Vynález se týká preparativní izolace /5-^H/uridinu metodou eluční vysokoúčinné kapalinové chromatografie.The present invention relates to the preparative isolation of (5H-H) uridine by elution high performance liquid chromatography.
Dosud známá metoda izolace uvedené sloučeniny z reakční směsi do dehalogenaci 5-joduridinu je metoda preparativní papírové chromatografie /Hais, I. M.; Macek K. a kol.: Papírová chromatografie, NČSAV Praha 1959, str. 532 až 535/. Tento způsob izolace má řadu nedostatků. Především dochází k izolačním ztrátám /až 30 %/, postup je časově náročný a velmi pracný a izolovaná sloučenina není chemicky čistá. Je to způsobeno přítomností výluhů z chromatografického papíru, případně nečistotami z rozpouštědel. Tyto nečistoty vadí při aplikaci preparátů v biochemickém, biologickém a lékařském výzkumu. Další nedostatek papírové chromatografie spadá do oblasti bezpečnosti práce s radioaktivními látkami. Manipulace s radioaktivními sloučeninami při nanášení na chromatografioké papíry, vlastní chromatografie, autoradiochromatografie a eluce zvyšují možnost kontaminace prostředí i osob. Dosud používaný technologický postup izolace /S-^H/uridinu z reakční směsi se provádí metodou papírové chromatografie na'chromatografickém papíru Whatman 3 v soustavě butanol - kyselina octová - voda /4:1: 5/, rozdělovači koeficient Rp uridinu v této soustavě je 0,38. Identifikace radioaktivních sloučenin na chromatogramech se provádí porovnáním s jejich'neaktivními standardy. Pruh, odpovídající radioaktivnímu uridinu, se vystřihne a eluuje redestilovanou vodou. Protože se nedosáhne požadované radiochemické čistoty, je třeba papírovou chromatografii zopakovat v jiné vyvíjecí soustavě (např. butanol - voda), čímž se dále zvyšují ztráty izolovaného preparátu.A hitherto known method for isolating said compound from a reaction mixture for the dehalogenation of 5-iodouridine is the method of preparative paper chromatography [Hais, I. M .; Macek K. et al .: Paper Chromatography, NČSAV Praha 1959, pp. 532-535 /. This method of isolation has a number of drawbacks. In particular, insulation losses occur (up to 30%), the process is time consuming and very laborious, and the isolated compound is not chemically pure. This is due to the presence of extracts from the chromatographic paper or impurities from the solvents. These impurities interfere with the application of preparations in biochemical, biological and medical research. Another shortcoming of paper chromatography falls into the field of safety of work with radioactive substances. Handling of radioactive compounds when applied to chromatographic papers, own chromatography, autoradiochromatography and elution increase the possibility of contamination of the environment and people. The previously used technological procedure of isolation of (S - H) uridine from the reaction mixture is carried out by the method of paper chromatography on Whatman 3 chromatographic paper in the system butanol - acetic acid - water (4: 1: 5), the partition coefficient Rp of uridine in this system is 0.38. Identification of radioactive compounds on chromatograms is performed by comparison with their inactive standards. The band corresponding to radioactive uridine is excised and eluted with redistilled water. As the required radiochemical purity is not achieved, the paper chromatography must be repeated in another developing system (eg butanol - water), which further increases the losses of the isolated preparation.
Výše uvedené nedostatky nemá způsob preparativní izolace /5-^H/ uridinu metodou eluční vysokoúčinné kapalinové chromatografie podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se směs sloučenin, vznikajících při přípravě radioaktivního /5-^H/uridinu, dělí na sloupci hydrofobního sférického sorbentu /podstatou je kyselina tetrahydrokřemičitá, povrch silikagelu je pokryt oktadecylovými skupinami /za použití eluentu vodného roztoku kyseliny mravenčí o koncentraci 0,2 až 0,7 mol/1 a 0,9 až 1,5 % metanolu. S výhodou lze použít tuzemský sorbent Separon SGX C18. Z eluovaného radioaktivního /5-^H/uridinu se odpaří kyselina mravenčí na vakuové odparce a uridin se převede do 2 % etanolu a po dozimetrickém měření aktivity a stanovení radiochemické čistoty se naředí na expediční koncentraci a sterilizovaný se expeduje.The method of preparative isolation of (5H-H) uridine by the elution high performance liquid chromatography method according to the invention does not have the above-mentioned disadvantages, the essence of which consists in separating the mixture of compounds of sorbent (the substance is tetrahydrosilicic acid, the surface of the silica gel is covered with octadecyl groups) using an eluent of an aqueous solution of formic acid with a concentration of 0.2 to 0.7 mol / l and 0.9 to 1.5% of methanol. Preferably, the domestic sorbent Separon SGX C18 can be used. Formic acid was evaporated from the eluted radioactive (5H) uridine on a vacuum evaporator and the uridine was taken up in 2% ethanol and, after dosimetric activity measurement and radiochemical purity determination, diluted to shipping concentration and sterilized shipped.
Výhody nového postupu spočívají v tom,, že výtěžek radioaktivního uridinu dosahuje až 90 % a značně se tedy sníží ztráty, ke kterým dochází při izolaci shora uvedeným způsobem preparativní papírové chromatografie. Zásadní výhodou izolace /5-3H/uridinu eluční vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií je možnost získání produktu o vysoké radiochemické čistotě /97 až 98 %/ a bez přítomnosti chemických nečistot. Další výhodou je zkrácení doby separace, místo 40 pouze 8 hodin. Dělení kapalinovou chromatografií probíhá v kapalném prostředí v uzavřeném poloautomatizovaném systému. Odpadá autoradiografie a sušení chromatografických papírů, kdy snadno může dojít ke kontaminaci. Tím se podstatně zvyšuje bezpečnost práce při příptavě./5-^H/uridinu.The advantages of the new process are that the yield of radioactive uridine is up to 90% and thus the losses which occur during isolation by the above-mentioned preparative paper chromatography method are considerably reduced. The main advantage of isolating (5- 3 H) uridine by elution high performance liquid chromatography is the possibility of obtaining a product of high radiochemical purity (97 to 98%) and without the presence of chemical impurities. Another advantage is the shortening of the separation time, instead of 40 only 8 hours. Separation by liquid chromatography takes place in a liquid medium in a closed semi-automated system. There is no need for autoradiography and drying of chromatographic papers, where contamination can easily occur. This significantly increases the safety of work during the preparation of (5- [1H] -uridine).
Dále j^”úveliěhniříkK3 0 molové aktivitě 0,6 až 1,0 TBq/mmol z reakční směsi po katalytické dehalogenaci 5-joduridinu /Filip J.5 Havlíček J.: Jaderná energie 15, 388 /1969/. /5-^H/uridin je z reakční směsi po neutralizaci na pH = 7 kyselinou chlorovodíkovou a mrazové sublimaci rozpouštědla zbaven tritia v labilních polohách. Přidá se 1 ml destilované vody, reakční směs se rozpustí zahřátím a znovu se podrobí mrazové sublimaci. Postup se opakuje celkem třikrát. /5-^H/uridin zbavený tritia v labilních polohách se vnáší na kolonu z korozivzdorné oceli /250 mm x 8 mm/ naplněnou Separonem SGX C18. Reakční směs o objemu menším, než 5 ml obsahuje 5-joduridin v množství do 5 mg, KCL a KI celkem do 0,5 mg a malé množství rozpadových látek /např. /5-^H/uracil/. Dělení probíhá při laboratorní teplotě, za tlaku 1,0 MPa a průtoku 60 ml/hod 0,5 M kyseliny mravenčí s 1 % metanolu. Eluční čas je 15 minut. /5-^H/uridin se eluuje v objemu cca 12 ml. Na kolonu byla vnesena reakční směs o složení 90,3 % uridinu a 2,4 % uracilu v množství 26 032 MBq. Bylo získáno 22 257 MBq /5-^H/uridinu o čistotě větší než 97 což odpovídá 95 % výtěžku.Further, j ^ "0 úveliěhniříkK3 molar activity of 0.6 to 1.0 TBq / mmol from the reaction mixture to catalytic dehalogenation of 5-iodo uridine / Filip Havlicek J.5 J .: Nuclear energy 15, 388/1969 /. After neutralization to pH = 7 with hydrochloric acid and freeze sublimation of the solvent, (5-H) uridine is freed of tritium in labile positions. 1 ml of distilled water is added, the reaction mixture is dissolved by heating and re-freeze-dried. The procedure is repeated a total of three times. (5- 4 H) tritium-depleted uridine at labile positions is applied to a stainless steel column (250 mm x 8 mm) packed with Separon SGX C18. The reaction mixture with a volume of less than 5 ml contains 5-iodouridine in an amount of up to 5 mg, KCL and KI in total up to 0.5 mg and a small amount of disintegrants / e.g. / 5- ^ H / uracil /. The separation is carried out at room temperature, at a pressure of 1.0 MPa and a flow rate of 60 ml / h of 0.5 M formic acid with 1% methanol. The elution time is 15 minutes. The (5H) -uridine elutes in a volume of about 12 ml. A reaction mixture of 90.3% uridine and 2.4% uracil in an amount of 26,032 MBq was applied to the column. 22,257 MBq (5H) of uridine were obtained with a purity of more than 97, which corresponds to a yield of 95%.