CS269252B1

CS269252B1 - A method of isolating and detecting harmful substances and metabolites from biological fluids

Info

Publication number: CS269252B1
Application number: CS883223A
Authority: CS
Inventors: Jiri Mudr Csc Horak; Milan Doc Drsc Jirsa; Marie Prom Chem Csc Tlustakova
Original assignee: Jiri Mudr Csc Horak; Milan Doc Drsc Jirsa; Marie Prom Chem Csc Tlustakova
Priority date: 1988-05-12
Filing date: 1988-05-12
Publication date: 1990-04-11
Also published as: CS322388A1

Abstract

Řešení se týká způsobu izolace a detekce škodlivých látek a metabolitó z biologických tekutin. Podstata řešení spočívá v tom, že se biologická tekutina nechá protéci malou kolonkou o objemu^10 až 100 ml naplněnou sorbentem, přičemž ae škodlivé látky a metabolity z biologických tekutin naadsorbují na sorbentu, poté ee deaorbují například organickým rozpouštědlem a stanovují například chromatogreficky.The solution concerns a method of isolating and detecting harmful substances and metabolites from biological fluids. The essence of the solution lies in allowing the biological fluid to flow through a small column with a volume of 10 to 100 ml filled with a sorbent, whereby the harmful substances and metabolites from the biological fluids are adsorbed on the sorbent, then desorbed, for example, with an organic solvent, and determined, for example, by chromatography.

Description

Vynález se týká způsobu izolace a detekce škodlivých látek a metabolitú z biologických tekutin. .The invention relates to a method for isolating and detecting harmful substances and metabolites from biological fluids.

V lékařství je řada situací, kdy diagnosa a způsob léčení, závisí na rozboru tělních tekutin a stanovení přítomnosti škodlivých látek v nich.In medicine, there are many situations where diagnosis and treatment depend on the analysis of body fluids and the determination of the presence of harmful substances in them.

Standardní způsob kvalitativního i kvantitativního stanovení spočívá v odběru určitého množství tělní tekutiny - krve, plazmy, krevního séra, lymfy, moči a podobně a její následné analýze, které často musí předcházet odstranění bílkovin z tělní tekutiny. Tento způsob stenovení vyhovuje v těch případech, kdy je stanovovaná škodlivá látka přítomna v tělní tekutině v dostatečném množství. V některých případech, zejména v počátečních stadiích choroby, může být ale sledovaná látka přítomna ve velmi nízké koncentraci, pod nebo na hranici citlivosti stanovení. V těchto případech je nutno odebrat větší množství tělní tekutiny a tuto různým způsobem zahušťovat, aby bylo dosaženo detegovetelné koncentrace stanovované látky. U látek, které je nutno před analýzou extrahovat může být pracovní postup velmi zdlouhavý a obtížný. V těchto případech jak extrakce,tak i zahušťování mohou být zdrojem značných nepřesností při stanovení, zejména je-li nutno ještě odstranit z tělní tekutiny bílkoviny.The standard method of qualitative and quantitative determination consists of taking a certain amount of body fluid - blood, plasma, blood serum, lymph, urine, etc. and its subsequent analysis, which often has to be preceded by the removal of proteins from the body fluid. This method of determination is suitable in cases where the harmful substance to be determined is present in the body fluid in sufficient quantities. In some cases, especially in the early stages of the disease, the substance under investigation may be present in a very low concentration, below or at the limit of sensitivity of the determination. In these cases, it is necessary to take a larger amount of body fluid and concentrate it in various ways in order to achieve a detectable concentration of the substance to be determined. For substances that must be extracted before analysis, the work procedure can be very lengthy and difficult. In these cases, both extraction and concentration can be a source of significant inaccuracies in the determination, especially if proteins must also be removed from the body fluid.

Podstata způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se biologická tekutina nechá protéci malou kolonou o objemu 10 až 100 ml naplněnou sorbentem, přičemž se škodlivé látky a metabolity z biologických tekutin naadsorbují na sorbentu,· potom se desorbují na příklad organickým rozpouštědlem a stanovují například chromatograficky. Kolonka zhotovená z polypropylenu, teflonu nebo jiného biokompatibilního materiálu musí mít takový objem, aby poskytovala dosti materiálu k analýze, ale nezatěžovala oběhově pacienta. 0ptimální objem kolonky je 10' až 100 ml.The essence of the method according to the invention consists in allowing the biological fluid to flow through a small column with a volume of 10 to 100 ml filled with a sorbent, whereby harmful substances and metabolites from the biological fluids are adsorbed on the sorbent, then desorbed, for example, with an organic solvent and determined, for example, by chromatography. The column made of polypropylene, Teflon or other biocompatible material must have such a volume that it provides enough material for analysis, but does not burden the patient's circulation. The optimal volume of the column is 10 to 100 ml.

Tvar kolonky může být různý. Jako kompromis mezi hemodynamiekými poměry v kolonce a množství zpracování materiálu byl zvolen válcový tvar těla kolonky. Koncovky pro připojení krevních setů mohou být ploché nebo konické. Prostor koncovky a těla kolonky je oddělen sítky. Uzavření kolonky koncovkami lze volit buď šroubem, nebo svarem. Šroubový uzávěr umožňuje otevření kolonky po použití, vyjmutí sorbentu a rozdělení pro extrakci na jednotlivá stanovení. Kolonka, jejíž koncovky jsou s tělem kolonky pevně spojeny svarem, zaručuje dlouhodobější sterilitu, desorpci je potom nutné provádět vhodně zvolenou směsí rozpouštědel a pro vlastní stanovení rozdělit získaný extrakt.The shape of the column can be different. As a compromise between the hemodynamic conditions in the column and the amount of material processing, the cylindrical shape of the column body was chosen. The ends for connecting blood sets can be flat or conical. The space between the end and the column body is separated by a sieve. The closure of the column with the ends can be selected either by screw or by welding. The screw cap allows the column to be opened after use, the sorbent to be removed and divided for extraction into individual determinations. A column whose ends are firmly connected to the column body by welding guarantees longer-term sterility; desorption must then be carried out with a suitably selected mixture of solvents and the obtained extract divided for the determination itself.

Kolonka je v případě stanovení látek v krvi umístěna v mimotělním krevním oběhu, popřípadě je zařazena za separator plazmy. Při stanovení látek v ostatních tělních tekutinách protéká tekutina kolonkou v otevřeném nebo uzavřeném systému. Výhodou způsobu stanovení podle vynálezu je to, že kolonkou může protéci daleko větší množství tělní teku tiny, než jaké by bylo možné odebrat* bez-nebezpečí pro pacienta. Tím se podstatně zvýší koncentrace stanovované škodlivé látky. Množství tělní tekutiny, která kolonkou proteče je díky známé rychlosti průtoku a známé době perfúze možno snadno stanovit. Množství rozpouštědla použité k desorpci je také známé,, takže lze koncentraci škodlivé látky zjistit s velmi dobrou přesností. Odpadá odstraňování bílkovin jako jedna z možností chyb stanovení i často nutná extrakce a zahušťování, což bývá druhým zdrojem nepřesností. Škodlivé látky se mohou rozpouštědly desorbovat jako směsi nebo postupně různými rozpouště dly. V obou případech ale lze příslušnými specifickými metodami stanovit více sledová ných látek z jedné kolonky.In the case of determining substances in the blood, the column is placed in the extracorporeal blood circulation, or is included after the plasma separator. In the case of determining substances in other body fluids, the fluid flows through the column in an open or closed system. The advantage of the determination method according to the invention is that a much larger amount of body fluid can flow through the column than could be removed without danger to the patient. This significantly increases the concentration of the harmful substance being determined. The amount of body fluid that flows through the column can be easily determined thanks to the known flow rate and the known perfusion time. The amount of solvent used for desorption is also known, so the concentration of the harmful substance can be determined with very good accuracy. Protein removal, as one of the possibilities for determination errors, and the often necessary extraction and concentration, which is a second source of inaccuracies, are eliminated. Harmful substances can be desorbed by solvents as mixtures or gradually with different solvents. In both cases, however, multiple monitored substances can be determined from one column using the appropriate specific methods.

Způsob stanovení škodlivých látek podle vynálezu může sloužit u metabolických a endokrinologických chorob ke stanovení stopových množství látek, například žlučových kyselin,· porfyrintú, hormonů, vitaminů, stopových prvků, cholesterolu, patologických metabolitů a podobně, které by se běžnými metodami stanovení nedaly díky jejich nízké končen traci v biologických tekutinách zjistit. U otrav léky a jinými exogenními látkami by kolonky plněné směsnými sorbenty mohly sloužit k rychlé orientaci o druhu požitých toxinú.The method for determining harmful substances according to the invention can be used in metabolic and endocrinological diseases to determine trace amounts of substances, for example bile acids, porphyrins, hormones, vitamins, trace elements, cholesterol, pathological metabolites and the like, which could not be detected by conventional methods of determination due to their low concentration in biological fluids. In poisoning with drugs and other exogenous substances, columns filled with mixed sorbents could serve for quick orientation on the type of ingested toxins.

CS 269 252 B1EN 269 252 B1

Vynález je popsán v příkladech provedení, aniž se na né omezuje*The invention is described in the examples without being limited thereto*

Příklad 1 ’ g eorbentu atyren-d.ivinylbenzenové pryakyřice Amberlite XAD-2 a povrchem upraveným 1 hmot. % póly 2-hydroxyethyl methakrylátu z kolonky bylo eluováno methanolem. Methanol ický roztok byl odpařen v teflonovém kelímku a hydrolyzován 10% hydroxidem sodným 24 hodin za pokojové teploty. Vzniklé volné žlučové kyseliny byly eaterifikovány diazometanem a analytovány pomocí gelové chromatografie - GLC.Example 1 A column of a sorbent of athyrene-divinylbenzene acrylic resin Amberlite XAD-2 and a surface treated with 1 wt. % poly 2-hydroxyethyl methacrylate was eluted with methanol. The methanolic solution was evaporated in a Teflon crucible and hydrolyzed with 10% sodium hydroxide for 24 hours at room temperature. The resulting free bile acids were esterified with diazomethane and analyzed by gel permeation chromatography - GLC.

Příklad 2 g sorbentu styren-divinylbenzenové pryskyřice Amberlite XAD-2 z kolonky bylo extrahováno roztokem kyaeliny sírové v methanolu -1:9 τ/ν-2 hodiny při pokojové teplotě. Po zředění trojnásobným objemem vody byl extrakt vytřepán do chloroformu. Chloroformový extrakt byl použit k analýze typu přítomných porfyrinů vysokotlakovou kapelinovou chromatografií -HPDC- nebo chromatografií v tenké vrstvě - TLC.Example 2 g of styrene-divinylbenzene resin sorbent Amberlite XAD-2 from the column was extracted with a solution of sulfuric acid in methanol -1:9 τ/ν-2 hours at room temperature. After dilution with three times the volume of water, the extract was shaken into chloroform. The chloroform extract was used to analyze the type of porphyrins present by high-pressure capillary chromatography -HPDC- or thin-layer chromatography -TLC.

Příklad 3 .Example 3.

g vysušeného sorbentu styren-divinylbenzenové pryskyřice Amberlite XAD-2 s· povrchem upraveným 2 hmot. % pely 2-hydroxyethyl methakrylátu z kolonky bylo extrehováné směsí metanol - dietyleter - 1:2 v/v. Steroidní hormony vyextrahované ze sorbentu byly stanoveny plynovou chromatografií.g of dried sorbent of styrene-divinylbenzene resin Amberlite XAD-2 with surface treated with 2 wt. % of 2-hydroxyethyl methacrylate from the column was extracted with a mixture of methanol - diethyl ether - 1:2 v/v. Steroid hormones extracted from the sorbent were determined by gas chromatography.

Claims

A method for isolating and detecting harmful substances and metabolites from biological fluids, characterized in that the biological fluid is allowed to flow through a small column with a volume of 10 to 1CC ml filled with an adsorbent, whereby harmful substances and metabolites from biological fluids are adsorbed on the sorbent, then desorbed, for example, with an organic solvent and determined, for example, by chromatography.