CS265934B1 - Rolyvalentnl inaktivované adsorbátová vakcína proti infekční bronchopneumonii hříbat a způsob její přípravy - Google Patents

Abstract

Řešení se týká polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat. Vakcína sestává z viru Rhinopneumoníe koní EHV-1, dvou subtypů virů Influenza egui - A/Egui 1 a A/Egui 2 a z povrchových bakteriálních antigenů, získaných z kmenů Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus equuli a Rhodococcus egui, které jsou vesměs navázány na minerální nosič, hydroxid hlinitý v gelové formě. Vakcína se připravuje tak, že povrchové bakteriální antigeny se získají extrakcí z bakteriální suspenze do vodného roztoku thiokyanatanu, extrakt se podrobí dialýze a povrchové bakteriální antigeny se navážou na gel hydroxidu hlinitého, přidaný v množství 1 až 2 % hmot. v přepočtu na hmotnost vodného roztoku antigenů. Suspenze virových antigenů, připravená známým způsobem, se podrobí lyofilizaci a lyofilizát se suspenduje v připraveném bakteriálním extraktu. Předností vakcíny je, že umožňuje imunizaci vysokobřezích klisen a tím přispívá k lepší pasivní ochraně hříbat a podstatnému snížení ztrát při jejich chovu.

Description

Vynález se týká polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat, sestavené z virových a z povrchových bakteriálních antigenů, která se může uplatnit při zvýšení specifické kolostrální imunity u hříbat v chovech s vysokým výskytem infekčních bronchopneumonií v postnatálním období.

riwmito inorbidily hříbat z. těchto příčin se v některých chovech pohybuje okolo 60 až 70 % a mortalita činí. 15 1 více* procent. Jako původci infekčních bronchopneumonií jitou označovány myxoviry (influenza virus), adenoviry, reoviry, picornaviry (rhinovirus a enterovirus) a herpesviry. Největší význam je přikládán herpesviru označenému jako virus Rhinopneumonie Equi, a to halvně subtyp EHV-1. Dále mají velký etiologický význam viry chřipky koní, a to Influenza A/Equi 1 a A/Equi 2. Na rozvoji infekčních bronchopneumonií hříbat se mohou podílet i bakteriální agens, a to především Streptococcus zooepidemicus, Corynebacterium equi (nově zařazené jako Rhodococcus equi) a na rozvoji purulentních ložisek se podílí i Actinobacillus equuli a Staphylococcus aureus.

V současné době se preventivně využívá k vakcinaci klisen vakcína proti viru EHV-1, a to stenuovaná (Prevaccinol) nebo inaktivovaná vakcína (Pneumabort-K). Dále se používají různě připravené inaktivované vakcíny proti viru chřipky koní, v ověřování je i kombinovaná synergická vakcína proti virům (Herpes virus EHV-1, viry Influenza 1 a 2 a reoviry sérotyp 1 a 3) pod názvem Resequin. Pro koně jsou v současné době připravovány dvě vakcíny, a to vakcína RPK, která obsahuje atenuovaný virus EHV-1 a vakcína Equimix, tj. inaktivovaná vakcína sestavená z jednoho viru Influenza equi A/l a dvou virů Influenza equi sérotypu A/2.

Proti bakteriálním původcům infekcí respiračních orgánů se připravují jen příležitostně stájové (autogenní) vakcíny z dodaných izolovaných kmenů.

Ne všechny dosud připravované vakcíny však jsou vhodné k aplikacím vysokobřezím, klisnám, u nichž je především nutno provádět imunizaci pro zvýšení pasivní ochrany hříbat prostřednictvím kolostra, které se musí provádět v posledních dvou měsících březosti. Vakcína RPK obsahuje živý virus, používá se v chovech koní především k prevenci abortů a předpokladem je, že vakcinace se provádí v celém státě současně. Equimix je inaktivovaná vakcína a nelze ji současně aplikovat s vakcínou RPK. Doposud připravované autogenní vakcíny z bakteriálních agens byly připravovány pro každý bakteriální druh samostatně a jelikož se aplikovaly značně velké objemy bakterinu, až 30 ml na jednu dávku, byly často doprovázeny lokálními reakcemi, popřípadě i horečnatými stavy, což je u březích klisen nežádoucí.

K odstranění zmíněných nedostatků a výraznému posílení kolostrální imunity hříbat směřuje polyvalentní inaktivovaná adsorbátová vakcína proti infekční bronchopneumonií hříbat s minerálním nosičem obsahující virové antigeny virů Rhinopneumonie a Influenza equi, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že vakcína sestává ze tří virových antigenů, a to viru Rhinopneumonie koní EHV-1 a dvou subtypů virů Influenza equi, a to A/Equi 1 a A/Equi 2 a z povrchových bakteriálních antigenů, získaných z kmenů Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus eguuli a Rhodococcus equi, přičemž virové antigeny i povrchové bakteriální antigeny jsou navázány na minerální nosič, například hydroxid hlinitý v gelové formě.

Cílem vynálezu bylo získat z výše uvedených virových a bakteriálních kmenů přijatelný objem imunizační dávky pro březí klisny, zbavit vakcínu zbytečných balastních látek, které by zatěžovaly organismus a tím, dosáhnout, aby vakcína neměla vedlejší reakce, a aby byla přitom dostatečně imunogenní a vyvolala tvorbu humorálních protilátek u klisen k zabezpeče- . ní kolostrální imunity u jejich hříbat v postnatálním období.

Zárukou splnění uvedených požadavků je způsob přípravy inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonií zvířat, který je rovněž předmětem vynálezu. Tento způsob spočívá v tom, že povrchové bakteriální antigeny se získají extrakcí z bakteriální suspenze do vodného roztoku thiokyanatanu, extrakt se podrobí dialýze a povrchové bakteriální antigeny se navážou na minerální nosič, například hydroxid hlinitý v gelové formě, který se přidá v množství 1 až 2 % hmot, v přepočtu na hmotnost vodného roztoku antigenu, suspenze vírových antigenů připravená známým způsobem se podrobí lyofilizaci a lyofilizát se suspenduje v připraveném bakteriálním extraktu.

K plípiavč Unlo'iny podle vynálezu byl vybrán Equine Rhinopneumonitis virus, Strain, Alb. 2 981/64 č. sb. CAI’M V-44, Influenza virus Λ/equine 1, Urno 78 č. sb. CAPM V-278, Influenza virus Λ/equine 2, Fontaineblou 79 č. sb. CAPM V-306, Streptococcus zooepidemicus CCM 6 260, Rhodococcus equi CCM 6 262 a Actinobacillus equuli CCM 6 258.

Pomnožení viru Influenzy koní se provádí na kuřecích embryích. Následnou operací je purifikace a koncentrace viru z alantoidní tekutiny ethanolovým srážecím postupem. Pomnožení víru EHV-1 probíhá na kontinuální buněčné linii AUBEK. Následuje koncentrace viru přes membránový filtr přibližně na 20% objem. K imunizaci se použije zahuštěný virus, zbavený buněčného detritu. Po smíchání koncentrovaného viru EHV-1 a precipitovaného viru Influenzy koní A/l a Λ/2 se k inaktivovaným virovým partikulím přidá lyofilízační médium a provede se lyofilizace.

Bakteriální kmeny Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi a Actinobacillus equuli se pomnožují na tekutých médiích a každý kmen se kultivuje samostatně. Po pomnožení se všechny tři bakteriny smíchají a zahušřují se odstředěním 20násobně. K zahuštěnému bakterinu se přidá stejný objem 1 M roztoku thiokyanatanu draselného a po dobu 6 hodin se provádí extrakce povrchových antigenů za stálého protřepávání při 37 °C. Po extrakci se odstředěním oddělí zbytek bakteriálního detritu a supernatant se dialyzuje proti pufru po dobu 48 hodin. Dialyzát se inaktivuje formalinem a naváže na minerální nosič, hydroxid hlinitý. Takto připravená komponenta z bakteriálních antigenů slouží současně jako médium pro lyofilizovanou virovou složku. V bakteriálním extraktu připraveném podle vynálezu se virový lyofilizát rozptýlí bezprostředně před aplikací vakcíny.

Aby se předešlo vedlejším reakcím při imunizaci koní, je nutno provést částečnou purifikaci pomnožených virů. K tomu se nabízejí různé postupy, jako srážecí nebo eluční postupy, centrifugace, absorpce nebo filtrační postupy. Pro purifikaci viru Influenzy se ukázala výhodnou precipitace viru vychlazeným etylalkoholem.

Obdobně pak u vakcíny z bakteriálních antigenů je vyvíjena snaha snížit obsah endotoxinu, který je velmi často příčinou vedlejších reakcí a postvakcinačních šoků v těch případech, kdy je nutno aplikovat větší objemy bakterií. Tomu lze rovněž předejít přípravou různých extraktů s použitím kyseliny chlorovodíkové za tepla, nebo kyseliny trichloroctové za chladna, kdy se extrahují především polysacharidové antigeny s nízkou molekulovou hmotností. Lze také využít extrakce při neutrálním pH, kdy se získají nativní kapsulární antigeny s vyšší molekulovou hmotností, které jsou lépe imunogenní (Baker, C. J. a Kasper, D. L., Rev. Inf. Dis., 7, 1985; 458 až 467). K extrakci za neutrálního pH se u některých bakterií použilo thiokyanatanu draselného, kterým se extrahuje z bakteriální stěny řada antigenů polysacharidové i proteinové povahy (Ryu, H. a Kaeberle, M. L., Vet. Microbiol., 11, 1986: 373 až 385). Jak se ukázalo v pokusech s extrakty z kmenů Pasteurella multocida a Pasteurella haemolytica, nedocházelo téměř k žádným vedlejším reakcím při imunizaci zvířat, i když bylo použito většího množství takto připraveného antigenu (Mukkur, T. K. S., J. Gen. Microbiol., 113, 1979: 37 až 43).

Předností nové polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat a způsobu přípravy této vakcíny podle vynálezu je, že tato vakcína je vhodná k imunizaci vysokobřezích klisen, a že touto vakcínou lze zabezpečit zvýšení kolostrálních protilátek proti viru Rhinopneumonie koní, virům Influenzy koní Al a A2 a proti třem nejdůležitějším bakteriálním agens, které se podílejí na infekčních bronchopneumoniích u hříbat v postnatálním období. V aplikační formě představují vakcínu koncentrované antigeny virové i bakteriální složky v malém objemu, čímž lze předejít případné lokální reakci u koní. Imunizace březích klisen zajistí lepší pasivní ochranu zvířat a podstatně sníží ztráty při jejich chovu. Navržená vakcína vhodně a účelně rozšíří dosud omezený sortiment imunoprotektivních přípravků pro koně.

Vakcína se aplikuje hluboko do svalu, nejlépe se osvědčila aplikace do gluteální svaloviny. Jelikož vakcíny s olejovým adjuvans i s hydroxidem hlinitým mohou vyvolávat místní reakce a granulomy, je vakcína koncentrována na objem 4 ml pro 1 aplikaci. Zatím byla ověřena aplikace asi u 500 ks a sterilní absces byl pozorován jen v 1 případu, kdy šlo asi o kontaminaci při aplikací. Větší nebezpečí ah.nroí?ů by bylo po podkožní aplikaci, proto je tento způsob u koní kontraindikován.

Kontraindikace vakcinace u navrhované vakcíny jsou všeobecně případy celkového oslabení zvířat s horečnatými stavy. Jinak je kontraindikací případné použití jiných vakcín v období 2 až 3 týdny před první vakcínací a 1 měsíc po revakcinaci.

Jelikož vakcína má sloužit ke zvýšené ochraně hříbat kolostrální a laktogenní imunitou, je nutno vakcínovat klisny v pozdním období gravidity v 7 až 9 měsíci. Předběžně bylo použití vakcíny ověřováno i u hříbat, ale zde ještě není ověřena nejvhodnější doba aplikace, která by měla být po odeznění kolostrální imunity.

Složení a zejména způsob přípravy polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat podle vynálezu vhodně ilustruje níže uvedený příklad přípravy vakcíny v množství pro 100 koní:

Způsobem podle vynálezu se nejprve připraví bakteriální složka vakcíny.

VakcinaČní kmen Rhodococcus equi CCM 6 262 se pomnoží v tekuté živné půdě tohoto složení:

Enzymatický kaseinový hydrolyzát 17 g/1

Sójový pepton3 g

Chlorid sodný 2,5g

Hydrogenfosforečnan dvojsodný kryst. 2,5g

Glukóza 2,5g pH roztoku se upraví na hodnotu 7,4.

VakcinaČní kmen Actinobacillus equuli CCM 6 258 se pomnoží na tekutém bujónu obdobného složení jako Rhodococcus equi.

VakcinaČní kmen Steptococcus zooepidemicus CCM se pomnoží v Tood Hewitově bujónu.

Ze všech tří vakcinačních kmenů se připraví nejdříve inokulum, které se kontrolním výsevem na krevní agar vyšetří na nepřítomnost jiné mikroflóry. Pro každý kmen se připraví 3 litry příslušné živné půdy a umístí se v termostatu při 37 °C. Po dosažení potřebné teploty se inokuluje každý kmen zvlášř v dávce 2 % hmot, bakteriální kultury a pomnožuje se staticky po dobu 24 hodin u Actinobacilla a Streptococca a po dobu 48 hodin u Rhodococca. Po této Q době se předpokládá nárůst bakterií minimálně 10 . Narostlá bakteriální kultura se smíchá a zahušťuje odstředěním na průtokové odstředivce a promyje fyziologickým roztokem. Konečný objem zahuštěné bakteriální suspenze je 350 ml. K tomuto objemu se přidá 350 ml 1 M vodného roztoku thiokyanatanu draselného. Směs se zahřeje na 40 °C a provádí se extrakce antigenu třepáním po dobu 6 hodin v termostatu při teplotě 37 °C. Po extrakci se směs bakterií odstředí při 3 000 g po dobu 1 hodiny při +5 °C. Supernatant s extrahovanými antigeny se dialyzuje proti pufru (0,01 M Na₂HPO₄), 0,3 M NaCl, pH 7,5) s přídavkem 0,5 » hmot, formalinu při teplotě +4 °C. Extrakt se dialyzuje proti lOnásobnému objemu pufru s jednou výměnou po dobu 48 hodin. Po ukončení dialýzy se bakteriální extrakt odstředí při 3 000 g po dobu 30 minut, pH supernatantu se upraví na hodnotu 7,0 až 7,5 a přidá se 10 % hmot, gelu hydroxidu hlinitého a upraví se koncentrace formalinu na 0,5 % hmot, i celkový objem vakcíny na 800 ml. Adsorbovaná bakteriální složka se rozplní do lékovek a je připravena jako solvens pro lyofilizovanou formu virové složky.

Při přípravě virové složky vakcíny se postupuje tak, že kmeny viru chřipky koní subtyp

A/l a A/2 se sbírkovým označením CAMP V-278 a CAMP V-306 se pomnožují známým postupem na kuřecích embyriích intraalantoidně po inokulaci dávkou 0,2 ml s obsahem 10³ až 10⁴ v inokulu. Po 48 hodinách inkubace při 35 °i ew₅0

C se vajíčka prohlédnou. Živá embrya se ochladí na 4 °C a při této teplotě se ponechají 24 hodin, a poté se odebírá alantoidní tekutina.

Z It.rAdých 10 vajíček m· vždy odebírá alantoidní tekutina zvlášE, aby bylo možné u těchto objemů stanovit titr haemaglutininů. Pro přípravu vakcíny se používá alantoidní tekutina s obsahem titru 256 a vyšším a objemy se smíchají tak, aby se dosáhlo průměrného titru 512 hemaglutinačních jednotek. Pro imunizaci 100 koní je nutno připravit 600 ml alantoidní tekutiny s obsahem 512 hemaglutinačních jednotek viru A/l v 1 ml a stejné množství viru A/2.

Získaná alantoidní tekutina se klarifikuje odstředěním při 2 000 g a inaktivuje se přidáním 0,1 Z hmot, formalinu. Virus z inaktivované alantoidní tekutiny se sráží vychlazeným 96 % hmot, etylalkoholem. Etyalkohol vychlazený na -40 °C se přidává do alantoidní tekutiny předem vychlazené na +4 °C do koncentrace alkoholu 40 % hmot, (k 1 200 ml alantoidní tekutiny se přidá 800 ml 96 % hmot, etylalkoholu). Po 24hodinovém stání při teplotě +4 °C se obsah vzniklého precipitátu rozmíchá a suspenze se odstřeluje při nízkých otáčkách 500 až 1 000 g po dobu 30 minut. Sediment představující vysrážené částice viru Influenzy s malou příměsí vaječné tekutiny se resuspenduje v kultivačním médiu obsahujícím virus EHV-1, jak bude uvedeno níže.

Virus rhinopneumonie koní EHV-1 se sbírkovým označením CAMP V-44 se pomnoží na tkáňové kultuře. Uvedený virus je adaptovaný na kontinuální buněčnou linii AUBEK. K pomnožení buněk se použije Eaglův roztok (MEM) s přídavkem 10 % hmot, fetálního séra, 200 j. penicilinu a 20 /rg streptomycinu/1 ml. Virus se množí na buňkách bez fetálního séra v udržovacím médiu. K inokulaci se používá virus ΤΚΙΏ^θ 10^/ml a kultivace se provádí 5 až 7 dnů, až se dosáhne cytopatického efektu asi u 80 % buněk. Pak se buňky uvolní a získaná buněčná suspenze se inaktivuje přidáním 0,1 % hmot, formalinu. Po 3denním uložení při 4 °C se provede uvolnění viru z buněk opakovaným zmrazením a rozmražením, které se 3x opakuje. Po uvolnění viru se buněčný detritus oddělí odstředěním při 2 000 g po dobu 30 minut. Supernatant se zahustí přes membránový filtr na 1/5 původního objemu. Pro přípravu vakcíny pro 100 koní je nutno připravit 3 500 ml suspenze infikovaných buněk. Po odstředění a zahuštění se získá 700 ml suspenze viru EHV-1 s obsahem viru ΤΚΙΟ^θ 10⁴/ml. Do zahuštěné suspenze viru EHV-1 se resuspenduje sediment viru Influenzy koní A/l a A/2, připravený postupem uvedeným shora. Suspenze se roztřepává na míchačce při 35 °C po dobu 2 až 3 hodin, čímž se dosáhne eluce viru. Pak se opětovně suspenze viru EHV-1 a Influenzy odstředí při nízkých otáčkách 700 až 800 g po dobu 30 minut a oddělí se nerozpuštěné bílkoviny z precipitátu získaného srážením alantoidní tekutiny.

Suspenze viru se doplní lyofilizačním médiem s želatinou, hodnota pH se upraví na 7,0 až 7,5 a provede se lyofilizace v lékovkách.

Polyvalentní vakcína proti infekční bronchopneumonii hříbat podle vynálezu, připravená podle uvedeného příkladu byla podrobena a vyhověla níže uvedeným zkouškám:

Zkouška sterility a inaktivace

Provádí se u bakteriální a virové složky vakcíny samostatně. Bakteriální část vakcíny se vyočkuje na'plotny krevního agaru a do tekutého živného média, virová část vakcíny před lyofilizací se ověřuje inokulaci do kuřecího embrya. Po inokulaci 0,2 ml do alantoidní tekutiny nedošlo k úhynu embrya.

Zkouška neškbdnosti

Vakcína se naočkuje vždy 4 myškám. Po intraperitoneální aplikaci 0,2 ml se myšky pozorují po dobu 1 týdne, neeošlo k úhynu.

Zkouška účinnosti

Provádí se imunizací králíků. Vakcína se aplikuje intramuskulárně do končetiny v množství 1 ml a revakcinuje se po 14 dnech. Po 3 týdnech se odebere krev pro sérologické vyšetření specifických protilátek. .

Doba expirace vakcíny podle vynálezu je 1 rok a vakcína se skladuje v temnu při teplotě cca +5 c.

Účinnost polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat připravené podle vynálezu potvrzují výsledky získané imunizací březích klisen a králíků, u kterých bylo dosaženo těchto titrů protilátek:

Antigen Průměrné titry před a po vakcinaci

	u klisen	u králíků
před	P°	před	PO
Virus rhinopneumonie	23	382	0	96
Virus chřipky	100	664	0	128
Actinobacillus	26	100	3	48
Corynebacterium	19	98	2	32
Streptococcus	578	2 064	24	96

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Polyvalentní inaktivovaná adsorbátová vakcína proti infekční bronchopneumonii hříbat s minerálním nosičem, obsahující virové antigeny virů Rhinopneumonie a Influenza equi, vyznačená tím, že sestává ze tří virových antigenů, a to viru Rhinopneumonie koní EHV-1 a dvou subtypů vorů Influenza equi, a to A/Equi 1 a A/Equi 2 a z povrchových bakteriálních antigenů, získaných z kmenů Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus equuli a Rhodococcus equi, přičemž virové antigeny i povrchové bakteriální antigeny jsou navázány na minerální nosič, například hydroxid hlinitý v gelové formě.
2. 2. Způsob přípravy vakcíny podle bodu 1, vyznačený tím, že povrchové bakteriální antigeny se získají extrakcí z bateriální suspenze do vodného roztoku thiokyanatanu, extrakt se podrobí dialýze a povrchové bakteriální antigeny se navážou na minerální nosič, například hydroxid hlinitý v gelové formě, který se přidá v množství 1 až 2 % hmot, v přepočtu na hmotnost vodného roztoku antigenů, suspenze virových antigenů připravená známým způsobem se podrobí lyofilizaci a lyofilizát se suspenduje v připravovaném bakteriálním extraktu.