CS265934B1

CS265934B1 - Polyvalent inactivated adsorbate vaccine against foals' infective bronchopneumonie and method of its preparation

Info

Publication number: CS265934B1
Application number: CS873701A
Authority: CS
Inventors: Leopold Mvdr Csc Ulmann; Evzen Doc Mvdr Csc Jurak; Dagmar Mvdr Veznikova
Original assignee: Leopold Mvdr Csc Ulmann; Evzen Doc Mvdr Csc Jurak; Dagmar Mvdr Veznikova
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1987-05-21
Publication date: 1989-11-14
Also published as: CS370187A1

Abstract

Řešení se týká polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat. Vakcína sestává z viru Rhinopneumoníe koní EHV-1, dvou subtypů virů Influenza egui - A/Egui 1 a A/Egui 2 a z povrchových bakteriálních antigenů, získaných z kmenů Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus equuli a Rhodococcus egui, které jsou vesměs navázány na minerální nosič, hydroxid hlinitý v gelové formě. Vakcína se připravuje tak, že povrchové bakteriální antigeny se získají extrakcí z bakteriální suspenze do vodného roztoku thiokyanatanu, extrakt se podrobí dialýze a povrchové bakteriální antigeny se navážou na gel hydroxidu hlinitého, přidaný v množství 1 až 2 % hmot. v přepočtu na hmotnost vodného roztoku antigenů. Suspenze virových antigenů, připravená známým způsobem, se podrobí lyofilizaci a lyofilizát se suspenduje v připraveném bakteriálním extraktu. Předností vakcíny je, že umožňuje imunizaci vysokobřezích klisen a tím přispívá k lepší pasivní ochraně hříbat a podstatnému snížení ztrát při jejich chovu.The solution relates to polyvalent inactivated infectious adsorbate vaccines foal bronchopneumonia. The vaccine consists of from Rhinopneumonia virus EHV-1 horses, two subtypes of Influenza egui - A / Egui 1 a A / Egui 2 and superficial bacterial antigens obtained from Streptococcus strains zooepidemicus, Actinobacillus equuli a Rhodococcus egui, which are generally bound for mineral carrier, aluminum hydroxide in gel form. The vaccine is being prepared that surface bacterial antigens are obtained by extraction from the bacterial suspension into of an aqueous solution of thiocyanate, the extract being undergo dialysis and superficial bacterial the antigens bind to the gel hydroxide % of aluminum, added in an amount of 1 to 2 wt. calculated as the weight of the aqueous solution antigens. Viral antigen suspension, prepared in a known manner, are lyophilized and the lyophilisate is suspended in the prepared bacterial extract. The advantage of the vaccine is that it allows immunization of high-cuts mares and thus contributes to a better passive protection of foals and substantial reduction of losses breeding.

Description

Vynález se týká polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat, sestavené z virových a z povrchových bakteriálních antigenů, která se může uplatnit při zvýšení specifické kolostrální imunity u hříbat v chovech s vysokým výskytem infekčních bronchopneumonií v postnatálním období.The invention relates to a polyvalent inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia of foals, composed of viral and surface bacterial antigens, which can be used to increase the specific colostral immunity in foals in farms with a high incidence of infectious bronchopneumonia in the postnatal period.

riwmito inorbidily hříbat z. těchto příčin se v některých chovech pohybuje okolo 60 až 70 % a mortalita činí. 15 1 více* procent. Jako původci infekčních bronchopneumonií jitou označovány myxoviry (influenza virus), adenoviry, reoviry, picornaviry (rhinovirus a enterovirus) a herpesviry. Největší význam je přikládán herpesviru označenému jako virus Rhinopneumonie Equi, a to halvně subtyp EHV-1. Dále mají velký etiologický význam viry chřipky koní, a to Influenza A/Equi 1 a A/Equi 2. Na rozvoji infekčních bronchopneumonií hříbat se mohou podílet i bakteriální agens, a to především Streptococcus zooepidemicus, Corynebacterium equi (nově zařazené jako Rhodococcus equi) a na rozvoji purulentních ložisek se podílí i Actinobacillus equuli a Staphylococcus aureus.riwmito inorbidily foals from these causes in some farms is around 60 to 70% and mortality is. 15 1 more * percent. Myxoviruses (influenza virus), adenoviruses, reoviruses, picornaviruses (rhinovirus and enterovirus) and herpesviruses are referred to as infectious bronchopneumonias. Herpesvirus, known as Rhinopneumonia Equi virus, is of the utmost importance, mainly the EHV-1 subtype. In addition, equine influenza viruses, namely Influenza A / Equi 1 and A / Equi 2, are of great etiological importance. Bacterial agents may also be involved in the development of infectious bronchopneumonia of foals, especially Streptococcus zooepidemicus, Corynebacterium equi (newly classified as Rhodococcus equi) and Actinobacillus equuli and Staphylococcus aureus are also involved in the development of purulent deposits.

V současné době se preventivně využívá k vakcinaci klisen vakcína proti viru EHV-1, a to stenuovaná (Prevaccinol) nebo inaktivovaná vakcína (Pneumabort-K). Dále se používají různě připravené inaktivované vakcíny proti viru chřipky koní, v ověřování je i kombinovaná synergická vakcína proti virům (Herpes virus EHV-1, viry Influenza 1 a 2 a reoviry sérotyp 1 a 3) pod názvem Resequin. Pro koně jsou v současné době připravovány dvě vakcíny, a to vakcína RPK, která obsahuje atenuovaný virus EHV-1 a vakcína Equimix, tj. inaktivovaná vakcína sestavená z jednoho viru Influenza equi A/l a dvou virů Influenza equi sérotypu A/2.Currently, the EHV-1 vaccine, a stenned vaccine (Prevaccinol) or an inactivated vaccine (Pneumabort-K), is used prophylactically to vaccinate mares. In addition, variously prepared inactivated vaccines against equine influenza virus are used, and a combined synergistic vaccine against viruses (Herpes virus EHV-1, Influenza viruses 1 and 2 and reoviruses serotypes 1 and 3) under the name Resequin is also being verified. Two vaccines are currently being prepared for horses, namely the RPK vaccine, which contains attenuated EHV-1 virus and the Equimix vaccine, ie an inactivated vaccine composed of one Influenza equi A / l virus and two Influenza equi serotype A / 2 viruses.

Proti bakteriálním původcům infekcí respiračních orgánů se připravují jen příležitostně stájové (autogenní) vakcíny z dodaných izolovaných kmenů.Only occasionally stable (autogenous) vaccines from supplied isolated strains are prepared against bacterial agents of respiratory organ infections.

Ne všechny dosud připravované vakcíny však jsou vhodné k aplikacím vysokobřezím, klisnám, u nichž je především nutno provádět imunizaci pro zvýšení pasivní ochrany hříbat prostřednictvím kolostra, které se musí provádět v posledních dvou měsících březosti. Vakcína RPK obsahuje živý virus, používá se v chovech koní především k prevenci abortů a předpokladem je, že vakcinace se provádí v celém státě současně. Equimix je inaktivovaná vakcína a nelze ji současně aplikovat s vakcínou RPK. Doposud připravované autogenní vakcíny z bakteriálních agens byly připravovány pro každý bakteriální druh samostatně a jelikož se aplikovaly značně velké objemy bakterinu, až 30 ml na jednu dávku, byly často doprovázeny lokálními reakcemi, popřípadě i horečnatými stavy, což je u březích klisen nežádoucí.However, not all vaccines currently being prepared are suitable for applications in high-pregnancy, mares, in which immunization is required in particular to increase the passive protection of foals by colostrum, which must be carried out in the last two months of pregnancy. The RPK vaccine contains a live virus, is used in horse breeding primarily to prevent abortions, and it is assumed that vaccination is carried out simultaneously throughout the country. Equimix is an inactivated vaccine and cannot be given at the same time as RPK. Autogenous vaccines from bacterial agents to date have been prepared separately for each bacterial species, and since very large volumes of bacterin, up to 30 ml per dose, have been administered, they have often been accompanied by local reactions and possibly febrile conditions, which is undesirable in pregnant mares.

K odstranění zmíněných nedostatků a výraznému posílení kolostrální imunity hříbat směřuje polyvalentní inaktivovaná adsorbátová vakcína proti infekční bronchopneumonií hříbat s minerálním nosičem obsahující virové antigeny virů Rhinopneumonie a Influenza equi, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že vakcína sestává ze tří virových antigenů, a to viru Rhinopneumonie koní EHV-1 a dvou subtypů virů Influenza equi, a to A/Equi 1 a A/Equi 2 a z povrchových bakteriálních antigenů, získaných z kmenů Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus eguuli a Rhodococcus equi, přičemž virové antigeny i povrchové bakteriální antigeny jsou navázány na minerální nosič, například hydroxid hlinitý v gelové formě.The polyvalent inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia of foals with a mineral carrier containing viral antigens of Rhinopneumonia and Influenza equi viruses, according to the invention, aims at eliminating the above-mentioned deficiencies and significantly enhancing the colostral immunity of foals, the vaccine consisting of three viral antigens, namely EHV-1 equine Rhinopneumonia virus and two subtypes of Influenza equi viruses, A / Equi 1 and A / Equi 2, and surface bacterial antigens obtained from Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus eguuli and Rhodococcus equi strains, with both viral antigens and surface bacterial antigens being to a mineral carrier, for example aluminum hydroxide in gel form.

Cílem vynálezu bylo získat z výše uvedených virových a bakteriálních kmenů přijatelný objem imunizační dávky pro březí klisny, zbavit vakcínu zbytečných balastních látek, které by zatěžovaly organismus a tím, dosáhnout, aby vakcína neměla vedlejší reakce, a aby byla přitom dostatečně imunogenní a vyvolala tvorbu humorálních protilátek u klisen k zabezpeče- . ní kolostrální imunity u jejich hříbat v postnatálním období.The object of the invention was to obtain from the above-mentioned viral and bacterial strains an acceptable volume of immunization dose for pregnant mares, to rid the vaccine of unnecessary ballast substances which would burden the organism and thus to ensure that the vaccine has no side effects and is sufficiently immunogenic to antibodies in mares to ensure safety. colostral immunity in their foals in the postnatal period.

Zárukou splnění uvedených požadavků je způsob přípravy inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonií zvířat, který je rovněž předmětem vynálezu. Tento způsob spočívá v tom, že povrchové bakteriální antigeny se získají extrakcí z bakteriální suspenze do vodného roztoku thiokyanatanu, extrakt se podrobí dialýze a povrchové bakteriální antigeny se navážou na minerální nosič, například hydroxid hlinitý v gelové formě, který se přidá v množství 1 až 2 % hmot, v přepočtu na hmotnost vodného roztoku antigenu, suspenze vírových antigenů připravená známým způsobem se podrobí lyofilizaci a lyofilizát se suspenduje v připraveném bakteriálním extraktu.The method for the preparation of an inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia in animals is a guarantee of the fulfillment of the stated requirements, which is also the subject of the invention. This method consists in obtaining bacterial surface antigens by extraction from a bacterial suspension into an aqueous thiocyanate solution, subjecting the extract to dialysis and binding the bacterial surface antigens to a mineral carrier, for example aluminum hydroxide in gel form, which is added in amounts of 1 to 2 % by weight, calculated on the weight of the aqueous antigen solution, the suspension of viral antigens prepared in a known manner is subjected to lyophilization and the lyophilisate is suspended in the prepared bacterial extract.

K plípiavč Unlo'iny podle vynálezu byl vybrán Equine Rhinopneumonitis virus, Strain, Alb. 2 981/64 č. sb. CAI’M V-44, Influenza virus Λ/equine 1, Urno 78 č. sb. CAPM V-278, Influenza virus Λ/equine 2, Fontaineblou 79 č. sb. CAPM V-306, Streptococcus zooepidemicus CCM 6 260, Rhodococcus equi CCM 6 262 a Actinobacillus equuli CCM 6 258.Equine Rhinopneumonitis virus, Strain, Alb. 2 981/64 No. sb. CAI’M V-44, Influenza virus Λ / equine 1, Urn 78 No. sb. CAPM V-278, Influenza virus Λ / equine 2, Fontaineblou 79 sb. CAPM V-306, Streptococcus zooepidemicus CCM 6 260, Rhodococcus equi CCM 6 262 and Actinobacillus equuli CCM 6 258.

Pomnožení viru Influenzy koní se provádí na kuřecích embryích. Následnou operací je purifikace a koncentrace viru z alantoidní tekutiny ethanolovým srážecím postupem. Pomnožení víru EHV-1 probíhá na kontinuální buněčné linii AUBEK. Následuje koncentrace viru přes membránový filtr přibližně na 20% objem. K imunizaci se použije zahuštěný virus, zbavený buněčného detritu. Po smíchání koncentrovaného viru EHV-1 a precipitovaného viru Influenzy koní A/l a Λ/2 se k inaktivovaným virovým partikulím přidá lyofilízační médium a provede se lyofilizace.Reproduction of equine influenza virus is performed on chicken embryos. The subsequent operation is the purification and concentration of the virus from the allantoic fluid by an ethanol precipitation procedure. EHV-1 virus propagation occurs on the AUBEK continuous cell line. This is followed by a concentration of virus through the membrane filter to approximately 20% by volume. A concentrated virus devoid of cellular detritus is used for immunization. After mixing the concentrated EHV-1 virus and the precipitated Equine Influenza A / 1 and Λ / 2 virus, lyophilization medium was added to the inactivated virus particles and lyophilized.

Bakteriální kmeny Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi a Actinobacillus equuli se pomnožují na tekutých médiích a každý kmen se kultivuje samostatně. Po pomnožení se všechny tři bakteriny smíchají a zahušřují se odstředěním 20násobně. K zahuštěnému bakterinu se přidá stejný objem 1 M roztoku thiokyanatanu draselného a po dobu 6 hodin se provádí extrakce povrchových antigenů za stálého protřepávání při 37 °C. Po extrakci se odstředěním oddělí zbytek bakteriálního detritu a supernatant se dialyzuje proti pufru po dobu 48 hodin. Dialyzát se inaktivuje formalinem a naváže na minerální nosič, hydroxid hlinitý. Takto připravená komponenta z bakteriálních antigenů slouží současně jako médium pro lyofilizovanou virovou složku. V bakteriálním extraktu připraveném podle vynálezu se virový lyofilizát rozptýlí bezprostředně před aplikací vakcíny.Bacterial strains of Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi and Actinobacillus equuli are propagated on liquid media and each strain is cultured separately. After multiplication, all three bacterins are mixed and concentrated by centrifugation 20-fold. An equal volume of 1 M potassium thiocyanate solution was added to the concentrated bacterin, and surface antigen extraction was performed for 6 hours with constant shaking at 37 ° C. After extraction, the remainder of the bacterial detritus is separated by centrifugation and the supernatant is dialyzed against buffer for 48 hours. The dialysate is inactivated with formalin and binds to a mineral carrier, aluminum hydroxide. The component thus prepared from bacterial antigens simultaneously serves as a medium for the lyophilized viral component. In the bacterial extract prepared according to the invention, the viral lyophilisate is dispersed immediately before the administration of the vaccine.

Aby se předešlo vedlejším reakcím při imunizaci koní, je nutno provést částečnou purifikaci pomnožených virů. K tomu se nabízejí různé postupy, jako srážecí nebo eluční postupy, centrifugace, absorpce nebo filtrační postupy. Pro purifikaci viru Influenzy se ukázala výhodnou precipitace viru vychlazeným etylalkoholem.Partial purification of propagated viruses must be performed to prevent side reactions during immunization of horses. Various processes are offered for this purpose, such as precipitation or elution processes, centrifugation, absorption or filtration processes. For the purification of Influenza virus, precipitation of the virus with chilled ethyl alcohol has been shown to be advantageous.

Obdobně pak u vakcíny z bakteriálních antigenů je vyvíjena snaha snížit obsah endotoxinu, který je velmi často příčinou vedlejších reakcí a postvakcinačních šoků v těch případech, kdy je nutno aplikovat větší objemy bakterií. Tomu lze rovněž předejít přípravou různých extraktů s použitím kyseliny chlorovodíkové za tepla, nebo kyseliny trichloroctové za chladna, kdy se extrahují především polysacharidové antigeny s nízkou molekulovou hmotností. Lze také využít extrakce při neutrálním pH, kdy se získají nativní kapsulární antigeny s vyšší molekulovou hmotností, které jsou lépe imunogenní (Baker, C. J. a Kasper, D. L., Rev. Inf. Dis., 7, 1985; 458 až 467). K extrakci za neutrálního pH se u některých bakterií použilo thiokyanatanu draselného, kterým se extrahuje z bakteriální stěny řada antigenů polysacharidové i proteinové povahy (Ryu, H. a Kaeberle, M. L., Vet. Microbiol., 11, 1986: 373 až 385). Jak se ukázalo v pokusech s extrakty z kmenů Pasteurella multocida a Pasteurella haemolytica, nedocházelo téměř k žádným vedlejším reakcím při imunizaci zvířat, i když bylo použito většího množství takto připraveného antigenu (Mukkur, T. K. S., J. Gen. Microbiol., 113, 1979: 37 až 43).Similarly, the bacterial antigen vaccine seeks to reduce the endotoxin content, which is very often the cause of side reactions and post-vaccination shocks in those cases where larger volumes of bacteria need to be administered. This can also be prevented by preparing various extracts using hot hydrochloric acid or cold trichloroacetic acid, in which low molecular weight polysaccharide antigens are extracted in particular. Neutral pH extractions can also be used to obtain higher molecular weight native capsular antigens that are better immunogenic (Baker, C. J. and Kasper, D. L., Rev. Inf. Dis., 7, 1985; 458-467). Potassium thiocyanate has been used in some bacteria for extraction at neutral pH, which extracts a number of antigens of polysaccharide and protein nature from the bacterial wall (Ryu, H. and Kaeberle, M. L., Vet. Microbiol., 11, 1986: 373-385). As shown in experiments with extracts from Pasteurella multocida and Pasteurella haemolytica strains, almost no side reactions occurred in the immunization of animals, although larger amounts of the antigen thus prepared were used (Mukkur, TKS, J. Gen. Microbiol., 113, 1979): 37 to 43).

Předností nové polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat a způsobu přípravy této vakcíny podle vynálezu je, že tato vakcína je vhodná k imunizaci vysokobřezích klisen, a že touto vakcínou lze zabezpečit zvýšení kolostrálních protilátek proti viru Rhinopneumonie koní, virům Influenzy koní Al a A2 a proti třem nejdůležitějším bakteriálním agens, které se podílejí na infekčních bronchopneumoniích u hříbat v postnatálním období. V aplikační formě představují vakcínu koncentrované antigeny virové i bakteriální složky v malém objemu, čímž lze předejít případné lokální reakci u koní. Imunizace březích klisen zajistí lepší pasivní ochranu zvířat a podstatně sníží ztráty při jejich chovu. Navržená vakcína vhodně a účelně rozšíří dosud omezený sortiment imunoprotektivních přípravků pro koně.An advantage of the new polyvalent inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia of foals and the method of preparation of this vaccine according to the invention is that this vaccine is suitable for immunization of highly pregnant mares and that this vaccine against the three most important bacterial agents involved in infectious bronchopneumonia in postnatal foals. In the application form, the vaccine represents concentrated antigens of viral and bacterial components in a small volume, which prevents a possible local reaction in horses. Immunization of pregnant mares will ensure better passive protection of animals and significantly reduce losses during their breeding. The proposed vaccine will suitably and effectively expand the hitherto limited range of immunoprotective preparations for horses.

Vakcína se aplikuje hluboko do svalu, nejlépe se osvědčila aplikace do gluteální svaloviny. Jelikož vakcíny s olejovým adjuvans i s hydroxidem hlinitým mohou vyvolávat místní reakce a granulomy, je vakcína koncentrována na objem 4 ml pro 1 aplikaci. Zatím byla ověřena aplikace asi u 500 ks a sterilní absces byl pozorován jen v 1 případu, kdy šlo asi o kontaminaci při aplikací. Větší nebezpečí ah.nroí?ů by bylo po podkožní aplikaci, proto je tento způsob u koní kontraindikován.The vaccine is given deep into the muscle, preferably in the gluteal muscle. Because both oil-adjuvanted and aluminum hydroxide vaccines can cause local reactions and granulomas, the vaccine is concentrated to a volume of 4 ml for 1 administration. So far, the application has been verified in about 500 pieces and a sterile abscess was observed in only 1 case, which was about contamination during application. There would be a greater risk of ah.roí? S after subcutaneous application, therefore this method is contraindicated in horses.

Kontraindikace vakcinace u navrhované vakcíny jsou všeobecně případy celkového oslabení zvířat s horečnatými stavy. Jinak je kontraindikací případné použití jiných vakcín v období 2 až 3 týdny před první vakcínací a 1 měsíc po revakcinaci.Contraindications to vaccination with the proposed vaccine are generally cases of general attenuation of animals with febrile conditions. Otherwise, the possible use of other vaccines in the period 2 to 3 weeks before the first vaccination and 1 month after revaccination is contraindicated.

Jelikož vakcína má sloužit ke zvýšené ochraně hříbat kolostrální a laktogenní imunitou, je nutno vakcínovat klisny v pozdním období gravidity v 7 až 9 měsíci. Předběžně bylo použití vakcíny ověřováno i u hříbat, ale zde ještě není ověřena nejvhodnější doba aplikace, která by měla být po odeznění kolostrální imunity.As the vaccine is intended to increase the protection of foals by colostral and lactogenic immunity, mares should be vaccinated late in pregnancy at 7 to 9 months. The use of the vaccine has also been preliminarily tested in foals, but the most suitable time of administration, which should be after the disappearance of colostral immunity, has not yet been verified.

Složení a zejména způsob přípravy polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat podle vynálezu vhodně ilustruje níže uvedený příklad přípravy vakcíny v množství pro 100 koní:The composition and in particular the method of preparing a polyvalent inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia of foals according to the invention suitably illustrates the following example of the preparation of a vaccine in an amount for 100 horses:

Způsobem podle vynálezu se nejprve připraví bakteriální složka vakcíny.The method of the invention first prepares the bacterial component of the vaccine.

VakcinaČní kmen Rhodococcus equi CCM 6 262 se pomnoží v tekuté živné půdě tohoto složení:The vaccine strain Rhodococcus equi CCM 6 262 is propagated in a liquid nutrient medium of the following composition:

Enzymatický kaseinový hydrolyzát 17 g/1Enzymatic casein hydrolyzate 17 g / l

Sójový pepton3 gSoy peptone3 g

Chlorid sodný 2,5gSodium chloride 2.5g

Hydrogenfosforečnan dvojsodný kryst. 2,5gDisodium hydrogen phosphate crystal. 2.5g

Glukóza 2,5g pH roztoku se upraví na hodnotu 7,4.Glucose The pH of the solution is adjusted to 7.4 with 2.5 g.

VakcinaČní kmen Actinobacillus equuli CCM 6 258 se pomnoží na tekutém bujónu obdobného složení jako Rhodococcus equi.The vaccine strain Actinobacillus equuli CCM 6 258 is propagated on a liquid broth of a composition similar to that of Rhodococcus equi.

VakcinaČní kmen Steptococcus zooepidemicus CCM se pomnoží v Tood Hewitově bujónu.The vaccine strain Steptococcus zooepidemicus CCM is propagated in Tood Hewitt broth.

Ze všech tří vakcinačních kmenů se připraví nejdříve inokulum, které se kontrolním výsevem na krevní agar vyšetří na nepřítomnost jiné mikroflóry. Pro každý kmen se připraví 3 litry příslušné živné půdy a umístí se v termostatu při 37 °C. Po dosažení potřebné teploty se inokuluje každý kmen zvlášř v dávce 2 % hmot, bakteriální kultury a pomnožuje se staticky po dobu 24 hodin u Actinobacilla a Streptococca a po dobu 48 hodin u Rhodococca. Po této Q době se předpokládá nárůst bakterií minimálně 10 . Narostlá bakteriální kultura se smíchá a zahušťuje odstředěním na průtokové odstředivce a promyje fyziologickým roztokem. Konečný objem zahuštěné bakteriální suspenze je 350 ml. K tomuto objemu se přidá 350 ml 1 M vodného roztoku thiokyanatanu draselného. Směs se zahřeje na 40 °C a provádí se extrakce antigenu třepáním po dobu 6 hodin v termostatu při teplotě 37 °C. Po extrakci se směs bakterií odstředí při 3 000 g po dobu 1 hodiny při +5 °C. Supernatant s extrahovanými antigeny se dialyzuje proti pufru (0,01 M Na₂HPO₄), 0,3 M NaCl, pH 7,5) s přídavkem 0,5 » hmot, formalinu při teplotě +4 °C. Extrakt se dialyzuje proti lOnásobnému objemu pufru s jednou výměnou po dobu 48 hodin. Po ukončení dialýzy se bakteriální extrakt odstředí při 3 000 g po dobu 30 minut, pH supernatantu se upraví na hodnotu 7,0 až 7,5 a přidá se 10 % hmot, gelu hydroxidu hlinitého a upraví se koncentrace formalinu na 0,5 % hmot, i celkový objem vakcíny na 800 ml. Adsorbovaná bakteriální složka se rozplní do lékovek a je připravena jako solvens pro lyofilizovanou formu virové složky.An inoculum is first prepared from all three vaccine strains and examined for the absence of other microflora by control seeding on blood agar. For each strain, 3 liters of the appropriate nutrient medium are prepared and placed in a thermostat at 37 ° C. After reaching the required temperature, each strain is inoculated separately at a dose of 2% by weight of bacterial culture and propagated statically for 24 hours in Actinobacillus and Streptococca and for 48 hours in Rhodococco. After this Q time, a bacterial growth of at least 10 is expected. The grown bacterial culture is mixed and concentrated by centrifugation in a flow centrifuge and washed with saline. The final volume of the concentrated bacterial suspension is 350 ml. To this volume was added 350 mL of a 1 M aqueous solution of potassium thiocyanate. The mixture was heated to 40 ° C and antigen extraction was performed by shaking for 6 hours in a thermostat at 37 ° C. After extraction, the bacterial mixture is centrifuged at 3,000 g for 1 hour at + 5 ° C. The supernatant with extracted antigens is dialyzed against buffer (0.01 M Na ₂ HPO ₄ ), 0.3 M NaCl, pH 7.5) with the addition of 0.5% by weight of formalin at + 4 ° C. The extract was dialyzed against 10 times the volume of one exchange buffer for 48 hours. After dialysis, the bacterial extract was centrifuged at 3,000 g for 30 minutes, the pH of the supernatant was adjusted to 7.0-7.5, and 10% by weight of aluminum hydroxide gel was added, and the formalin concentration was adjusted to 0.5% by weight. , and the total volume of vaccine per 800 ml. The adsorbed bacterial component is dispensed into vials and is prepared as a solvate for the lyophilized form of the viral component.

Při přípravě virové složky vakcíny se postupuje tak, že kmeny viru chřipky koní subtypIn preparing the viral component of the vaccine, the equine influenza virus strains are subtype

A/l a A/2 se sbírkovým označením CAMP V-278 a CAMP V-306 se pomnožují známým postupem na kuřecích embyriích intraalantoidně po inokulaci dávkou 0,2 ml s obsahem 10³ až 10⁴ v inokulu. Po 48 hodinách inkubace při 35 °i ew₅0A / l and A / 2, collectively designated CAMP V-278 and CAMP V-306, are propagated in a known manner on chicken embryos intraalantoid after inoculation with a dose of 0.2 ml containing 10 ³ to 10 ⁴ in the inoculum. After 48 hours incubation at 35 ° and EW ₅ 0

C se vajíčka prohlédnou. Živá embrya se ochladí na 4 °C a při této teplotě se ponechají 24 hodin, a poté se odebírá alantoidní tekutina.C the eggs are inspected. The live embryos are cooled to 4 ° C and left at this temperature for 24 hours, after which the allantoic fluid is collected.

Z It.rAdých 10 vajíček m· vždy odebírá alantoidní tekutina zvlášE, aby bylo možné u těchto objemů stanovit titr haemaglutininů. Pro přípravu vakcíny se používá alantoidní tekutina s obsahem titru 256 a vyšším a objemy se smíchají tak, aby se dosáhlo průměrného titru 512 hemaglutinačních jednotek. Pro imunizaci 100 koní je nutno připravit 600 ml alantoidní tekutiny s obsahem 512 hemaglutinačních jednotek viru A/l v 1 ml a stejné množství viru A/2.The allantoic fluid is always taken separately from the other 10 eggs in order to determine the haemagglutinin titer in these volumes. An allantoic fluid with a titer of 256 or higher is used to prepare the vaccine and the volumes are mixed to give an average titer of 512 hemagglutination units. For immunization of 100 horses, 600 ml of allantoic fluid containing 512 haemagglutination units of A / 1 virus in 1 ml and the same amount of A / 2 virus must be prepared.

Získaná alantoidní tekutina se klarifikuje odstředěním při 2 000 g a inaktivuje se přidáním 0,1 Z hmot, formalinu. Virus z inaktivované alantoidní tekutiny se sráží vychlazeným 96 % hmot, etylalkoholem. Etyalkohol vychlazený na -40 °C se přidává do alantoidní tekutiny předem vychlazené na +4 °C do koncentrace alkoholu 40 % hmot, (k 1 200 ml alantoidní tekutiny se přidá 800 ml 96 % hmot, etylalkoholu). Po 24hodinovém stání při teplotě +4 °C se obsah vzniklého precipitátu rozmíchá a suspenze se odstřeluje při nízkých otáčkách 500 až 1 000 g po dobu 30 minut. Sediment představující vysrážené částice viru Influenzy s malou příměsí vaječné tekutiny se resuspenduje v kultivačním médiu obsahujícím virus EHV-1, jak bude uvedeno níže.The allantoic fluid obtained is clarified by centrifugation at 2,000 g and inactivated by the addition of 0.1% by weight of formalin. The virus is precipitated from the inactivated allantoic fluid with chilled 96% by weight of ethyl alcohol. Ethyl alcohol cooled to -40 ° C is added to the allantoic fluid pre-cooled to + 4 ° C to an alcohol concentration of 40% by weight (800 ml of 96% by weight ethyl alcohol are added to 1200 ml of the allantoic fluid). After standing for 24 hours at + 4 DEG C., the contents of the precipitate formed are stirred and the suspension is blasted at low speed of 500 to 1000 g for 30 minutes. The sediment representing precipitated Influenza virus particles with a small amount of egg fluid is resuspended in culture medium containing EHV-1 virus, as described below.

Virus rhinopneumonie koní EHV-1 se sbírkovým označením CAMP V-44 se pomnoží na tkáňové kultuře. Uvedený virus je adaptovaný na kontinuální buněčnou linii AUBEK. K pomnožení buněk se použije Eaglův roztok (MEM) s přídavkem 10 % hmot, fetálního séra, 200 j. penicilinu a 20 /rg streptomycinu/1 ml. Virus se množí na buňkách bez fetálního séra v udržovacím médiu. K inokulaci se používá virus ΤΚΙΏ^θ 10^/ml a kultivace se provádí 5 až 7 dnů, až se dosáhne cytopatického efektu asi u 80 % buněk. Pak se buňky uvolní a získaná buněčná suspenze se inaktivuje přidáním 0,1 % hmot, formalinu. Po 3denním uložení při 4 °C se provede uvolnění viru z buněk opakovaným zmrazením a rozmražením, které se 3x opakuje. Po uvolnění viru se buněčný detritus oddělí odstředěním při 2 000 g po dobu 30 minut. Supernatant se zahustí přes membránový filtr na 1/5 původního objemu. Pro přípravu vakcíny pro 100 koní je nutno připravit 3 500 ml suspenze infikovaných buněk. Po odstředění a zahuštění se získá 700 ml suspenze viru EHV-1 s obsahem viru ΤΚΙΟ^θ 10⁴/ml. Do zahuštěné suspenze viru EHV-1 se resuspenduje sediment viru Influenzy koní A/l a A/2, připravený postupem uvedeným shora. Suspenze se roztřepává na míchačce při 35 °C po dobu 2 až 3 hodin, čímž se dosáhne eluce viru. Pak se opětovně suspenze viru EHV-1 a Influenzy odstředí při nízkých otáčkách 700 až 800 g po dobu 30 minut a oddělí se nerozpuštěné bílkoviny z precipitátu získaného srážením alantoidní tekutiny.Equine rhinopneumonia virus EHV-1 with the collection designation CAMP V-44 is propagated in tissue culture. Said virus is adapted to the continuous cell line AUBEK. Eagle's solution (MEM) supplemented with 10% w / w, fetal serum, 200 [mu] l penicillin and 20 [mu] g streptomycin / 1 ml was used to propagate the cells. The virus multiplies on cells without fetal serum in maintenance medium. Virus ΤΚΙΏ ^ θ 10 ^ / ml is used for inoculation and cultivation is carried out for 5 to 7 days until a cytopathic effect is obtained in about 80% of the cells. The cells are then released and the cell suspension obtained is inactivated by adding 0.1% by weight of formalin. After 3 days of storage at 4 ° C, the virus is released from the cells by repeated freezing and thawing, which is repeated 3 times. After virus release, cell detritus is separated by centrifugation at 2,000 g for 30 minutes. The supernatant is concentrated through a membrane filter to 1/5 of the original volume. To prepare a vaccine for 100 horses, 3,500 ml of a suspension of infected cells must be prepared. After centrifugation and concentration, 700 ml of EHV-1 virus suspension containing ΤΚΙΟ ^ θ 10 ⁴ / ml virus are obtained. The equine influenza virus sediment A / l and A / 2, prepared as described above, is resuspended in the concentrated EHV-1 virus suspension. The suspension is shaken on a stirrer at 35 ° C for 2 to 3 hours to elute the virus. The EHV-1 and Influenza virus suspension is then centrifuged again at low speed of 700 to 800 g for 30 minutes, and the undissolved proteins are separated from the precipitate obtained by precipitation of the allantoic fluid.

Suspenze viru se doplní lyofilizačním médiem s želatinou, hodnota pH se upraví na 7,0 až 7,5 a provede se lyofilizace v lékovkách.The virus suspension is supplemented with lyophilization medium with gelatin, the pH is adjusted to 7.0 to 7.5 and lyophilization is performed in vials.

Polyvalentní vakcína proti infekční bronchopneumonii hříbat podle vynálezu, připravená podle uvedeného příkladu byla podrobena a vyhověla níže uvedeným zkouškám:The polyvalent vaccine against infectious bronchopneumonia of foals according to the invention, prepared according to the above example, was subjected to and passed the following tests:

Zkouška sterility a inaktivaceSterility and inactivation test

Provádí se u bakteriální a virové složky vakcíny samostatně. Bakteriální část vakcíny se vyočkuje na'plotny krevního agaru a do tekutého živného média, virová část vakcíny před lyofilizací se ověřuje inokulaci do kuřecího embrya. Po inokulaci 0,2 ml do alantoidní tekutiny nedošlo k úhynu embrya.It is performed on the bacterial and viral components of the vaccine separately. The bacterial portion of the vaccine is inoculated onto blood agar plates and liquid nutrient medium, and the viral portion of the vaccine is verified by inoculation into a chicken embryo prior to lyophilization. No embryo death occurred after inoculation of 0.2 ml into allantoic fluid.

Zkouška neškbdnostiInnocence test

Vakcína se naočkuje vždy 4 myškám. Po intraperitoneální aplikaci 0,2 ml se myšky pozorují po dobu 1 týdne, neeošlo k úhynu.The vaccine is inoculated with 4 mice each time. After intraperitoneal administration of 0.2 ml, the mice were observed for 1 week, no deaths occurred.

Zkouška účinnostiEfficacy test

Provádí se imunizací králíků. Vakcína se aplikuje intramuskulárně do končetiny v množství 1 ml a revakcinuje se po 14 dnech. Po 3 týdnech se odebere krev pro sérologické vyšetření specifických protilátek. .It is performed by immunizing rabbits. The vaccine is administered intramuscularly to the limb in an amount of 1 ml and revaccinated after 14 days. After 3 weeks, blood is collected for serological testing for specific antibodies. .

Doba expirace vakcíny podle vynálezu je 1 rok a vakcína se skladuje v temnu při teplotě cca +5 c.The expiration time of the vaccine according to the invention is 1 year and the vaccine is stored in the dark at a temperature of about +5 c.

Účinnost polyvalentní inaktivované adsorbátové vakcíny proti infekční bronchopneumonii hříbat připravené podle vynálezu potvrzují výsledky získané imunizací březích klisen a králíků, u kterých bylo dosaženo těchto titrů protilátek:The efficacy of the polyvalent inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia of foals prepared according to the invention is confirmed by the results obtained by immunization of pregnant mares and rabbits in which the following antibody titers were obtained:

Antigen Průměrné titry před a po vakcinaciAntigen Mean titers before and after vaccination

u klisen in mares u králíků in rabbits před before P° P ° před before PO AFTER Virus rhinopneumonie Rhinopneumonia virus 23 23 382 382 0 0 96 96 Virus chřipky Influenza virus 100 100 664 664 0 0 128 128 Actinobacillus Actinobacillus 26 26 100 100 3 3 48 48 Corynebacterium Corynebacterium 19 19 98 98 2 2 32 32 Streptococcus Streptococcus 578 578 2 064 2 064 24 24 96 96

PŘEDMĚT VYNÁLEZUOBJECT OF THE INVENTION

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

A polyvalent inactivated adsorbate vaccine against infectious bronchopneumonia of foals with a mineral carrier, comprising viral antigens of Rhinopneumonia and Influenza equi viruses, characterized in that it consists of three viral antigens, namely equine Rhinopneumonia equine EHV-1 and two subtypes of Influenza equi, namely: A / Equi 1 and A / Equi 2 and bacterial surface antigens obtained from Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus equuli and Rhodococcus equi strains, wherein both viral antigens and bacterial surface antigens are bound to a mineral carrier, for example aluminum hydroxide in gel form.

2. A method of preparing a vaccine according to claim 1, wherein the bacterial surface antigens are obtained by extraction from a battery suspension into an aqueous thiocyanate solution, the extract is dialyzed and the bacterial surface antigens are bound to a mineral carrier such as aluminum hydroxide in gel form. is added in an amount of 1 to 2% by weight, based on the weight of the aqueous antigen solution, the suspension of viral antigens prepared in a known manner is subjected to lyophilization and the lyophilisate is suspended in the prepared bacterial extract.