CS276477B6 - Způsob přípravy protinádorového biopreparátu cACPL - Google Patents

Abstract

Rešaní způsobu přípravy protinádorového biopreparátu cAGPL spočívá va sterilizaci povrchu skořápek ptačích vajec s deseti až dvanáctidennimi embryi UV zářením a přerušením jejich růstu a života parafinováním skořápek tekutým parafinem, ηβ’- bo v atmosféře čistého dusíku při 37 °C po dobu 10 dni.

Description

Vynález se týká protinádorového biopreparátu cACPL (crude anticancer phospholipid), jshož účinnou složkou je l-O-alkyl-2-acyl-sn-glycero-3-fosfo-(N-acyl)-ethanolamin a jeho protinódorová účinnost je známa a byla popsána například v publikaci 3.Kárá a sp., Neoplasma 33, 187-205, 19&3..Způsob přípravy tohoto biopreparátu byl popsán v čs. autorském osvědčení č. 252177 a v Čs. patentu 145770.

Způsob umrtvení desetidenních kuřecích embryí pomocí chloroformu nebo jiných Činidel jak je popsán v čs. patentu 145770 nebo v čs. autorském osvědčení č. 252177 se ukázal nevhodným pro přípravu preparátů cACPL určených pro perorálni použití, pro možnost kontaminace preparátů chloraformam nebo jinými Škodlivými látkami. Uvedenou nevýhodu odstraňuje nový způsob přípravy protinádorového biopreparátu cACPL z ptačích vajec s usmrcenými deseti- až dvanáctidsnními kuřecími embryi podle vynálezu, jehož podstata spočívá ve sterilisování povrchu skořápek vajec s desetidenními kuřecími embryi pod UV-zářivkami po dpbu 60 minut a v použití parafinování povrchu skořápek k přerušení růstu embryí a vytvoření ischemické embryonální tkáno produkující l-0-alkyl-2-acyl-sn-glycero-3~fosfor~(N-acyl)-etňanolamin při následné inkubaci, nebo použití inkubace vajec v čistém dusíku při 37 °C.

Příklad 1 _

Příprava biopreparátu cACPL parafinovou metodou:

a) Slepičí vejce obsahující desetidenní embrya sa nejdříve desinfikují na povrchu ozářením pod ultrafialovou germicidní zářivkou. Ozáření vajec pod UV-zářivkami sa provádí na platech, na kterých jsou vajíčka umísťována do thermostatu (líhně). Trubicové UV-zářivky jsou umístěny přibližně 1 metr nad vajíčky ve sterilním boxu. Vajíčka sa ozařují z jedné strany po dobu 30 minut, potom se obrátí o 180° a znovu se ozařuji 30 minut z druhé strany. Tento způsob desinfekca stačí k odstraněni mikroorganismů s povrchu skořápek. Tato preventivní desinfekca je nutná, aby se zabránilo ztrátám vzniklým bakteriální kontaminací obsahu vajec při dalším zpracováni.

b) Desinfikovaná vejce (ozářená pod UV-zářivkami) se krátce (na několik vteřin) ponoří do roztaveného parafinu (teplota 50 °C) a parafin na povrchu skořápek se ihned ochladí na vzduchu při narraálni teplete místnosti. Parafin uzavře průduchy ve skořápkách vajec, což vede k úhynu embryi v anaerobních podmínkách, zastavení krevního oběhu v embryonální tkáni, a tlm ke vzniku ischemické embryonální tkáně, ve které jo tímto způsobem indukována synthesa N-acylathanolaminových gíycerofosfolipidů. Biologicky účinný alkyl-Fosfolipid PNAE ftj. plasmanyl-(N-acyl)ethanolamln) vzniká enzymatickou transacylací prekursoru l-0-alkyl-2-acyl-fosfatidylethanolaminu, který je přítomen ve vaječném žloutku, během inkubace parafinovaných embryonálních vajec.

c) Parafinovaná vajíčka se ihned umísti do thermostatu (lihně) při 37 °C a inkubuji se při této teplotě 24 hodin. Potem sa parafin z povrchu vajec odstraní seškrabáním a vojce sa inkubuji dále při teplotě 37 °C v lihni po dobu 10 dní.

d) Pc desetidenní inkubaci se vajíčka postavená v papírových plotech na špičku na horní polovině skořápek desinfikuji lihovým roztokem jodu (Ifó roztok) a skořápka se potom otevře sterilními nůžkami a pincetou (kruhové odstřižení skořápky nad vzduchovou bublinou). Mrtvá embrya se odstraní pincetou a uloži se v mrazicím pultu při -15 °C (mohou být použita k extrakci alkyl-fosfolipidu PNAE.

e) Tekutý obsah vajec se filtruje přes dvojitou vrstvu sterilní (autoklávované) gázy do sterilních skleněných kádinek (obsah 1 až 2 litry). Filtrát obsahující předavším teku- tý žloutek sa rozdělí po 200 ml do sterilních NTS lahvi (obsah 500 ml), lahve se uzavřou Šroubovacími víčky a obsah se zmrazí na vnitřnin válcovém povrchu lahve otáčením v mrázíci alkoholové lázni při -50 °C lyofilizačního přístroje FRIGERA-Kolín, lahve ee otevřou, hrdlo sa převáže nylonovou sitkou (sterilní), vloži se do lyofilizačního bubnu uvedené aparatury a obsah lahvi se vysuší mrazovou sublimaci (lyofilizaci).

CS 27S 477 SS

f) Lyofilizovaný obsah lahví se homogenizuje roztíráním vo sterilních porcelánových trenkách ve sterilním boxu (místnost vyzářená UV-zářivkami), nebo se homogenizuje vo sterilním porcelánovém kulovém mlýnku. Žlutý lycfilizovaný prášek (preparát cACPL) se plní do sterilních NTS-lahví a uzavře se vzduchotěsné sterilními pryžovými zátkami se šroubovacím' víčkem. Lahve co uloží ve chladné místnosti a chrání se před světlem nejlépe v uzavřené skříni. Za těchto podmínek uskladnění je biologická aktivita preparátu (protinádorový a radioprotektivní účinek) zachována po dobu nejméně tří let. Tato dlouhodobá expirace preparátů cACPL byla ověřena testováním biologické účinnosti skladovaných preparátů v lotech 1933 - 1988.

Dusíková modifikace“ přípravy cACPL;

Uvedený postup přípravy cACPL může být modifikován tak. že místo parafinování (bod b)) se vajíčka s desetidenními embryi umístí v dusíkové atmosféře (vzduchotěsná skříň naplněná dusíkem z tlakové lahve) a iř.kubuji se při 37 °C v dusíku (tj. anaerobně) po dobu 10 dní. Další postup zpracování vajoc ja stejný jako u ^parafinové metody” (body d až f). ' ’

Preparát cACPL připravený parafinovou metodou má protinádorovou aktivitu stojnou jak bylo publikováno dříve (3. Kára _a sp., NEOPLASIA, 33, 187-205, 1003). Důkazem tcho jsou také výsledky experimentálních výzkumů/ získané na řadě experimentálních myších nádorů. Byly studovány následující typy nádorů: adenokarcinom mléčné žlázy Ca-755, nádor děložniho čípku r3m-5, fibrooarkom Mcll, Crockerův sarkom 8-180 a sarkom. 37 (sseitová forma). Preparát byl zvířatům aplikován perorálně ve fyziologickém roztoku jako homogenní suspenze. Byl použit široký rozsah dávek (od 10 mg do 1000 mg/kg) při mnohonásobné aplikaci preparátu cACPL v průběhu 10 - 15 dní. Oako kriteria léčebného účinku byly použity: inhibico růstu nádorů (v procentech) a zvýšení délky přežití léčených zvířat ve srovnání s kontrolou (v procentech).

Bylo zjištěno, že biopreparát cACPL brzdi růst pevných nádorů Ca-755, RŠH-5, Kc-ll o 73 2» 95 % a 67 2 a prodlužuje dobu přežiti zvířat se sarkomem -37 o 56 'j.

Farmakokinetickými studiemi při pcrorólni aplikaci biopreparátu cACPL raySim BDF e nádorem Mcll v dávce 300 mg/kg bylo zjištěno,' že se v nádoru objevuje frakce N-acyl-fosfatidylethanolaminových fosfolipidů, které obsahuji protinádorovou komponentu plasmenyl-(N-acylJ-ethanolamin (PNAE). ·

Opakovaná aplikace biopreparátu cACPL vede ke kumulaci fosfolipidů v nádorové tkáni a v krvi myši.

Farmakokinetika C-PNAE v krvi myši po jednorázové'perorální aplikaci je popsána matematickým farmakokinetickým modelem s poločasem dosaženi maxima v krvi za 1,3 has poločasem sníženi koncentrace ^⁴C-PNAE v krvi za 126 h. Při opakované intravenosni apli. taci ^C-PNAE byla pozorována kumulace ^C-PNAE v nádoru,' v játrech, plicích, slezině a • v mozku zvířat a ^C-PNAE a jeho metabolity nebyly vylučovány ledvinami z organismu.

Biopreparát cACPL není toxický pro normální tkáně a nemá negativní účinky r.n krvetvorbu. ·

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   J * ·

   Způsob přípravy protinádorového biopreparátu cACPL z ptačích vajec s deseti až dvsnáctidennimi embryi přerušením jejich růstu a života, vyznačující se tim, že se povrch skořápek těchto vajec nejdříve sterilizuje po dobu 30 minut UV Zářonim a po jajich otočení o 160 °C po dobu dalších 30 minut, potom se přeruší růst a život embryi parafinováním skořápek tekutým parafínem při 50 °C nebo v atmosféře čistého dusíku, polom se provede jejich inkubace za anaerobních podmínek, nebo v atmosféře čistého dusíku při 37 °C po dobu 10 dní. ‘