CS274177B1

CS274177B1 - 2-amino-2-hydroxymethyl-3,4-trans-epoxy-14-oxo-6-trans-eikosenic acid and method of its preparation

Info

Publication number: CS274177B1
Application number: CS150288A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Rndr Sailer; Vaclav Rndr Csc Sasek; Vladimir Rndr Phmr Drs Musilek; Jan Rndr Csc Sejbal; Milos Rndr Csc Budesinsky
Original assignee: Miroslav Rndr Sailer; Vaclav Rndr Csc Sasek; Vladimir Rndr Phmr Drs Musilek; Jan Rndr Csc Sejbal; Milos Rndr Csc Budesinsky
Priority date: 1988-03-09
Filing date: 1988-03-09
Publication date: 1991-04-11
Also published as: CS150288A1

Description

Vynález ee týká kyseliny 2-amino-2-hydroxymathyl-3,4-trans-apoxy-14-oxo-trans-eikosanové a způsobu jeji připravy.

Dále je předmětem vynálezu použiti této látky jako antibiotika. Kyselina aa vyznačuje vysokou antibiotickou účinnosti proti kvasinkám a vláknitým houbám.

□a znám calkam malý počat antibiotik a syntetických preparátů užívaných v terapii mykotických onemocněni člověka. Vzhledem k současnému vzrůstajícímu počtu těchto onemocněni a stoupající rezistenci původců onemocněni proti užívaným preparátům je trvalá potřeba hledat dalši látky, které máji antifungální účinek.

Z používaných antifungálnich antibiotik lze uvést zejména antibiotika polyénového typu produkovaná straptomycaty, nako např. nystatin (Házen E. L. a Brown R., Science 112: 423, 1950), amfotaricin B (Gold W. a kol., Antibiotlcs Ann.: 579, 1955/1956) nabo primaricin (Struyk A, P. a kol., Antibiotlcs Ann.: 878, 1957/1958) dála griaaofulvin produkovaný kulturou Panicilllum grieaofulvum (Oxford A, F. a kol., Biocham. □, 33: 240, 1939) a konečně i československý mucidln (Mucidermin SPOFA) produkovaný kulturou Oudamansialla mucida (Čs. pat. 136 492).

K léčbě mykotických onemocněni sa vadla antibiotik používají i eyntaticky připravená antimykotika, z nichž se v posledních letech zjaména uplatňuji imidazolové sloučeniny.

Nevýhodou některých těchto známých látek ja, ža například řada z nich není účinná proti kvasinkám nabo jejich specifická účinnost je malá.

Tyto nevýhody odstraňuje kyselina 2-amino-2-hydroxymathyl-3,4-trans-apoxy-14-oxo-6-trans-aikosanová obecného vzorca

O /\

NH,

CH₃-(CH₂)₅-C0-(CH₂)₆-CH»CH-CH₂-CH-CH-C-C00H \

CH₂0H u které byla zjištěna vysoká antibiotická účinnost proti kvasinkám a vláknitým houbám.

Z tohoto důvodu lza tuto kyselinu použit jako účinné antibiotikum.

Kyselina 2-amino-2-hydroxymathyl-3,4-trana-apoxy-oxo-6-tran8-aikosanová sa připravuje tak, ža sa aerobně kultivuje houba Malanconia flavovirana na tekuté živná půdě obsahující jednoduché cukry nebo polysacharidy v koncentraci 1 až 10 % hmot. jako zdroj uhlíku a komplexní zdroj dusíku a to při teplotě v rozmázl 18 až 30 °C, pH v rozmázl 4,0 až

6,5.

Výhodné ja provádět kultivaci 3ubmarznim způsobem, Jako produkční organismus sa může použit například kmen houby Malanconis flavovirana uložený va ablrca CCF pod č. 1 886, Uvedená kyselina podlá vynálezu sa vyznačuje antifungální účinnosti zejména proti kvasinkám a vláknitým houbám.

Podrobná charakteristika nového antibiotika

Kyselina 2-amino-2-hydroxymathyl-3,4-trans-apoxy-14-oxo-6-trana-aikosanová (dála jen pracovní název flavovirin) ja bilá krystalická sloučenina 8 následujícími vlastnostmi: teplota táni 156 až 158 °C, optická otáčivost + 13,5° _+ 1° (c O, 66 % pyr.), UV spektrum namá žádné charakteristická maximum, IČ spektrum (KBr) má významná maxima při 3 415,

926, 2 854, 1709, 1 645, 1 499, 1 457, 1 254, 1 064, 972, 908 cml. Viz obr. lj ¹H NMR 13 spektrum, viz obr. 2j C NMR spektrum, viz tabulka 1. Elementární analýza: pro sumární vzorec C_2lH₃₇N0₅ (m. h. 383) vypočteno: C 65,77 %, H 9,72 %, N 3,65 %j nalezeno: C 65,67 %, H 9,65 %, N 3,72 %. Pozitivní reakce: a ninhydrinem a dinitrofanylhydrazinam. Rozpustnost: flavovirin ja nerozpustný v patrolsthsru, disthylathsru, benzenu, částečně rozpustCS 274 177 Bl ný v chloroformu, methanolu, ethanolu, n-butanolu, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, pyridinu.

Stabilita: sloučenina Je v roztoku v rozsahu pH 2 až 10 stabilní, při zahříváni na 100 °C po 15 min. klesá Jeji aktivita na polovinu, při skladováni při teplotě 4 °C se aktivita antibiotika během několka měsíců nezměnila.

Antibiotická účinnost je výrazná proti kvasinkám a některým vláknitým houbám, proti baktériím nabyla zjištěna; viz tabulka 2.

Tabulka 1

C NMR spektrum flavovirinu (50,31 MHz, v haxadautarodimathylaulfoxidu)

Uhlik č.	<ý~(ppm)
1	168,11
2	63,60
3	58,08®
4	53,66®
5	34,33
6	133,09
7	124,62
8	32,21
9	31,27
10	28,89^b
11	28,64^b
12	23,39
13	41,98
14	210,75
15	41,98
16	23,39
17	28;58^b
18	28,45^b
19	22,16
20	14,09
21	62,16

a; b Přiřazeni signálů označených stejným písmenem může být zaměněno

CS 274 177 Bl

Tabulka 2

Biologické spektrum flavovirinu a jeho srovnáni s myriocinem

Testovací organismu	MIC flavovirin	^§(yUg/mL)	myrlocin
Candida albicans	0,39		1,56
C. pssudotropicalis	0,39		3,12
C. utilis	0,39		0,78
Cytospora leucostoma	0,78		0,78
Fuearium oxysporum	7200		6/25
Hansenula anomala	0/78		0,78
Chaetomium globosum	0,78		1,56
Kloecksra apiculata	0;10		0,78
Metschnikowia pulchsrrlma	0,78		3,12
Penicillíum stipitatum	200		7200
Pichia fermentans	0/10		1,56
Saccharomyces cerevisiae	0/39		1,56
S. cerevisiae var. ellips.	0,39		1,56
S. lipolytica	0,39		0,78
Verticillium cinnabarinum	25		7200
Bacillus subtilis	7 200		7 200
Escherichia coli	7200		z200

§ MIC - minimální inhibiční koncentrace

Testy byly prováděny plotnovou difusni metodou.

Způsob přípravy antibiotika

Produkčním organismem je kmen houby Melanconis flavovirens uložený ve sbírce CCF pod č. 1886 (autorské osvědčeni č. 234 407). Kultura je uchovávána na šikmém sladinovém agaru při teplotě 4 °C; přeočkovávána po 6 měsících. Dále jsou uvedeny příklady výroby kyseliny (flavovirinu) podle vynálezu.

Přiklad 1

Fermentace flavovirinu probíhá bu3 v baňkách na třepačce; nebo ve fermentačnim tanku při použiti půdy o složení: glukosa 3 % hmot., kukuřičná máčecí voda (50 % hmot. sušiny) 1,5 % hmot., MgSO^.7 H^O 0,15 % hmot., pH 5,5 (upraveno KOH před aterilizaci), optimální teplota kultivace 24 °C. Inokulum je 5 % obj. submerzni kultury. Maximum produkce je mezi 12 až 14. dnem kultivace, kdy kultura obsahuje 20 až 35 mg flavovirinu v 1 L,

Narostlá submerzni kultura se filtrací rozdělí na médium a mycelium. Mycelium se extrahuje methanolem. Zahuštěný methanolický extrakt se spoji s médiem a js dále čištěn chromatograficky na sloupci amberlitu XAD 2 (směs voda, methanol, až do 80 % obj. konc. methanolu). Aktivní frakce po odpařeni methanolu je extrahována chloroformem. Po odpařeCS 274 177 Dl ni chloroformu je vzorek čištěn chromatograficky na sloupci s polyamidem (směs voda : ethanol, až do 96 % obj. konc. ethanolu). Následuje adsorpčni chromatografie na sloupci silikagelu (směs chloroformmathanol, až do 80 % obj. konc. methanolu).

Vzhledem k tomu, že antibiotický komplex kromě flavovirinu obsahuje také antibiotikum myriocln (thermozymocidin) (Aragozzini F. a kol., Tetrahedron 28: 5493, 1972, US patent 3 758 529j Begli 3. F. a kol.,' 3. Org. Chám. 38: 1253, 1973), ja nutno obě sloučeniny rozdělit. Flavovirin se za směsi izoluje jednak precipitaci v ethylacetátu, jednak chromatografii na silikagelu (soustava ieopropanol : HCOOH : HgO,’ v poměru 97 : 1,5:

: 1,5) a analytické čistoty Ja dosaženo opakovanou krystalizaci ze směsi ethanol : voda (8:2).

Přiklad 2

Fermentace probíhala 9tejně jako v přikladu 1. Narostlá 9ubmerzni kultura byla homogenizována s dvojnásobným objemem n-butanolu. Po odděláni mycelia filtraci se butanolické fáze odpaří a odparek je dále zpracován roztřepávánim mezi chloroformem a vodou. Dalěi postup Je shodný jako v přikladu 1.

Srovnáni flavovirinu 8 myrlocinam (thermozymocidinem)

Vzhledem k tomu, ža flavovirin je etrukturou blizký myriocinu (tharmozymocidinu), byla obě antibiotika porovnána Jak z hlediska fyzikálně-chemických vlastnosti;' tak z hlediska biologické aktivity.

Prvý rozdíl ja v produkčních organismech. Myriocin je produkován tarmofllni houbou Myriococcum albomycez Cooney a Emerson, což Js synonymum pro Thiolavia albomycos (Coonay a Emerson) Malloch a Caln, produkční kultura ja uložena va sbírce NRRL pod č. 3 858. Totéž antibiotikum bylo pod názvem thermozymocidin izolováno z blíže neurčené termofilní houby; která je uložena va sbirca ATCC pod č. 20 349. Naproti tomu produkční organismus Melanconia flavovirena (Otth) Wahm. patři do skupiny hub Pyrenomycates a vedle myriocinu (thermozymocidinu) produkuje dalši antibiotikum flavovirin.

Rozdíl fyzikálně-chemických charakteristik mezi flavovirinam a myrlocinam ja zřejmý z tabulky č. 3. Chemická příbuznosti flavovirinu s myriocinem bylo využito při řešeni struk tury flavovirinu vzhledem ke známé absolutní kofiguraci myriocinu.

Tabulka 3

Srovnáni některých fyzikálně-chemických charakteristik flavovirinu a myriocinu (thermozymocidinu)

	FLAVOVIRIN	MYRIOCIN
Sumární složeni	^C21^H37^N05	^C21^H39^N06
Teplota táni	156 až 158 °C	176 až 179 °C
Optická otóčivost
/°£/q * 1° (pyridin)	+13,-5° (c 0,66 %)	+19,5° (c n 0,48 %}
Chromatografická pohyblivost TLC (Rf) a) silikagel (n-amylacetát : EtOH : : HCOOH : H₂0 - 12 : 6 : 1 : 1)	0,49	0,39
b) Celulóza - org. fáze (n-amylacetát:
:aceton : CHgCOOH : H₂0 - 7 : 2 : 1 : 4)	0,54	0,29

CS 274 177 Bl

Dalši rozdíl mezi oběma látkami je v biologické účinnosti. Při použiti difuení plotnové metody je účinek flavovirinu ve srovnáni s myriocinem ve většině připadů vyšši až 15x u druhu Pichia fermentans,' viz tabulka 2. Odpovidajici rozdíly byly zjištěny i pomoci zkumavkové zřeňovaci metody, již byly porovnávány minimální inhibiční koncentrace (MIC) a minimální fungicidni koncentrace (MFC) proti vybraným druhům kvasinek, viz tabulka 4,

Tabulka 4

Srovnáni minimálních inhibičnich koncentraci (MIC) a minimálních fungicidnich koncentraci (MFC) flavovirinu a myriocinu na vybrané druhy kvasinek^

Testovací organismus	MIC flavovirin	(/Ug/mL) myriocin	MFC flavovirin	(/Ug/mL) myriocin
Candida pseudotropicalis	o;25	2;5	0,75	7.5
C. albicans	0,20	1,0	1,0	5,0
Kloackara aplculata	0/10	0,5	0,5	2.0

§ Testy byly prováděny zkumavkovou zřsňovaci metodou

Claims

1. Kyselina 2-amino-2-hydroxyraethyl-3,4-trans-epoxy-14-oxo-6-trane-eikosenová obecného vzorce I ' O NH_O

Λ /

CH₃-(CH₂)₅-C0-(CH₂)₆-CHmCH-CH₂-CH-CH~CH-C-C00H

CHgOH

2. Způsob přípravy kyseliny podle bodu 1, vyznačený tim, že se aerobně kultivuje houba Melanconie flavovirens na tekuté živné půdě obsahující jednoduché cukry nebo polysacharidy v koncentraci 1 až 10 % hmot. jako zdroj uhlíku a komplexní zdroj dusíku při teplotě v rozmezí 18 až 30 °C,' pH v rozmezí 4,'O až 6;5; načež ze získané biomasy se kyselina izoluje extrakci; sloupcovou chromatografií a opakovanou krystalizaci.

3. Způsob podle bodu 2,' vyznačený tim, že se kultivace provádí submerzně.

4. Způsob podle bodu 2, vyznačený tim; že se použije kmen houby Melanconis flavovirens uložený ve sbírce CCF pod č. 1 886.