CS264992B1 - Spdsob přípravy siefovanóho proteinu - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká přípravy sletovaného proteinu pre účely přípravy štandardných chromolytických substrátov. Podstata riešenia spočívá v tom, že protein sa sieťuje za použitia homobifunkčného činidla odvodeného od L-aminokyselinových zložiek primárnéj štruktúry proteinu, akým je L-etylester kyseliny 2,6-diizotiokyanátohexánovej v množstve 0,5 až 10 % hmot. vztiahnuté na hmotnost suchého proteinu, pri pH 7 až 12 upraveném pomocou roztokov zriedených lúhov alebo kyselin alebo tlmivých roztokov 1 až 50 mmol.l-^, s výhodou fosfátových alebo borátových, pri teplote 10 až 50 °C po dobu 10 až 120 min.

Description

264992 2

Vynález sa týká spdsobu přípravy sletovaných proteinov a to tak pre účely přípravyštandardných chromolytických substrátov, afinantov proteolytických enzýmov obecného typu,hydrogélov proteinového typu, alebo nosičov k imobilizácii enzýmov a buniek.

Doteraz známe spósoby sietovania proteinov využívajú prevažne homobifunkčné látkytypu glutaraldehydu (S. Avrameas, Immunochemistry, 6/1969/43) , alebo heterobifunkčně látkytypu 2-chlormetyloxiránu (AO 194 592; AO 218 709). Zatial čo v príprave sietovania glutaral-dehydom vznikajú nedefinované oligomérne a polymérne štruktúry, obsahujúce alfa-nenasýtenéaldehydy, ktoré taktiež sa zúčastňujú reakcie sietovania (F. M. Richards, J. R. Knowles, J. Mol. Biol. 37/1968) (231) Schiffove bázy, ktoré v priebehu sietovania vznikajú, nezaru- čujú stabilitu výsledného produktu. V případe sietovania 2-chlorometyl-oxiránom je potřebnápoměrně vysoká alkalita (pH 14) na premenu intermediárneho chlorohydrínu na oxiránovú skupinu,čo je sprevádzané degradačnými reakciami v primárnej štruktúre proteinu. Navýše uvedenáreakcia sietovania je sprevádzaná vysokou tvorbou solí, čo negativné ovplyvňuje hydrodynamickévlastnosti připravovaného proteinového gélu. Pri príprave váčších množstiev sletovanéhoproteinu za použitia 2-chlorometyloxiránu vznikajú technologické problémy s homogénnoudistribúciou lúhu v priereze reakčnej zmesi, čo má za následok nerovnoměrnost zosietovaniagélu na jednej straně a lokálnu degradáciu proteinu na vodorozpustné fragmenty v dósledkuvysokej alkality na straně druhej.

Uvedené nedostatky odstraňuje postup podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom,že v prvom stupni sa protein sieťuje za použitia homobifunkčného činidla odvodeného odL-aminokyselinových zložiek primárnej štruktúry proteinu akým je L-etylester kyseliny 2,6--diizotiokyanátohexánovej, v množstve 0,5 až 10 % hmot. vztiahnuté na hmotnost suchéhoproteinu, v prostředí roztoku o pH 7 až 12, s výhodou borátového alebo fosfátového pufru,pri teplote 10 až 50 °C po dobu 10 až 120 minút. V druhom stupni sa sletovaný protein vyperieod zložiek tlmivého roztoku a adjustuje pre Salšie použitie. Hydrogél sletovaného proteinumožno použit ako selekěnú pódu k sledovaniu mikr.obiálnych producentov enzýmov proteolytické-ho typu alebo v suchom stave po defibrácii v rýchlootáčkovom mixéri a následnom vysušenía vysitovaní ako afinant k izolácii proteolytických enzýmov zo zmesi enzýmov, alebo akonerozpustný protein k príprave štandardných chromolytických substrátov k stanoveniu aktivitproteolytických enzýmov v chemickej úpravě so zlúčeninami obsahujúcimi chromofórové skupiny. Výhodou uvedeného postupu je skutočnosť, že v priebehu reakcie nedochádza k tvorběvedlajších produktov, reakcia sietovania prebieha kontrolované v jednom smere bez tvorbysprievodných solí, umožňuje přípravu nových proteinových gélov v širokom rozsahu fyzikálnycha chemických vlastností pre Specifické potřeby ich využívania. Vysušený sletovaný proteinsa dobré skladuje. Podlá reakčných podmienok možno reakciu sietovania viesť tak, aby před-nostně reagovali len tiolové skupiny proteinu, alebo tak tiolové, ako aj primárné amino--skupiny proteinu. Příklad 1

Lyofilizovaný albumin hovSzieho séra (5 g) sa rozpúšta za miešania na elektromagnetickéjmiešačke v 100 ml borátového pufru (10 mmol.l ; pH 12) za přídavku 0,01 ml n-oktanolu. K rozpustnému proteinu sa přidá 0,5 g etylesteru 2,6-diizokyanátu lyzinu za rýchleho premieša-nia a reakčná zmes sa vyleje do formy (40x40 cm) o.výške 0,5 cm. Reakcia sietovania saukončí po 10 minútach pri 50 °C. Vzniknutý hydrogél sletovaného proteinu sa vyperie v desti-lovanej vodě od zvyškov borátového pufru. Získaný produkt po vymytí a Salšom napučaní vovodě má suchú hmotnost 1,1 % a modul elasticity penetrometricky 26 mm.

Príklad2

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako protein sa použije ovalbumín. Získaný produkt má suchú hmotnost 1,8 ta modul elasticity penetrometricky 24 mm.

Claims (1)

1. 3 264992 Příklad 3 Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že ako protein sa použije kazeín. Reakciasieťovania sa uskotoční v prostředí fosfátového pufru (40 mmol.l-1; pH 7) a za přídavku25 mg etylesteru 2,6-diizotiokyanátu L-lyzínu. Reakcia sieťovania sa ukončí po 10 minútachpri 10 °C. Získaný produkt sa za mokra defibruje vo vysokootáčkovom mixéri, premýva destilo-vanou vodou a etanolom a suší za izbovej teploty (20 °C). Získaný suchý gél sa sítujena velkost častíc 0,06 až 0,3 mm napučací objem 33 ml.g 1 a použije ako afinant proteolytickýchenzýmov (pepsín, trypsin, chymotrypsín) obecného typu. Vynález má široké uplatnenie predovšetkým v enzýmovom inžinierstve, potravinárstvea v obecnej aplikovanéj mikrobiologii. PREDMET VYNÁLEZU Spósob přípravy sieťovaného proteinu vyznačený tým, že protein sa sieťuje za použitiahomobifunkčného činidla odvodeného od L-aminokyselinových zložiek primárnej štruktúryproteinu akým je L-etylester kyseliny 2,6-diizotiokynátohexánovej v množstve 0,5 až 10 %hmot. vztiahnuté na hmotnost suchého proteinu, pri pH 7 až 12 upraveném pomocou roztokovzriedených lúhov alebo kyselin, alebo pomocou tlmivých roztokov 1 až 50 mmol.l 1, s výhodoufosfátových alebo borátových, pri teplote 10 až 50 °C po dobu 10 až 120 minút.