CS276891B6

CS276891B6 - Biocompatible atelocollagen and method of its preparation

Info

Publication number: CS276891B6
Application number: CS911079A
Authority: CS
Inventors: Antonin Ing Csc Galatik; Karel Doc Mudr Csc Kubena
Original assignee: Hypro Vyzkum
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 1992-08-12
Also published as: CS107991A3

Abstract

Je popsán nový kolagenový materiál určený pro humánní a veterinární medicínu, založený na vysokočistém, krystalickém kolagenu typu I, zbaveném podstatných podílů telopeptidů, přičemž obsah trypsinem odštépitelných bílkovin je menší než 0,1 % hmot., obsah minerálních látek nepřevyšuje 6,5 % hmot. a podíl krystalického atelokolagenu je vyšší než 99,0 % hmot., vztaženo na obsah bílkovin. Podstata způsobu přípravy spočívá v tom, že vazivo zvířecích šlach je extrahováno vodnými roztoky hydroxidů alkalických jedno a dvojsytných kovů při pH 9,0 až 13,6 a/nebo kyselin při pH 2,0 až 4,5 a následným působením proteolytických enzymů ze skupiny vyznačující se atelopeptidázovou aktivitou v množství odpovídají címu 0,5 až 45 tis. kaseinových jednotek na 1 kg použitého vaziva při teplotě 10 až 42° c po dobu nejméně 15 minut. Biokompatibilní atelokolagén je vhodný pro implantaci do živé tkáně a má vysokou haematostopickou účinnost.A new collagen material intended for human and veterinary medicine is described, based on highly pure, crystalline collagen type I, free of significant amounts of telopeptides, with the trypsin-cleavable protein content being less than 0.1% by weight, the mineral content not exceeding 6.5% by weight and the proportion of crystalline atelocollagen being higher than 99.0% by weight, based on the protein content. The essence of the preparation method consists in the fact that the connective tissue of animal tendons is extracted with aqueous solutions of hydroxides of alkali mono- and dibasic metals at pH 9.0 to 13.6 and/or acids at pH 2.0 to 4.5 and subsequent action of proteolytic enzymes from the group characterized by atelopeptidase activity in an amount corresponding to 0.5 to 45 thousand casein units per 1 kg of the used connective tissue at a temperature of 10 to 42° C for at least 15 minutes. Biocompatible atelocollagen is suitable for implantation into living tissue and has high haematostatic efficacy.

Description

Biokompatibilní atelokolagen a způsob jeho přípravyBiocompatible atelocollagen and method of its preparation

Oblast technikyField of technology

Vynález se týká prostředku pro zastavení chirurgického a úrazového krváceni a pro vytváření biologických obvazů a krytů, majícího schopnost snášenlivosti a postupného samovolného vstřebání v živé tkáni lidské i zvířecí.The present invention relates to a device for stopping surgical and traumatic bleeding and for forming biological dressings and covers, having the ability to be tolerated and gradually absorbed spontaneously in living human and animal tissue.

Charakteristika dosavadního stavu technikyCharacteristics of the prior art

Různé formy kolagenu, vláknité bílkoviny vyskytující se v několika variacích ve vazivových tkáních, kostech a orgánech těla, jsou ve zdravotnické praxi využívány již dlouho. První aplikaci známe z r. 1913, kdy Chessin popsal použití podkožní kolagenové blány, fascie, pro podporu haemostáze. Prvé použití čištěného kolagenu ve formě prášku popsal v r. 1976 Battista a uvedl do praxe přípravek Avitene. Další vývoj vedl k používání kolagenové pěny a houby, poprvé popsané Chvapilem a Holušou v roce 1968. V současnosti je vyráběna řada kolagenových přípravků, jejichž heamostatické vlastnosti jsou podobné, a navzájem se liší strukturou poresní vrstvy, stupněm chemického zesíťování a podílem nekolagenových bílkovin a želatiny. Kolagenové přípravky nalezly použití i pro své mechanické vlastnosti a schopnost nevyvolávat v tkáni po implantaci trvalé záplatové reakce. Jsou z nich zhotoveny i fólie, niti a kryty na rohovku i jiné citlivé povrchy těla, nebo tzv. biologické obvazy v nichž kolagen má schopnost podporovat epithelizaci v ráně.Various forms of collagen, a fibrous protein found in several variations in connective tissues, bones and organs of the body, have long been used in medical practice. We know the first application from 1913, when Chessin described the use of a subcutaneous collagen membrane, fascia, to support haemostasis. The first use of purified collagen in powder form was described by Battista in 1976 and put Avitene into practice. Further development led to the use of collagen foam and sponge, first described by Chvapil and Holuš in 1968. A number of collagen preparations are currently produced whose heamostatic properties are similar and differ in porous layer structure, degree of chemical crosslinking and proportion of non-collagen proteins and gelatin. . Collagen preparations have also been used for their mechanical properties and ability not to induce a permanent patch reaction in the tissue after implantation. Foils, threads and covers for the cornea and other sensitive surfaces of the body are also made of them, or so-called biological dressings in which collagen has the ability to support epithelialization in the wound.

Vysvětlení podstaty vynálezu a jeho výhod, popřípadě nevýhody současného stavu technikyExplanation of the essence of the invention and its advantages or disadvantages of the current state of the art

Dlouholetá klinická evidence ukázala, že běžné kolagenové přípravky mají i některé nežádoucí vlastnosti. Jde o tři hlavní problémy:Long-term clinical evidence has shown that conventional collagen preparations also have some undesirable properties. There are three main problems:

a/ patologická kalcifikace některých kolagenových implantátů, kterou vysvětlili Levy a spol. v roce 1986 jako důsledek chemického zesíťování, která používají někteří výrobci pro prodloužení doby resorbce u implantovaných kolagenů.a / pathological calcification of some collagen implants, which was explained by Levy et al. in 1986 as a result of chemical crosslinking used by some manufacturers to extend the resorption time of implanted collagens.

b/ schopnost kolagenových implantátů podporovat mikrobiální infekci v nesterilních ranách.b / the ability of collagen implants to promote microbial infection in non-sterile wounds.

c/ vznik zápalové reakce v tkáni po implantaci kolagenu. Tato reakce závisí na množství implantátu a na individuální schopnosti pacienta.c / development of an inflammatory reaction in the tissue after collagen implantation. This reaction depends on the amount of implant and the individual abilities of the patient.

První problém jsme se pokusili vyřešit pomocí důkladné demi-neralizace kolagenu a převedením zbylých stopových kationtů vápníku do neaktivního chelátu. Tím se blokuje aktivita kolagenázy a potlačí metabolismus mikroflóry. Tento postup, podle čs. autorského osvědčení č. 269 196, má však i nevýhodu v možnosti interference vlastního hojivého procesu, kde stopové prvky mají výz / namnou úlohu a mohou být vázány zbylým chelátotvorným činidlem.We tried to solve the first problem by thoroughly demineralizing collagen and converting the remaining trace calcium cations into an inactive chelate. This blocks collagenase activity and suppresses the metabolism of the microflora. This procedure, according to MS. No. 269 196, however, also has the disadvantage of the possibility of interference of the healing process itself, where trace elements have a significant role and can be bound by the remaining chelating agent.

Nahoře uvedené problémy řeší nový postup přípravy atelo-kolagenových derivátů podle tohoto vynálezu. Atelo-kolagen je chemicky pozměněný kolagen, v jehož molekule jsou enzymaticky odštěpeny koncové telopeptidy. Tyto relativně krátké polypeptidické řetězce obsahují hlavní antigenní determinanty kolagenu,tedy ty úseky kolagenové molekuly, v nichž se vyskytují mezidruhové variace podmiňující immunologickou reakci implantátu. Současně jsou kolagenové deriváty vyčištěny od nekolagenových bílkovin a. želatiny takovým způsobem, aby obsahovaly více než 99,9 % krystalického podílu kolagenu, a méně než 0,1 % trypsinem odštěpitelné frakce. Za těchto podmínek se vzniklý substrát chová inhibičně k mikroorganismům a po implantaci se v tkáni plně toleruje, bez pozorovatelné zápalové reakce. Dále se prokázalo, že takto modifikovaný kolagen má nesníženou heamostatickou účinnost a vstřebává se ve tkáni přibližně stejnou rychlostí, jako běžně používané nezesilované kolageny. Tyto nové vlastnosti umožňují výrazné snížení rizika při implantaci u alergických pacientů, a při použití u infikovaných ran /dekubity, bércové vředy/ nebo u rozsáhlejších chirurgických výkonů, jako jsou transplantace jater, nebo nitrotělní chirurgické revise u těžkých úrazů, kde je nutno ve tkáni ponechat relativně značné množství implantovaného kolagenového materiálu.The above-mentioned problems are solved by a new process for the preparation of atelo-collagen derivatives according to the invention. Atelo-collagen is a chemically modified collagen in the molecule of which the terminal telopeptides are enzymatically cleaved. These relatively short polypeptide chains contain the major antigenic determinants of collagen, i.e., those regions of the collagen molecule in which interspecies variations occur that determine the immunological response of the implant. At the same time, the collagen derivatives are purified from non-collagen proteins and gelatin in such a way that they contain more than 99.9% of the crystalline fraction of collagen and less than 0.1% of the trypsin-cleavable fraction. Under these conditions, the resulting substrate behaves inhibitory to microorganisms and is fully tolerated in the tissue after implantation, without an observable inflammatory reaction. Furthermore, collagen thus modified has been shown to have unreduced hemostatic activity and to be absorbed in the tissue at approximately the same rate as commonly used unreinforced collagens. These new features allow a significant reduction in the risk of implantation in allergic patients, and when used in infected wounds (pressure ulcers, shin ulcers) or in major surgical procedures such as liver transplants, or intrauterine surgical revisions in severe injuries where tissue must be left in the tissue. a relatively large amount of implanted collagen material.

Příprava atelo-kolagenu podle našeho vynálezu je založena na použití kolagenové suroviny ze šlach, což je zdroj méně kontaminovaný nekolagenovými fibrilárními bílkovinami, než je dosud používané vazivo kůže, na způsobu enzymatického čištění v němž jsou použity proteinázy o takové aktivitě, že spolu s chemickou extrakcí se dosáhne obsahu zbylých nekolagenových bílkovin a želatiny nižší než 0,1 % hmot., vztaženo na celkový obsah bílkovin v hotovém přípravku, a vhodnou volbou specifické aktivity proteinázy, která má vysokou specificitu k telopeptidům a snadno se odstraní z atelo-kolagenu, přičemž její kolagenolytická aktivita je zanedbatelně nízká. Takové vlastnosti má komerčně vyráběná proteináza Ateláza H nebo směsi proteináz serinového a rennin-pepsinového typu.The preparation of atelo-collagen according to our invention is based on the use of collagen raw material from tendons, which is a source less contaminated with non-collagen fibrillar proteins than the skin ligament used so far, on an enzymatic purification method using proteinases with such activity that together with chemical extraction a residual non-collagen protein and gelatin content of less than 0.1% by weight, based on the total protein content of the finished preparation, is achieved by a suitable choice of specific proteinase activity which has high specificity for telopeptides and is easily removed from atelo-collagen, collagenolytic activity is negligibly low. Commercially produced proteinase Atelase H or mixtures of proteinases of the serine and renin-pepsin type have such properties.

Příklady uskutečnění vynálezuExamples of embodiments of the invention

Příklad 1Example 1

Hovězí achillovy šlachy, odebrané ihned po porážce, očištěné a povrchově zbavené vazivové blány, se nakrájí na kousky asi 1 cm dlouhé, promyjí se dionizovanou vodou a vloží do 10 % roztoku chloridu sodného tak, aby poměr kapaliny a šlach byl 1:1. Směs se promíchá a ponechá v klidu do druhého dne. Potom se dekantuje kapalina a extrakce novým 10 % roztokem chloridu sodného se opakuje ze stejných podmínek, až je vzniklý extrakt bezbarvý, nejméně však 3x. Potom se provádí extrakce nasycených hydroxidem vápenatým po dobu 24 hodin a dekantovaný roztok se nahradí stejným objemem zpoloviny nasyceným roztokem hydroxidu vápenatého. Během extrakce se roztok občas promíchává, nejméně však po 6 hodinách klidu. Druhá extrakce se provádí 1 až 3 dny, extrakce pátá a další po dobu 5 až 10 dní, tyto se promíchávají nejméně 2x denně. Po dekantaci poslední lázně hydroxidu vápenatého se vazivo promyje vodou a potom zaplaví 100 % roztoku obsahujícího 3,5 až 8 % síranu amonného a po promíchání se ponechá do druhého dne v klidu. Potom se lázeň dekantuje, vazivo promyje vodou a zaleje vodným roztokem Chelatonu III/dvojsodné soli kyseliny etylendiamin tetraoctové/, o koncentraci 5g/l, ve množství 100 % na hmotnost šlach. Po promíchání sé ponechá v klidu do druhého dne, kdy se kontroluje reakce řezu kouskem šlachy, který musí být bezbarvý na fenolftalein. Dekantovaná lázeň se nahradí stejným objemem roztoku Chelatonu III 2 až 5 g/1. V této lázni se šlachy ponechají 1 až 3 dny,potom se lázeň sleje a šlachy promyjí nejméně 3x stejným objemem vody. Promyté a·dekantované vazivo se pořeže na masořezu a mixuje s vodou v destruktoru s nožovou hlavou až do rozvlákněný materiál se okyselí kyselinou octovou, zředěnou 1 : 8 vodou, použije se 120 ml roztoku kyseliny na 10 litrů suspenze vlákniny. Po promíchání se vytvoří gel, který se ponechá vychladit na 5 °C. Vychlazený gel se znovu mixuje s takovým množstvím vody, aby vznikla koncentrace sušiny 2 až 4 %. Potom se gel neutralizuje roztokem uhličitanu sodného na pH 5,5 až 7,0 a vzniklá vláknitá suspenze se promíchá a nejméně třikrát promyje stejným objemem vody. K promyté vláknině se přidá 100 ml zředěné kyseliny octové 1 : 20 na 10 litrů suspenze a po promíchání se mixuje asi 2 minuty. Potom se do vzniklého gelu přidá 50 ml roztoku Atelázy H/10 1 gelu, promíchá se a mixuje na malé rychlosti asi 5 minut. Potom se pH upraví přídavkem roztoku uhličitanu sodného na hodnotu 5,5 až 7,0 a směs se ponechá nejméně 30 minut stát při pokojové teplotě. Takto vzniklou suspenzi je možno použít pro vytváření dílců mražením a lyofilizací.The bovine Achilles tendons, taken immediately after slaughter, cleaned and free of the fibrous membrane, are cut into pieces about 1 cm long, washed with dionized water and placed in 10% sodium chloride solution so that the ratio of liquid to tendons is 1: 1. The mixture is stirred and allowed to stand until the next day. The liquid is then decanted and the extraction with a new 10% sodium chloride solution is repeated under the same conditions until the resulting extract is colorless, but at least 3 times. Extraction with saturated calcium hydroxide is then carried out for 24 hours and the decanted solution is replaced by an equal volume of half with saturated calcium hydroxide solution. During the extraction, the solution is stirred occasionally, but at least after 6 hours of rest. The second extraction is performed for 1 to 3 days, the extraction for the fifth and another for 5 to 10 days, these are mixed at least twice a day. After decantation of the last calcium hydroxide bath, the binder is washed with water and then flooded with a 100% solution containing 3.5 to 8% ammonium sulphate and left to stand until the next day after stirring. The bath is then decanted, the binder is washed with water and quenched with an aqueous solution of Chelaton III (disodium salt of ethylenediamine tetraacetic acid), at a concentration of 5 g / l, in an amount of 100% by weight of tendons. After mixing, it is left undisturbed until the next day, when the reaction of the incision is checked with a piece of tendon, which must be colorless to phenolphthalein. The decanted bath is replaced by an equal volume of Chelaton III solution 2 to 5 g / l. The tendons are left in this bath for 1 to 3 days, then the bath is decanted and the tendons are washed at least 3 times with the same volume of water. The washed and decanted ligament is cut on a meat grinder and mixed with water in a knife-head destroyer until the fibrous material is acidified with acetic acid diluted 1: 8 with water, using 120 ml of acid solution per 10 liters of fiber suspension. After stirring, a gel formed which was allowed to cool to 5 ° C. The cooled gel is remixed with enough water to give a dry matter concentration of 2 to 4%. The gel is then neutralized with sodium carbonate solution to pH 5.5 to 7.0 and the resulting fibrous suspension is mixed and washed at least three times with the same volume of water. To the washed fiber is added 100 ml of 1:20 dilute acetic acid per 10 liters of suspension and mixed after mixing for about 2 minutes. Then 50 ml of Atelase H / 10 1 gel solution are added to the resulting gel, mixed and mixed at low speed for about 5 minutes. The pH is then adjusted to 5.5 to 7.0 by the addition of sodium carbonate solution and the mixture is allowed to stand at room temperature for at least 30 minutes. The resulting suspension can be used to form parts by freezing and lyophilization.

Příklad 2Example 2

Kolagenové vazivo, očištěné a mechanicky zbavené všech příměsí a cizích tkání, je rozřezáno na kousky s průměrnou velikostí 3 až 5.mm. Takto připravená surovina je opakovaně extrahována v 15 % roztoku chloridu sodného. Extrakce se opakuje 5x v denních, v posledních dvou extrakcích v dvoudenních intervalech. Během extrakce je směs míchána; poměr lázně k vazivu je nejméně 2:1. Po každém extrakčním kroku je lázeň odstředěna. Čistění vaziva potom pokračuje v kyselých lázních, obsahujících 100 g/1 chloridu sodného a 25 g/1 kyseliny octové a 2 g/1 kyseliny peroctové. Poměr lázně k vazivu je 2 : 1 hmot. Tyto extrakce probíhají za střídavého pohybu a opakují se tak dlouho, až v extrakční lázni působící nejméně 24 hodin, nelze biuretovou reakcí detegovat rozpuštěné bílkoviny. Těchto extrakčních kroků je obvykle nejméně 5 a po jejich ukončení se vazivová směs promyje roztokem chloridu sodného /100 g/1/ a ochladí na cca 5 °C. Takto vychlazený materiál se potom mixuje až do rozvláknění. Vzniklá směs se zředí vodou na koncentraci 20 g/1 a přidá se 5 ml roztoku Atelázy H na každý litr suspenze. Směs se ponechá pomalu míchat při 18 až 25 °C po dobu 20 minut. Potom je 12 h v klidu, odstředí se, promyje 10 % roztokem chloridu sodného, neutralizuje se uhličitanem sodným na pH 5,5 až 7,0 a pere vyměňovanou vodou až do vymizení reakce na chloridové ionty /detekce pomocí 1 % roztoku dusičnanu stříbrného. Nakonec se suspenze zředí vodou na koncentraci 25 g/1, popřípadě se upraví pH a použije pro formování kolagenových výrobků, suší, balí do dvojitých fóliových obalů s příbalovým letáčkem a sterilizuje se dávkou 25 kGg gama záření.Collagen ligament, cleaned and mechanically free of all impurities and foreign tissues, is cut into pieces with an average size of 3 to 5 mm. The raw material thus prepared is repeatedly extracted in 15% sodium chloride solution. The extraction is repeated 5 times in daily, in the last two extractions at two-day intervals. During the extraction, the mixture is stirred; the ratio of bath to ligament is at least 2: 1. After each extraction step, the bath is centrifuged. Purification of the binder is then continued in acid baths containing 100 g / l of sodium chloride and 25 g / l of acetic acid and 2 g / l of peracetic acid. The ratio of bath to ligament is 2: 1 by weight. These extractions are carried out in alternating motion and are repeated until dissolved proteins cannot be detected by the biuret reaction in the extraction bath for at least 24 hours. There are usually at least 5 of these extraction steps, and after their completion, the fibrous mixture is washed with sodium chloride solution (100 g / l) and cooled to about 5 ° C. The thus cooled material is then mixed until it is pulped. The resulting mixture is diluted with water to a concentration of 20 g / l and 5 ml of Atelase H solution is added for each liter of suspension. The mixture was allowed to stir slowly at 18-25 ° C for 20 minutes. It is then at rest for 12 h, centrifuged, washed with 10% sodium chloride solution, neutralized with sodium carbonate to pH 5.5 to 7.0 and washed with exchanged water until the reaction to chloride ions disappears / detection with 1% silver nitrate solution. Finally, the suspension is diluted with water to a concentration of 25 g / l, optionally adjusted to pH and used to form collagen products, dried, packaged in double foil packages with a package leaflet and sterilized with a dose of 25 kGg gamma radiation.

CS 276891 B6 4CS 276891 B6 4

Výsledky analytického hodnocení atelo-kolagenové plstiResults of analytical evaluation of atelo-collagen felt

Dosažení vlastností uváděných v,popisné části dokumentují analytické výsledky získané při laboratorním, předklinickém a klinickém hodnocení výrobků z atelokolagenu.The achievement of the properties stated in the descriptive part is documented by analytical results obtained during laboratory, preclinical and clinical evaluation of atelocollagen products.

1. Obsah trypsinem odštěpitelných peptidů při použití 50 mg krystalického trypsinu na 1 g atelokolagenu, inkubace 60 minut při 37 °C ve vodě, je menší než 0,1 % hmot., vztaženo na obsah bílkovin.1. The content of trypsin-cleavable peptides using 50 mg of crystalline trypsin per 1 g of atelocollagen, incubation for 60 minutes at 37 ° C in water, is less than 0.1% by weight, based on the protein content.

2. Atelo-kolagenová plst, uchovávaná v nesterilních vlhkých podmínkách, si po dobu více než 1 rok uchovává své vlastnosti, bez známky růstu plísní.2. Atelo-collagen felt, stored in non-sterile humid conditions, retains its properties for more than 1 year, without any sign of mold growth.

3. Předklinické a klinické hodnocení atelokolagenové plsti proveděné v souvislosti s registrací jako léčivo u MZ ČR prokázalo, že atelo-kolagenová plst má srovnatelné haemostatické vlastnosti jako komerční druhy kolagenu, vstřebává se u pokusných zvířat bez pozorovatelné zápalové reakce a při aplikaci u více než 300 pacientu v průběhu klinického zkoušení nebyl pozorován v žádném případě nežádoucí vedlejší účinek nebo komplikace jež by bylo možno dát do vztahu ke zkoušenému atelo-kolagenu.3. Preclinical and clinical evaluation of atelocollagen felt performed in connection with registration as a drug at the Ministry of Health of the Czech Republic showed that atelo-collagen felt has comparable haemostatic properties as commercial types of collagen, is absorbed in experimental animals without observable inflammatory reaction and when applied in more than 300 No adverse side effects or complications related to the atelo-collagen under test were observed in any patient during the clinical trial.

4. Výsledky analýzy vzorku atelo-kolagenu připraveného podle příkladu 2;4. Results of analysis of a sample of atelo-collagen prepared according to Example 2;

Označení vzorku: 0991Sample designation: 0991

Obsah vlhkosti: 14,7 % hmot.Moisture content: 14.7% by weight

Obsah síranového popele: 3,8 % hmot.Sulphated ash content: 3.8% by weight

Obsah trypsinem odštěpitelných peptidů: 0,034 % hmot.Content of trypsin-cleavable peptides: 0.034% by weight

Obsah atelokolagenu /z hydroxiprolinu/: 99,2 % hmot.Atelocollagen content (from hydroxiproline): 99.2% by weight.

Claims

PATENT CLAIMS

1. Biocompatible atelo-collagen usable in human and veterinary therapy, characterized in that it contains type I collagen-free telopeptides, the content of trypsin-cleavable proteins is less than 0.1% by weight, the mineral content does not exceed 6.5% by weight, and the proportion of crystalline atelocollagen is higher than 99.0% by weight, based on the protein content.

2. A process for the preparation of atelocollagen according to claim 1, characterized in that the ligament of the sliced animal tendons is successively extracted with aqueous solutions of alkali metal and dibasic metal hydroxides at pH 9.0 to 13.6 and / or acids at pH 2.0 to 4, 5, preferably with the addition of neutral salts, and the binder is neutralized and / or washed with water after optional grinding and exposed to proteolytic enzymes from the group characterized by atelopeptidase activity in an amount corresponding to 0.5 to 45 thousand. casein units per kg of binder used, the reaction being carried out at a temperature of 10 to 42 ° C for at least 15 minutes.

3. The method of claim 2, wherein the enzyme Atelase H is used for atelopeptidation, the treatment is stirred for at least 3 minutes, and then the mixture is allowed to stand for at least 10 minutes, and after washing, the atelocollagen mass is dehydrated by lyophilization, drying under ordinary or elevated temperatures, or by solvent dehydration, and sterilized by gamma irradiation, or by temperature at reduced atmospheric pressure.