CS272185B1 - Zmobilizovaný biokatalyzátor pro transformaci nikotinamidadenindinukleotidu v nikotinamidadanindinukleotidfoefát a způsob jeho přípravy - Google Patents

Abstract

Imobilizovaný biokatalyzátor pro transformaci nikotinamidadenindinukleotidu v nikotinamidadenindlnukleotidfosfát obsahuje 10 až 30 % hmot. vlhkých permeabilizovaných mikrobiálních buněk 3 metafosfátdependentni nikotinamidadenindinukleotid-kinasovou aktivitou, s výhodou Arthrobacter globiformis nebo Bravibacterium ammoniagenes nebo Brevibacterium stationis, v 1,5 až 4 % hmot. gelu genu-carrageenanu. Způsob ■ přípravy spočívá v tom, že se vlhké promyté, odstředěná bakteriální .buňky imobilizují do gelu genu-carrageenanu, načež se na vzniklé částice gelu působí organickým rozpouštědlem, například acetonem, nebo povrchově aktivními látkami, například dodecylsulfátem.

Description

Vynález se týká imobilizovaného biokatalyzátoru pro transformaci nikotinamidadenindinukleotidu (NAD⁺) v nikotinamidadanindinukleotidfostát (NADP⁺) a způsobu jeho přípravy, Nikotinamidadenindinukleotidfosfát js důležitým koenzymem řady oxidoreduktas, dříve oziačovaných dehydrogenasy. Osho funkce spočívá v reversibilní vazbě vodíku:

NAOP⁺ + 2 H NADP + H⁺

V redukované formě se NADPH účastní synthesy řady sloučenin v živých buňkách - sacharidů mastných kyselin, kyseliny mevalonové při syntéze isoprenoidů atd. V chemických a biologických laboratořích se používá především při enzymovém stanoveni D-glukosy a při mctabolické aktivaci chemických sloučenin testovaných z hlediska jejich mutagenních a kancerogenních účinků.

Původně se nikotinamidadenindinukleotidfosfát získával z mikrobiálních buněk (Hoda Y. a ap., Oaponský patent 76-151318, 1976). V těchto buňkách se věak vyskytuje v mnohem nižších koncentracích než nikotinamidadenindinukleotid (Murata K. a sp., Biotechnol. Bioeng. 21, 887, 1979), z něhož lze připravit fosforylací. Fosforylaci katalyzují specifické nikotinamidadenindinuklotid-kinasy dvojího druhu: kinasy vyžadující jako donor fosfátu adenosintrifosfát a kinasy, které k tomuto účelu využívají metafosfát (Murata K. a sp*. Agric. Biol. Chern. 44; 61, 1980). Izolaci a charakterizaci obou druhů byla věnována náležitá pozornost (Appa O. K., Eur. O. Biochem. 55, 475, 1975, Blomquist Ch. H*, Methods Enzymol. 66, 101, 1980, Hayashi T. a sp., Biotechnol. Bioeng. 21, 1019, 1979, Murata K. a sp., Agric Biol. Chern. 44, 1165, 1980) včetně možnosti přípravy heterogenního biokatalyzátoru imobilizací na různé typy nosičů (Sundaram P. V. a Apps D. K., Biochem 3. 161, 441, 1977).

Aplikace adenosintrifosfát-dependentní nikotinamidadenindinukleotid-kinasy pro přípravu nikotinamidadenindinukleotidfosfát vyžaduje jako donor fosfátu přítomnost adenosintrifosfát v reakční směsi. Pokud je biotransformace prováděna imobilizováním enzymem, je výhodné adenosintrifosfát regenerovat v reakční směsi vhodnou spřaženou enzymovou reakci. K této regeneraci byl např. použit koimobilizovaný enzym acetát-kinasa (Miyawaki O. a sp., Agric. Biol. Chern, 46,' 2725, 1982). Přes všechny tyto možnosti je však pro přípravu nikotinamidadenindinukleotidfosfát jako výhodnější použití metafosfátdependentní NAO-kinasy, případně imobilizace celých mikrobiálních buněk ji obsahujících.

Příprava a použití heterogenních biokatalyzátorů na bázi imobilizovaných buněk je ve srovnání s imobilizovanými enzymy výhodnější nejenom z hlediska možnosti regenerace adenosintrifosfát či některých kofaktorů, ale i tím, že odpadá mnohdy technicky i ekonomicky náročná izolace enzymů, přičemž se tyto enzymy obsažené přímo v imobilizovaných buňkách nacházejí ve fyziologickém prostředí, lokalizované často na subcelulárních částicích, v důsledku čehož je i jejich stabilita velmi často výrazně vyšší než v izolovaném stavu. Z tohoto důvodu je i stabilita heterogenních biokatalyzátorů připravených imobilizací celých buněk většinou vyšší ve srovnání s biokatalyzátory na ba'zi imobilizovaných enzymů. Ve shodě s těmito zobecněnými zkušenostmi byla i pro biotransformači nikotinamidadenindinukleotid v nikotinamidadenindínukleotidfosfát věnována nejvyšší pozornost přípravě heterogenních biokatalyzátorů obsahujících imobilizované buňky s nikotinamidadenindinukleotid-kinasovou aktivitou.

Z mnoha druhů mikroorganismů, u nichž byla prokázána nikotinamidadenindinukleotid-kinasová aktivita, byly pro přípravu heterogenních biokatalyzátorů používány především Achromobacter aceris (Uchida I. a sp., Biotechnol. Bioeng. 20, 255, 1978), Proteus vulgaris (Watanabe T. a sp., Oaponský patent 78-115891 a Japonský patent 78-115892, 1978) a Brevibacterium ammoniaganes (Hayashi T. a sp., Biotechnol. Bioeng. 21, 1019, 1979, Watanabe T. a sp., Oaponský patent 78-88385, 78-99386, 78-115891,· 78-115892, 1978 a Murata K. a sp., Biotechnol. Bioeng. .21, 887, 1979). Vedle nejčastěji používané imobilizace do polyakrylamidového gelu, případně koimobilizace s kvasinkami do tohoto gelu (Ado Y, a Kimura Κ·, Enzyme Eng. 5, 295, 1980, Watanabe T, a sp., Oaponský patent 78, 142596 a

CS 272 185 81 ^ώ

78-142597, 1978) byl např. použit též polymer vytvořený z polyethylenglykoldimethakrylátu (Tanaka Y. a sp., Biotechnol. Bioeng. 24, 857, 1982). U mikroorganismu Brevibacterium ammoniagenes imobilizovaného do polyakrylamidového gelu bylo využito též jeho metafosfátdependsntní nikotinamidadenindinukleotid-kinasové aktivity (Murata K. a sp., Biotechnol. Bioeng. £1, 887, 1979).

Příprava heterogenních biokatalyzátorů zabudováním enzymové aktivního biologického materiálu do synthetického gslu vytvořeného radikálovou polymsrací akrylamidu s N/N*-methylen-bis-akrylamidem má však řadu nevýhod. Dosud není znám způsob provedení polymeracs, podle kterého by bylo možno připravit částice gelu sférického tvaru a alespoň přibližně shodné velikosti, které by zaručovaly optimální hydrodynamické vlastnosti biokatalyzátoru. Největším nedostatkem uvedeného postupu je však skutečnost, že by? i krátkodobým stykem buněčného materiálu s monomery akrylamidem a N,N^/-methylen-bis-akrylamidem dochází často ks snížení příslušné enzymové aktivity. Ke ztrátám enzymové aktivity buněčného materiálu dochází též pod vlivem tepla, které se uvolňuje během polymerace.

Uvedený nedostatek je možno odstranit využitím imobilizovaného biokatalyzátoru podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje mikrobiální buňky s metafosfátdspendantní nikotinamidadenindinukleotid-kinasovou aktivitou v gelu genu-carrageenanu, popřípadě dále mechanicky zpevněného a stabilizovaného. Imobilizovaný biokatalyzátor podle vynálezu obsahuje s výhodou mikrobiální buňky Brevibacterium ammoniagenes nebo Brevibacterium stationis nebo Arthrobacter globiformis, zabudované v 1,5 až 4% (hmot.) gelu genu-carrageenanu v množství 10 až 30 % hmot, vlhkých buněk. Při přípravě biokatalyzátoru se vlhké nakultivované buňky suspendují v 3 až 5% sólu genu-carrageenu 30 až 50 °C teplého. Po důkladném promíchání se směs nakape do vychlazeného roztoku 0,3 M chloridu draselného přes vrstvu parafínového oleje. Vzniklé kuličky gelu s imobilizovanými buňkami se po 24 h stání v 0,3 M roztoku chloridu draselného a následné permeabilizaci používají pro biotransformace nikotinamidadenindinukleotid na nikotinamidadenindinukleotidfosfát, případně se s výhodou dále zpevní zesítěním jejich povrchové vrstvy přídavkem 1,6-diaminohexanu a glutaraldehydu. Buňky se s výhodou permeabilizuji acetonem nebo povrchově aktivními látkami, například dodecylsulfátem až po jejich imobilizaci. Pro potlačení rozvoje mikrobiální kontaminace je výhodné použiti inhibitorů, například 0,01 až 0,3 mol/1 fluoridu sodného a/nebo 0,1 až 3 mM/1 azidu eodného.

Připravený imobilizovaný biokatalyzátor použije k biotransformaci nikotinamidadenindinukleotid na nikotinamidadenindinukleotidfosfát v prostředí obsahujícím 2 až 20 mM nikotinamidadenindinukleotid, 2 až 60 mM Mg , 0,05 až 3 % hmot, metafosfátu a případně i 0,01 až 0,2 M D-glukosu. Všechny složky se rozpustí ve vhodném pufru o pH 5,5 až 9,0, Biotransformace se provádí v rozmezí 20 až 55 °C. Izolace nikotinamidadenindinukleotidfosfát se provádí po proběhnutí reakce některých ze známých postupů, například ionexovou chromatografií. Nezreagovaný nikotinamidadenindinukleotid se vrací do reakce.

Hlavni výhodou imobilizovaného biokatalyzátoru je použiti genu-carregeenanu k imobilizaci buněk. Genu-carrageenan je druh carrageenanu izolovaný z řas rodů Gigartinaceae a Solieriaceae obsahující ve své molekule D-galaktosu, 3,6-anhydro-D-galaktoeu a 20 až 30 % hmot, sulfátových skupin. Gsnu-carrageenan může být použit k imobilizaci přímo po izolaci z mořských řas, na rozdíl od kappa-carrageenanu běžně izolovaného z řas Chondrus crispus; který musí být oddělen ze eměei od lambda-carrageenanu,' nebo? tento nevytváří za přítomnosti draselných lontů rigidní gely. Z tohoto důvodu je genu-carrageenan ve srovnání s kappa-carrageenanem technicky i ekonomicky daleko snáze ziskatelný.

Vytvořený imobilizovaný biokatalyzátor má velmi dobré hydrodynamické vlastnosti a dostatečnou rigiditu částic s malým rozpětím distribuce jejich velikosti. Jeho hlavní předností je va srovnáni s dříve používanými imobilízaČními postupy velmi dobrá stabilita umožňující dlouhodobé použití, zvláště pokud jsou imobilizovány buňky Brevibacterium stationis nebo Arthrobacter globiformis; které vykazuji po imobilizaci dlouhodobou nikoI

CS 272 185 Bl tinamidadenindinukleotid-kinasovou aktivitu, i za přítomnosti azidu sodného, tj. substance potlačující rozvoj bakteriální kontaminace.

Vynález je dále blíže objesněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.

Příklad 1

K 1 hmot, dílu nakultivovaných, vodou promytých a odstředěných buněk Bravibacterium ammoniagenes CCM 317 se přidají 4 obj. díly 4% (hmot.) sólu genu-carrageenanu 37 °C teplého. Směs se po důkladném promíchání nakape do vychlazeného 0,3 M roztoku chloridu draselného přes vrstvu parafínového oleje. Buňky imobilizované ve vytvořených kuličkách gelu se po 16 h stáni v 0,3 M KC1 podrobí permeabilizaci vychlazeným acetonem po dobu 15 minut. Po odstranění acetonu se připravený imobilizovaný biokatalyzátor přidá do reakční směsi obsahující 5 mM nikotinamidadenindinukleotid, 20 mM MgClg a 1% (hmot.) metafosfát draselný v tris-HCl pufru o pH 6/8. Směs se inkubuje za míchání 4 h při 37 °C. Po odfiltrování biokatalyzátoru se z filtrátu izoluje některým ze známých postupů nikotinamidadenindinukleotidfosfát, Konverze činí 38 %.

Příklad 2 '

Buňky Brevibacterium stationis OBM 1073 se po kultivaci při 30 °C v prostředí o pH 7,5 obsahujícím v 1 litru: 20 g D-glukosy, 1 g /NH^/gSO^,’ 0,1 g MgClg.7 HgO, 8,7 g KgHPO^ a 10 g kvasničného autolyzátu odstředí a potom promyjí vodou. K 1 hmot, dílu Vlhkých buněk se přidají čtyři obj. díly 3% (hmot.) sólu genu-carrageenanu 37 °C teplého. Směs se po důkladném promíchání nakape přes vrstvu parafínového oleje do vychlazeného roztoku 0,3 M KC1, Po 12 h stání v tomto roztoku se k sférickým částicím biokatalyzátoru přidá v poměru 1 : 1 (obj.) vychlazený roztok obsahující 0,5 M fosfátový pufr pH 7,0, 0,3 M KC1 a 0,085 M 1,6-diaminohexan. Po 5 minutách stání ee biokatalyzátor odsaje a potom se převrství roztokem obsahujícím 0,5 M fosfátový pufr pH 7,0/ 0,3 M KC1 a 0,085 M glutaraldehyd. Po 30 minutách míchání při 5 °C se biokatalyzátor promyje 0,3 M roztokem KC1 a potom se imobilizované buňky permeabilizují acetonem. Po odstraněni acetonu se 2,5 hmot, dílu imobilizovaného biokatalyzátoru přidá k reakční směsi obsahující 3 obj. díly 0,1 M tris-maleinanového pufru pH 7,0, 0,2 obj. dílu 1,2 M MgClg, 0,8 obj. dílu 0,75 M NaF, 1,2 obj. dílu metafosfátu obsahujícího 6,25 g metafosfátu ve 20 ml roztoku, 0,2 obj. dílu 30% roztoku D-glukosy, 0,6 obj. dílu 250 mM NAD⁺ a 0/03 obj. dílu 100 mM NaNg. Po 4 h míchání při 37 °C ee biokatalyzátor odsaje a opětně použije k dalěi biotranaformaci. Konverze transformací nikotinamidadenindinukleotid v nikotinamidadenindinukleotidfosfát se pohybuje kolem 40 %,

Přiklad 3

Imobilizovaný biokatalyzátor připravený z nakultivovaných buněk Arthrobacter globiformis postupem popsaným v příkladu 2 se vloží do kolony, kterou se nechá poté protékat reakční eněa shodného složení jako v příkladu 2. Rychlost průtoku se volí tak, aby se celkový objem reakční směsi v koloně vyměnil za 3 až 4 h, Z eluátu se izoluje nikotinamidadenindinukleotidfostát s výtěžkem biotransformace kolem 40 %.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Imobilizovaný biokatalyzátor pro transformaci nikotinamidadenindinukleotidu v nikotinamidadenindinukleotidfosfát, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 30 % hmot, vlhkých permeabilizovaných mikrobiálních buněk s metafosfátdependentní nikotinamidadenindinukleotid-kinasovou aktivitou, s výhodou Arthrobacter globiformia nebo Brevibacterium ammoniagenes nebo Brevibacterium stationis, v 1,5 až 4 % hmot, gelu genu-carrageenanu.

   CS 272 185 Bl 4
2. 2. Způsob přípravy imobilizovaného biokatalyzátoru podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vlhké, promyté; odstředěné bakteriální buňky imobilizujcí do gelu genu-carrageenanu; načež se na vzniklé částice gelu působí organickým rozpouštědlem; například acetonem nebo povrchově aktivními látkami; například dodecylsulfátem, načež se případně stabilizuje.
3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se na vytvořené částice biokatalyzátoru působí diaminem s výhodou 1,6-di-aminohexanem a následně glutaraldehydem.
4. 4. Způsob stabilizace imobilizovaného biokatalyzátoru podle bodu 2, vyznačující se tím, že se imobilizovaný biokatalyzátar saturuje roztokem inhibitoru rozvoje mikrobiální kontaminace; například fluoridem sodným a/nebo azidem sodným.