CS266901B1

CS266901B1 - Způsob přípravy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu

Info

Publication number: CS266901B1
Application number: CS873916A
Authority: CS
Inventors: Ludmila Silhankova; Zora Ing Kovarova; Tomas Ing Csc Ruml; Miroslav Doc Ing Csc Marek
Original assignee: Ludmila Silhankova; Zora Ing Kovarova; Tomas Ing Csc Ruml; Marek Miroslav
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1987-05-28
Publication date: 1990-01-12
Also published as: CS391687A1

Abstract

Způsob přípravy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu mikrobiální fosforylací spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami druhu ί Brevibacterium stationis Breed nebo Arthrobacter globiformis Conn et Dimmick obsahují- 1 čími metafosfátdependentní nikotinamidade» nindinukleotid-kinasu, které se pěstují na půdě obsahující kvasničný autolyzát nebo jiný přirozený zdroj organického dusíku, zdroj uhlíku a minerálních látek. Zvláště výhodné je použití buněk Brevibacterium stationis DBM 1073 a Arthrobacter globiformis CCM 193. Permeabilizované buňky mohou být imobilizovány. Fosforylací lze provádět v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace například fluoridu sodného nebo azidu sodného.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP⁺), což je koenzymem řady oxidoredukčních enzymů. V redukované formě se účastní synthesy mnoha sloučenin v živých buňkách. V chemických, biologických a klinických laboratořích se používá především při enzymovém stanovení glukosy a při metabolické aktivaci chemických sloučenin testovaných z hlediska jejich mutagenních a kancerogenních účinků. Další použití má při biologickém a biochemickém výzkumu.

Nikotinamidadenindinukleotidfosfát se původně získával izolací z mikrobiálních buněk podobně jako je tomu až dosud u nikotinamidadenindinukleotidu (NAD⁺). Protože se však nikotinamidadenindinukleotidfosfát vyskytuje v buňkách v mnohem nižších koncentracích než nikotinamidadenindinukleotid, je tento postup získání velmi drahý. Zlepšení přinesla fosforylace levného nikotinamidadenindinukleotidu působením nikotinamidadenindinukleotidkinasy permeabilizovaných buněk různých bakteriálních druhů, což je předmětem několika patentů.

Uvedená fosforylace však vyžaduje jako donor fosfátu poměrně drahý adenosintrifosfát, který se přitom přeměňúje v adenosindifosfát. Určité zlepšení přineslo použití bakteriálních kmenů, jež vedle enzymu nikotinamidadenindinukleotid-kinasy obsahují také enzym adenylátkinasu (Watanabe T. a sp., Jap. patent 53-115891, 1978, Watanabe T. a sp., Jap. patent 53-115892,1978). Další zlepšení znamenalo použití kombinace mikrobiálních buněk dvou druhů, z nichž jeden zajišťoval fosforylaci nikotinamidadenindinukleotidu v nikotinamidadenindinukleotidfosfát a druhý regeneraci odpadajícího adenosindifosfátu v adenosintrifosfát za použití anorganického fosfátu (Watanabe T. a sp., Jap. patent 53-142596, 1978, Yasudo Y. a sp., Jap. patent 54-46891, 1979, Aiba S. a sp., Jap. patent 56-117797,1981) používají pro regeneraci adenosindifosfátu v acjenosintrifosfátu při přípravě nikotinamidadenindinukleotidfosfátu osvětlovaných chromoforů fotosyntetických bakterií.

Podstatné zlevnění celého procesu přineslo použití permeabilizovaných buněk takového mikrobiálního druhu, který obsahuje rovněž metafosfátdependentní nikotinamidadenindinukleotid-kinasu, takže jako donor fosforu se při fosforylaci používá metafosfát, který je mnohem levnější než adenosintrifosfát. Jako vhodný kmen se jevil Brevibacterium ammoniagenes JAM 1645, jehož permeabillzované buňky byty použity také, podobně jako u procesů používajících adenosintrifosfát, v imobilizované formě (Murata K., Biotechnol. Bioeng. 21, 887, 1979). Búňky používané pro tento proces však musí být získány kultivací v médiu obsahujícím kvasničný extrakt, zbavený fosforylovaných organických sloučenin pomocí poměrně komplikovaného postupu podle Weimbergera R. a Ortona W. L„ J. Bacteriol. 89, 740, 1963. PoPsaný proces využívající metafosfát dependen• ^tnixⁿl . Inamidadenindinukleotid-kinasu navíc vyžaduje aerobní podmínky a je proto velmi ci

CS 266 901 Bl

Ί tlivý k inhibičním účinkům azidu sodného, který se běžně používá k potlačení mikrobiální kontaminace při technologických enzymových reakcích a při postupech pracujících s permeabilizovanými nebo mobilizovanými buňkami.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu mikrobiální fosforylaci podle vynálezu, který spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami druhu Breevitbacterium stationis Breed nebo Arthrobacter globiformis Conn et Dimmick obsahujícími metafosfátdependentní nikotinamidadenindinukleotid-kinasu, které se pěstují na půdě obsahující kvasničný autolyzát nebo jiný přirozený zdroj organického dusíku, zdroj uhlíku a minerálních látek. Zvláště výhodné je použití buněk Bravibacterium stationis DBM 1073 a Arthrobacter globiformis CCM 193 uložených ve sbírce mikroorganismů katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze pod číslem 1073 a 1075. Permeabillzované buňky mohou být mobilizovány. Fosforylaci lze provádět v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace například fluoridu sodného nebo azidu sodného.

Extracelulární fosforylace nikotinamidadenindinukleotidu pomocí Brevibacterium stationis nebo pomocí Arthrobacter globiformis podle vynálezu se provádí tak, že se buňky těchto mikroorganismů pomnoží za aerobních podmínek v tekutém médiu obsahujícím vedle vhodného zdroje uhlíku a energie také zdroj dusíku ve formě amonné soli a kvasničného extraktu (autolyzátu) nebo jiného přirozeného zdroje tohoto prvku, dále hořečnaté a draselné ionty a fosfát. Buňky se oddělí od pomnožovacího média, nejlépe odstředěním a podle potřeby se promyjí vodou. Permeabilizace buněk se dosáhne buď třepáním s acetonem nebo jiným rozpouštědlem, nebo působením vhodné povrchově aktivní látky (např. dodecylsulfátu, cetylpyridiniumchloridu apod.) tak, aby aktivita nikotinamidadenindinukleotid-kinasy zůstala zachována. Pro mobilizaci buněk se může použít vhodný gel jako je polyakrylamid, agar apod. Permeabilizace buněk může být provedena před jejich imobilizací nebo až po ní.

Reakce probíhá v reakčním roztoku 2 až 20 mM nikotinamidadenindinukleotidu, 2 až 60 mM Mg²⁺ a 0,05 až 5 % hmot, metafosfátu, k němuž se přidají permeabillzované buňky, volné nebo mobilizované, v množství 5 až 60 mg sušiny/ml, případně ještě glukóza v konečné koncentraci 0,01 až 0,2 molu/1. Přídavky fluoridu sodného NaF (v konečné koncentraci 0,01 až 0,3 molu/1) a azidu sodného NaN₃ (v konečné koncentraci 0,1 až 3 mmoly/1) jsou vhodné pro potlačení rozvoje mikrobiální kontaminace. Základní látky i aktivátory a inhibitory se rozpustí ve vhodném pufru o pH 5,5 až 9,0, reakční teplota se volí v rozmezí 20 až 55 °C.

Po proběhnutí reakce se z reakční kapaliny oddělí některým ze známých postupů (např. vedením přes vhodný ionex) nikotinamidadenindinukleotidfosfát a dále se čistí. Nezreagovaný nikotinamidadenindinukleotid se může opět využít k reakci.

Vynález je v dalším blíže objasněn na konkrétních příkladech způsobu přípravy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu za použití Brevibacterium stationis DBM 1073 a Arthrobacter globiformis CCM 193.

Příklad 1

Brevibacterium stationis DBM 1073 se aerobně kultivuje při 30 °C v prostředí o pH 7,5 obsahujícím v 1 litru: 20 g glukózy, 1 g síranu amonného, 0,1 g MgSO₄. 7 H₂O, 8,7 g K₂HPO₄, 10 g kvasničného autolyzátu. Po 18 h kultivace se buňky odstředí při 800 g, promyjí vodou a permeabilizují trojnásobným objemem vychlazeného acetonu po dobu 15 minut. Pak se buňky odstředí, aceton se slije a jeho residua se odstraní proudem vzduchu. K reakční směsi 5 mM nikotinamidadenindinukleotidu, 20 mM MgCl₂, 1 % hmot, metafosfátu a 1 mM NaN₃ v tris-HCl pufru o pH 6,8 se přidají permeabilizované buňky v množství 20 mg buněčné sušiny/ ml a směs se inkubuje za míchání 2 h při 37 °C. Během této doby dojde k transformaci cca 50 % nikotinamidadenindinukleotidu v nikotinamidadenindinukleotidfosfátu. Inkubační dobu lze prodloužit až na 4 h s příslušným zvýšením výtěžku. Buňky se od reakční směsi oddělí centrifugací při 800 g až 1 000 g a ze supernatantu se některým ze známých postupů izoluje nikotinamidadenindinukleotidfosfát.

Příklad 2

Mikrobiální buňky Arthrobacter globiformis CCM 193 se kultivují v půdě uvedené v příklaPŘEDMĚT

1. Způsob přípravy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu mikrobiální fosforylací vyznačující se tím, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami druhu Brevibacterium stationis Breed nebo Arthrobacter globiformis Conn et Dimmick obsahujícími metafosfátdependentní nikotinamidadenindinukleotid-kinasu, které se pěstují na půdě obsahující kvasničný autolyzát, nebo jiný přirozený zdroj organického dusíku, zdroj uhlíku a minerálních látek.

CS 266 901 Bl du 1. K promyté a odstředěné suspenzi nakultivovaných buněk v dvojnásobném objemu vody se přidá 20% hmot, monomeru akrylamidu a 2 % hmot. N,N‘-methylen-bis-akrylamidu a po ochlazení na 7 až 10 °C se přidají 3 % obj. 5% (hmot.) roztoku dimethylaminopropionitrilu a 5% (hmot.) persíranu draselného. Po proběhnuté polymeraci se z vytvořeného gelu připraví částice o velikosti 1 až 5 mm. K těmto částicím se přidá stejný objem acetonu a třepe se za chladu 30 min, aby se imobilizované buňky permeabilizovaly. Poté se aceton slije, částice se promyjí vodou a naplní do reaktoru. Po přídavku dvojnásobného objemu reakční směsi shodného složení jako v příkladu 1 se reakční směs míchá 2 hodiny. Po oddělení heterogenního biokatalyzátoru se nikotinamidadenindinukleotidfosfát izoluje některým ze známých postupů. K heterogennímu biokatalyzátoru obsahujícímu imobilizované a permeabilizované buňky se přidá nový podíl reakční směsi a postup biotransformace se opakuje. Výtěžnost nikotinamidadenindinukleotidfosfátu je kolem 40 %.

Příklad 3

Imobilizované a permeabilizované buňky Brevibacterium stationis DBM 1073 připravené podle postupu uvedeného v příkladu 1 a 2 se plní do kolony, kterou se nechá poté protékat reakční směs shodného složení jako v příkladu 1. Rychlost průtoku se volí tak, aby celková náplň kolony se vyměnila za 2 až 3 h. Tento kontinuální způsob biotransformace poskytuje výtěžnost nikotinamidadenindinukleotidfosfátu kolem 40 %.

Claims

VYNÁLEZU
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí buňkami Brevibacterium stationis DBM 1073 a Arthrobacter globiformis CCM 193.
3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že na nikotinamidadenindinukleotid působí imobilizovanými permeabilizovanými buňkami.
4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se fosforylace provádí v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace například fluoridu sodného nebo azidu sodného.