CS267244B1 - Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu z nikotinamidadenindinukleotidu - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenin/iinukleotidfosfátu spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí při pH 5 až 8 v přítomnosti metafosfátu, případně i glukózy, permeabilizovanými buňkami bakterií rodu Brevibacterium nebo Arthrobacter a poté permeabilizovanými buňkami kvasinek nebo kvasinkovitýc^ mikroorganismů oři pH 7,2 až 11. Zvlášt výhodné je použití buněk Brevibacterium stationis DBM 1073, Arthrobacter globiformis DBM 1075 a Rhodotonula glutinis DBM 18, uložených ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemickotechnologicke v Praze pod čísly 1073, 1075 a 18. Výhodné .ie také použití lisovaného pekařského droždí, sušeného aktivního droždí, lisovaného krmného droždí, nebo odpadních pivovarských nebo vinařských kvasnic. Permeabilizované buňky mohou být imobilizovány. Reakce .lze provádět v přítomnosti Mg+^a v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, např. azidu sodného nebo fluoridu sodného.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (MADPH). Nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP ) je koenzymem řady oxidoredukčních enzymů. Jeho redukovaná forma se používá v analytické chemii, v biochemickém výzkumu a při enzymové přípravě některých organických sloučenin.

Až dosud se získával enzymovou redukcí nikotinamidadeninnukleotidfosfátu (NADP ) pomocí izolovaných enzymů nebo pomocí permeabiLizovaných buněk vhodných mikroorganismů. Nevýhodou těchto postupů je vysoká cena výchozího substrátu, tj. nikotinamidadenindinukleotidfosfátu, který se získává enzymovou nebo mikrobiální fosforylácí nikótinamidadenindinukleotidu a musí být z reakční směsi izolován poměrně nákladnými postupy. Schuetz H.J. a spol. (Biotech. Form. J, 97, 1986) použili jako výchozí surovinu nikotinamidadenindinukleotid (NAD) za použití komplikovaného systému izolovaných imobilizovaných enzymů, vyžadujících drahé substráty.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH) podle vynálezu, který spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid (NAD) při pH 5 až 8 působí v přítomnosti metafosfátu hořečnatých iontů, případně glukózy permeabilizovanými buňkami rodů Brevibacterium Breed nebo Arthrobacter Conin et Dimmick, čímž vznikne nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP). Pak se pH reakční směsi upraví na 7,2 až 11,0, případně se přidá glukosa nebo její zdroj a na přítomný nikotinamidadenindinukleotidfosfát se působí permeabilizovanými buňkami pravých kvasinek nebo kvasinkovítých mikroorganismů. Zvláště výhodné je pro

267 244

- 2 fosforylaci nikotinamidadenindinukleotidu použít druh Brevibacterium stationis DBM 1073 nebo Arthrobacter globiformis DBM 1075, uložené ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze pod číslem 1073 a 1075· Pro redukci vzniklého nikotinamidadenindinukleotidfosfátu lze použít například příslušníky rodů Saccharomyces Meyen ex. Reess, Candida Berkhout a Rhodotorula Harrison. S výhodou lze použít lisované pekařské droždí (tj. Saccharomyces cerevisiae), aktivní sušené pekařské droždí, lisované krmné droždí (tj. Candida utilis) a odpadní pivovarské nebo vinařské kvasnice (S. cerevisiae, S. bayanus, S. uvarum). Zvlášt výhodné je použití buněk druhu Rhodotorula glutinis DBM 18, uloženého ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze pod Číslem 18. Permeabilizované buňky bakterií i kvasinek a kvasinkovitých mikroorganismů mohou být také imobilizovány. Celý proces lze provádět v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, napři azidu sodného nebo fluoridu sodného.

Pro fosforylaci nikotinamidadenindinukleotidu pomocí permeabilizovaných buněk rodů Brevibacterium nebo Arthrobacter podle vynálezu se buňky těchto mikroorganismů pomnoží za aerobních podmínek v tekutém médiu, obsahujícím vedle vhodného zdroje uhlíku a energie také zdroj dusíku ve formě amonné soli a kvasničného extraktu (autolyzátu) nebo jiného přirozeného zdroje tohoto prvku, dále hořečnaté a draselné ionty a fosfát. Buňky se oddělí od pomnožovacího media, nejlépe odstředěním a podle potřeby se promyjí vodou. Permeabilizace buněk se dosáhne buč třepáním s vychlazeným acetonem, toluenem nebo jiným rozpouštědlem, nebo působením vhodné povrchově aktivní látky (např. cetyltrimethylamoniumbromidu, dodecylsulfátu apod.) tak, aby aktivita nikotinamidadenindinukleotidzinasy zůstala zachována. Pro imobilizaci buněk se může použít vhodný gel jako je polyakrylamid, genu-carrageenan, epoxidový polymer dianového typu a pod. Permeabilizace buněk může být provedena před jejich imobilizaci nebo až po ní. Redukce vzniklého nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP) se provádí působením per meabilizovaných buněk kvasinek a kvasinkovitýcb mikroorganismů které byly pomnoženy v tekutém médiu obsahujícím vedle vhodného zdroje uhlíku o ener/jie lok/' zdroje dusíku ve formě amonné soli, kvasničného extraktu (autolyzátu), peptonu nebo jiného přirozeného’ zdroje tohoto prvku, dále horečnaté a draselné ionty, fosfát a sulfát. Buňky se oddělí od pomnožovacího me'dia, nejlépe odstředěním, a podle potřeby se promyjí vodou. Permeabilizace a případná iinobilizace se provádí některým z postupů uvedených u buněk rodů Brevibacterim a Arthrobacter.

Reakce podle vynálezu probíhá v reakčním roztoku 2 až 20 mM nikotinamidadenindinukleotidu, 2 až 60. mM Mg a 0,05 až 7 / hmot, metafosfátu, k němuž se přidají permeabilizované buňky, volné nebo imobilizované v množství 5 až 60 mg sušiny/ml, případně ještě glukosa v konečné koncentraci 0,1 až 4 % hmot, fluorid sodný v koncentraci 0,01 až 0,3 M a azid sodný v koncentraci 0,1 až 5mM. Základní látky i aktivátory a inhibitory se rozpustí ve vhodném pufru o pH 5,0 až 8,0, reakční teplota se volí v rozmezí 20 až 55 °C. Po proběhnutí reakce se bakteriální buňky odstraní odstředěním, filtrací nebo dekantací pro jejich opětovné použití nebo se ponechají v reakční směsi, pH reakční směsi se upraví na 7,2 až 11,0 a přidají se permeabilizované kvasinkové buňky, volné nebo imobilizované, a to v množství 2 až 120 mg buněčné sušiny/ml reakční směsi. Případně se přidá ještě glukóza do koncentrace 1 až 6 % hmot. Reakční teplota se volí v rozmezí 10 až 50 °C. Po proběhnutí reakce se reakční kapalina oddělí od buněk například odstředěním, dekantací nebo filtrací a izoluje se^-z ní některým ze známých postupů, například vedením přes vhodný ionex, redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát, který se dále čistí. Nezreagovaný nikotinamidadenindinukleotid se může opět využít k reakci.

Vynález je v dalším blíže objasněn na konkrétních příkladech způsobu přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotid fosfátu za použití bakteriálních a kvasinkových buněk.

- 4 Příklad 1 267 244

Brevibacterium stationis DBM 1073 se aerobně kultivuje při 30 °C v prostředí o pH 7,2 obsahujícím v 1 litru: 20 g glukosy, 1 g (NH₄)₂SO₄, 0,1 g MgS0₄.7H₂0, 8,7 g K₂HP0₄, 10 g kvasničného autolyzátu. Po 18 h kultivace se buňky odstředí při 800 g, promyjí vodou a permeabilizují třepáním se čtyřnásobným objemem vychlazeného acetonu po dobu 15 min. Pak se buňky odstředí, aceton.se slije a jeho residua se odstraní proudem vzduchu. Rhodotorula glutinis DBM 18 se aerobně kultivuje při 28 až 30 °C v prostředí o pH 5,8 obsahujícím v 1 litru: 10,0 g glukosy, 5,0 g sušeného kvasničného autolyzátu a 5,0 g enzymového hydrolyzátu kaseinu. Po 20 h kultivace se buňky odstředí, promyjí v.odou a permeabilizují třepáním se čtyřnásobným objemem vychlazeného acetonu po dobu 15 min. Pak se aceton slije a jeho residua se odstraní proudem vzduchu. K reakční směsi lOmM nikotinamidadenindinukleotidu, 20 mM MgCl₂, 6,2 % hmot, metafosfátu a 1 % hmot, glukosy a 1 mM NaN^ v tris-HCl pufru o pH 7,2 se přidají permeabilizované buňky Brevibacterium stati onis DBM 1073 v množství 30 mg buněčné sušiny/ml a směs se inkubuje za třepání 2 h při 37 °C. Během této doby dojde k fosforylaci cca 65 % nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) v nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP). Pák se pH reakční směsi upraví pomocí 2M NaOH na 10,0, přidá se glukóza do koncentrace 4 % hmot, a permeabilizované buňky Rhototorula glutinis DBM 18 v množství 30 mg sušiny/ml reakční směsi a inkubuje se za mírného třepání 1,0 h při 30 °C. Během této doby dojde k přeměně cca 60 % přítomného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP) v jeho redukovanou formu (NADPHJ. Koncentrace vzniklého redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu (NADH) je pouze 0,1 až 0,5 mM. Mikrobiální buňky se od reakční směsi oddělí centrifugací a'mohou se použít pro další podíl reakční směsi. Ze supernatantu se některým ze známých postupů izoluje redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát. Z odpadních buněk Rhodotorula glutinis se může extrakcí získat provitamin A pro veterinární účely.

- 5 Příklad 2 267 244

Buňky Arthrobacter globiformis DBM 1075 se aerobně kultivují v půdě uvedené v příkladu 1, odstředí a promyjí vodou. 6,6 g vlhkých buněk se doplní vodou na 10 ml, přidá se 2,22 g akrylamidu a 0,20 g Ν,Ν-methylen-bis-akrylamidu a po důkladném rozmíchání ae vychladí na 10 °C. Pak se přidá 0,5 ml 5 % hmot, roztoku persíranu draaelného a nechá se polymerovat 1 h při 10 °C. Vzniklý heterogenní biokatalyzátor se rozřeže na krychličky o hraně cca 1 mm nebo rozmixuje v mixeru a pak se třepe 30 min s dvojnásobným objemem vychlazeného acetonu. Po slití acetonu ae biokatalyzátor promyje vodou a naplní do reaktoru. Po přídavku dvojnásobného objemu reakční směsi shodného složení jako v příkladu 1 se reakční směs míchá 2 h při 37 °C· Po oddělení heterogenního biokatalyzátoru se pH reakční směsi upraví 1M NaOH na 9,5 a přidá se heterogenní biokatalyzátor připravený z lisovaného pekařského droždí imobilizací do epoxidového polymeru dianového typu podle postupu Veruoviče B. a sp. (A0c217 857), a to tak, aby buněčná sušina činila 25 % suchého biokatalyzátoru a následnou permeabilizací acetonem.. Množství heterogenního biokatalyzátoru činí 0,12 g/ml reakční směsi. Po 1 h míchání reakční směsi s kvasinkovým biokatalyzátorem se reakční směs slije a izoluje se z ní redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát. Heterogenní bakteriální a kvasinkové biokatalyzátory se použijí pro další podíl reakční směsi.

Claims (7)

1. Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu z nikotinamidadenindinukleotidu,vyznačující ae tím, že ae na nikotinamidadenindinukleotid působí při pH 5 až 8 v přítomnosti metafosfátu hořečnatých iontů a glukosy nebo jejího endogenního nebo exogenního zdroje permeabilizovánými bakteriálními buňkami rodů Brevibacterium breed nebo Arthrobacter Conn et Dimmick a vzniklý nikotinamidadenindinukleotidfosfát ae v téže reakční směsi redukuje při pH 7,2 až 11 působením přidaných permeabilizovaných buněk kvasinek nebo kvasinkovitých mikroorganismů.

2, Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami Brevibacterium sta ti onis DBM 1073 nebo Arthrobacter globiformis CCM 193.

3. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že po působení bakteriálních buněk se působí permeabilizovanými buňkami druhu Rhodotorula glutinis DBM 18,

4. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že po působení bakteriálních buněk se působí permeabilizovanými buňkami lisovaného pekařského droždí, aktivního sušeného droždí, lisovaného krmného droždí nebo odpadních pivovarských nebo vinařských kvasnie.

5. Způsob podle bodu 1 až 4,vyznačující se tím, že použité permeabilizované bakteriální nebo kvasinkovité buňky nebo oboje jsou zmobilizovány.

267 244

6. Způsob podle bodu 1 až 5, vyznačující se tím, že zdrojein glukosy je škrobový sirup nebo hydrolyzát celulózy nebo dřeva.

7 · Způsob podle bodu 1 až 6, vyznačující se tím, že jeden nebo oba reakční s tupně se provádějí v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, například azidu sodného nebo fluoridu sodného.