CS270664B1 - Způsob řízení biosyntézy fungicidinu - Google Patents

Abstract

Navrženým postupem řízení biosyntézy se při přípravě inokulačního materiálu Streptomyces noursei odstraní nestandartnost způsobená nepřesným a subjektivním hodnocením růstu kultury. Při zavedení Teologického řízení kultivace očkovacích tanků bude možno srovnáním s modelovým průběhem viskosity přesně naplánovat inokulaci produkčního fermentoru podle aktuální dosahované fyziologické zralosti mycelia. Návazně s využíváním exponenciální růstové fáze dojde ke zkrácení kultivace, snížení rizika kontaminací, urychlení startu produkce a celkovému zvýšení tvorby účinné látky o cca 10 .

Description

Vynález se týká způsobu řízení biosyntézy funglcidinu kultivací Streptomyces noursei s využitím znalostí fyziologická aktivity kultury počínaje způsobem přípravy inokulačního materiálu podle tokových vlastností biosuspenze.

Při biosyntetické přípravě fungicidinu se v průmyslovém měřítku suspendují v očkovacích tancích zdroje asimilovatelného uhlíku, dusíku, fosforu, minerální živné sole ve vodě s odpěňovacími prostředky. Aerobní kultivace Streptomyces noursei probíhá za stálého intensivního míchání a vzdušnění. Při přípravě inokula produkčního mikroorganismu je využíván jednostupňový inokulační postup podle schématu:

DT —— ----------------=> FT očkovací fermentor produkční fermentor

Po inokulaci očkovacího termentoru suspenzi spor produkčního mikroorganismu probíhá při kultivační teplotě 28 °C klíčení spor a fáze zrychleného růstu podle běžných zákonitostí kinetiky růstu mycelárních mikroorganismů. Kultivace v očkovacím fermentoru je ukončena po dosažení tzv. dobrého nárůstu, což je podle výrobního reglementu zpravidla za 45 až 60 h. Je-li nárůst delší než 60 h, svědčí to o nevhodnosti použitých konserv. Během růstu inokulačního materiálu dochází k poklesu hodnoty pH z původních 6,8 až 7,0 na hodnoty 6,0 až 6,2, popřípadě i nižší 5,8 až 6,0. Tento pokles pH, mikroskopický obraz a sterilita jsou podle reglementu kriterií určujícími vhodnost použití očkovacího materiálu k inokulaci produkčního fermentoru. '

Přípravou inokula a podmínkami, za jakých probíhá kultivace produkčních mikroorganismů v produkčních stupních se zabývá řada autorů. Bylo zjištěno, že způsob vedení procesu, počínaje prvními přípravnými pracemi hraje spolu s historií kultury velmi významnou úlohu při standardizaci biosyntézy v produkčním stupni a ovlivňuje také výši dosahované produkce účinné látky. Propracovali jsme například podmínky kultivace Streptomyces erythreus v očkovacím stupni při blosyntéze erythromycinu (J. Páca, P. Ettler, V. Grégr: J.Ferm. Technol., 56, 2, 144, 1978). Japonští autoři používají pro optimalisaci očkovacího stupně model.ového mikroorganismu Saccharomyces cerevisiae (T. Nagamune, I. Endo, I. Inoue: J.of Chem.Eng., 15, 6, 481, 1982). Z těchto literárních citací vyplývá, že kinetika tvorby primárních i sekundárních metabolitů je v inokulačním stupni studována i z chemickoinženýrského hlediska. Práce Lopatněvy a kol. (Antibiotiki, 20, 1, 31, 1975 a Antibiotiki, 18, 7, 608, 1973) popisují biosyntézu fungicidinu jako náročnou z pohledu zajištění odpovídající dodávky kyslíku k rostoucím buňkám. Přesto však tato hlediska bývají ve výrobních aparaturách přehlížena. Potřeba pojímat celý biosyntetický proces jako interakci mezi danou geometrií míchání a vzdušnění a fyziologií produkčního kmene se začíná prosazovat až v poslední době.

Dosavadní způsob řízení biosyntézy fungicidinu kultivací Streptomyces noursei v očkovacích fermentorech lze považovat za zastaralý z několika pohledů. Nestandardnost dodávek surovin, zvláště komplexních zdrojů (sušené kvasnice, kukuřičný výluh ap.) způsobuje, že podmínky pH uváděné ve výrobním reglementu nejsou buď dodržitelné, nebo pokles pH je tak plynulý a nevýrazně rozložen do 20 h intervalu, že umožňuje subjektivní interpretaci pro určení přesného času k inokulaci produkčního stupně. Dále jsme zjistili, že tento údaj není obrazem obsahu biomasy produkčního kmene, natož jeho aktivity. Při hodnocení vitálních nebo fixovaných preparátů produkčního kmene se není možno vystříhat subjektivity z důvodů lidského faktoru. Objektivní hodnocení větvení hyf pomocí automatisovaného systému není k dispozici.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob řízení biosyntézy fungicidinu a přípravy inokulačního materiálu kultury Streptomyces noursei podle Teologických charakteristik s využitím živného média, obsahujícího snadno asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku, anorganické živné sole a odpěňovací prostředky, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se řízení biosyntézy provádí kontrolou Teologických charakteristik fermentační půdy

CS 270064 Ol a přesným definováním tukových podmínek po inokulaci produkčního fermentoru při zdánlivé viskositě půdy nad 6 in l'as za slřekové rychlosti 698 s' . lo odpuvídá zvýSeuí obsahu volného sedimentu nad 35 % obj. v období mezi 32 a 40 h kultivace.

Cílem vynálezu bylo nalezení objektivnějšího způsobu hodnocení optimální doby pro inokulaci produkčního fermentoru. Byl proveden komplexní rozbor inokulačního stupně zmapováním průběhu jeho metabolismu s využitím mikrobiologických, biochemických a fyzikálně-chemických metodik. Dále byla ve 4 h intervalech prováděna inokulace produkční půdy v laboratorním měřítku ze sterilních vzorků biosuspenze odebrané z výrobní aparatury. Tímto způsobem bylo možno stanovit maximální produkci účinné látky v daném časovém úseku a korelovat ji s ostatními parametry.

Ukázalo se, že parametrem, který nejvýstižnějsím způsobem popisuje průběh kultivace produkčního kmene Streptomyces noursei a přitom zahrnuje jak katabolické, tak anabolické metabolické dráhy, úbytek substrátů i přírůstek biomasy, její vitalitu z pohledu rigidity vláken, obsahu vakuolap. je zjištění teologické charakteristiky vzorku biosuspenze. Pokrok biotechniky nám dosud neumožňuje tato měření provádět in situ, přímo ve fermentoru, při zachování skutečných podmínek míchání, zádrže plynu a ostatních parametrů, které ovlivňují tvar buněk, pevnost hyf a jejich fyziologický stav. Proto je nutno pro optimální řízení celého procesu pomocí zjištování tokové charakteristiky odebírat ze vsádky reaktoru representativní vzorky a ihned je bez jakékoliv časové prodlevy analyzovat při kultivační teplotě na rotačním viskosimetru. Podle zjištěné závislosti mezi smykovým napětím a střihovou rychlostí je možno usoudit na jednotlivá stadia růstu kultury. Z Teologického pohledu je při kultivaci inokulačního materiálu chování fermentační půdy určeno především morfologií a koncentrací vláken mycelia. Ostatní složky média jak suspensního, tak nesuspensního charakteru se v tomto případě uplatňují z hlediska fyzikálně-chemických vlastností biosuspenze v zanedbatelné míře. Výchozí fermentační půda je kapalinou s tokovým chováním blížícím se newtonskému typu. Po ukončení období klíčení spor se objevují vlákna mycelia, která se intensivně prodlužují a větví. Reologicky se tento jev projevuje vzrůstem viskosity s postupným přechodem k newtonskému chování. U Streptomyces noursei byla na daném médiu nalezena dobrá korelace mezi vzrůstem viskosity a hladinou volného sedimentu. Zatímco například při biosyntéze penicilinu informuje sediment v převážné míře o koncentraci buněk a viskosita kromě koncentrace buněk i o jejich morfologii, při biosyntéze fungicidinu je zjištování obsahu volného sedimentu bez centrifugace podpůrnou metodikou k Teologickému měření. V průběhu kultivace očkovacího tanku dochází ke změně newtonského chování na binghamské až pseudoplastické. Podle srovnávacích měření je možno stanovit dostatečnou zralost očkovacího materiálu k inokulaci produkčního fermentoru při zdánlivé viskositě mezi 6 a 8 m Pas při smykové rychlosti 0 = 698 3^-^. Zdánlivá viskosita výchozího média měřená za stejných podmínek se pohybuje mezi 2 a 3 m Pas. V případě, že není s okamžitou platností k disposici rotační viskosimetr, byla stanovena pomocná kriteria sledováním průběhu kultivace. Zralost očkovacího materiálu pro inokulaci produkčního stupně je určena těmito hodnotami:

Koncentrace redukujících látek (dle Janíčka) 20 až 30 mg.ml koncentrace amonných iontů (dle Parnas-Wagnera) 0,5 až 0,7 mg.ml'' obsah volného sedimentu minimálně 35 ‘-í na daném médiu. Těchto hodnot je možno dosáhnout za daných vnějších podmínek určených geometrií míchání, velikostí inokulace a složením média za 32 až 40 h.

Řízení kultivace inokulačního materiálu Streptomyces noursei podle Teologické charakteristiky podle vynálezu má ve srovnání s dosavadními způsoby vedení procesu řadu významných výhod. Vylučuje subjektivitu posuzování zralosti očkovacího stupně, standardizuje průběh celého fecmentačního cyklu, využívá optimální fyziologické zralosti mycelia před jeho částečnou autolýzou, zrychluje start tvorby sekundárního metabolitu v produkčním fermentoru, a tím zvyšuje i celkovou produktivitu způsobu přípravy fungicidinu. Zkrácením doby kultivace očkovacího fermentoru se snižuje i riziko jeho zkontaminování. Pokud se jedná o vlastní měřicí teologickou metodu, poskytuje ve velmi krátkém čase, tj. do 5

CS 279664 Bl 3 minut po odebrání vzorku objektivní informaci o koncentraci a morfologii produkčního kmene, což u ostatních metod není možné.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.

Příklad 1

Suroviny pro kultivaci Streptomyces noursei jsou suspendovány ve vodě, po úpravě pH a přídavku odpěňovacích prostředků je provedena sterilizace média. Po zchlazení média na 29 °C je fermentor naočkován suspensí spor a vsádka je míchána a vzdušněna po celou dobu kultivace. Pro určení optimální zralosti inokula není využíván údaj o hodnotě pH, jehož pokles je nevýrazný a plynule rozložen do 20 h intervalu. Je vyloučeno také subjektivní posouzení růstu a nahrazeno exaktním řízením kultivace podle Teologických vlastností vsádky. Po adaptačním období klíčení spor na počátku kultivace, dochází ke zrychlení metabolismu, zvýšení obsahu volného sedimentu na minimálně 35 % obj., poklesu koncentrace redukujících látek na 20 až 30 mg.ml’¹, poklesu koncentrace amonných iontů na 0,5 až 0,7 mg.ml¹· a vzrůstu zdánlivé viskosity na 6 až 8 m Pas při střikové rychlosti 698 s¹. Tento údaj zahrnuje mikrobiologické, biochemické a bioinženýrské vlastnosti vsádky a je užit pro rozhodnutí o optimální době inokulace produkčního fermentoru.

Příklad 2

Suroviny pro kultivaci Streptomyces noursei jsou suspendovány ve vodě, po úpravě pH a přídavku odpěňovacích prostředků je provedena sterilizace média. Po zchlazení média na 29 °C je fermentor naočkován suspensí spor a vsádka je míchána a vzdušněna po celou dobu kultivace. Pro určení optimální zralosti inokula není využíván údaj o hodnotě pH, jehož pokles je nevýrazný a plynule rozložen do 20 h intervalu. Je vyloučeno také subjektivní posouzení růstu a nahrazeno exaktním řízením kultivace podle Teologických vlastností vsádky. Po adaptačním období klíčení spor na počátku kultivace, dochází ke zrychlení metabolismu, zvýšení obsahu volného sedimentu na minimálně 35 % obj., poklesu koncentrace redukujících látek na 20 až 30 mg.ml¹, poklesu koncentrace amonných iontů na 0,5 až 0,7 mg.ml’¹ a vzrůstu zdánlivé viskosity na 6 až 8 m Pas při střikové rychlosti 698 s'¹. Tento údaj zahrnuje mikrobiologické, biochemické a bioinženýrské vlastnosti vsádky a je užit pro rozhodnutí o optimální době inokulace produkčního fermentoru.

Byl vypracován modelový průběh zdárflivé .viskosity, ke kterému jsou porovnávány všechny naměřené výsledky z rotačního viskosimetru z odebraných vzorků biosuspenze. Komparace s nomogramem umožňuje řešiteli provést okamžité rozhodnutí a řídit tak standardním způsobem biosyntézu fungicidinu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob řízení biosyntézy fungicidinu a přípravy inokulačního materiálu kultury Streptomyces noursei podle Teologických charakteristik s využitím živného média obsahujícího snadno asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku, anorganické živné sole a odpěňovací prostředky, vyznačující se tím, že řízení biosyntézy se provádí kontrolou Teologických charakteristik fermentační půdy a přesným definováním tokových podmínek po inokulaci produkčního fermentoru při zdánlivé viskositě půdy nad 6 m Pas za střikové rychlosti 698 s'¹, odpovídající zvýšení obsahu volného sedimentu nad 35 % obj. v období mezi 32. až 40. h kultivace.