CS269204B1 - Způsob přípravy nerozpustných značených substrátů pro stanovení proteolytické aktivity - Google Patents

Abstract

Příprava nerozpustných značených substrátů pro stanovení proteolytické aktivity podle řeSení se provádí zapolymerováním značených bílkovin do struktury polyakrylamidu.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy nerozpustných značených substrátů pro lytické aktivity.

stanovení proteoPro stanovení aktivity proteolytlckých enzymů je možno použít celou řadu substrátů. Mezi nimi významné místo zaujímají nerozpustné bílkovinné značené substráty. Mezi ne' patří například kožní práéek s navázanou Remazolovou brilantní modří, elastin s navázanou kongo červení, fibrin obarvený indigokarmínem, želatina zesítěná glutaraldehydem v přítomnosti nlgroslnu, želatina značená fluoresceinem a navázaná na Sepharosu 4B, kolagen značený nebo sítované bílkoviny s kovalentně navázaným reaktivním barvivém.

Dosud používané způsoby přípravy nerozpustných značených bílkovinných substrátů pro stanovení proteolytické aktivity spočívají v tom, že ae na přirozenou nerozpustnou bílkovinu (například kolagen, keratin, elastin, fibrin) kovalentné nebo adsorbcí naváže vhodná značka, nebo se běžné rozpustné bílkoviny v roztoku zesítí bifunkčním činidlem, přičemž se vytvoří nerozpustné sítované bílkoviny, na které se v druhém Stupni kovalentné nebo absorbcí naváže vhodná značka. Dalěí možností je, že se v roztoku bílkoviny suspenduje nebo rozpustí vhodná značka a potom se provede zesítění bílkoviny vhodným bifunkčním činidlem; značka je zabudována do struktury nerozpustné bílkoviny. Je také možné značenou rozpustnou bílkovinu navázat na vhodnou matrici. Deriváty kaseinu je možné tepelným zásahem převést na nerozpustnou formu.

Způsob přípravy nerozpustných značených substrátů pro stanovení proteolytické aktivity podle vynálezu spočívá v tom, že se značená bílkovina zabuduje do struktury polyakrylamldu. Vzniklý produkt se převede na jemné částice, která se důkladně promyjí vodou a organickými rozpouštědly a potom se usuSÍ. Působením proteolytlckých enzymů se ze zabudované bílkoviny odStěpují značené peptidy, jejichž množství je úměrné aktivitě proteinasy, a je možné je stanovit například spektrofotometrlcky, fluorimetricky nebo radiometricky, po odfiltrování nebo odstředění nerozloženého nerozpustného substrátu.

Vynález je dokumentován příklady.

Příklad 1

Na kaseln se kovalentně naváže reaktivní barvivo dlchlorotrlazlnového nebo monochlorotrlazinového typu (například Ostažinová červeň S-5B, Ostazinová modř S-2G nebo Ostazinová modř H-5R) podle standardního postupu. 5 g značeného kaseinu se rozpustí v 70 ml 10% Na₂HPO^.12 HjO. Po rozpuštění se přidá 28,8 g akrylamldu a 1,2 g N,N'-methylen-bis-akrylamldu. Po rozpuštění se objem roztoku upraví na 100 ml, roztok se odvzduSní a přidá se 1,5 ml 10% persíranu amonného a 150 ul N,N,N' ,N '-tetramethylenethylendiamlnu (TEMED) . Po promíchání se směs ponechá polymerovat. Po 24 hodinách se vzniklý gel rozkrájí na malé kousky a homogenizuje se v nožovém mixeru. Jemná částice gelu se zabudovanou značenou bílkovinou se na fritě promyjí důkladně vodou a etanolem a usuSÍ se při laboratorní teplotě.

Příklad 2

Do zkumavek se naváží po 70 mg substrátu, připraveného podle bodu 1. Přidají se 3 ml vhodného pufru a substrát se ponechá bobtnat při pracovní teplotě po dobu 20 min. Potom se do zkumavek přidá po 1 ml roztoku obsahujícího proteinasy a směs ae protřepe. Po vhodně dlouhé inkubaci (například 30 min při 37 až 50 °C) se substrát odfiltruje nebo odstředí a filtrát nebo supernatant se proměří při vhodné vlnové délce (520 nm pro Ostazinovou červeň S-5B, 590 nm pro Ostazinovou modř H-5R nebo 620 nm pro Ostazinovou modř S-2G). Trypsin bylo možno úspěšně stanovit v rozsahu koncentrací 0,1 až 10 ug/ ml. '

Claims (1)

1. Způsob přípravy nerozpustných značených substrátů pro stanovení proteolytické aktivity, vyznačující se tím, že se značená bílkovina zapolymeruje do struktury polyakrylamidu.