CS274437B2

CS274437B2 - Method of new quinoline derivative production

Info

Publication number: CS274437B2
Application number: CS619588A
Authority: CS
Inventors: Dat Xuong Nguyen; Jean Rapin; Thadee Staron
Original assignee: Lafon Pharma
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1991-04-11
Also published as: CS619588A2; NO167383C; IL87784A0; HU198682B; NO884116D0; ATE70263T1; EP0308349A1; US4894393A; FI884272A7; ZA886916B; FI884272L; YU175188A; PT88520B; PL274705A1; DK519288A; NZ226237A; FR2620701A1; GR3003694T3; FI884272A0; ES2039668T3

Description

Vynález se týká způsobu výroby nového cholinového derivátu, oholindiethyldithiukarbamátu, který je možno vyjádřit vzorcem \

N-C-S

CH.

• I

CH₃-N-CH₂-CH₂0H ch₃ z cholinchloridu a z thihydratovaného diethyldithíokarbamátu sodného.

Uvedenou látku je možno použít k léčbě degenerativních onemocnění mozkových.

Sumární vzorec nové sloučeniny je molekulová hmotnost 252,40.

Nová sůl cholinu má formu jemných bezbarvých nebo lehce nažloutlých krystalů s teplotou tání 96 až 97 °C, sloučenina je snadno rozpustná ve vodě, v alkoholech a v glykolech, méně rozpustná je v organických rozpouštědlech.

Krystaly cholindiethyldithiokarbamátu jsou velmi hygroskopické a je nutno je uchovávat v chladu v hermeticky uzavřené nádobě.

Dále jsou uvedeny výsledky analýzy v %:

	Vypočteno	Nalezeno	Průměr
Uhlík	48,85	48,18 - 48,47	48,33
Vodík	9,64	9,37 - 9,54	9,45
Dusík	11,12	11,59 - 11,51	11,55
Síra	25,55	24,94 - 24,75	24,85
Kyslík	6,35

Spektrum v infračerveném světle, ultrafialovém světle a NMR-spektrum obsahují pásy, které jsou charakteristické pro molekulu nové sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu.

Cholindiethyldithiokarbamát je možno získat z trihydratovaného diethyldithíokarbamátu sodného a z cholinchloridu.

i

Reakci je možno vyjádřit následujícím reakčním schématem:

^C2^H5

CH.

, N-C-S-Na +

II s

ch₃-n-ch₂-ch₂oh

Cl ^C2»5

CH.

N-C-S

CH„ ch₃-n-ch₂-ch₂oh + NaCl ^C2^H5

CH„

Syntézu je možno provádět následujícím způsobem:

Ve dvou baňkách nebo kádinkách se odděleně od sebe rozpustí:

- 56 g, 0,40 molu cholinchloridu ve 100 ml ethanolu (absolutního) za současného mírného zahřívání elektrickou destičkou nebo na lázni za současného míchání pro snadnější rozpuštění,

- 90 g, 0,40 moli trihydratovaného diethyldithiokarbamátu sodného ve 100 ml absolutního ethanolu.

Oba roztoky jsou zakalené. Pak se pomalu vleva roztok cholinu v alkoholu do roztoku sodné soli za energického míchání a za současného zevního chlazení směsí vody a ledové drti, protože reakce je silně exothermní.

Po přidání přibližně třetiny celkového množství roztoku se počne vytvářet masivní sraženina. V přidávání se pokračuje za současného energického míchání.

Přidávání alkoholového roztoku cholinu do roztoku sodné soli trvá přibližně 15 minut

Směs se pak dále mícha jeste 30 minut. Pak bu zůstává nádoba s reakční směsí uzavřena

Následujícího dne se odstraní chlorid vždy 50 ml absolutního ethanolu.

Tímto způsobem se oddělí přibližně 23

Alkoholový matečný louh s obsahem cho nolu se zahustí na vodní lázni ve vakuu za ku ethanolu.

Pak se takto získaný viskozní odparek ného nebo porcelánového hmoždíře a pak se fosforečným.

Získá se pevná látka ve formě jemných rý je bezbarvý nebo nepatrně nažloutlý.

Tímto způsobem se v kvantitativním vý ethyldithiokarbamátu.

se směs nechá zchladnout přes noc. Po tuto dosodný odsátím a na filtru se dvakrát promyje g chloridu sodného.

indiethyldithiokarbamátu, rozpuštěného v ethasoučasného odlučování vody k odstranění prebytrychle vloží do baňky nebo kádinky nebo skleněuší v exsikátoru ve vysokém vakuu nad oxidem krystalků nebo jemně krystalického prášku, kteěžku získá celkem 100 g výsledného cholindiTakto získaný cholin diethyldithiokarbamát je nutno uschovávat v uzavřené nádobě, protože je hygroskopický.

Nový derivát cholinu, který je možno získat způsobem podle vynálezu má zajímavé farmakologické vlastnosti a poměrně nízkou toxicitu.

Zkoušky na toxicitu byly prováděny na švýcarských bílých myších.

V případě cholindiethyldithiokarbamátu byla sledována akutní toxicita, chronická toxicita, počet živě narozených plodu, teratogenita, fertilita v průběhu podávání i delší dobu po něm, vliv imunologické odpovědi na účinnost nového derivátu.

Pro všechny typy pokusů byly myši vybírány náhodně, rozděleny podle pohlaví, byly vytvořeny skupiny po 30 myších a březí myši byly izolovány do oddělených klecí. Zvířata byla krmena běžným krmivém ad libitum. Jako nápoj jim byla podávána voda s obsahem zkoumané látky, kontrolním zvířatům byla podávána pouze voda.

Podávané krmivo obsahovalo obiloviny, rostlinné bílkoviny, živočišné bílkoviny, anorganické soli a vitaminy.

Při zkouškách na akutní toxicitu byla nová sloučenina podávána podkožně a intraperitoneálně, zkouškami bylo možno prokázat velmi nízkou toxicitu nového derivátu.

Při dávce nižší než lg/kg hmotnosti vůbec nedošlo k uhynutí zvířat.

Dávka DL^g pro nový derivát se pohybuje v rozmezí 1,4 až 1,7 g/kg.

Na obr. 1 je graficky znázorněna akutní toxicita pro myš v g/kg při podkožním nebo intraperitoneálním podání.

Na ose úseček je znázorněna dávka cholindiethyldithiokarbamátu v g/kg hmotnosti pokusných zvířat. Na ose úseček je znázorněno množství uhynulých myší v %.

Při zjišíování chronické toxicity nového derivátu, získaného způsobem podle vynálezu byla nová sloučenina podávána perorálně ve vodě v dávce 20 mg/kg denně čtyřem skupinám po 30 myších po dobu 100 dnů. Po tuto dobu nebylo možno pozorovat žádný nepříznivý účinek zkoumané látky na zdravotní stav pokusných zvířat.

U švýcarských bílých myší pak byl stanoven vliv nového derivátu na počet živě narozených plodů a na teratogenitu. Pokusy byly prováděny na čtyřech generacích zvířat, přičemž bylo možno prokázat, že skupiny, jimž byla podávána zkoumaná látka mají celkově o 15 % více potomstva než kontrolní skupiny, protože počet mrtvě narozených plodů se snížil na polovinu.

Výsledky těchto pokusů jsou shrnuty v následující tabulce:

Pokusy s živě narozenými plody a na teratogenitu na 4 generacích bílých myších samic po dobu 4 měsíce (T-kontroly, G-pokusné skupiny s 1 o/oo zkoumané látky ve vodě)

Generace	Počet sledovaných gravidních myší v každé generaci	Počet živě narozených plodů	Počet mrtvě narozených plodů	Počet resor- bovaných plodů
	T	G	T	G	T	G	T	G
I	30	30	255	249	7	-	15	2
II	30	30	242	316	5	2	9	2
III	30	30	258	324	8	-	8
IV	30	30	263	308	3	-	11	-
Celkem	120	120	1 018	1 197	23	2	43	4

Při sledování fertility myších samic v závislosti na jejich věku bylo možno prokázat, že nová sloučenina, získaná způsobem podle vynálezu podstatně prodlužuje období fertility u myších samic, jak je shrnuto v následující tabulce.

Pokusy s fertilitou švýcarských bílých myších samic v závislosti na jejich stáří T = kontroly, G = pokusné skupiny, jimž bylo podáváno 1 o/oo zkoumané látky v pitné vodě

	% fertilních myších samic	průměrný počet živých plodů na fertilní myš
	T	G	T	G
myši - stáří 4 měsíce	97	97	8,5	9,8
8 měsíců	62	92	6,9	7,5
15 měsíců	23	60	5,2	7,5
Pokud jde o růst zvířat a	o jejich délku	života, bylo	možno pozorovat, že nový deri-

vát, získaný způsobem podle vynálezu neměl negativní vliv na růst přesto, že došlo k přibližně 25¾ snížení příjmu vody a přibližně 5¾ snížení příjmu potravy. Na druhé straně bylo možno prokázat, že podáváním nového derivátu je možno podstatně oddálit stárnutí. Tento účinek je možno pozorovat zejména u myších samců a jejich menším sklonem ke zraňování, k němuž obvykle dochází v důsledku jejich velké agresivity. Kontrolní samci byli daleko agresivnější, takže došlo i k poraněním a uhynutím těchto kontrolních zvířat.

Výsledky těchto pokusů jsou shrnuty grafickým způsobem na obr. 2, na němž je znázorněna mortalita švýcarských bílých myších samců a samic. Kontrolním myším byla podávána jako nápoj voda, pokusným myším voda s obsahem 1 o/oo cholindiethyldithiokarbamátu. Na ose úseček je na grafu znázorněn věk zvířat v měsících, na ose pořadnic množství uhynulých zvířat v procentech.

Začátek každého pokusu je označen šipkou. Získané výsledky jsou znázorněny čtyřmi křivkami. Křivka (1) byla získána nanesením výsledků pro kontrolní skupinu, křivka (2) pro skupinu, jíž byl podáván cholindiethyldithiokarbamát, křivky (1) a (2) byly získány při použití myších samců. Křivka (3) byla získána nanesením výsledků pro kontrolní skupinu myších samic a křivka (4) pro skupinu myších samic, jimž byl podáván cholindiethyldithiokarbamát.

Dále byl sledován také účinek nového derivátu, získaného způsobem podle vynálezu, na účinnost imunologické odpovědi u švýcarských bílých myší.

Ochrana uvedených zvířat proti agresivnímu působení je zajišíována imunitním systémem ve vztahu k antigenům na podkladě komplexu histokompatibility. Účinnost imunologické reakce závisí na těchto mechanismech a na rovnováze, která je určována hlavními parametry uvedeného-systému (citlivost, kompetence, intensita a trvání popudu). Tím dochází k jevu, že celá rada agresivních působení není napadeným hostitelem vůbec zaznamenána a hostitel ji nepocituje. Protože však také dochází k neodpovídajícím a chybným reakcím, vznikají různá a početná zánětlivá onemocnění, která se léčí stále hůře se zvyšujícím se věkem.

S přibývajícím věkem jich také rovněž přibývá. V těchto případech je zapotřebí preventivně i léčebně napravovat tyto omyly imunologického systému a potlačit zánětlivě projevy za současné obnovy funkce tkáně a poškozených oblastí.

V následující tabulce jsou shrnuty výsledky, při nichž byla zkoumána možnost potenciace imunologické odpovědi podáváním cholindiethyldithiokarbamátu.

V tabulce je prokázán kladný účinek tohoto podávání, protože k dosažení stejného účinku bylo zapotřebí podat 100 /bg specifické vakciny u kontrolních zvířat a pouze 20 ^ug této vakciny u zvířat, jimž byl podáván cholindiethyldithiokarbamát.

Vliv cholindiethyldithiokarbamátu na imunologickou odpověď u myší v případě podkožního podání Escherichia coli jako pathogenního organismu

	Množství vakciny, podané podkožně v 25 g, 8 dnů před infekcí	/Ug na	myš o hmotnosti
DL v % pro užitý	0	3	10	20 50	' 70	100 150
pathogen při podání uvedené vakciny	T G	T G T	G	T G T G	T G	T G T G
DL_q				+ +	+	+ + + +
^OL30			+
dl₅₀					+
^DL70		+		+ +
^DL100	+ +	+ +

Ze všech prováděných pokusů vyplývá, že toxicita nového derivátu, který je možno získat způsobem podle vynálezu je nepatrná. Je také zřejmé, že při podávání uvedeného nového derivátu švýcarským bílým myším je možno pozorovat velmi příznivé účinky na počet živě narozených plodů, délku života a účinnost imunologické odpovědi.

Farmakologické zkoušky s použitím nové sloučeniny ukazují, že tato látka má chelatační účinek na těžké a přechodné kovy, stimuluje imunologický systém, má antidegenerativní účinek a příznivý účinek na přenos neurony, v důsledku této účinnosti je možno novou sloučeninu použít k léčbě degenerativních onemocnění mozku, jako jsou senilní demence, Alzheimerova nemoc a různé demence Alzheimerova typu.

Je známo, že při svrchu uvedených onemocněních jsou nejprve chorobou zasaženy centrální cholinergní neurony, které se nacházejí na úrovni syntézy mediátoru nervového přenosu, kterým je acetylcholin, nebo na úrovni membrány, která potřebuje cholin pro svou biosyntézu. Z léčebného hlediska není nezbytné v těchto případech dodávat přímo acetylcholin, který membránami neprochází, vlastně to ani není uskutečnitelné, avšak výsledky, kterých bylo dosaženo podáváním samotného cholinu ve formě chloridu byly neuspokojivé.

Nového derivátu cholinu, který je možno získat způsobem podle vynálezu bylo použito k pokusům, které byly prováděny na dvou modelech pokusných zvířat s degenerací nervů, která byla vyvolána buď destrukcí cholinergního jádra mozkové baze, nebo opakovaným podáním hydroxidu hlinitého. V obou případech bylo možno pozorovat, že schopnost učit se u těchto zvířat, která byla zhoršena v souvislosti s uvedenou degenerací nervů se opět zlepšila v průběhu perorálního podávání cholindiethyldithiokarbamátu, získaného způsobem podle vynálezu. V případě třítýdenní léčby bylo možno pozorovat účinek, který byl závislý na velikosti dávky, účinná dávka ΕΟ^θ byla v tomto případě v rozmezí 0,10 g až 0,30 g/kg hmotnosti zvířete.

Dále byla zkoumána schopnost nového derivátu cholinu jako prekursorů acetylcholinu u starých krys.

Chalindiethyldithiokarbamát (DTC) byl podáván v dávkách, ekvivalentních dávkám cholinchloridu, tj. v dávkách 50 mg/kg/den perorálně po dobu 8 dnů krysám ve stáří 26 měsíců. Byla užita skupina kontrolních krys, skupina krys, jimž byl podán DTC a skupina krys, jimž byl podáván cholinchlorid.

Po usmrcení zvířat bylo sledováno množství cholinu a acetylcholinu v různých oblastech mozku (frontální laloky, okcipitální laloky,parietální laloky, hippokampus, corpus striatum, mozeček a prodloužená mícha) radioenzymologickým způsobem. Ve všech strukturách bylo zvýšeno množství cholinu ve srovnání s kontrolní skupinou. Toto zvýšení je patrné zejména v případě, že byl podáván DTC, V kůře frontálního laloku je výsledek statisticky významný při p<0,05. Mimoto je v případě podávání DTC zvýšeno i množství synthetizovaného acetylcholinu v kůře frontálního laloku ve srovnání se zvířaty, jimž byl podáván cholin chlorid. V případě podávání cholinchloridu je zvýšení o 10 %, v případě podávání DTC o 35 t, výsledek je opět statisticky významný.

Výsledky ukazují, že při podávání ekvivalentních dávek dojde k většímu zvýšení množství cholinu a acetylcholinu v případě podávání DTC (p<0,05 pro kůru frontálního laloku).

Klinické zkoušky

a) Výsledky, které byly získány s podáváním cholinu a jeho prekursorů (lecithin) jsou protichůdné a nestejnorodé, jak již bylo popsáno v publikaci The use of chlolinergic prekursors in neuropsychiatric diseases, Gordon S., Rosenberg a Kenneth L. Davis, Am. 0. of Clin Nutrition 36: říjen 1982, str. 709-720.

Bylo možno pozorovat zejména, že při dávkách

- cholinu 8 až 16 g/24 hod a

- lecithlnu 35 až 100 g/24 hod byly .výsledky neprůkazné a odporovaly si, a to:

cholin: ve třech pokusech, provedených dvojitou slepou zkouškou bylo možno pouze v jednom z nich prokázat účinek na zlepšení paměti u 5 nemocných pouze po dobu dvou týdnů,

-ve čtyřech otevřených pokusech bylo možno pouze ve dvou z nich prokázat mírné zlepšení u části nemocných, lecithin: ze dvou pokusů, provedených dvojitou slepou zkouškou byl jeden positivní po dobu 6 týdnů, ,

-ze dvou otevřených pokusů byly oba zcela negativní po dobu tří měsíců i delší.

b) Působení DTC bylo prováděno prof. Rancurelem (nemocnice Salpetriěre, Paříž).

- DTC byl podáván v dávce 500 mg/den (1 gelová kapsle s obsahem DTC 250 mg ráno a v poledne) ,

- léčba byla prováděna 3 měsíce,

- bylo použito dvojité slepé zkoušky proti placebu,

- jak je zřejmé z následujícího podrobnějšího popisu zkoušek, bylo možno prokázat statisticky významné zlepšení (p 0,01) v případě testů na zhoršení mentálního stavu a paměti a rovněž (p 0,05) pro lékařské i rodinné hodnocení stavu nemocného.

Jednotlivé zkoušky byly provedeny následujícím způsobem:

Dvojitá slepá zkouška proti placebu byla provedena na paralelních skupinách 30 ambulantních nemocných ve věku 50 až 70 let s progresivní degenerativní demencí Alzheimerova typu, která byla diagnostikována podle následujících hledisek:

- Demence DSM III,

-mentální stav (mini mental statě) 10 až 20,

- skoře podle Hachinskiho nižší než 7,

- nepřítomnost deprese (MADRS),

- nepřítomnost léčitelné demence původu

- toxického,

- metabolického,

- endokrinního,

- nádorového,

- hydrocephalického.

Všichni nemocní byli klasifikováni jako stadium II klasifikace podle Sjorgena.

Vyhodnocení bylo prováděno na začátku pokusu (den 0) a 90. dne podle následujících kriterií:

- WAIS

- Visuální percepce (Benton),

- Reyovy obrázky,

- MMS (mini mental statě)

- Profil stavu paměti PRM2,

- Klinické vyhodnocení lékařem a vyhodnocení rodinou.

Nemocným, náhodně rozděleným na dvě skupiny po 15 osobách byly 3 měsíce podávány

- 2 želatinové kapsle s obsahem DTC cholinu (250 mg/24 hod.)

- 2 želatinové kapsle s obsahem placeba.

Výsledky, které jsou shrnuty v následující tabulce jsou velmi povzbuzující z následujících důvodů:

- došlo k mírnému zlepšení visuální percepce (Benton),

- došlo k významnému zlepšení všech zkoumaných hledisek, a to i v případě MMS, kde je všeobecně pokládáno za možné jen malé zlepšení,

- došlo ke zlepšení aktivity nemocných, a to jak podle hodnocení lékaře, tak podle cení příslušníků rodiny nemocného.	hodno-
Kriterium	DTC čholin (15.případů)	Pláčebo (15 případů)
	den 0	den 90	rozdíl	den 0	den 90	rozdíl .
MMS	11,07	12,40	1,33	14,33	14,60	0,27	p < 0,01
	+ 4,20	+4,27	+ 0,90	+3,50	+3,46	+0,96
WAIS	4,93	6,40	1,47	5,73	5,73	0	P <0,01
	+1,49	+1,50	+ 1,06	+1,28	+1,49	+0,65
Benton	6,60	8,93	2,33	8,27	8,60	0,33	P <0,01
	+2,19	+2,40	+1,72	+2,28	+2,41	+ 0,49
PRM2	4,86	5,87	1	4,86	5,13	0,27	p<0,01
	+ 1,30	+ 1,19	+0,926	+ 1,32	+ 1,46	+0,46

CS 274437 02

Tabulka - pokračování

Kritérium	DTC cholin (15 případů)	Placebo (15 případů)
den 0	den 90	rozdíl	den 0	den 90	rozdíl
lékařské hodnocení	3,53	4,6	1,07	3,36	3,64	0,42	P < 0,05
	+ 0,81	+ 1,11	+ 0,59	+ 1,29	+ 1,30	+0,108
hodnocení rodiny	2,50	3,43	0,93	3,20	3,33	0,37	p <0,05
	+ 0,93	+ 1,47	+ 0,86	+ 1,18	+ 1,23	+0,52

Výsledky tedy ukázaly, že je možno při léčení novým derivátem cholinu, získaným způsobem podle vynálezu dosáhrvout ústupu nebo alespoň podstatného zmenšení obtíží a také zlepšení nálady nemocných a jejich aktivity. Tyto výsledky byly potvrzeny pozorováním lékařů a příslušníků rodin nemocných a současně objektivizovány psychomotorickými zkouškami .

V případě léčení placebem bylo možno pozorovat v některých případech mírné zlepšení, které však bylo menší a mělo kratší trváni než zlepšení, jehož bylo dosaženo podáváním nového derivátu cholinu, získaného způsobem podle vynálezu.

Nový derivát, získaný způsobem podle vynálezu je možno zpracovat na farmaceutické prostředky, které uvedený derivát obsahují jako účinnou složku a které je možno podávat perorálně, rektálně nebo injekčním způsobem podle pathofysiologického stavu zažívací soustavy a podle onemocnění.

V případě perorálního podání je možno farmaceutický prostředek s obsahem cholindiethyldithiokarbamát podávat ve formě tablet nebo želatinových kapslí, v nichž je účinná látka smísena s běžnými pomocnými látkami. Tyto pomocné látky s výhodou obsahují silikagel vzhledem k silně hygroskopické povaze cholindiethyldithiokarbamátu. Mimoto je nutno vyloučit předčasnou hydrolýzu této sloučeniny, k níž by mohlo dojít v žaludku, takže je zapotřebí lékovou formu opatřit enterosolventním povlakem, jak je to u lékových forem pro perorální podání běžné, například tvorbou mikrokapslí.

V případě rektálního podání je možno zpracovat novou účinnou látku na čípky běžným způsobem.

V případě injekčního podání je třeba uchovávat odděleně od sebe cholindiethyldithiokarbamát a fysiologický roztok chloridu sodného a smísit obě tyto látky až bezprostředně před podáváním.

Nová účinná látka se ve formě farmaceutického prostředku podává v dávce 250 mg až

2,5 g denně, pro perorální podání obsahuje tableta nebo želatinová kapsle s výhodou dávku 125 mg a je možno podávat 2 až 20 těchto dávek denně, pro rektální podání jsou výhodné čípky s dávkou 250 nebo 500 mg účinné látky, v tomto případě může být podána dávka až 3 g denně.

3e samozřejmé, že v případě potřeby je možno podat nižší i vyšší dávky a farmaceutické prostředky mohou obsahovat i jiná množství účinné látky.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU Způsob výroby cholindiethyldithiokarbamátu vzorce ^C2^H5 CH + \ r ι ί , N-C-S CH„-N-CH_o-CH,0H / '1 ' s 3 2 2 < 1 J ^C2^H5 CH₃ vyznačující se tím, že se uvede do reakce cholinchlorid s trihydratovaným diethyldithio- <arbamátem sodným.

2 výkresy