CS271584B1 - Method of solid phase peptide preparation - Google Patents
Method of solid phase peptide preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CS271584B1 CS271584B1 CS881387A CS138788A CS271584B1 CS 271584 B1 CS271584 B1 CS 271584B1 CS 881387 A CS881387 A CS 881387A CS 138788 A CS138788 A CS 138788A CS 271584 B1 CS271584 B1 CS 271584B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- gln
- dcm
- yield
- pro
- solid phase
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 abstract description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 14
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 p-methylbenzhydryl Chemical group 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002696 acid base indicator Substances 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- ZIOCIQJXEKFHJO-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C ZIOCIQJXEKFHJO-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N (2s,3s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SCCCIUGOOQLDGW-UHFFFAOYSA-N 1,1-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1N(C(=O)N)C1CCCCC1 SCCCIUGOOQLDGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]acetic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCC(O)=O VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- KJOZJSGOIJQCGA-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound ClCCl.OC(=O)C(F)(F)F KJOZJSGOIJQCGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N meoh methanol Chemical compound OC.OC COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-MQYCRUOZSA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-MQYCRUOZSA-N 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(57) Řešení ee týká způsobu přípravy peptidů na pevné fázi. Podstata spočívá v tom, že se zakotvení karboxyterminální aminokyseliny a postupná výstavba peptidového řetězce včetně promývacích kroků provádí v ultrazvukovém poli· Reaktor 8 polystyrénovým nosičem se umístí do ultrazvukové lázně. Za občasného mechanického promíchání se působí na směs polymerního nosiče a reaktantů,'příp. promývacích roztoků ultrazvukem. Působením ultrazvuku se reakce výrazně urychlí.
271 584 (11) .
(13) Bl (51) lni. Cl.5
C 07 К 1/04
CS 271584 Bl
Vynález ee týká způsobu přípravy peptidů na pevné fázi v ultrazvukovém poli.
Příprava peptidů na pevné fázi je charakterizována jako sled opakujících se reakcí a promývacích operací, které probíhají na polymerním nosiči. Vyznačuje ee tím, že není možné čistit reakční meziprodukty. Proto jeou kladeny vyeoké požadavky na průběh jednotlivých reakcí, mimo jiné i na jejich úplnou konverzi. Stupeň konverze je možné ovlivnit: dobou reakce, změnou reakčního proetředí (např. z DCM do DMF), vhodným katalyzátorem (např. DMAP), opakováním reakce e novou navážkou činidel, příp. změnou činidel. Často se Btává, ře reakce probíhá velmi pomalu, potom jeou uvedené způsoby zdlouhavé, dochází ke zvýěené spotřebě činidel, příp. к nežádoucím reakcím (např. racemizace při dlouhodobé katalýze DMAP).
Uvedené nevýhody přípravy peptidů na pevné fázi odstraňuje způsob přípravy podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, Že ee jednotlivé reakční kroky postupné výstavby peptidového řetězce provádějí v ultrazvukovém poli.
Použití ultrazvukového pole při přípravě peptidů na pevné fázi podle vynálezu ee provádí tak, že ee do reaktoru umístí polymerní noeič polystyrénového typu síťovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, funkcionalizovaný vhodnými funkčními skupinami, s výhodou p-methylbenzhydrylovými. К polymernímu nosiči se přidá reakční kompo· nenta a reaktor se umístí do ultrazvukové lázně. N-alfa-aminoskupiny byly chráněny acidolabllní chránící skupinou, β výhodou Boc skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo prováděno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo HC1 v DCM, čs. autorské osvědčení č. 255500. Postranní funkční skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, 8 výhodou HOBt estery. Ukončení reakce bylo monitorováno barvenou změnou acidobazického indikátoru, s výhodou bromfenolovou modří, čs. autorského osvědčení Č. 268230. Všechny kroky postupné výstavby peptidového řetězce byly provedeny v ultrazvukovém poli. Po ukončené syntéze byl peptid z pryekyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, в výhodou působením kapalného HF. Surový produkt byl čištěn, buň pomocí sloupcové chromátografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptidy byly charakterizovány aminokyselinovou analýzou a jejich čistota byla ověřena ohromatografickými a elektroforetlckými metodami.
Způsob přípravy peptidů na pevné fázi v ultrazvukovém poli podle vynálezu urychluje reakce a promývací operace probíhající na polymerním nosiči, umožňuje dosažení úplné konverze v krátké době, zjednodušuje přípravu peptidů a přináší úspory materiálu (snížení spotřeby činidel, rozpouštědel a katalyzátoru).
Následující příklady způsobu přípravy peptidů na pevné fázi v ultrazvukovém poli podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.
Příklad 1
Do průtokového reaktoru (vnitřní objem 10 ml) bylo umístěno 400 mg p-methylbenzhydrylaminové kopoly(styren-1% divinylbenzen)ové pryskyřice (obsah aminoskupin 0,4 meq/g). Syntéza byla provedena na manuálně ovládaném syntetizátoru vlastní konstrukce (viz čs. autorské osvědčení č. 262081) kontinuální průtokovou metodou podle čs. autorského osvědčení č. 255089. Průtočný reaktor byl umístěn do kádinky naplněné DMF, tak aby byl celý obsah reaktoru ponořen v kapalině. Podobně byla umístěna kádinka β reaktorem do ultrazvukové lázně naplněné vodou, α-aminoskupiny byly chráněny Boc skupinou, postranní řetězce vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Arg p-toluensulfonovou skupinou. Chráněné aminokyseliny byly aktivovány pro kondenzaci formou HOBt esterů. Jeden syntetický cyklus obsahoval tyto kroky:
CS 271584 Bl (1) štěpení Boc chránících skupin, 40% TFA v DCM, 30 min (3 min promývat, 27 min v klidu):
(2) promývání, DCM, do slabě kyselého efluentu (kontrolováno navlhčeným pH papírkem);
(3) neutralizace, 5% DIEA v chloroformu, 3 min;
(4) promývání, DMF, do neutrálního efluentu;
(5) kondenzace: chráněná aminokyselina, 0,8 meq v DCM (nebo DCM : DMF, 4 : 1, je-li třeba), přidat HOBt, 0,8 meq v DMF, přidat DCC, 0,8 meq v DCM, 30 min při 20 °C, odfiltrovat Ν,Ν-dicyklohexylmoČovinu, promýt DCM, odpařit DCM za sníženého tlaku (t < 25 °C), naředit DMF, zfiltrovat, promýt DMF, doplnit DMF na koncentraci 0,2 M, přidat několik kapek 0,001 M roztoku bromfenolové modře v DMF (70 mg/100 ml), nestříknout do průtokového reaktoru, ponechat reagovat do přechodu acidobazického indikátoru z modré do žluté barvy;
(6) promývání, DMF, 5 min.
Průtok během promývacích cyklů byl cca 20 až 30 ml/min, přetlak inertního plynu 20 až 50 kPa. Syntéza byla ukončena odštěpením Boc skupiny z poslední kondenzované aminokyseliny /krok (1)/· peptidyl-pryskyřice byla promyta DCM, methanolem a byla vysušena proudem dusíku. Výtěžek 920 mg, Surový peptid byl získán po štěpení peptidyl-pryskyřice kapalným fluorovodíkem. Po odstranění HF byly produkt a pryskyřice suspendovány v etylacetátu, zfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové a lyofilizován. Výtěžek 330 mg. Surový peptid byl Čištěn na koloně (2,6 x 100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyamidový gel (Biogel P4), mobilní fáze 20% kyseliny octové ve vodě. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 50 % MeOH, 50 % vody obsahující 0,1 % TFA)ý chromátografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : vody - 4 : 1 : 1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.
Výtěžek 94 mg Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Aep-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-A8n-Gly-Ssr-Leu-NH2
Příklad 2
Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ib. К chránění postranní skupiny cysteinu byla použita p-methylbenzylová skupina, výtěžek peptidyl-pryskyřice byl 820 mg, výtěžek surového produktu 262 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou e teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 40 % MeOH, 60% vody obsahující 0,1 % TFA), chromátografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda -4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.
Výtěžek 132,5 mg H-Cys-Val-Pro-Thr-Aep-Pro-Asn-Pro-Gln-Glu-Val-Val-HH2
Příklad 3 ’
Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ic. К chránění postranní skupiny cysteinu byla použita p-methylbenzylová skupina. Výtěžek peptidyl- pryskyřice byl 1 005 mg, výtěžek surového produktu 34-6 mg. Výsledný produkt mel aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 6,0 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 55 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda -4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.
Výtěžek 201 mg H-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lye-Ser-Ile-Arg-Ile
Příklad 4
Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Id· К chránění postranní funkce tryptofanu byla použita formylová skupina· Výtěžek peptiáyl-pryskyřice byl 945 mg, výtěžek surového produktu 401 mg· Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou β teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 7,5 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 55 % vody obsahující 0,1 % TPA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda · 4 : 1 : 1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5·
Výtěžek 199 mg H-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr-NH2
Příklad 5
Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ιβ· К chránění postranní funkce tryptofanu byla použita fornjylová skupina· Výtěžek peptidyl-pryskyřice 840 mg, výtěžek surového produktu 368 mg· Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 7,5 min, mobilní fáze 55 % MeOH, 45 % vody obsahující 0,1 % TPA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda -4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5*
Výtěžek 186 mg H-Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser-Asn-Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile-NH2
Příklad 6
Chlormethylovaná kopoly(atyren-l%divinylbenzen)ová pryskyřice (2,0 g, obsah aktivního chloru 0,8 meq/g) byla esterifikována KP metodou Boc glycinem (obsah Gly 0,76 meq/ /g) a byla umístěna do reakční nádoby automatického syntetizátoru vlastní konstrukce· Jeden syntetický cyklus obsahoval tyto kroky:
(1) Štěpení Boc chránících skupin, 40 % TPA v DCM, 1x5 min, 1 x 30 min?
(2) promývání, DCM, 3x2 min:
(3) neutralizace, 5% DIEA v chloroformu, 2x3 min:
(4) promývání, DCM, 3x2 min:
(5) kondenzace: chráněná aminokyselina, 5 mmoluv DCM (nebo DCM : DMP, 4 : 1, je-li třeba), přidat HOBt· 5 mmoluv DMP, přidat DCC, 5 mmoluv DCM, 30 min při 20 °C, odfiltrovat N,N-dicyklohexylmočovinu, promýt DCM, odpařit DCM za sníženého tlaku .
(t < 25 °C), naředit DMP, zfiltrovat, promýt DMP, doplnit DMP na koncentraci 0,2 M, přidat několik kapek 0,001 M roztoku bromfenolové modře v DMP (70 mg/100 ml), ponechat reagovat do přechodu acidobazického indikátoru z modré do žluté barvy:
(6) promývání, DMP, 2x2 min:
(7) promývání, DCM, 3x2 min:
V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující aminokyseliny: Вос-Leu, BocPro, Boc-Cys(Bzl), Boc-Asn, Boc-Gln, Boc-Ile, Boc-Tyr a Boc-Cys(Bzl)· Syntéza byla ukončena odštěpením Boc skupiny z poslední kondenzované aminokyseliny (krok 1) a peptidyl- pryskyřice byla promyta DCM, methanolem a vysušena proudem suchého dusíku· Výtěžek byl 3,8 g· Surový peptid byl získán po amonolýze peptidyl-pryskyřice, chránicí ekupiny byly odstraněny sodíkem v kapalném amoniaku· Po odstranění kapalného amoniaku byl produkt
CS 271584 Bl oxidován 0,01 M roztokem ferrikyanidu draselného při pH 6,8 (30 min). Okyselený roztok (pH 3 až 4) byl odsolen na sloupci IRA 400 v H+ cyklu. Výtěžek 1,18 g. Odsolený surový peptid byl čištěn na koloně (2,6 x 100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyamidový gel (Biogel P4), mobilní fáze 20% kyselina octová ve vodě. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami. Čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 50 % MeOH, 50 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda - 4 : 1 : 1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.
Výtěžek 940 mg
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2
Příklad 7
Do dvou průtočných reaktorů (vnitřní objem 10 ml) bylo umístěno po 400 mg p-methylbenzhydrylaminové kopoly(styren-l%divinylbenzen)ové pryskyřice (obsah volných aminoskupin 0,4 meq/g). Reaktory byly spojeny a podle postupu uvedeném v příkladu 1 byly připraveny dva peptidy shodné sekvence, s tím rozdílem, že jen v prvním reaktoru byly reakce urychlovány ultrazvukem. Z obou reaktorů bylo odebráno cca 1/8 peptidyl-pryskyřice a ke zbytku byla přikondenzována další aminokyselina Boc-Nle· Po odštěpení Boc skupin byly surové peptidy získány fluorovodíkovým štěpením. Bylo získáno 22,6 mg Leu-Gln-Pro-Gln-Asn-Pro-Ser-Gln-Gln-Gln-Pro-Gln-NH2 z reaktoru 1 a 22,4 mg Leu-Gln-Pro-Gln-Asn-Pro-Ser-Gln-Gln-Gln-Pro-Gln-NH2 z reaktoru 2; 175,2 mg Nle-Leu-Gln-Pro-Gln-Asn-Pro-Ser-Gln-Gln-Gln-Pro-Gln-NH2 z reaktoru 1 a 180,5 mg Nle-Leu-Gln-Pro-Gln-Asn-Pro-Ser-Gln-Gln-Gln-Pro-Gln-NH2 z reaktoru 2.
Produkty měly aminokyselinové analýzy shodné s teoretickými hodnotami. Čistota byla zjištěna pomocí HPLC. Pro stanovení byly použity následující podmínky:
kolona 250 x 4 mm naplněná reverzní fází C18, průtok 0,8 ml/min, rozpouštědlo A 90% acetonitrilu ve vodě s přídavkem 0,1 % TFA, rozpouštědlo В 5% acetonitrilu ve vodě s přídavkem 0,1 % TFA« gradientovy profil v%AvB: 0-5 min 0,1 %, 5 až 95 min 0,1 až
35,2 %, 95 až 115 min 35,2 až 58,8 %, 115 až 116 min. 58,8 až 99,9 %, 116 až 122 min 99 »9 %, 122 až 123 min 0,1 %.
Analýzou bylo zjištěno, že srovnávané dvojice peptidů jsou vysoce čisté, totožné látky se shodným elucním profilem. Stejných výsledků bylo docíleno i při chromatografií na tenké vrstvě a elektroforéze. Úspory syntézy provádění v ultrazvuku jsou uvedeny v tabulce:
Tabulka
Vyhodnocení srovnávací syntézy
| Sledovaný údaj | Syntéza s ultrazvukem bez ultrazvuku | Úspora | ||
| Doba kondenzací | 210 min | 520 min | 310 | min |
| Počet opakování kondenzace | lx | 4x | ||
| Spotřeby chemikálií: | ||||
| DCM | 1 300 ml 1 | 600 ml | 300 | ml |
| DMP | 650 ml | 800 ml | 150 | ml |
| Akt. komponenta | 14 mmol | 17 mmol | 3 | mmol |
| Výtěžek 100% látky | 47,9 % | 46,8 % |
CS'271584 B1
Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:
| HPLC | vysokoúčinná kapalinová chromatografie |
| TPA | kyselina trifluoroctová |
| DCM | dichlormetan |
| DMP | N,N-dimethylformamid |
| HOBt | N-hydroxybenzotriazol |
| Boc | t-butyloxykarbonyl |
| DIEA | ethyl-diisopropylamin |
| MeOH | metha nol |
| DCC | N, N '-dicyklohexylkarbodiimid |
| HP | fluorovodík |
| Arg | arginin |
| Asp | kyselina asparágová |
| Cys | cystein |
| Gin | glutamin |
| Gly | glycin |
| Glu | kyselina glutámová |
| Ile | isoleucin |
| Leu | leucin |
| Lys | lysin |
| Met | methionin |
| Pro | prolin |
| Ser | serin |
| Thr | threonin |
| Trp | tryptofan |
| Val | valin |
PŘEDMĚT VYNÁLEZU
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUZpůsob přípravy peptidů na pevné fázi, vyznačující se tím, že se jednotlivé reakční kroky postupné výstavby peptidového řetězce provádějí v ultrazvukovém poli.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS881387A CS271584B1 (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Method of solid phase peptide preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS881387A CS271584B1 (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Method of solid phase peptide preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS138788A1 CS138788A1 (en) | 1990-02-12 |
| CS271584B1 true CS271584B1 (en) | 1990-10-12 |
Family
ID=5348116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS881387A CS271584B1 (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Method of solid phase peptide preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS271584B1 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5670332A (en) * | 1992-04-29 | 1997-09-23 | Degussa Aktiengesellschaft | Enzymatic reactions and apparatus for carrying them out |
-
1988
- 1988-03-03 CS CS881387A patent/CS271584B1/cs unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5670332A (en) * | 1992-04-29 | 1997-09-23 | Degussa Aktiengesellschaft | Enzymatic reactions and apparatus for carrying them out |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS138788A1 (en) | 1990-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Atherton et al. | Peptide synthesis. Part 2. Procedures for solid-phase synthesis using N α-fluorenylmethoxycarbonylamino-acids on polyamide supports. Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65–74 decapeptide | |
| Wachter et al. | Aminopropyl glass and its p-phenylene diisothiocyanate derivative, a new support in solid-phase Edman degradation of peptides and proteins | |
| EP3392266B1 (en) | Linaclotide synthesis method | |
| Kaiser Sr et al. | Chlorotrimethylsilane-phenol as a mild deprotection reagent for the tert-butyl based protecting groups in peptide synthesis | |
| KR970010922B1 (ko) | 티모신 α₁의 고상합성방법 | |
| JP2679786B2 (ja) | 非ペプチド結合を有するペプチド合成方法 | |
| US4107298A (en) | Antigenically active polypeptide and a process for its preparation | |
| Hojo et al. | Development of a Linker with an Enhanced Stability for the Preparation of Peptide Thioesters and Its Application to the Synthesis of a Stable-Isotope-Labelled HU-Type DNA-Binding Protein. | |
| Bodanszky et al. | Synthesis of the vasoactive intestinal peptide (VIP) | |
| EP3398957A1 (en) | Method for synthesizing etelcalcetide | |
| EP0529573B1 (en) | Solid-phase synthesizer | |
| GB2116564A (en) | Calcitonin derivatives | |
| JP2733591B2 (ja) | 固相ペプチド合成法 | |
| Wang et al. | SOLID PHASE SYNTHESIS OF BOVINE PITUITARY GROWTH HORMONE‐(123–131) NONAPEPTIDE | |
| CN106554391B (zh) | 一种海洋生物肽Xen2174的合成方法 | |
| CS271584B1 (en) | Method of solid phase peptide preparation | |
| CN111057129B (zh) | 一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法 | |
| US4327075A (en) | Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation | |
| PHILOSOF‐OPPENHEIMER et al. | The 2, 4‐dinitrophenyl group for protection of hydroxyl function of tyrosine during solid‐phase peptide synthesis | |
| ITMI990777A1 (it) | Polipeptidi ad attivita' antiangiogenica | |
| Ball et al. | N-(2-chlorobenzyloxycarbonyloxy)-succinimide as a terminating agent for solid-phase peptide synthesis: Application to a one-step purification procedure | |
| Dölling et al. | An efficient mild acidolytic deprotection procedure for Boc/Bzl-based solid phase peptide synthesis | |
| STERN et al. | POLYMERIC 2‐MERCAPTOPYRIDINE AND 2‐MERCAPTO‐NITROBENZENE DERIVATIVES: New Reagents for Peptide Synthesis | |
| EP0370165B1 (en) | Novel calcitonin derivative and salt thereof | |
| Maccecchini | Large Scale Peptide Production |