CS254823B1

CS254823B1 - Preparative isolation / methyl-1 H-thymine elution by high performance liquid chromatography

Info

Publication number: CS254823B1
Application number: CS859675A
Authority: CS
Inventors: Jan Koelbl
Original assignee: Jan Koelbl
Priority date: 1985-12-21
Filing date: 1985-12-21
Publication date: 1988-02-15
Also published as: CS967585A1

Abstract

/methyl-^H/ thymin je používán jako stopovací látka v biologickém, biochemickém a lékařském výzkumu, dále^jako výchozí látka pro syntézu složitějších biologicky aktivních látek, ti. /methyl-^H/ thyadinu, resp. 5 -fosfátu /methyl-lH/ thymidinu. Cílem řešení je zajistit vyšší výtěžky /methyl-^H/ thyminu, zlepšit kvalitu výsledného produktu a snížit časovou náročnost Ž eho preparativní izolace, při využití eluní vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Uvedeným postupem bylo dosaženo radioaktivního výtěžku 85 až 90 % /methyl-3H/ thyminu, vztaženo na radioaktivitu výchozí reakční směsi· Radiochemická a chemická čistota je 98 %./methyl-^H/ thymine is used as a tracer in biological, biochemical and medical research, as well as a starting material for the synthesis of more complex biologically active substances, i.e. /methyl-^H/ thyadine or /methyl-lH/ thymidine 5-phosphate. The aim of the solution is to ensure higher yields of /methyl-^H/ thymine, improve the quality of the resulting product and reduce the time required for its preparative isolation, using high-performance liquid chromatography elution. The above procedure achieved a radioactive yield of 85 to 90% of /methyl-3H/ thymine, based on the radioactivity of the initial reaction mixture. The radiochemical and chemical purity is 98%.

Description

Vynález se týká způsobu praparativní izolace /methyl- H/ thyminu metodou eluční vysokoúčinné kapalinové chromatografie.BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a process for the praparative isolation of (methyl-H) thymine by high performance liquid chromatography.

Dosud známá metoda izolace uvedené sloučeniny z reakční směsi po její syntéze je metoda preparativní papírové chromatografie (Hais I.M., Macek K. a kol. : Papírová chromatografie, NĚSAV Praha 1959, str. 532 - 535). Zejména při přípravě /methyl- H/ thyminu o vysoké molové aktivitě má tento způsob izolace řadu nedostatků. Především dochází k izolačním ztrátám (30 % hmotnostních) a izolovaná sloučenina není chemicky čistá. Příprava /methyl-^H/ thyminu a dosud používaná metoda jeho izolace je popsána v AO 192 238. Nízký stupeň chemické čistoty preparátů izolovaných preparativní papírovou chromatografií je zapříčiněn přítomností výluhu z chromatografického papíru, případně nečistoty z rozpouštědel. Při případné aplikaci /methyl-^H/ thyminu, obsahující chemické nečistoty, na př. pro enzymatickou syntézu /methyl- H/ thymidinu,The method known to date for isolating the compound from the reaction mixture after its synthesis is a method of preparative paper chromatography (Hais I.M., Macek K. et al.: Paper Chromatography, SESAV Prague 1959, pp. 532-535). Especially in the preparation of (methyl-H) thymine of high molar activity, this method of isolation has a number of drawbacks. In particular, insulation losses (30% by weight) occur and the isolated compound is not chemically pure. The preparation of (methyl-1H) -thymine and the method used to isolate it hitherto is described in AO 192 238. The low degree of chemical purity of the preparations isolated by preparative paper chromatography is due to the presence of leach from chromatographic paper or impurity from solvents. On the eventual application of (methyl-1H) thymine containing chemical impurities, for example for the enzymatic synthesis of (methyl-1H) thymidine,

3 /methyl- H/ thymidin monofosfátu a /methyl- H/ thymidin trifosfátu nelze vyloučit úplnou ztrátu katalytické účinnosti enzymových preparátů (Výzkumná zpráva ÚVVVR, Ing.3.Filip, Ing.L.Boháček, 1979). Další nedostatek papírové chromatografie spadá do oblasti bezpečnosti práce s radioaktivními látkami. Manipulace s radioaktivními sloučeninami při nanášení na chromatografické papíry vlastní chromatografie, autoradiografie a eluce zvyšují možnost kontaminace prostředí i osob.3 / methyl-H / thymidine monophosphate and / methyl-H / thymidine triphosphate cannot be excluded total loss of catalytic activity of enzyme preparations (Research Report ÚVVVR, Ing.3.Filip, Ing.L.Boháček, 1979). Another shortcoming of paper chromatography falls within the field of safety of work with radioactive substances. Handling of radioactive compounds when applied to chromatographic paper by own chromatography, autoradiography and elution increases the possibility of contamination of the environment and people.

Dosud používaný technologický způsob izolace /methyl-'⁵H/ thyminu z reakční směsi se provede metodou papírové chromatografie na chromatografickém papíru Whatmann-3 v soustavě butanol - propanol - amoniak - voda (7:5:7:2), rozdělovači koeficient Rp thyminu v této soustavě je 0,45. Identifikace radioaktivních sloučenin na chromatogramech se provede jejich porovnáním s neaktivními standardy. Pruh odpovídající radioaktivnímu thyminu se vystřihne a eluuje redestilovanou vodou. Protože se nedosáhne požadované radiochemické čistoty, je třeba papírovou chromatografii zopakovat v jiné vyvíjející soustavě, čímž se dále zvyšují ztráty izolovaného preparátu.Technology hitherto used method of isolation / methyl ^'5 H / thymine from the reaction mixture is conducted by paper chromatography on Whatman chromatography paper 3-butanol in the system - propanol - ammonia - water (7: 5: 7: 2) partition coefficient Rp thymine in this system is 0.45. The identification of radioactive compounds in the chromatograms is carried out by comparing them with inactive standards. The band corresponding to radioactive thymine is excised and eluted with redistilled water. Since the desired radiochemical purity is not achieved, the paper chromatography should be repeated in another developing system, further increasing the losses of the isolated preparation.

Výše uvedené nedostatky nená způsob preparativní izolace /methyl-^H/ thyminu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie, jehož podstata spočívá v tom, že se směs sloučenin, vznikajících při přípravě radioaktivního /methyl-^H/ thyminu dělí na sloupci hydrofobního sférického sorbentů za použití vodného roztoku čistého etanolu o objemové koncentraci jako eluentu.The above-mentioned drawbacks are not a method of preparative isolation of (methyl-1H) thymine by high performance liquid chromatography, which consists in separating a mixture of compounds resulting from the preparation of radioactive (methyl-1H) thymine on a column of hydrophobic spherical sorbents using aqueous a solution of pure ethanol at a concentration by volume as eluent.

- 2 284 «23- 2,284 «23

Povrch silikagelu (kyselina tetrahydrokřemičitá H^SiO^) je pokryt oktadecylovými skupinami a zbytkové silanoly jsou blokovány methylovými skupinami. Eluovaný radioaktivní /methyl-^H/ thymin se po dozimetrii a stanovení radiochemické čistoty naředí na expediční koncentraci a přímo expeduje, respektive se použije pro další chemické syntézy.The surface of silica gel (tetrahydro silicic acid H 2 SiO 2) is covered with octadecyl groups and the residual silanols are blocked with methyl groups. The eluted radioactive (methyl-1H-thymine) is diluted to the shipping concentration after dosimetry and radiochemical purity determination and is directly shipped or used for further chemical syntheses.

Výhody nového postupu spočívají v tom, že výtěžek radioaktivního produktu je v dlouhodobém průměru o 20% vyšší než při izolaci výše uváděným způsobem preparativrií papírové chromatografie.The advantages of the novel process are that the yield of the radioactive product is 20% higher in the long-term average than when isolated by the above-mentioned method by preparative paper chromatography.

Přínosem vynálezu je nalezení takového postupu, který umožňuje získat produkt o vysoké radiochemické čistotě (minimálně 97%) a bez přítomnosti chemických nečistot. K přínosu vynálezu patří i to, že výchozí substráty při přípravě /methyl-^H/ thyminu chemickou syntézou (na př. formyluracil) se získávají zpět bez chemické kontaminace. Dělení kapalinovou chromatografií probíhá v kapalném prostředí v uzavřeném poloautomatizovaném systému. Odpadá autoradiografie a sušení chromatografických papírů, při nichž snadno může dojít ke kontaminaci radioaktivitou, tím se podstatně zvyšuje bezpečnost práce při přípravě /methyl-^H/ thyminu.It is an object of the present invention to provide such a process which makes it possible to obtain a product of high radiochemical purity (at least 97%) and in the absence of chemical impurities. It is also an advantage of the invention that the starting substrates in the preparation of (methyl-1H) thymine by chemical synthesis (e.g. formyluracil) are recovered without chemical contamination. Separation by liquid chromatography takes place in a liquid medium in a closed semi-automated system. There is no need for autoradiography and drying of chromatographic papers, which can easily be contaminated with radioactivity, thus significantly increasing the safety of the preparation of (methyl-1H) thymine.

Kde není v textu uvedena bližší specifikace u výrazu %, jedná se o radiochemickou čistotu. Radiochemická čistota je vyjádřena poměrným vztahem mezi skutečným a teoretickým obsahem stanovované látky.Where no specification is given in the text for%, this is radiochemical purity. Radiochemical purity is expressed by the relative relationship between the actual and theoretical content of the test substance.

Příklad :Example:

Jedná se o izolaci /methyl-^H/ thyminu z reakční směsi po hydrogenaci neaktivního 5 mg formyluracilu v prostředí 0,4 ml 0,1 M HC1, plynným tritiem. Jako katalyzátoru se používá 10% Pd na aktivním uhlí (AO 192 238). Kromě uvedených látek obsahuje reakční směs ještě vzniklý hydroxymethyluracil. Po chemické syntéze se z reakční směsi odstředí katalyzátor s aktivním uhlím. K reak ční směsi se přidá 0,1 M HaOH pro úpravu pH na hodnotu 6-7. Takto upravená reakční směs v objemu 5 ml se vnášecím zařízením vnese na kolonu 15 x 450 mm. Kolona je plněna tuzemským sorbentem SEPAROH SIX-C-18. Po vnesení vzorku se kolona promývá vodným roztokem čistého etanolu v objemové koncentraci 1,5% a průtoku 100 ml/hod. Při takto nastaveném průtoku se po 50 - 52 minutáchIt is the isolation of (methyl-1H) thymine from the reaction mixture after hydrogenation of inactive 5 mg of formyluracil in a medium of 0.4 ml of 0.1 M HCl with tritium gas. 10% Pd on activated carbon (AO 192 238) is used as catalyst. In addition to the above compounds, the reaction mixture also contains the hydroxymethyluracil formed. After chemical synthesis, the activated carbon catalyst is centrifuged from the reaction mixture. 0.1 M HaOH was added to the reaction mixture to adjust the pH to 6-7. The reaction mixture thus treated, in a volume of 5 ml, was loaded onto a 15 x 450 mm column by means of a feed device. The column is packed with domestic sorbent SEPAROH SIX-C-18. After loading the sample, the column is washed with an aqueous solution of pure ethanol at a volume concentration of 1.5% and a flow rate of 100 ml / h. With this set flow, after 50 - 52 minutes

254 823 od začátku promývání začíná eluovat neaktivní formyluracil. Tato látka se eluuje 7 minut v objemu 14 ml. Po 60 minutách od začátku promývání se eluuje neaktivní hydroxymethyluracil, který se uluuje též 7 minut v objemu 14 ml.254 823 from the beginning of the wash begins to elute inactive formyluracil. This material was eluted for 7 minutes in a volume of 14 ml. 60 minutes from the beginning of the wash, the inactive hydroxymethyluracil is eluted, which is also eluted for 7 minutes in a volume of 14 ml.

Po 102 minutách se začíná eluovat /ιηεΐΓψΙ-^Η/ thymin. Jeho doba eluce činí 14 minut. Radioaktivní /methyl-⁵H/ thymin se eluuje v objemu 28 ml. Radiochemická čistota takto získaného /methyl-'⁵H/ thyminu je 98%. Ha kolonu byla nanesena reakční směs o radioaktivitě 15 760 MBq. Z kolony bylo získáno 14 170 MBq /methyl-^H/ thyminu, což představuje výtěžek 89,9%.After 102 minutes, / ιηεΐΓψΙ- ^ Η / thymine begins to elute. Its elution time is 14 minutes. Radioactive / ^methyl-5 H / thymine was eluted in a volume of 28 ml. The radiochemical purity of the thus obtained / methyl ^'5 H / thymine is 98%. A reaction mixture of 15,760 MBq was loaded on the column. 14 170 MBq (methyl-1H) -thymine was obtained from the column, which represents a yield of 89.9%.

TřTr

Claims

Preparative isolation of (methyl-H) -thymine by high performance liquid chromatography elution with ethanol as solvent, characterized in that the mixture of compounds resulting from the preparation of radioactive (methyl-1H) -thymine is separated on a column of porous hydrophobic ion exchanger based on silica gel covered octadecyl groups, the elution being carried out with an aqueous solution of pure ethanol in a concentration by volume