CS269834B1 - Fosfolipoproteiny a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Fosfolipoproteiny jsou nové komplexy obsahující kyselé fosfolipidy a peptidy nebo · bílkoviny v hmotnostním poměru 1 až 50 : 99 až 50. Peptidy musejí obsahovat nejméně dva aminokyselinové zbytky, z nichž aspoň jeden je tvořen bazickou aminokyselinou. Získávají se smísením kyselých fosfolipidů s peptidy nebo bílkovinami za intenzivního ml- ■ cháni při 10 až 100 °C. Fosfolipoproteiny najdou uplatnění jako nové biologické fak.- tory v lékařství, kosmetice, v potravinářském průmyslu a v zemědělství.

Description

CS 269834 81

Vynález se týká fosfolipoproteinů, obsahujících kyselé fosfolipidy komplexně vázanéna peptidy nebo proteiny a způsobu jejich výroby.

Fosfolipoproteiny jsou nové biologické faktory, k jejichž přípravě lze použit íosfolipidy získané známými izolačními a syntetickými postupy. Pro průmyslovou přípravu jsouvhodné zejména směsi fosfatidových kyselin a bis/diacylglycerol/fosforečných kyselina jejich lysoderivátů, které se připravují fosforylací směsi parciálních acylglycerolů,například postupem podle čs. autorského osvědčení č. 173 220, čs. autorského osvědčeníč. 203 421, čs. autorského osvědčení č. 256 691 a čs. autorského osvědčení č. 259 440.

Komplexy, které vznikají interakcí bílkovin s fosfolipidy, se vyskytují ve všech ži-vých objektech, kde plní řadu funkcí, z nichž nejdůležitější je funkce strukturní /bio-membrány/ a transportní /přenášeče látek přes membrány nebo lipoproteiny/. V biologic-kých membránách se komplexy tvoří na fázovém rozhraní lipidové dvojvrstvy s integrální-mi a periferními proteiny. Z hlediska struktury vzniklých komplexů s integrálními bílko-vinami jde o útvary, kde vazba obou složek je zprostředkována především hydrofobnímiinterakcemi mezi uhlovodíkovými řetězci acylových skupin fosfolipidů a lipofilními část-mi aminokyselin v polypeptidových molekulách, jako jsou aromatická jádra v tryptofanu,tyrosinu a fenylalaninu a alifatické, popřípadě rozvětvené řetězce leucinu, isoleucinua valinu. Periferní bílkoviny, které jsou lokalizovány na povrchu membrán jsou na nějvázány polárními vazbami a většinou také vodíkovými vazbami. I tyto vazby jsou relativ-ně slabé, protože periferní bílkoviny lze z povrchu snadno uvolnit, například účinkemzředěných roztoků neutrálních solí. Počet molekul fosfolipidů vázaných na molekulu bíl-koviny závisí jak na velikosti molekuly integrálního proteinu, tak i na složení a struk-tuře jeho povrchu, který je ve styku s lipidovou dvojvrstvou. Fosfolipidy vázané na bíl-kovinnou molekulu se neustále vyměňují rychlostí, srovnatelnou s rychlostí laterálnídifúze těchto molekul v prostoru membrány a jejich složení významně ovlivňuje funkcídaného komplexu. Lipoproteiny, které jsou nejvýznaronější transportní formou lipidů krev-ní plazmy jsou, podobně jako biomembrány, tvořeny jádrem /s obsahem triacylglycerolůa esterů cholesterolu/ a dále pláštěm tvořeným fosfolipidovou vrstvou, na které jsou vá-zány speciální proteinové molekuly, tzv. apoproteiny. Také zde se vazba realizuje přede-vším hydrofobními interakcemi mezi hydrofobními řetězci fosfolipidů a hydrofobními po-stranními řetězci apolipoproteinů /o jejichž struktuře se říká, že je amfifilní/. Hydro-filní postranní řetězce apoproteinů vyčnívají do vodné fáze a umožňují transport lipidův krevní plazmě. Vazba všech složek v lipoproteinových částicích je poměrně volná, pro-tože při pohybu lipoproteinů v krevní plazmě se jednotlivé molekuly apoproteinů, alei lipidů, snadno vyměňují za jiné. Existence shora popsaných komplexů fosfolipoproteinův biomembránách i v lipoproteinech byla odvozena především z fyzikálních vlastností na-tivních systémů. Pokud je nám známo, takové komplexy nebyly, vzhledem k jejich malé sta-bilitě, zatím izolovány. Interakce lipidů s peptidy a bílkovinami se významně uplatňujíi při některých jiných fyziologických dějích, například při myelinizaci nervových vlá-ken, kdy se uskutečňuje mimo jiné vazba lysofosfatidylcholinu na basický protein myeli-nu, dále při tvorbě antiatelektaktického lipoproteinů, který vystýlá vnitřní povrchplicních alveolú a při vzniku ionoforů, komplexů lipidů s nižšími peptidy, které umož-ňují transport iontů přes membrány a podobně. V posledních letech je také věnována po-zornost významu interakce lipidů a proteinů v potravinách, kde se vzniku komplexu při-suzuje významná úloha při trávení a při resorpci živin ze zažívacího traktu. V této sou-vislosti byly především studovány interakce neutrálních /amfoterních/ fosfolipidů /fo-sfatidylcholinu, lysofosfatidylcholinu/ s některými potravinářskými bílkovinami a jejichfrakcemi, zejména s mléčnými a sójovými bílkovinami. Také z těchto prací vyplynulo, žepři vzniku komplexů se uplatňují převážně hydrofobní interakce mezi acylovými řetězcifosfolipidů a hydrofobními skupinami bílkoviny a že polární část fosfolipidů zůstává re-lativně volná. Jinými slovy řečeno, izolace těchto komplexů pro praktické využití jakobiologických faktorů v lékařství a ve výživě by byla, vzhledem k jejich malé chemické CS 269834 B1 a fyzikální stabilitě jen obtížně realizovatelná. Dosvědčuje to ostatně i skutečnost, žekomplexy tohoto typu se zatím nikde neobjevily na trhu.

Pro průmyslovou výrobu a pro aplikace jako biologické faktory v lékařství, potravi-nářském průmyslu a ve výživě zvířat jsou podle vynálezu vhodné fosfolipoproteiny chara-kterizované tím, že obsahují kyselé fosfolipidy a peptidy nebo bílkoviny v hmotnostnímpoměru 1 až 50 : 99 až 50. Jako kyselé fosfolipidy lze použít přírodní nebo syntetickéglycerolfosfolipidy nebo sfingofosfolipidy, obsahující aspoň jednu volnou kyselou fosfá-tovou nebo karboxylovou skupinu schopnou interakce s bazickými skupinami peptidů nebobílkovin. Patří sem mimo jiné zejména kyseliny fosfatidová, bis/diacylglycerol/fosforeč-ná, plasmanová, plasmenová a fosíatidylgylcerolíosforečná, dále íosíatidylglycerol, di-fosfatidylglycerol, fosfatidylserin, fosfatidylinositol nebo jejich lysoderiváty, dálekyseliny ceramidfosforečná, ceramidfosfoinositol, ceramidfosfoserin nebo jejich směsis neutrálními fosfolipidy. > Jako peptidy se hodí nízkomolekulové i vysokomolekulové peptidy, obsahující nejméně dva aminokyselinové zbytky /dipeptid/, z nichž aspoň jeden je tvořen bazickou aminoky-selinou, jako arginin, lysin, histidin nebo ornithin. Lze je připravit buď izolacemiz přírodních materiálů, nebo vhodnými metodami chemické syntézy a biosyntézy. Bílkovinná složka ve fosfolipoproteinech může být tvořena jakoukoliv bílkovinourostlinného, mikrobiálního nebo živočišného původu nebo připravená synteticky /čistěchemicky nebo biochemicky/, nativní nebo denaturovanou, která nese ve svých postranníchřetězcích bazické skupiny schopné vázat fosfátové nebo karboxylové anionty. Mohou to býtmimo jiné například proteinové koncentráty ze sóje, řepky, brambor, řas, z listů rostlina stromů, z kvasinek, z mléka, kostí, z kůže, z krve a krevní plazmy, z vaječného bílkua žloutku nebo jejich směsi.

Fosfolipoproteiny podle vynálezu lze připravit intenzivním mícháním obou složekza teplot 10 až 100 °C. Fosfolipidy, které jsou za dané teploty tekuté, lze míchats práškovými peptidy a bílkovinami,.přičemž se reakce urychluje přídavkem malého množ-ství vody. Tuhé fosfolipidy lze předem rozpustit ve vhodných organických rozpouštědlech,například alifatických uhlovodících, v chlorovaných a fluorovaných uhlovodících, v di-ethyletheru a výšemolekulových etherech, v nižších alkoholech aj. Přebytečné rozpouštěd-lo se po reakci odstraní odpařením. Reakci mezi kyselými fosfolipidy a peptidy nebo bíl-kovinami lze uskutečnit i rozptýlením fosfolipidů ve vhodných roztocích bílkovin a odpa-řením vody ve vhodném zařízení za zvýšené teploty, popřípadě i sníženého tlaku.

Fosfolipidy jsou ve fosfolipoproteinech, připravených podle vynálezu, vázány nejenběžnými hydrofobními interakcemi a vodíkovými vazbami, ale prostřednictvím svých fosfá- , tových a volných karboxylových skupin i pevnějšími elektrostatickými vazbami na bazické skupiny lysinu, histidinu, argininu v postranních řetězcích peptidů a proteinů. Vzniktéto vazby, aí již H-vazebného iontového páru bez přenosu protonu nebo iontové vazby, * vyplývá mimo jiné i ze zřetelné změny pH reagujícího systému.

Vazbou fosfolipidů na peptidy nebo bílkoviny se výrazně změní jejich rozpustnostve vodě i v organických rozpouštědlech. Většina fosfolipoproteinů je na rozdíl od vý-chozích fosfolipidů dobře rozpustná nebo dispergovatelná ve vodě a chová se - podle po-měru mezi fosfolipidem a peptidem nebo proteinem - jako typická povrchově aktivní látka,vytvářející s hydrofobními oleji emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji. Přítomnostvýšemolekulové peptidové nebo proteinové složky zaručuje dobrou stabilitu vzniklých emul·zí nebo disperzi. Přiklad 1 85 kg práškového sójového koncentrátu obsahujícího 72 % hmot. proteinů bylo smíchá- no v uzavřeném homogenizátoru, napojeném na chlazený kondenzátor s disperzí 15 kg kyse- lých amonných solí fosfatidových a bis/diacylglycerol/fosforečných kyselin v 100 kg 3 CS 269834 B1 π-hexanu. Kyselé soli byly vyrobeny fosforylací diacylglycerolů ze slunečnicového olejea parciální neutralizací plynným amoniakem a obsahovaly 40 % hmot. fosfatidových kyselin,15 % hmot. bis/diacyíglycerol/fosforečných kyselin, 6 °-í hmot. jejich lysoderivátů, l %mastných kyselin, 2 % hmot. diacylglycerolů a 36 % hmot. triacylglycerolů. Po přidání2 kg vody byla reakční směs 2 hodiny míchána při 40 až 55 °C za sníženého tlaku. Získanýfosfolipoprotein byl upraven na prážek v sítovém mlýnu a byl použit jako nutriční faktorv dietetických přípravcích pro sportovce. Obsahoval komplex fosfolipidů a bílkovin v hmotnostním poměru 25 : 75. Příklad 2 1 kg lyofilizovaného lidského seralbuminu reagovalo s disperzí 10 kg syntetickél-hexadecyl-2-lyso-sn-glycerol-3-fosforečné kyseliny /l-hexadecyl-2-lyso-plasmanové kyse-liny/ v 200 ml diethyletheru a 20 ml vody. Po 30 minutách míchání byl diethylether od-destilován za sníženého tlaku při 30 °C a takto získaný práškový fosfolipoprotein bylsušen v tenké vrstvě ve vakuové sušárně po dobu 2 hodin při 30 °C. Přípravek obsahovalkomplex fosfolipidů a bílkovin v hmotnostním poměru 1 : 99 a byl zkoušen jako modifiká-tor maligních transformací a růstu buněk. Přiklad 3 10 kg ultrafiltrátu sérových mléčných bílkovin s obsahem 65 % hmot. proteinů bylorozptýleno v disperzi 7 kg fosfatidylcholinové frakce sójového lecithinu v 30 litrechn-hexanu a po 20 minutách míchání bylo rozpouštědlo odpařeno při 40 °C za sníženého tla-ku. Bylo získáno 16,5 kg komplexu obsahujícího fosfolipid a bílkovinu v hmotnostním pomě-ru 50 : 50. Přiklad 4 90 kg bílkoviny z brambor /85 % hmot. proteinu/ bylo v temperovaném homogenizátorupři 80 °C smícháno s 10 kg směsi fosfatidových a bis/diacylglycerol/fosforečných kyselin,získaných fosforylací diacylglycerolů z řepkového oleje s nízkým obsahem kyseliny eruko-vé. Fosfolipldová směs obsahovala 60 % hmot. fosfatidové kyseliny, 10 % hmot. kyselinybis/diacylglycerol/fosforečné, 15 % hmot. jejich lysoderivátů, 4 % hmot. mastné kyseli-ny a 11 % hmot. triacylglycerolů. Po 2 hod. míchání, když původně kyselá směs přešlana neutrální, byly získané fosfolipoproteiny prosety v sítovém mlýnu a použity jako nu-triční faktory při výrobě dietetického pečivá a jako emulgátory v emulgovaných tucích.Hmotnostní poměr mezi fosfolipidy a proteiny byl v tomto komplexu 16 : 84. Přiklad 5 V 1 kg tekutých vaječných bílků s obsahem 10,5 % hmot. bílkovin bylo dispergováno10 g sójového lecithinu, získané chromatografií lecithinu na sloupci oxidu hlinitého.Kysele reagující frakce obsahovala 64 % hmot. fosfatidylinositu, 12 % hmot. fosfatidyl-serinu, 10 % hmot. fosfatidylethanolaminu, 5 % hmot. fytoglykolipidů, 4 % hmot. fosfa-tidylcholesterolu, 1 % hmot. lysofosfatidylcholesterolu, 3 % hmot. fosfatidové kyseli-ny a 1 % hmot. mastných kyselin. Po 10 minutách míchání při 25 °C byla získaná emulzepráškována v proudu horkého vzduchu v rozprašovací sušárně. Finální práškové fosfolipo-proteiny byly použity jako nutriční faktor a emulgátor v enterální výživě. Obsahovalyfosfolipidy a bílkoviny v hmotnostním poměru 9 : 91. Přiklad 6

Ke 500 mg vodného roztoku /4%/ nonapeptidu bradykinu bylo při 40 °C přimícháno 100 mg 1% disperze 1.2-diolevl-sn-glycerol-3-fosfátu /fosfatidové kyseliny/, připrave- né reakcí 1,2-sn-dioleylglycerolu oxychloridem fosforečným. Po 5 minutách mícháni se

Claims (3)

1. 4 CS 269834 B1 původně kyselá reakce směsi změnila na neutrální. Získaný roztok fosfolipoproteinů bylpoužit jako biologicky aktivní látka při studiu experimentálních zánětů. Hmotnostní po-měr mezi kyselým fosfolipidem a peptidem byl 5 : 95. Fosfolipoproteiny jsou nové látky, jejichž uplatnění v lékařství, v potravinářskémprůmyslu, v zemědělství, popřípadě i v jiných oborech si vyžádá ještě značnou výzkumnoupráci. Podle zatím získaných výsledků lze počítat s jejich využitím pro přípravu disperznich enterálních dietních směsí pro aplikaci v medicíně, které se zavádějí jako plno-hodnotný doplněk parenterálni výživy. V dermatologii se pravděpodobně uplatni předevšímkomplexy s albuminy a kolageny jako přísady do krémů a lotionů a jako farmaka pro léče-ni ran a popálenin. V humánní výživě je lze aplikovat jako aditiva s vysokou nutričníhodnotou do nových typů dietetik a směsi s roborujícím účinkem, zejména pro sportovce,rekonvalescenty, nemocné se zhoubnými nádory jakož i pro fyziologicky stárnoucí popula-ci. Dále jako netoxické emulgátory a stabilizátory do speciálních potravinářských emul-zí a jako dispergátory tuku v masných výrobcích a podobně. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Fosfolipoproteiny složené z kyselých přírodních nebo syntetických glycerofosfolipidůa bílkovin rostlinného, mikrobiálního nebo živočišného původu, vyznačující se tím,že obsahují· kyselé fosfolipidy a peptidy nebo bílkoviny v hmotnostním poměru 1 až50 : 99 až 50.
2. 2. Fosfolipoproteiny podle bodu 1, vyznačující se tím, že peptidy obsahují alespoňdva aminokyselinové zbytky, z nichž aspoň jeden je tvořen basickou aminokyselinou,jako je arginin, lisin, histidin nebo ornithin.
3. 3. Způsob výroby fosfolipoproteinů podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se při te-plotě 10 až 100 °C smísí za intenzivního míchání kyselé fosfolipidy nebo jejich roz-toky v organických rozpouštědlech nebo jejich disperze ve vodě s práškovými peptidynebo bílkovinami nebo s vodnými roztoky peptidů nebo bílkovin a po ukončení reakcese přebytečná voda odstraní odpařením nebo azeotropickou destilací. 5