CS269070B1

CS269070B1 - Způsob přípravy 2-naftylamidú N-aoylaoinokyselin a jejich 4-methoxyderivátů

Info

Publication number: CS269070B1
Application number: CS876663A
Authority: CS
Inventors: Vaclav Rndr Csc Cerovsky
Original assignee: Cerovsky Vaclav
Priority date: 1987-09-14
Filing date: 1987-09-14
Publication date: 1990-04-11
Also published as: CS666387A1

Abstract

je máma řada ohromogexmíoh a fluorogemdch substrátů pro studium proteolytických enzymů & zejména pro stanovování proteasové aktivity v tkáních a tělních tekutinách, oož poskytuje infaneaoe o rozsahu různých onemocnění. Mezi tyto látky patří 2-naftylamidy a 4-eethoxy-2-naftylamidy N—acylaainokyseiin, jejichž nový způsob přípravy spočívá v toa, že se na směs N-aoylami— nokyseliny a 2-naftylaainu nebo na směs N—acylaminokyseliny a 4-eethoxy-2-nafty3 aninu působí papainem ve vodném pufru o píT v rozmezí od 4,1 do 5,5 s výhodou o pH 4,8 po dobu 2 hodin až 48 hodin při teplotě od 25 až 45 C, čímž dochází ke vzniku aoidioké vazby. Výhodou tohoto postupu Je, Že poskytuje chemicky i opticky čisté produkty, Je Jednoduchý, Jednoetupnový, ekonomický a minIma Lizuje množství odpadních ákodlivých látek.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy 2-naftylamldů N-aoylamlnokyaolln a Jejich 4-methoxyderivátů.

2-Naf tylamidy N-aoylaminokyselln a 4-nethoxy-2-naftylamidy N-aoylamlnokyselin jsou prvním synthetiokým stupně· při příprav* 2-naftylajnídů a 4-methoxy-2-naftylamldů aminokyselin a peptidů. Věsohny výio uvedeni látky ae používají Jako ohromogenní nebo fluorogenní substráty pro studium proteolytickýoh enzymů. Největšího uplatnění pak nalézají v hlstochemli pro detekci proteasové aktivity v tkáních nebo v tSíních tekutinách. Z praktického hlediska se Jedná o stanovováni rozsahu různých chorobných procesů, Jako jsou třeba maligní onemocnění. Tyto látky Se synthetisují z odpovídajíc! N—acylaminokyseliny a 2-naftylaminu nebo 4-methoxy-2-naftylamlnu methodou směsných ankydrldů (Green M.M., Tsou K.C., Bressler R. , Seligman A.M. : Arch. Bioohem, Biophya. 57, 458 /1955/, Folk J.E., Burstone M.S.: Proc. Soo. Exp. Biol. Med. 89, 473 /1955/, Plapinger R.E. , Neohlas Μ.M., Seligman M.L., Seligman A.M. : J. Org. Chem. 30, 1781 /1965/) nebo pomocí dioyklohexylkarbodlimidu (Glenner G.G., Cohen L.A. , Folk J.E.: J. Histoohem. Cytochem. 13, 57 /19^5/, Goldstein T.P., Plapinger R.E., Nachlas M.M., Seligman A.M.: J. Med. Pharm. Chem. 5, 852 /1962/, Nesvadba H. : Monatah. Chem. 93, 386 /1962/)·

Je známo, že proteolytloké enzymy, Jejichž funkcí v přírodě Jo štěpení peptidových vazeb, se mohou za určitých podmínek používat k reakci opačné, tj. pro tvorba peptidových vazeb (přehled viz: Brtník F., Jolt K.: Chem. listy 74, 951 /1980/, Fruton J.S.: Adv. Enzymol, 53, 239 /1982/, Jakubko H.-D., Kuhl P., Konneoke A.: Angev. Chem. 24, 85 /1985/). V literatuře je též popsána syntheea anilidů a substituovaných anilidů ’ N-acylaminokyselin pomocí protoolytiokého enzymu papainu (Valdsohmidt-Leitz E., Kuhn K. : Hoppe-Soyler's Z. physiol. Chem. 285, 23 /1950/).

Nyní bylo zjištino, že pomocí papainu Je možno synthetisovat též 2-naftylamidy a 4-eethoxy-2-naftylamidy ví ech kódových N-aoyl-L-aminokyselin s výjimkou prolinu. Tento způsob synthosy poskytuje chemicky 1 opticky čisté produkty, je Jednoduchý Jak z hlediska provedení reakce, tak i z hlediska .zpracování vzniklého produktu. Drahá che- . mlcká kondensačnl činidla Jsou nahrazena mnohem menším množstvím laciného papainu a částečné i organická rozpouštědla vodným pofrem, .čímž Jo tento způsob výhodný Jak z hlediska ekonomického, tak 1 z hlediska ekologického. Syntheaa je jednostupňová, a to i v případech aminokyselin s funkčními skupinami v postranním řetézoi, kdy se eliminuje chráníní těohto skupin nutné při chemické synthese. Syntheaa 2-naftylamldů a 4-methoxy-2-naftylamldů pomocí papainu Je principiální uskutečnitelná i pro případ ' některých nekodovýoh N-aoyl-L-aminokyselln.

Podstatou vynálezu Je, že se na směs N-aoyl-L-aminokyseliny a 2 -rmf tyj part nu nebo na směs N-acylaminokyseliny a 4—methoxy-2-naftylaminu působí papainem ve vodném pufru o pH v rozmezí od4,1 do pH 5,5 s výhodou o pH 4,8 po dobu 2 hodin až 48 hodin při teplotě od 25 až 45 °C, čímž dochází ke vzniku amidioké vazby.

Oba typy sloučenin Jsou schematicky znázorněny vzorci I a II.

( I )

Vzorec I znázorňuje 2—naftylamid N—aoylanxinokyseliny * vzorec XX znázorňuje 4—methoxy— -^“naftylamid N-aoylaminokyseliny, kde Ao je benzyloxykarbonyl, teroiálni butyloxykarbonyl nebo jiná· chrániči skupina, Xaa je L—ominokyeelinai Šipka udává papainem kataly— •ovanou tvorbu amidioká vazby.

Způsob přípravy 2-naf tylamldů a 4—methoxy-2—naf tylamldů N—aoylaminokyselin e využitím papainu se dále objasňuje v příkladech použití.

CS 269 070 Bl

Příklad 1

2-Naf tylamid benzyloxykarbony1slaninu

K roztoku benzyloxykarbonylalaninu (223 “«) a 2-naftylaminu (215 mg) ve smšsi dlmethylformamidu (3 ml) a 0,2 mol.l^-1 aoetátováho pufru pH 4,8 (7 ml) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraootová (3 mg) a hydroohlorid cysteinu (10 mg) a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání papainu (40 mg) byl* smšs inkubována 48 h při 38 °C. Vyloučená sraženina byl* odfiltrována, promyta I mol.l^-1 HC1, vodou, 5% NaHCO^, vodou * poté byla vysušena. Bylo získánd~170 ®β (IřO-Jí) produktu o t.t. 191>až 192 °C. - 33,4° (o 0,3, dlmethylformamid). Pro Ο,^Η^Ν.^ (383,4) vypočteno: 72,39 £ 0, 5,79 H, 8,04 JÍ N; nalezeno! 72,5 JÍ C, 5,79 Jí H, 7,90 JÍ N. Literatura uvádí t.t. 193,5 °C. (Goldstein T.P., Pla pinger R.E., Nachlas H.M., Seligman A.M.: J. Med. Pharm, Chem. jí, 852 (1962)).

Příklad 2

2-Naf tylamid benzylozykarbonylleuoinu

K roztoka benxyloxykarbonylleuoinu (1,33 β) a 2-naftylam!nu (1,1 g) ve smšsi dime thylfornuuaidu (17 ad.) * 0,2 mol.l^-1 aoetátováho pufru pH 4,8 (33 ml) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraootová (15 mg) a hydroohlorid oysteinu (50 mg) a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání papainu (200 mg) byla směs inkubována 24 h při 38 °C. Produkt, ktorý se vyloučil v podobí sraženiny, byl z reakčni směsi extrahován do ethylaoetátu, ethylaoetátový roztok byl promyt 1 mol.l^-1 HC1, vodou, 5% NaHCO^, vodou, vysušen NagSO^ * odpařen. Odparek byl krystalován ze smšsi ethylaoetátu a petrole them, Bylo získáno 1,72 g (88 Jí) produktu o t.t. 1Ó2 až 163 °C. Re kry staly sací z ethylaoetátu se t.t. produktu nezmínila, [d- 54,7° (o 1, chloroform). Pro C24^6^2°3*^O,5 ¾⁰ ^99,5) vypočteno: 72,15 Jí 0, 6,81 JÍ H, 7,01 JÍ Ni nalezeno: 72,52 JÍ C, 6,83 JÍ H, 6,72 Jí N, Literatur* uvádí t.t. 157 ai 158 °C, [o(J_n- 61,6° (o 1,98, chloroform). (Green H.N., Tsou K.C., Bressler R., Seligjaan A.M. 1 Arch. Bioohea, Bíophys, 57. 458 /1955/).

Příklad 3

2-Naf tylamid benzyloxykarbonylf enylalaninu

K roztoko benzyloxykarbonylfenylalaninu (300 mg) a 2-naftylamlnu (215 mg) ve smísí dimethylformamidu (3 al) a 0,2 mol.l^-1 aoetátováho pufru pH 4,8 (7 ml) byla přidána kyse lina ethylendiaminotetraootová (3 mg) a hydroohlorid cysteinu (10 mg) a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání papainu (40 mg) byla smšs inkubována 24 h při 38 °C.

Vyloučená sraženina byla odfiltrována, promyta 1 mol.l^-1 HC1, potí vysušena. Bylo získáno 295 mg (70 Jí) produktu o t.t. 180 vodou, 5jí NaH30_, vodou a ⁺ °’³’ dimethylformamid). Pro Cg^H^NgO^ (424,5) vypočteno:' 76,39 jí C, 5,70 Jí H, 6,60 jí N; nalezeno; 7ó,02 JÍ C, 5,71 JÍ H, 6,56 JÍ N. Literatura uvádí t.t. 175 °C»Z?/j_D - M** (o 1,4, ethylaoetát). (Ooldsteln T.P., Plaplxiger R.E. , Neohlas M.M. , Seligman Λ.Μ. :

J. Hed. Pharm. Chem. jí, 852 /1962/).

Příklad 4

2-Naftylamid tero. butyloxykarbonyltyroslnu K roztoku tero. butyloxykarbonyltyroslnu (282 g) a 2-naftylaminu (215 “β) ve smšsi dime thylf ormamidu (3 ml) * 0,2 mol.l^-1 aoetátováho pufru pH 4,8 (7 ml) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraootová (3 mg) * hydroohlorid oysteinu (lO mg) a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání, papainu (40 mg) a smis byla inkubována 24 h

CS 269 070 B1 při 38 °C. Produkt byl eitraKov4n do othylaootÁtu, ethylaoetátový roztok byl pro myt HSO^ pufrem pH 2, vodou, 5£ roztokem NaHCO^, vodou, vysušen NajSO^ a odpařen. Odparek byl rozetřen petroletherem a produkt byl rekryetálován ze smšsi ethylacetátu a petroletheru. Bylo zinkáno 220 mg (53 jí) produktu o t.t. 1 04 až 105 °^c«£{ťzjp + 62,7° (o 0,3, dimethylf ormamld). Pro ^4^6^2^^K2° (^’5,3) vypočteno: 69,37 C, 6,55 í H, 6,76 jí Nj nalezeno: 69,83 C, 6,35 í H, 6,75 % N. '

Příklad 5

2-Naftylamid benzyloxykarbonyl-S -benzyloystelnu

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzyloysteinu (346 mg) a 2-naftylaminu (215 mg) ve smšei dimethylformsuaidu (3 ml) a 0,2 mol.l^-1 aoetátového pufru pH 4,8 (7 ml) byla přidána kyseilna ethylendiaminotetraootová (3 mg) a hydrochlorid cysteinu (10 mg) a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidáni papalnu (20 mg) byla směs inkubována 24 h při 38 °C.

Vyloučená ‘sr aženlna byla odfiltrována, promyta 1 mol.l^-1 HC1, vodou, 5jí NaHCO-, vodou a . . . Λ vysuSena. Bylo získáno 328 mg (70 Jí) produktu o t.t. 170 až 171 C. duktu ze směsi ethylacetátu a petroletheru se t.t. nezmšnila.J_D

Rekryetalisací pro+ 22° (o 0,3, dlmethylf ormamld). Pro Cjglíjg^OjS, (470,6) vypočteno: 71,46 1° C, nalezeno: 71,06 Jí C, 5,60 H, 6,06 N.

5,57 H, 5,95 $ N;

Příklad 6

2-Naftylamld kyseliny benzyloxykarborrylglutamové

K roztoku kyseliny benzyloxykarbonylglutamová (282 mg) a 2-naftylaminu (215 ®β) ve snšel dime thylf ormamidu (2 ml) a 0,2 mol.l^-1 aoetátového pufru pH 4,8 (8 ml) byla při dána kyselina ethylendiaminotetraootová (3 mg) a hydrochlorid oesteinu (l0 mg) a pH roztoku.bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání papalnu (40 mg) byla amSa inkubována 24 h při 38 °C. Vyloučená sraženina byla odfiltrována, promyta 1 mol.l ¹ UC1, vodou a vysušena. Po rekrystailsaoi ze smčoi ethylacetátu a petroletheru bylo získáno 130 mg (32 jí) produktu o t.t. 217 «ž 218 °C.Ceó J & - 6,8° (o 0,3, dimethylformamld). Pro Cj^H^NjO^ (406,4) vypočteno: 69,97 í C, 5,46 jí H, 6,89 Jí Nj nalezeno,· 67,67 jí C, 5,43 Jí H, 6,77 £ ». literatura uvádí t.t. 22 1 _D - 0,71° (o 1,7, dimethylformamid). (Goldstein T.P., Plapinger R.E. , Naohlas M.M. , Seligman Λ.Μ. : J. Med. Pharm. Chem. 2, ⁸52 /1962/).

Přiklad 7

-Me th oxy —2 -nať tylamid benzyloxykarbonyIf ony lalaninu

K roztoku benzyloxykarbonyl fenylalaninu (30 mg) a 4-methoxy-2-naftyž,aminu (25 mg) ve smáai dimethylfomaaidu (0,3 ml) a 0,2 mol.l”¹ aoetátováho pufru pH 4,8 (0,7 ml) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraootová (0,3 mg) a hydrochlorid cysteinu (1 mg) <

pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání pepainu {4 mg) byla smis inkubová— na 24 h. při 38 °C. Vyloučená sraženina byla odfiltrována, promyta 1 mol.l“¹ HCl, vo dou, 199

C. Rekrystalisaoí produktu ze eméai ethylacetátu a petroletheru se b.t.

198 AŽ nezmínil.+ 45,7° (o 0,3, dimethylformaaid)« Pro ^C2g^^2^4 ^^9^) vypočteno: 73,99 c, 5,77 t H, 6,17 JÍ N₍ nalezeno: 73,54 JÍ C, 5,73 JÍ H, 5,95 % N.

Příklad 8

4-Methoxy-2-naftylamid terč, butyloxykarbonylleuoinu

CS 269 070 B1

K roztoku terč. butyloxykarbonylleuolnu (25 mg) a 4-methoxy-2-nafty] aminu (23 mg) ve směsi dimethylformamidu (0,3 “l) a 0,2 mol.l^-' aoetátového pufru pH 4,8 (0,7 “1) byla přidána kyselina ethylendlaminotetraootová (0,3 mg) a hydroohlorid cysteinu (i mg) a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4,8. Po přidání papalnu (4 mg) byla směs inkubována 24 h při 38 °C. Produkt byl z reakční směsi extrahován do ethylacetátu, ethylaoetátový roztok byl promyt chlazenou 1 mol.l^-' HC1, vodou, 55· NaHCO^, vodou,' vysušen NajSO^ a odpařen. Odparek byl krystalován ze smě a i methanolu a vody. Bylo získáno 28 mg (72 produktu o t.t, 79 až 81 °C, Pro ^c22Hjoⁿ2°4 (386,5) vypočteno: 68,36 £ C, 7,82 £ H, 7,25 £ N| nalezeno: 68,30 % C, 7,80 % H, 7,01 % N.

Claims

Způsob přípravy 2-naftylamidů N—aoyltuainokyaelin a JeJioh 4—metboxyderivátů syn— tórou ze směsi N-aoylaminokyaeliny a 2-naftylaminu nebo ze směsi N-aoyl ami nnkyseliny a 4—<aethoxy-2-naftylaminu, vyznačený tím, že se na uvedenou směs působí popelném ve vodném pufru o pH v rozmezí od 4,1 do 5,5 s výhodou o pH 4,8 po dobu 2 hodin až 48 hodín při teplotě od 25 až 45 °C.