivo zvířecích šlach je extrahováno vodnými roztoky hydroxidů alkalických jedno a dvojsytných kovů při pH 9,0 až 13,6 a/nebo kyselin při pH 2,0 až 4,5 a následným působením proteolytických enzymů ze skupiny vyznačující se atelopeptidázovou aktivitou v množství odpovídají­ címu 0,5 až 45 tis. kaseinových jednotek na 1 kg použitého vaziva při teplotě 10 až 42° c po dobu nejméně 15 minut. Biokompatibilní atelokolagén je vhodný pro implantaci do živé tkáně a má vysokou haematostopickou účinnost.

Description

Biokompatibilní atelokolagen a způsob jeho přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká prostředku pro zastavení chirurgického a úrazového krváceni a pro vytváření biologických obvazů a krytů, majícího schopnost snášenlivosti a postupného samovolného vstřebání v živé tkáni lidské i zvířecí.

Charakteristika dosavadního stavu techniky

Různé formy kolagenu, vláknité bílkoviny vyskytující se v několika variacích ve vazivových tkáních, kostech a orgánech těla, jsou ve zdravotnické praxi využívány již dlouho. První aplikaci známe z r. 1913, kdy Chessin popsal použití podkožní kolagenové blány, fascie, pro podporu haemostáze. Prvé použití čištěného kolagenu ve formě prášku popsal v r. 1976 Battista a uvedl do praxe přípravek Avitene. Další vývoj vedl k používání kolagenové pěny a houby, poprvé popsané Chvapilem a Holušou v roce 1968. V současnosti je vyráběna řada kolagenových přípravků, jejichž heamostatické vlastnosti jsou podobné, a navzájem se liší strukturou poresní vrstvy, stupněm chemického zesíťování a podílem nekolagenových bílkovin a želatiny. Kolagenové přípravky nalezly použití i pro své mechanické vlastnosti a schopnost nevyvolávat v tkáni po implantaci trvalé záplatové reakce. Jsou z nich zhotoveny i fólie, niti a kryty na rohovku i jiné citlivé povrchy těla, nebo tzv. biologické obvazy v nichž kolagen má schopnost podporovat epithelizaci v ráně.

Vysvětlení podstaty vynálezu a jeho výhod, popřípadě nevýhody současného stavu techniky

Dlouholetá klinická evidence ukázala, že běžné kolagenové přípravky mají i některé nežádoucí vlastnosti. Jde o tři hlavní problémy:

a/ patologická kalcifikace některých kolagenových implantátů, kterou vysvětlili Levy a spol. v roce 1986 jako důsledek chemického zesíťování, která používají někteří výrobci pro prodloužení doby resorbce u implantovaných kolagenů.

b/ schopnost kolagenových implantátů podporovat mikrobiální infekci v nesterilních ranách.

c/ vznik zápalové reakce v tkáni po implantaci kolagenu. Tato reakce závisí na množství implantátu a na individuální schopnosti pacienta.

První problém jsme se pokusili vyřešit pomocí důkladné demi-neralizace kolagenu a převedením zbylých stopových kationtů vápníku do neaktivního chelátu. Tím se blokuje aktivita kolagenázy a potlačí metabolismus mikroflóry. Tento postup, podle čs. autorského osvědčení č. 269 196, má však i nevýhodu v možnosti interference vlastního hojivého procesu, kde stopové prvky mají výz / namnou úlohu a mohou být vázány zbylým chelátotvorným činidlem.

Nahoře uvedené problémy řeší nový postup přípravy atelo-kolagenových derivátů podle tohoto vynálezu. Atelo-kolagen je chemicky pozměněný kolagen, v jehož molekule jsou enzymaticky odštěpeny koncové telopeptidy. Tyto relativně krátké polypeptidické řetězce obsahují hlavní antigenní determinanty kolagenu,tedy ty úseky kolagenové molekuly, v nichž se vyskytují mezidruhové variace podmiňující immunologickou reakci implantátu. Současně jsou kolagenové deriváty vyčištěny od nekolagenových bílkovin a. želatiny takovým způsobem, aby obsahovaly více než 99,9 % krystalického podílu kolagenu, a méně než 0,1 % trypsinem odštěpitelné frakce. Za těchto podmínek se vzniklý substrát chová inhibičně k mikroorganismům a po implantaci se v tkáni plně toleruje, bez pozorovatelné zápalové reakce. Dále se prokázalo, že takto modifikovaný kolagen má nesníženou heamostatickou účinnost a vstřebává se ve tkáni přibližně stejnou rychlostí, jako běžně používané nezesilované kolageny. Tyto nové vlastnosti umožňují výrazné snížení rizika při implantaci u alergických pacientů, a při použití u infikovaných ran /dekubity, bércové vředy/ nebo u rozsáhlejších chirurgických výkonů, jako jsou transplantace jater, nebo nitrotělní chirurgické revise u těžkých úrazů, kde je nutno ve tkáni ponechat relativně značné množství implantovaného kolagenového materiálu.

Příprava atelo-kolagenu podle našeho vynálezu je založena na použití kolagenové suroviny ze šlach, což je zdroj méně kontaminovaný nekolagenovými fibrilárními bílkovinami, než je dosud používané vazivo kůže, na způsobu enzymatického čištění v němž jsou použity proteinázy o takové aktivitě, že spolu s chemickou extrakcí se dosáhne obsahu zbylých nekolagenových bílkovin a želatiny nižší než 0,1 % hmot., vztaženo na celkový obsah bílkovin v hotovém přípravku, a vhodnou volbou specifické aktivity proteinázy, která má vysokou specificitu k telopeptidům a snadno se odstraní z atelo-kolagenu, přičemž její kolagenolytická aktivita je zanedbatelně nízká. Takové vlastnosti má komerčně vyráběná proteináza Ateláza H nebo směsi proteináz serinového a rennin-pepsinového typu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Hovězí achillovy šlachy, odebrané ihned po porážce, očištěné a povrchově zbavené vazivové blány, se nakrájí na kousky asi 1 cm dlouhé, promyjí se dionizovanou vodou a vloží do 10 % roztoku chloridu sodného tak, aby poměr kapaliny a šlach byl 1:1. Směs se promíchá a ponechá v klidu do druhého dne. Potom se dekantuje kapalina a extrakce novým 10 % roztokem chloridu sodného se opakuje ze stejných podmínek, až je vzniklý extrakt bezbarvý, nejméně však 3x. Potom se provádí extrakce nasycených hydroxidem vápenatým po dobu 24 hodin a dekantovaný roztok se nahradí stejným objemem zpoloviny nasyceným roztokem hydroxidu vápenatého. Během extrakce se roztok občas promíchává, nejméně však po 6 hodinách klidu. Druhá extrakce se provádí 1 až 3 dny, extrakce pátá a další po dobu 5 až 10 dní, tyto se promíchávají nejméně 2x denně. Po dekantaci poslední lázně hydroxidu vápenatého se vazivo promyje vodou a potom zaplaví 100 % roztoku obsahujícího 3,5 až 8 % síranu amonného a po promíchání se ponechá do druhého dne v klidu. Potom se lázeň dekantuje, vazivo promyje vodou a zaleje vodným roztokem Chelatonu III/dvojsodné soli kyseliny etylendiamin tetraoctové/, o koncentraci 5g/l, ve množství 100 % na hmotnost šlach. Po promíchání sé ponechá v klidu do druhého dne, kdy se kontroluje reakce řezu kouskem šlachy, který musí být bezbarvý na fenolftalein. Dekantovaná lázeň se nahradí stejným objemem roztoku Chelatonu III 2 až 5 g/1. V této lázni se šlachy ponechají 1 až 3 dny,potom se lázeň sleje a šlachy promyjí nejméně 3x stejným objemem vody. Promyté a·dekantované vazivo se pořeže na masořezu a mixuje s vodou v destruktoru s nožovou hlavou až do rozvlákněný materiál se okyselí kyselinou octovou, zředěnou 1 : 8 vodou, použije se 120 ml roztoku kyseliny na 10 litrů suspenze vlákniny. Po promíchání se vytvoří gel, který se ponechá vychladit na 5 °C. Vychlazený gel se znovu mixuje s takovým množstvím vody, aby vznikla koncentrace sušiny 2 až 4 %. Potom se gel neutralizuje roztokem uhličitanu sodného na pH 5,5 až 7,0 a vzniklá vláknitá suspenze se promíchá a nejméně třikrát promyje stejným objemem vody. K promyté vláknině se přidá 100 ml zředěné kyseliny octové 1 : 20 na 10 litrů suspenze a po promíchání se mixuje asi 2 minuty. Potom se do vzniklého gelu přidá 50 ml roztoku Atelázy H/10 1 gelu, promíchá se a mixuje na malé rychlosti asi 5 minut. Potom se pH upraví přídavkem roztoku uhličitanu sodného na hodnotu 5,5 až 7,0 a směs se ponechá nejméně 30 minut stát při pokojové teplotě. Takto vzniklou suspenzi je možno použít pro vytváření dílců mražením a lyofilizací.

Příklad 2

Kolagenové vazivo, očištěné a mechanicky zbavené všech příměsí a cizích tkání, je rozřezáno na kousky s průměrnou velikostí 3 až 5.mm. Takto připravená surovina je opakovaně extrahována v 15 % roztoku chloridu sodného. Extrakce se opakuje 5x v denních, v posledních dvou extrakcích v dvoudenních intervalech. Během extrakce je směs míchána; poměr lázně k vazivu je nejméně 2:1. Po každém extrakčním kroku je lázeň odstředěna. Čistění vaziva potom pokračuje v kyselých lázních, obsahujících 100 g/1 chloridu sodného a 25 g/1 kyseliny octové a 2 g/1 kyseliny peroctové. Poměr lázně k vazivu je 2 : 1 hmot. Tyto extrakce probíhají za střídavého pohybu a opakují se tak dlouho, až v extrakční lázni působící nejméně 24 hodin, nelze biuretovou reakcí detegovat rozpuštěné bílkoviny. Těchto extrakčních kroků je obvykle nejméně 5 a po jejich ukončení se vazivová směs promyje roztokem chloridu sodného /100 g/1/ a ochladí na cca 5 °C. Takto vychlazený materiál se potom mixuje až do rozvláknění. Vzniklá směs se zředí vodou na koncentraci 20 g/1 a přidá se 5 ml roztoku Atelázy H na každý litr suspenze. Směs se ponechá pomalu míchat při 18 až 25 °C po dobu 20 minut. Potom je 12 h v klidu, odstředí se, promyje 10 % roztokem chloridu sodného, neutralizuje se uhličitanem sodným na pH 5,5 až 7,0 a pere vyměňovanou vodou až do vymizení reakce na chloridové ionty /detekce pomocí 1 % roztoku dusičnanu stříbrného. Nakonec se suspenze zředí vodou na koncentraci 25 g/1, popřípadě se upraví pH a použije pro formování kolagenových výrobků, suší, balí do dvojitých fóliových obalů s příbalovým letáčkem a sterilizuje se dávkou 25 kGg gama záření.

CS 276891 B6 4

Výsledky analytického hodnocení atelo-kolagenové plsti

Dosažení vlastností uváděných v,popisné části dokumentují analytické výsledky získané při laboratorním, předklinickém a klinickém hodnocení výrobků z atelokolagenu.

1. Obsah trypsinem odštěpitelných peptidů při použití 50 mg krystalického trypsinu na 1 g atelokolagenu, inkubace 60 minut při 37 °C ve vodě, je menší než 0,1 % hmot., vztaženo na obsah bílkovin.

2. Atelo-kolagenová plst, uchovávaná v nesterilních vlhkých podmínkách, si po dobu více než 1 rok uchovává své vlastnosti, bez známky růstu plísní.

3. Předklinické a klinické hodnocení atelokolagenové plsti proveděné v souvislosti s registrací jako léčivo u MZ ČR prokázalo, že atelo-kolagenová plst má srovnatelné haemostatické vlastnosti jako komerční druhy kolagenu, vstřebává se u pokusných zvířat bez pozorovatelné zápalové reakce a při aplikaci u více než 300 pacientu v průběhu klinického zkoušení nebyl pozorován v žádném případě nežádoucí vedlejší účinek nebo komplikace jež by bylo možno dát do vztahu ke zkoušenému atelo-kolagenu.

4. Výsledky analýzy vzorku atelo-kolagenu připraveného podle příkladu 2;

Označení vzorku: 0991

Obsah vlhkosti: 14,7 % hmot.

Obsah síranového popele: 3,8 % hmot.

Obsah trypsinem odštěpitelných peptidů: 0,034 % hmot.

Obsah atelokolagenu /z hydroxiprolinu/: 99,2 % hmot.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Biokompatibilní atelo-kolagen použitelný v humání a veterinární terapii, vyznačující se tím, že obsahuje telopeptidů zbavené řetězce kolagenu typu I, obsah trypsinem odštěpitelných bílkovin je menší než 0,1 % hmot., obsah minerálních látek nepřevyšuje 6,5 % hmot, a podíl krystalického atelokolagenu je vyšší než 99,0 % hmot, vztaženo na obsah bílkovin.
2. 2. Způsob přípravy atelokolagenu podle bodu 1, vyznačující se tím, že vazivo nakrájených zvířecích šlach je postupně extrahováno vodnými roztoky hydroxidů alkalických jedno a dvojsytných kovů při pH 9,0 až 13,6 a/nebo kyselin při pH 2,0 až 4,5 s výhodou za přidání neutrálních solí, a vazivo je po případném rozmělnění neutralizováno a/nebo vypráno vodou a vystaveno působení proteolytických enzymů ze skupiny vyznačující se atelopeptidázovou aktivitou v množství odpovídajícímu 0,5 až 45 tis. kaseinových jednotek na 1 kg použitého vaziva, přičemž reakce probíhá při teplotě 10 až 42 °C po dobu nejméně 15 minut.
3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že k atelopeptidaci je použit enzym Ateláza H, působení probíhá za míchání po dobu alespoň 3 minuty a potom je směs ponechána v klidu nejméně 10 minut a po vyprání je atelokolagenová hmota odvodněna lyofilizací, sušením za obyčejné nebo zvýšené teploty, nebo dehydrací rozpouštědly, a sterilizována zářením gama, nebo teplotou při sníženém atmosférickém tlaku.